CN107723359B - 一种先天性白内障致病基因及其应用、检测引物、检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种先天性白内障致病基因及其应用、检测引物、检测试剂盒，属于遗传学技术领域。本发明的先天性白内障致病基因为变异的CRYBA4基因，其第4外显子的第277位碱基由T突变为C，该突变导致编码第93位丝氨酸的遗传密码子(TCC)变成脯氨酸的遗传密码子(CCC)。该变异基因可作为探针用于家族性先天性白内障的诊断，并可制备成基因芯片用于检测家族性先天性白内障的诊断。本发明的检测引物及检测试剂盒对于本发明中所述的家系中的先天性白内障的诊断准确。

Description

一种先天性白内障致病基因及其应用、检测引物、检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种先天性白内障致病基因及其应用、检测引物、检测试剂盒，属于遗传学技术领域。

背景技术

先天性白内障是在胚胎发育过程中多种因素导致的眼部晶状体先天性白内障是在胚胎发育过程中多种因素导致的眼部晶状体发育异常，表现为晶发育异常，表现为晶状体不同程度、形式的浑浊。约30％的先天性白内障是由单基因突变所致，其遗传方式包括常染色体，其遗传方式包括常染色体显性遗传、常染色体隐和X连锁隐性遗传等，以常染色体显性遗传最为见。

先天性白内障多在出生前后即已存在，或在儿童期内罹患，白内障其发生率在我国为0.05％。白内障能导致婴幼儿失明或弱视，失明儿童中有22％～30％为白内障所致，是一组严重的致盲疾病，严重影响儿童的视力发育，已成为儿童失明的第二位原因。可为单纯性白内障或伴发眼部及其他全身发育异常。

婴幼儿白内障主要症状为白瞳症。新生儿出生后瞳孔区有白色反射称为白瞳症，其中最常见的即是先天性白内障，不完全性白内障则常常以视力低下、斜视、眼球震颤等异常就诊。视功能检查，不同程度的视力下降，但应具备光照反应。晶体呈各种形态的混浊，有全白内障、核性白内障、绕核性白内障、前极后极白内障、花冠状白内障、缝性白内障、点状白内障等等。可继发斜视，眼球震颤。可并发眼部其他先天异常，如小眼球小角膜、无虹膜、永存增生原始玻璃体(PHPV)，视网膜脉络膜病变等。

先天性白内障大约有1/3的病例有遗传因素，最常见的为常染色体显性遗传，有的表现为不规则的隔代遗传；隐性遗传多与近亲婚配有关。对先天性白内障致病基因的突变检测是了解其发病的分子机制的重要步骤。

发明内容

本发明的目的是提供一种先天性白内障致病基因。

本发明还提供了上述先天性白内障致病基因的应用。

本发明还提供了检测上述先天性白内障致病基因的检测引物及检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种先天性白内障致病基因，其第4外显子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。与人类正常的CRYBA4基因相比，其第4外显子的第277位碱基由T突变为C(即SEQ ID NO.1中第119位)。该突变导致编码第93位丝氨酸的遗传密码子(TCC)变成脯氨酸的遗传密码子(CCC)，即发生了Ser93Pro突变。

人类CRYBA4基因的gDNAGene Bank登录号为NC_000022，cDNA的Gene Bank登录号为NM_001886，所对应的蛋白质的Gene Bank登录号为NP_001877。CRYBA4基因位于22q12.1，编码序列全长591bp，由6个外显子组成，该基因编码由196个氨基酸组成的beta betabeta-crystallin A4蛋白。构成哺乳动物眼晶状体的三类主要球蛋白包括α晶状体球蛋白(40％)、β晶状体球蛋白(35％)和γ晶状体球蛋白(25％)，CRYBA4基因是β晶状体球蛋白之一。β晶状体球蛋白能与其他β晶状体球蛋白聚集而成不同大小能够自我关联的二聚体或异二聚体。

本发明中的CRYBA4基因c.277T>C(p.Ser93Pro)变异导致其编码蛋白beta-crystallin A4的第93位氨基酸由属于极性不带电脂肪族氨基酸链状丝氨酸(Ser)突变为属于非极性杂环亚氨基酸的环状脯氨酸(Pro)。第93位氨基酸位于一个小的β折叠和一个小的β转角之间(如图4所示，该蛋白和自身形成同源二聚体结构，图中的两个圆圈是第93位氨基酸)，此氨基酸替代很可能损害了晶状体球蛋白的内部稳定性，进而影响该蛋白质结构和眼晶状体的透明性。

