CN108866183A - 弱精子症相关的grp78基因snp标志物及其应用 - Google Patents

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廖碧云
陈兴鸿
覃海媚
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Abstract

本发明公开一种弱精子症相关的GRP78基因SNP标志物及其应用，涉及基因工程和生殖医学技术领域。本发明采用多重单碱基延伸技术分析GRP78基因多个位点多态性与弱精症的相关性，得出GRP78基因rs3216733和rs391957 SNP与弱精症发生存在相关性，可下调其蛋白表达而增加弱精症发生风险，可作为辅助诊断弱精子症的试剂或试剂盒。

Description

弱精子症相关的GRP78基因SNP标志物及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程和生殖医学技术领域，具体的涉及一种弱精子症相关的GRP78基因SNP标志物及其应用。
背景技术
不孕不育发病率逐年上升，严重影响约10％～15％育龄夫妇，其中男性因素被认为在不孕不育中起着至关重要的作用。导致男性不育病因复杂多样，其中弱精子症为重要致病因素之一。弱精子症是指精子活动力下降而导致男性不育的疾病，表现为前向运动精子小于32％。其发病机制与感染、精液液化异常、内分泌因素、免疫因素、遗传性因素等相关，但到目前为止尚未完全阐明。近年来，单核苷酸多态性(SNP)与男性不育的相关性研究被许多学者青睐。
葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)是一个多功能基因，GRP78是热休克蛋白70家族(heat shock protein， Hsp70)的成员之一，又称为免疫球蛋白重链结合蛋白 (immunoglobulin heavy chain binding protein，Bip)，高度保守的GRP78基因序列具有调节内质网钙稳态、阻止内质网新生肽聚集、启动未折叠蛋白反应等作用；葡萄糖调节蛋白78(GRP78)表达水平与精子活力密切相关，其可能机制为GRP78调节精子细胞内钙离子的水平而影响其活力；GRP78基因SNPs与多种疾病相关，功能性突变或缺失可调节其蛋白表达。有研究报道GRP78蛋白的表达在精子活力正常组和弱精子症组中存在差异，即在弱精子症组中GRP78蛋白的表达相对下降，提示GRP78与弱精子症的发生密切相关，但目前，尚未有GRP78基因多态性与男性不育弱精症相关性研究报道，同时目前也缺乏具体明显的标志物来确定其与弱精子症发病风险的关联。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明采用多重单碱基延伸技术分析GRP78基因多个位点多态性与弱精症的相关性，得出GRP78基因rs3216733和rs391957SNP与弱精症发生存在相关性，可下调其蛋白表达而增加弱精症发生风险，可作为辅助诊断弱精子症的试剂或试剂盒。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
一种弱精子症相关的GRP78基因SNP标志物，该标志物为：GRP78 基因rs3216733和rs391957SNP。
所述标志物筛选方法为：采用多重单碱基延伸技术分析GRP78 基因多个位点：rs3216733，rs17840761，rs17840762，rs391957位点进行基因分析；
在Primer 3.0引物软件设计待测SNP位点的所需引物，并合成；
通过对外周血提取的DNA样本PCR扩增后进行基因分型，包括 PCR产物的纯化、碱基延伸PCR及纯化、芯片点样；
统计分析，得出：rs3216733C/D基因型和rs391957C/T基因型显著增加弱精症易感性；单体型分析显示由rs3216733，rs17840761， rs17840762，rs391957构建的单体型C-G-G-T能显著增加弱精症发病风险。
所述标志物GRP78基因rs3216733和rs391957SNP与弱精症发生存在相关性，可下调其蛋白表达而增加弱精症发生风险。
进一步的，在Primer 3.0引物软件设计待测SNP位点的所需引物， rs3216733_rs17840761_rs17840762_rs391957四个位点共同正向引物：CCCCTCCGCAATAAACGTCACTG
rs3216733_rs17840761_rs17840762_rs391957四个位点共同反向引物：GCATCTAAGCTGCGACTGGTCTAC
rs3216733位点延伸引物：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
CAATGAATCAGCTGGGGGGG
rs17840761位点延伸引物：CCCTAGGGGGTCGGAGTAG
rs17840762位点延伸引物： TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGTGACCCC
CCGGGGCTG
rs391957位点延伸引物：TTTTTTTTTTAGGAAGGGAGAACAAGCAGT
AGAGAAG
本发明的另一目的在于：提供一种弱精子症辅助诊断的试剂或试剂盒，包括GRP78基因rs3216733和rs391957SNP。
