CN109943631A - 非梗阻性无精子症辅助诊断基因检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
非梗阻性无精子症辅助诊断基因检测试剂盒,涉及无精子症诊断领域,解决了男性不育症存在的临床诊断困难的问题。本发明的非梗阻性无精子症辅助诊断基因检测试剂盒,包括特异性PCR引物、PCR缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶,特异性PCR引物为检测非梗阻性无精子症TEX11基因中第69826819位突变位点的一组特异性引物。通过设计特异性引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2,该特异性引物具有较高的特异性,采用由上述特异性引物组成的非梗阻性无精子症辅助诊断基因检测试剂盒检测男性患者TEX11基因中第69826819位突变位点,其基因突变的检出率为100%。
Description
技术领域
本发明涉及无精子症的诊断技术领域,具体涉及一种非梗阻性无精子症辅助诊断基因检测试剂盒。
背景技术
男性不育症(Male Infertility),是指夫妻婚后有正常性生活,未采用任何避孕措施,由于男方原因而致妻子不受孕者。男性不育症严重影响男性健康,根据世界卫生组织调查显示,在育龄期约有8%的夫妇患有不育的疾患,据此推算全世界约有5000万至8000万人患有不育问题,并且呈逐年增加趋势。其中男性原因导致不育比例一般不低于50%。男性不育症根据临床表现分为绝对不育和相对不育;根据病程可分为原发不育和继发不育。
男性不育症的发病原因主要有生殖道梗阻、炎症或免疫性因素以及性功能障碍等等,但高达60~75%的患者是找不到原因,这种情况被称之为特发性男性不育,属于非梗阻性无精症(non-obstructive azoospermia,NOA)。根据组织病理学分类,主要分为三种类型,分别为:唯支持细胞综合征、精子发生停滞或称为成熟抑制及精子发生低下。目前临床上能够检测的男性不育症的因素为:染色体核型和AZF缺失情况。AZF基因是1976年,Tiepolo等人通过核型分析发现了6例无精子症患者的Y染色体长臂的微缺失并提出了无精子因子即AZF概念,随后的研究将其定位于Yq11.23,AZF并不是单一基因,而是功能上相互关联的基因家族,在精子发生、发育和成熟中起到重要作用。
多种基因突变检测技术主要包括蛋白截断试验、单链构象多态性、异源双链分析化、变性梯度凝胶电泳和溫度梯度凝胶电泳等。但是上述这些检测方法都存在一定的局限性,极大的限制了基因突变的检出率。
正是由于临床上对绝大部分的NOA患者的真正原因仍然不清楚,从而导致临床上针对NOA的诊断存在很大的困难。基于此,亟待需要研制出一种无精子症辅助诊断基因检测试剂盒,辅助诊断非梗阻性无精子症。
发明内容
为了解决非梗阻性无精子症存在的临床诊断困难的问题,本发明提供一种非梗阻性无精子症辅助诊断基因检测试剂盒。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下:
本发明的非梗阻性无精子症辅助诊断基因检测试剂盒,包括特异性PCR引物、PCR缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶,所述特异性PCR引物为检测NOA患者TEX11基因中第69826819位突变位点的一组特异性引物。
作为优选的实施方式,所述特异性PCR引物的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示,所述特异性PCR引物的下游引物序列如SEQ ID NO:2所示。
位于X染色体上的TEX11基因,是X染色体编码的精细胞特异蛋白,在睾丸精原细胞和精母细胞中有丰富的表达,与精子发生形成有很大的联系。已有研究表明:破坏该基因的表达会导致无精子症,这表明生精障碍与特定性别染色体的减数分裂特异性基因有关。
TEX11基因定位于染色体Xql3.1,含有34个外显子。TEX11在雄性减数分裂中具有两个显著的功能:一是促进染色体的联会,二是交叉互换。鉴于破坏TEX11基因在小鼠中的表达会引起无精子症,因此在人类中TEX11基因的突变是造成遗传性男性不育的原因之一。因为男性只有一个继承自母亲的X染色体,所以只有一个拷贝的TEX11基因,理论上任何突变都可导致精子发生障碍。像其他X染色体连锁疾病一样,如色盲、肌营养不良症,通过他的母亲传递的基因突变可以造成儿子的无精子症。