上述的先天性白内障致病基因在制备诊断或检测先天性白内障试剂中的应用。具体的可用于制备先天性白内障疾病基因诊断芯片，本领域技术人员以该核苷酸为基因探针，根据基因杂交的原理，可以检测生物样本中是否存在与该探针序列互补的核苷酸序列。因此使用这种方法也可以检测出样本中是否存在着本发明的基因突变位点。

检测上述先天性白内障致病基因的检测引物，本领域技术人员可以依据SEQ IDNO.1及其上下游的序列，根据聚合酶链扩增反应的要求，设计出检测引物，以扩增出包含其第4外显子的第277位核苷酸的片段。

包含上述检测引物的检测试剂盒，还包括dNTPs、PCR反应缓冲液、DNA聚合酶中的一种或几种。dNTPs为2mM的dNTPs。

检测上述先天性白内障致病基因的检测引物，

正向引物序列为：GCAGGGTGAGGGGGACGCTTAC(SEQ ID NO.2所示)；

反向引物序列为：TTTGATTCCGAAGTGCCCACATG(SEQ ID NO.3所示)。

该检测引物容易扩增出该段片段，扩增的阳性率达到99％。

包含上述检测引物的检测试剂盒，还包括dNTPs、反应缓冲液、DNA聚合酶中的一种或几种。dNTPs为2mM的dNTPs。

上述试剂盒用于先天性白内障致病基因的扩增，该试剂盒的检测体系为：总体积24μL；ddH₂O 7μL，100mM KCL 4μL，3mM MgCl₂ 2μL，20mM Tris-HCL 2μL，500uM dNTP 4μL，20uM引物2μL，0.1U Taq酶1μL，DNA模板2μL。该试剂盒其采用普通PCR进行扩增，反应程序为：94℃预变性4分钟，然后进入第一个循环，94℃变性30秒，58℃退火复性30秒，72℃延伸30秒，共进行32个循环，72℃延伸7分钟，4℃保存。

所述DNA模板为使用QIAGEN公司QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒抽提血液样品基因组DNA得到。

得到包含CRYBA4基因第4外显子的第277位核苷酸的PCR扩增产物后，可采用测序的方法获得该片段的实际序列，并根据序列判断DNA模板的主体是否发生该突变，进而判断是否发生先天性白内障疾病。还可以采用其他方法测定该基因是否发生突变，如质谱检测法。

本发明的变异的人类CRYBA4基因中，其第4外显子的第277位碱基由T突变为C。该突变导致编码第93位丝氨酸的遗传密码子(TCC)变成脯氨酸的遗传密码子(CCC)。该变异基因可作为探针用于家族性先天性白内障的诊断，并可制备成基因芯片用于检测家族性先天性白内障的诊断。本发明的检测引物及检测试剂盒对于本发明中所述的家系中的先天性白内障的诊断准确。对于其他患者进行诊断时，如果结果是发生了该突变，则判断为是先天性白内障患者；如果结果是未发生本发明中的突变，则并不能排除其因其他基因突变患白内障的可能性。

附图说明

图1为先天性白内障家系的系谱图；

图2为CRYBA4基因新突变位点的测序分析结果；

图3为实施例2中胎儿产前诊断结果图；

图4为晶状体球蛋白beta A4的模型结构图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。以下实施例中的基因组DNA提取试剂盒QIAamp DNA Blood Mini Kit购于QIAGEN公司；PCR检测试剂盒购自Qiagen,Hilden,Germany。

实施例1

1)CRYBA4突变基因的发现

来本院就诊的一个先天性白内障家系(遗传图谱如图1所示：箭头为先证者)，该家系无近亲婚配。先证者，女四岁，为先天性白内障患者，自出生双眼发病，晶状体核呈白色浑浊，眼科诊断为中央核性白内障。先证者母亲，三十岁与先证者罹患同样疾病。在签署知情意书后，于2016年6月收集该家系2例患者(Ⅱa、Ⅲa)和3名表型正常者(Ⅰa、Ⅰb、Ⅱb)的外周血标本，使用EDTA抗凝采血管集静脉4mL。家系成员经调查走访或做全身检查以排除其它疾病和系统异常。对家系成员进行了详细的眼科检查，包括视力、裂隙灯显微镜、散瞳后的眼底检查。所有患者经裂隙灯显微镜拍照。所有参加调查和被采集血样的家系成员都了解本研究的目的意义并签署了知情同意书。