本发明的有益效果为：本发明通过采用多重单碱基延伸技术分析 GRP78基因多个位点多态性与弱精症的相关性，得出GRP78基因 rs3216733和rs391957SNP与弱精症发生存在相关性，可下调其蛋白表达而增加弱精症发生风险，可用于制作辅助诊断弱精子症的试剂或试剂盒，从而用于诊断患者的弱精子症。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例所述病例和对照组血清GRP78水平的表达情况；
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
研究对象
本实验经右江民族医学院附属医院伦理委员会的批准，招募了 400例弱精子症患者及400例正常生育史的健康男性。将400例弱精子症患者作为病例组(即前向运动的精子(a和b级)小于32％，其他精液参数及生化指标正常)，其婚后均具有正常的性生活、未避孕情况下同居18个月及以上都不能生育，并且其配偶各项检查指标正常、无不孕病史。排除内分泌腺功能减退、Y染色体微缺失、核型异常、输精管阻塞、精索静脉曲张、隐睾、睾丸炎、附睾炎、生殖道感染史等引起不育的患者。对照组为同期正常生育史，无生殖道疾病及其他疾病史，精液参数正常的健康男性。所有研究对象签署知情同意书。
研究方法
精液质量的分析
研究对象均禁欲2-7天，手淫法将全部精液收集于洁净的取精杯中，放置37℃孵育30min。根据WHO《人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)标准进行精液常规分析(西班牙SCA全自动精液分析系统)，Diff-Quik快速染色进行镜下精子形态分析。
外周血DNA的提取收集受试者3ml静脉血于EDTAK2抗凝管，按照DNA提取试剂盒说明书(北京天根公司)提取基因组的DNA，保存于-20℃冰箱中备用。
GRP78基因分型运用多重单碱基延伸PCR(SNaPshot)方法对研究对象的GRP78基因rs3216733，rs17840761，rs17840762，rs391957 位点进行基因分型。在Primer 3.0引物软件(http://primer3.ut.ee/) 设计待测SNP位点的所需引物，合成于上海生工公司(见表1)。对所有DNA样本PCR扩增后进行基因分型，实验包括PCR产物的纯化、碱基延伸PCR及纯化、芯片点样等过程，由上海天昊遗传分析中心协助完成。
表1 GRP78基因4个位点的引物信息
具体实验操作步骤
DNA样本取1μl 1％agarose电泳对其样本进行质量检查以及浓度估计，然后根据估计的浓度将样本稀释到工作浓度5-10ng/μl.
多重PCR反应：
PCR引物
rs11247594F：CACATGTGGAACATGCAGGAAAG
rs11247594R：TCTCCAACTAGAAACTGGACATTTGT
rs12685F：CCTCCTCCCAGCTACCCCTTTA
rs12685R：TTTCACACCTCGATTAGAAAGAAAACAA
rs1295685F：CAACTGAGGCAGACAGCAGCTC
rs1295685R：GGACCCCAGTGAGGTAGCAGAA
rs1295687_rs2069744F：TTTGCCAACTGGATTTTGACCA
rs1295687_rs2069744R：TCTGATGGTGAGGGAACACTGC
rs20541F：AGCTTGCATGTCCGAGACACC
rs20541R：CCCGCCTACCCAAGACATTTTT
rs34502618F：TTCTCTTTTGGCCCTTCAACCT
rs34502618R：AGGCTCACCACCCAGCTCATAC
rs1140763F：gagtgccgggctggagtaca
rs1140763R：cgggtggatcacaaggtcaag
rs12009F：GGTGGTCCACGGTAGTGAGAGC
rs12009R：GGGCAGACCCTGAGCAGAATAC
rs16927997F：GCCCCTTGCCTGAGTAAAGATGTG
rs16927997R：GATACTCGTGTGTGGGGTGAGGG
rs3216733_rs17840761_rs17840762_rs391957F：
CCCCTCCGCAATAAACGTCACTG
rs3216733_rs17840761_rs17840762_rs391957R：
GCATCTAAGCTGCGACTGGTCTAC
rs430397F：AACACTTTCTGGACGGGCTTCA
rs430397R：GACTCGGGCCAAATTTGAAGAG
PCR条件
反应体系(10μl)包含1x GC-I buffer(Takara.),3.0mM Mg2+,0.3mM dNTP,1UHotStarTaq polymerase(Qiagen Inc.)，1μl样本DNA和1μl 多重PCR引物。
多重PCR引物中各对引物的浓度：(μM)
内容一：
内容二：
PCR循环程序
以下参照”ABI PRISM SNaPshot Multipelx Kit“Protocol
PCR产物纯化
在10μl PCR产物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37℃温浴 1小时,然后75℃灭活15分钟。
4)SNaPshot多重单碱基延伸反应
a)延伸引物：
