CN113528652B - 与畸形精子症相关的aurkc基因snp位点及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与畸形精子症相关的AURKC基因SNP位点及其应用，属于生物技术领域。本发明提供用于检测AURKC基因rs56255892、rs758097、rs758099位点的试剂在制备畸形精子症辅助诊断试剂盒中的应用，证明了rs758097位点的AA和GA/AA基因型及A等位基因、rs758099位点的CC基因型及C等位基因会增加畸形精子症的发病风险，且单倍型为G‑G‑T的个体罹患畸形精子症的概率较高。本发明将有助于进一步研究我国男性畸形精子症的发病机制，并且为辅助诊断和预警畸形精子症提供了工具。

Description

与畸形精子症相关的AURKC基因SNP位点及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种与畸形精子症相关的AURKC基因SNP位点及其应用。
背景技术
近年来，多国流行病学实验数据提示人类的生育力普遍降低，特别是男性生育力下降明显，单纯男方因素导致不育超过1/3。男性畸形精子症指正常形态精子百分率低于4％。精子形态正常才能保证精子各项功能都正常，精子形态出现异常也会导致相应的功能受到影响，进而降低精子活力，与卵子结合的概率下降，导致出现不育症。任何内环境的改变以及生理结构的损伤都可能导致精子形态异常，从而影响男性生育能力，其中基因异常最为多见，是导致畸形精子症的主要原因。
极光激酶(Aurora)对于细胞生成具有重要作用，可以对整个周期进行调节，影响其中的进程，它由三种类型构成，分别为Aurora A、Aurora B、Aurora C。其中Aurora C参与调节减数分裂过程中染色体的排布和纺锤体的形成，参与精子生成与成熟，对人类中整倍体精子的形成至关重要。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)是人类可遗传变异中最常见的一种，由单个核苷酸变异，如转换、颠换等引发的DNA序列变化，从而产生遗传的多态性，可以用于表现个体和群体之间的遗传差异。但现有研究对我国男性畸形精子症的研究中未见AURKC基因SNPs相关的报道，因此，AURKC基因SNPs多态性分析对于畸形精子症的辅助诊断及预警具有重要价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种与畸形精子症相关的AURKC基因SNP位点及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，分析AURKC基因SNPs突变与畸形精子症的关系，提供其在制备辅助诊断畸形精子症的试剂盒中的应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了用于检测AURKC基因rs56255892、rs758097、rs758099位点的试剂在制备畸形精子症辅助诊断试剂盒中的应用。
优选的，AURKC基因rs758097位点在人群中存在G和A两种等位基因，携带A等位基因的个体罹患畸形精子症的风险高于G等位基因；rs758099位点在人群中存在C和T两种等位基因，携带C等位基因的个体罹患畸形精子症的风险高于T等位基因。
优选的，rs56255892、rs758097、rs758099位点单倍型为G-G-T的个体罹患畸形精子症的风险高于其他单倍型。
本发明还提供一种检测AURKC基因rs56255892、rs758097、rs758099位点的试剂盒，所述试剂盒中包括如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.9所示的引物。
本发明还提供一种检测AURKC基因rs56255892、rs758097、rs758099位点的PCR方法，包括以下步骤：
1)利用SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示的引物组进行多重PCR；
2)多重PCR产物纯化；
3)纯化后的多重PCR产物进行SNaPshot多重单碱基延伸反应，延伸产物纯化后测序。
优选的，步骤1)中，PCR的反应程序为：95℃2分钟；94℃20秒，65℃40秒，72℃1分钟，共11次循环；之后94℃20秒，59℃30秒，72℃1分钟，共24次循环；72℃，2分钟。
优选的，步骤3)中，多重单碱基延伸反应程序为：96℃1分钟；96℃20秒，55℃5秒，60℃延伸30秒，共循环28次。
本发明公开了以下技术效果：
本发明采用病例-对照研究的方法，采用多重单碱基延伸PCR基因分型技术对AURKC基因多态性位点进行了检测，用酶联免疫法检测了畸形组和对照组血浆和精浆AURKC蛋白水平，并运用统计软件多项Logistic和非参数秩和检验分析位点多态性与畸形精子症的相关性及蛋白表达情况。证明了AURKC基因rs758097位点的AA和GA/AA基因型及A等位基因、rs758099位点的CC基因型及C等位基因会增加畸形精子症的发病风险，AURKC基因通过降低精浆中AURKC蛋白水平而导致精子畸形率增高，rs56255892、rs758097、rs758099位点单倍型为G-G-T的个体罹患畸形精子症的概率较高。本发明将有助于进一步研究我国男性畸形精子症的发病机制，并且为辅助诊断和预警畸形精子症提供了工具。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为一些异常形态精子略图；