通过Ion PGM测序平台，DNA测序发现先证者(Ⅲa)CRYBA4基因存在c.277T>Cc.277T>C(p.Ser93Pro)杂合突变，导致CRYBA4编码蛋白beta-crystallin A4的第93位氨基酸由丝氨酸突变为脯氨酸。丝氨酸为极性不带电脂肪族氨基酸，脯氨基酸为非极性杂环亚氨基酸。本家系另外一例患者(Ⅱa)测序结果显示携带同样的CRYBA4基因c.277T>C(p.Ser93Pro)杂合突变，而三例表型正常的亲属(Ⅰa、Ⅰb、Ⅱb)未携带此杂合突变，测序结果如图2所示，*号为突变为点。

另收集本院22例全外显子组测序的无白内障表型的受试者和ADNI项目(Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative，阿尔兹海默病神经影像学倡议)公共数据资源809例全基因组测序的无关表型受试者数据作为对照人群数据(本发明所用作为对照的公共数据通过ADNI项目审核并获取权限，本研究所用院患者项目审核并获取权限，本研究所用院患者数据经郑州大学第一附属医院医学伦理委员会批准)。在本科室22例全外显子组测序无关表型受试者中未发现该突变。来自ADNI项目公共数据809例无关表型受试者中亦未发现该突变。

由此说明，本发明的突变位点并非是罕见的SNP位点；同时也确定了CRYBA4基因第277位碱基的T>C点突变是该家系的致病基因突变。从而发现了本发明中的变异的人类CRYBA4基因，其第4外显子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2)上述的变异的人类CRYBA4基因，可作为探针，作为诊断或检测先天性白内障试剂用于检测先天性白内障。

上述变异的人类CRYBA4基因还可以制备成基因芯片，用于检测先天性白内障。

本发明还提供了一种检测来源于人体的生物样本中是否存在上述突变的方法，其步骤包括：

(1)从所述样本(外周血、胎儿绒毛或胎儿羊水等)中提取和纯化DNA材料；

(2)使步骤(1)获得的DNA材料与所述的变异的人类CRYBA4基因核苷酸进行接触；

(3)观察经过步骤(2)，所述DNA材料与所述核苷酸是否存在基于序列特异性的杂交结合。

实施例2

为了验证本发明的效果，本院于2017年4月收集先证者母亲的12孕周胎儿绒毛组织标本，通过绒毛膜穿刺术获取。

本实施例中先天性白内障致病基因的检测引物：

正向引物序列为：GCAGGGTGAGGGGGACGCTTAC；

反向引物序列为：TTTGATTCCGAAGTGCCCACATG。

采用自动DNA合成仪合成，稀释为20μmol/L。

本实施例中先天性白内障致病基因的检测试剂盒，包括：500uM dNTP、PCR反应缓冲液，DNA聚合酶，PCR扩增引物对和双蒸水。

本实施例中检测先天性白内障致病基因的方法，包括以下步骤：

1)使用QIAGEN公司QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒抽提绒毛组织样本基因组DNA；

2)对样本DNA目标片段进行PCR体外扩增；PCR扩增体系为：总体积24μL；ddH₂O 7μL，100mM KCL 4μL，3mM MgCl₂ 2μL，20mM Tris-HCL 2μL，500uM dNTP 4μL，20uM引物2μL，0.1U Taq酶1μL，DNA模板2μL；PCR反应在ABI 9700PCR仪上进行，PCR反应程序为94℃预变性4分钟，然后进入第一个循环，94℃变性30秒，58℃退火复性30秒，72℃延伸30秒，共进行32个循环，72℃延伸7分钟，4℃保存；

3)对PCR产物电泳检测：PCR反应结束后，取2μl反应产物加入2μl的2×LoadingBuffer，4000rpm离心30秒，上样于1％的琼脂糖凝胶中，100V电压下电泳20min，凝胶摄像仪拍摄检测；片段大小约为259bp；