rs1140763SR：TTTTGAGGCAGGAGAATCACTCGAACC
rs430397SR：TTTTTAGATAACAGACATCACAGTAACCAT
rs16927997SR：TTTTTTTTGGTATGTTGGGATAAGGAAACACTTC
rs12009SF：TTTTTTTTTTTTTACAGCACTGTAGGTCATCTTTAATGGCT
rs17840761SF：CCCTAGGGGGTCGGAGTAG
rs12685SR：TTTTTCGCACCAAGAGGGGCGAT
rs2069744SF：TTTTTTGCCTGGCCAACACCAGAGTGT
rs1295685SF：TTTTTTTTTTTTGGGGAAGACTGTGGCTGCT
rs20541SR：TTTTTTTATGATGCTTTCGAAGTTTCAGTTGAAC
rs391957SR：TTTTTTTTTTAGGAAGGGAGAACAAGCAGTAGAGAAG
rs17840762SR：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGTGACCCCCCGGGGCTG
rs11247594SF：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATTGACTGGTGGGCAGGG
rs34502618SR：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTCTGGGGTGGTTACTAACACCTG
rs1295687SR：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGGCAAGGAGCGGACTCTACTAA
rs3216733SR：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAATGAATCAGCTGGGGGGG
b)延伸反应
延伸反应体系(10μl)包括5μl SNaPshot Multiplex Kit(ABI),2μl纯化后多重PCR产物，1μl延伸引物混合物，2μl超纯水。
延伸引物混合物中各条延伸引物的浓度：(μM)
内容一：
rs17840762SR rs12685SR rs2069744SF rs17840761SF
2.4 1 1 1
rs1295685SF rs20541SR rs391957SR rs11247594SF
2.4 1 1 1.6
rs3216733SR rs1295687SR rs34502618SR rs34917480SF
2.4 1 1 0.4
内容二：
反应程序
5)延伸产物纯化
在10μl延伸产物中加入1U SAP酶，37℃温浴1小时,然后75℃灭活15分钟.
6)延伸产物上ABI3730XL测序仪
取0.5μl纯化后的延伸产物，与0.5μl Liz120SIZE STANDARD，9μl Hi-Di混匀，95℃变性5分钟后上ABI3730XL测序仪
7)ABI3730XL测序仪上收集的原始数据用GeneMapper 4.1 (AppliedBiosystemsCo.,Ltd.,USA)来分析,延伸产物的荧光标记及长度信息见本文件同目录下的“SNaPshotinformation.xls”文件。
统计分析
基因型、等位基因频率分布及哈迪-温伯格定律(Hardy-Weinberg) 的检测采用χ2检验。计量资料采用表示，用t检验计算变量差异。4个位点的单倍型分析运用SHEsis在线软件分析。所有数据均经 SPSS 17.0软件分析，以P<0.05为具有统计学意义。
研究对象的临床特征
所有对象经严格筛选分析，弱精子症组和对照组的年龄差异无统计学意义(P>0.05)，平均年龄分别为和岁。此外，两组的精液浓度、禁欲时间、精液量、精液PH值、精子形态及其各项性激素指标均在正常值范围之内，且差异均无统计学意义(P均>0.05，数据未展示) 根据WHO第五版标准分析，弱精子症组和对照组的前向运动精子、非前向运动精子、不动精子的差异均具有统计学意义(P均<0.001)。
400个弱精子症患者和400个对照组平均年龄为33.03±6.8年分别为32.29±6.5岁。AZS患者间无显著差异控制年龄，吸烟，饮酒，睡眠等等精液参数(精子形态、体积、浓度等数据未显示)。然而，AZS 患者精子活力明显低于正常组控制。
表2研究组和对照组的各特征参数
GRP78启动子多态性之间的基因型和等位基因频率弱精子症和对照组如表3所示。哈迪温伯格平衡(HWE)两组P值为>0.05。rs3216733的等位基因频率(也叫rs391957)两组间rs3216733C等位基因差异有统计学意义(P＝0.006)；rs391957T等位基因)在AZS患者中较常见(35.9％)。
表3弱精子症GRP78启动子多态性的基因型和等位基因频率
单核苷酸多态性,单核苷酸多态性；或者,比值比；CI置信区间。*按年龄、性别、吸烟及采用logistic回归模型分析饮酒与睡眠状况。
单体型GRP78启动子多态性分布如表4所示。主要的d-A-G-C单倍型在病例和对照中分别占46.1％和49.9％，分别。然后C-G-G-T单倍体与AZS风险增加有关(调整OR＝1.28,95％CI＝1.01-1.61,P＝0.039)
表4弱精子症和对照组GRP78启动子多态性的单倍型分布