本发明的有益效果是:本发明通过设计特异性引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2,用于检测非梗阻性无精子症TEX11基因中第69826819位突变位点,该特异性引物具有较高的特异性,并且采用由上述特异性引物组成的非梗阻性无精子症辅助诊断基因检测试剂盒检测男性不育症TEX11基因中第69826819位突变位点,其基因突变的检出率为100%。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供的非梗阻性无精子症辅助诊断基因检测试剂盒,包括特异性PCR引物、PCR缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶,其中特异性PCR引物为检测男性不育症TEX11基因中第69826819位突变位点的一组特异性引物。
其中,PCR缓冲液采用10mmol/L的Tris-Cl缓冲液,pH为8.3~8.8。
DNA聚合酶(DNA polymerase)是细胞复制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶,以DNA为复制模板,从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成及其相辅的活性。
特异性PCR引物的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示,下游引物序列如SEQ ID NO:2所示。序列信息详见表1。
表1
目标基因名称:TEX11
目标基因位置:Xq13.1
碱基变化:T>C
SNP位点碱基:GG
碱基位置:chrX:69826819
基因序列:>NC_000023.10:c69827000-69826700Homo sapiens chromosomeX,GRCh37.p13Primary Assembly
SEQ ID NO:3
GAGAAACCCCTTACTAGTATGTTAATATCAAAGGTGTAAGTATCAGAAATTGTAATGGTACAGACTAAATGGTAGATTTTCATAATTTCATATTATTATGTTATTTCATGTTAATTTCCAGCTTGGAACTTGGCTGTGCAATGTGACAAAGATCCAGTGATGATGAGAGAGTTTTTTATACTTTCTTATAAGGTAAGTTTCTTTTAATAAGTATCTCATGTATGGACCACAACAAGGCTATAACCACTATGGCTATAGTAAAGGGCTAAATATAGACTAGGATTGTCTCTTGATCTAGGAA
其中,突变基因的位置在69826819,表现为T>C的纯合突变,突变后两条基因位点的SNP为GG,序列中已标注下划线。
临床患者表现:无精子症,具体信息详见表2。
表2
实施例2非梗阻性无精子症辅助诊断基因检测试剂盒的使用方法
采用非梗阻性无精子症辅助诊断基因检测试剂盒检测男性不育症TEX11基因中第69826819位突变位点,其具体操作流程如下:
1、PCR扩增
PCR反应条件为:95℃预变性5min;95℃变性30s,68℃退火2min30s,30个循环;72℃后延伸10min。
2、PCR产物的鉴定:采用琼脂糖电泳分析鉴定PCR产物,经PCR鉴定后送至长春库美科技有限公司进行测序。
3、紫外灯下观察电泳条带有无情况,根据电泳条带有无情况来判断样品中是否含有致病突变基因。
以患者血液为样本,提取DNA后作为模板、以基因检测试剂盒中的特异性PCR引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)为上下游引物进行PCR扩增,据电泳条带有无情况来判断样品中是否含有致病突变基因。具体的判断方法如下:若观察到目的电泳条带,则说明样品DNA模板在第69826819位突变位点含有突变型基因。
实施例3临床试验
筛选临床上确诊的30例非梗阻性无精子症患者(这30例患者的病因均是因男性不育症TEX11基因中的第69826819位基因突变导致的,突变基因的位置在69826819,表现为T>C的纯合突变,突变后两条基因位点的SNP为GG),采用实施例1的非梗阻性无精子症辅助诊断基因检测试剂盒,参照实施例2的使用方法对这30例患者进行基因突变位点的检测。紫外灯下观察电泳条带有无情况,观察到100条目的条带,由此说明样品DNA模板在第69826819位突变位点含有突变型基因,基因突变的检出率为100%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.非梗阻性无精子症辅助诊断基因检测试剂盒,包括特异性PCR引物、PCR缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶,其特征在于,所述特异性PCR引物为检测非梗阻性无精子症TEX11基因中第69826819位突变位点的一组特异性引物。
2.根据权利要求1所述的非梗阻性无精子症辅助诊断基因检测试剂盒,其特征在于,所述特异性PCR引物的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示,所述特异性PCR引物的下游引物序列如SEQ ID NO:2所示。
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