4)对PCR产物进行纯化：PCR产物中残余的引物和dNTP对于后续的测序反应会产生不良影响，我们采用SAP(北极虾碱性磷酸酶)降解残余dNTP，Exo(核酸外切酶)降解残余引物；将SAP和Exo两种酶和10×缓冲液预先混合后保存，每微升混合液中含SAP和EXO各0.5单位，对于每个纯化反应，取PCR产物1.5-2μl加入SAP酶1.5μl；

反应程序为：SAP/Ex在37℃处理PCR产物40分钟，接着85℃持续20分钟灭活，然后4℃保温；

5)测序反应需要在纯化后的PCR产物中加入测序引物和BDT(BigDyeTerminator3.1，Applied Biosystems)。由于目的是筛选致病基因的突变，所以我们进行了正反向引物的双向测序；测序反应体系为5μl，包含纯化后的PCR产物，测序引物3.2pmol以及BDT0.5μl，剩下体积用ddH₂O补齐；测序反应程序为：96℃1分钟(一个循环)；96℃10秒，50℃5秒，60℃4分钟(25个循环)；4℃保持；

测序反应结束后，需要对测序产物再次纯化(测序后纯化)，以除去测序反应带来的小分子物质，避免其对测序的干扰；纯化步骤如下：(1)测序反应的96孔板中每孔加25μl醋酸钠—乙醇溶液(3M醋酸钠+100％乙醇，体积比为1：25)；4℃,4000rpm离心45分钟；倒置，600rpm离心1分钟甩干；(2)再加入50μl70％乙醇溶液；4℃,4000rpm离心10分钟；倒置600rpm离心1分钟甩干；重复一次；(3)室温静置约半小时让其自然干燥；

6)对PCR产物进行测序：在测序以前先要使DNA样品变性，变性的方法是在纯化后的样品中加入10μl HiDi(去离子甲酰胺)，在PCR仪上95℃保持5分钟使之完全变性，变性后即刻放入冰中至少2分钟防止其复性；接着上样至BI 3130xl序仪/分型仪(AppliedBiosystems)进行测序，序列结果如SEQ ID NO.4所示。

测序分析结果显示该胎儿(Ⅲb)携带此杂合突变(测序结果如图3所示)。结合该突变位点的致病性分析和本家系表型分布，判断胎儿(Ⅲb)为CRYBA4基因c.277T>C(p.Ser93Pro)杂合变异而导致的先天性白内障患者。2017年6月该孕妇(孕20周)在我院超声科行影像学产前检查复查，超声结果显示胎儿双侧眼球大小正常，晶状体中央出现强回声。胎儿的双侧瞳孔区晶状体呈白色混浊。报告证实该胎儿为先天性白内障患者。

<110> 郑州大学第一附属医院

<120> 一种先天性白内障致病基因及其应用、检测引物、检测试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 142

<212> DNA

<213> 序列

<221> 变异人类CRYBA4基因核苷酸序列

<400> 1

gtgggtgggc tttgagcatg ctggcttcca agggcagcag tacattctgg aacgaggcga 60

atatccaagc tgggatgcct ggggcggcaa cacggcctac cccgccgaga ggctcacccc 120

cttccggcct gcggcctgtg ct 142

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 正向检测引物

<400> 2

gcagggtgag ggggacgctt ac 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 反向检测引物

<400> 3

tttgattccg aagtgcccac atg 23

<211> 259

<212> DNA

<213> 序列

<221> PCR扩增片段

<400> 4

gcagggtgag ggggacgctt acctcctgca cactctaccc tctgtctgca ggtgggtggg 60

ctttgagcat gctggcttcc aagggcagca gtacattctg gaacgaggcg aatatccaag 120

ctgggatgcc tggggcggca acacggccta ccccgccgag aggctcaccc ccttccggcc 180

tgcggcctgt gctgtaagtt ctaccactgc tgcatcccgg ggaggcccaa gcccctcatg 240

tgggcacttc ggaatcaaa 259

Claims (3)

1.一种先天性白内障相关基因，其特征在于：该基因为变异的人类CRYBA4基因，其第4外显子核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示，5’端起第119位碱基由T突变为C。

2.如权利要求1所述的先天性白内障相关基因在制备诊断或检测先天性白内障试剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：依据变异的人类CRYBA4基因设计检测引物，该基因第4外显子的第277位碱基为C，所述检测引物的扩增片段包含该基因第4外显子的第277位核苷酸；

正向引物序列为：GCAGGGTGAGGGGGACGCTTAC；

反向引物序列为：TTTGATTCCGAAGTGCCCACATG。

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