进一步观察病例和对照组血清GRP78水平的表达情况(如图1)。 AZS患者血清中GRP78水平明显低于对照组在控制(P<0.001)。AZS 患者中位血清GRP78水平为0.479ng/ml0.661ng/ml的控制。此外，我们还发现rs3216733/rs391957多态性与AZS患者血清GRP78水平相关(图1B)。血清GRP78Cd/CC(也叫CT/TT)基因型水平明显低于dd(也叫CC)基因型(P<0.001)。然而，血清GRP78水平与rs17840761和 rs17840762(P>0.05，数据未显示)。
GRP78启动子多态性之间的基因型和等位基因频率，弱精子症和对照组。哈迪温伯格平衡(HWE)两组P值为>0.05。rs3216733的等位基因频率(也叫rs391957)两组间rs3216733C等位基因差异有统计学意义(P＝0.006)；(alsors391957T等位基因)在AZS患者中更常见(35.9％)。单体型GRP78启动子多态性分布如表4所示。主要的D-A-G-C单倍型在病例和对照中分别占46.1％和49.9％，分别。然后C-G-G-T单倍体与AZS风险增加有关(调整OR＝1.28,95％CI＝1.01-1.61,P＝0.039)
采用病例对照研究，纳入400例弱精症患者和400例健康对照人群，采用多重单碱基延伸技术分析GRP78基因多个位点：rs3216733， rs17840761，rs17840762，rs391957位点进行基因分析；得出rs3216733 C/D基因型和rs391957C/T基因型显著增加弱精症易感性；单体型分析显示由rs3216733，rs17840761，rs17840762，rs391957构建的单体型C-G-G-T能显著增加弱精症发病风险。
所述标志物GRP78基因rs3216733和rs391957SNP与弱精症发生存在相关性，可下调其蛋白表达而增加弱精症发生风险。
所述弱精子症相关的GRP78基因SNP标志物：GRP78基因 rs3216733和rs391957SNP用于制备弱精子症辅助诊断的试剂或试剂盒。
本发明通过采用多重单碱基延伸技术分析GRP78基因多个位点多态性与弱精症的相关性，得出GRP78基因rs3216733和rs391957 SNP与弱精症发生存在相关性，GRP78启动子区域的rs3216733和 rs391957可能改变转录活性，影响血清GRP78蛋白的差异表达，从而增加了精子机能减退的风险，GRP78基因rs3216733和rs391957 SNP可下调其蛋白表达而增加弱精症发生风险，可用于制作辅助诊断弱精子症的试剂或试剂盒，从而用于诊断患者的弱精子症。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (6)

1.一种弱精子症相关的GRP78基因SNP标志物，其特征在于：该标志物为：GRP78基因rs3216733和rs391957 SNP。
2.如权利要求1所述的弱精子症相关的GRP78基因SNP标志物的筛选方法，其特征在于：采用多重单碱基延伸技术分析GRP78基因多个位点：rs3216733，rs17840761，rs17840762，rs391957位点进行基因分析；
在Primer 3.0引物软件设计待测SNP位点的所需引物，并合成；
通过对外周血提取的DNA样本PCR扩增后进行基因分型，包括PCR产物的纯化、碱基延伸PCR及纯化、芯片点样；
进行统计分析得出标志物为：GRP78基因rs3216733和rs391957 SNP。
3.如权利要求2所述的弱精子症相关的GRP78基因SNP标志物的选方法，其特征在于：
rs3216733_rs17840761_rs17840762_rs391957四个位点共同正向引物：CCCCTCCGCAATAAACGTCACTG
rs3216733_rs17840761_rs17840762_rs391957四个位点共同反向引物：GCATCTAAGCTGCGACTGGTCTAC
rs3216733位点延伸引物：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAATGAATCAGCTGGGGGGG
rs17840761位点延伸引物：CCCTAGGGGGTCGGAGTAG
rs17840762位点延伸引物：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGTGACCCC
CCGGGGCTG
rs391957位点延伸引物：TTTTTTTTTTAGGAAGGGAGAACAAGCAGTAGAGAAG。
4.如权利要求1所述的弱精子症相关的GRP78基因SNP标志物，其特征在于：rs3216733C/D基因型和rs391957 C/T基因型显著增加弱精症易感性；可下调其蛋白表达而增加弱精症发生风险。
5.一种如权利要求1所述的弱精子症相关的GRP78基因SNP标志物在制备辅助诊断弱精子症的试剂或试剂盒中的应用。
6.如权利要求5所述的辅助诊断弱精子症的试剂或试剂盒，其特征在于：包括rs3216733 C/D基因型和rs391957 C/T基因型及引物。
CN201810976644.2A 2018-08-25 2018-08-25 弱精子症相关的grp78基因snp标志物及其应用 Pending CN108866183A (zh)

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