图2为ELISA检测AURKC精浆蛋白水平图；
图3为rs56255892基因测序图；图中①、②、③分别代表rs56255892的GG、GA、AA基因型；
图4为rs758097基因测序图；图中①、②、③分别代表rs758097的AA、GA、GG基因型；
图5为rs758099基因测序图；图中①、②、③分别代表rs758099的TT、TC、CC基因型；
图6为AURKC基因rs56255892、rs758097、rs758099位点连锁不平衡分析图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所使用方法如无特殊说明均为本领域常规实验方法，所采用材料及试剂如无特殊说明，均可由商业途径获得。
实施例1
1、研究对象
1.1实验对象
选取2019年6月至2019年11月在右江民族医学院附属医院生殖中心就诊的不育男性患者为研究对象，根据正常形态精子百分率进行分组，正常形态精子百分率超过或等于4％为对照组，正常形态精子百分率小于4％为畸形精子症组(病例组)。本研究经院伦理委员会批准，已签署知情同意书。
1.2患者入选及排除标准
畸形组：所有入选者夫妻双方共同生活，性生活正常，时间超过12个月。所有人都在未经避孕措施的情况下无法孕育。其精液质量分析正常，但正常形态精子百分率低于4％的患者。排除已明确导致精子畸形的疾病，如生殖器感染、损伤、化学药物等。
对照组：入选者经精液相关检查，正常形态精子百分率超过或等于4％的患者，其精液质量分析正常、身体健康、无遗传性疾病、生殖道疾病等。
排除精液凝集、不完整等。
1.3样本含量确定
运用Quanto软件对样本含量进行估计，设统计效能为80％，结合位点的风险值、最小等位基因频率及纳入排除标准，确定病例组200例，对照组200例。其中畸形精子症组年龄20～55岁，对照组年龄20～55岁。
2、实验方法
2.1 AURKC基因位点信息
如表1所示，其中MAF(1000g-CHBS)表示位点千人基因组计划中中国北京汉族人群最小等位基因频率。
表1 AURKC基因3个SNPs的基本信息
Figure BDA0003249626930000061
2.2精子形态学检查
将固定好的精液涂片浸染在苏木素染液中10分钟。染色完成后将涂片取出，用水对其反复冲洗，直到多余染料去除。准备75％乙醇溶液，将冲洗好的涂片浸入其中，同时进行计时，2分钟后取出。滴去多余乙醇后放入混合好的磷钨酸染液、黄色伊红染液和亮绿染液混合液体，3分钟后取出，水洗，自然干燥。准备显微镜，对上述涂片进行观察，确定精子形态状况，计算正常形态精子百分率并记录。正常形态精子判断标准及一些异常形态精子如表2和图1。
表2正常精子判断标准
Figure BDA0003249626930000071
2.3全血标本、血浆及精浆的采集及储存
准备EDTA-K2抗凝管。所有研究对象入组后，给于静脉穿刺，采集静脉血3ml，注入上述抗凝管当中。准备2管1.5ml EP管，将所抽全血标本分装其中，冷冻保存，放入-70℃冰箱之中，用于后续DNA的提取。采集研究对象当天精液标本1ml，4000rpm10分钟，离心，吸取上层精浆至1.5ml EP管中-70℃冰箱保存待用于Elisa实验。
2.4基因组DNA的提取及保存
(1)将500uLWB裂解液LB加入1.5mL离心管内；
(2)吸取100μL抗凝全血样本加入离心管，剧烈涡旋20秒；
(3)短暂离心，向离心管加入100μLWB沉淀液PB，剧烈涡旋20秒。
(4)对上述液体进行离心处理，12000rpm 5分钟。
(5)转移离心管内的上清液至套进WB收集管的WB离心柱的凹缝下方，再次进行离心，转速与之前相同，时间改为30秒。
(6)取下WB收集管，弃掉滤液。把WB离心柱重新套进WB收集管，加入500uL WB洗涤液W1至WB离心柱的凹缝下方，离心机转速与时间设置不变，离心；
(7)取下WB收集管，弃掉滤液。把WB离心柱再次套进WB收集管，加入500uL WB洗涤液W2至WB离心柱的凹缝下方，离心机设置与之前相同，进行离心处理。
(8)重复步骤(7)一次；
(9)离心完成后，将WB收集管，再次将滤液倒掉。收集管备用。准备WB离心柱，套入管中，再次离心，转速相同，时间为2分钟。
(10)取出WB离心柱。准备1.5ml干净的离心管，套入，在膜中心加入100μLWB洗脱液EB(10mM Tris-HCl，pH8.5)，静置，用时一分钟，室温下进行即可。计时完成后进行离心处理，转速与之前相同，共需要一分钟。
(11)将WB离心柱取出，底部为DNA溶液，进行冷冻处理，-70℃保存，此为DNA模板。
2.5多重PCR反应
取1μl DNA样本，用1％琼脂糖电泳评估其浓度后，对其进行稀释处理，要求浓度为5-10ng/μl，用于后续实验。PCR引物序列如下所示。
rs56255892引物序列：
上游引物(SEQ ID NO.1)：5'-CCTGAATCGGACGTGACCTTGA-3'；
下游引物(SEQ ID NO.2)：5'-AGCCCGTGACCCTAAACCACT-3'。
rs758097引物序列：
上游引物(SEQ ID NO.3)：5'-GAACAGCCATCCAGAGGGTTCA-3'；
下游引物(SEQ ID NO.4)：5'-GGAGAGGGAGGGGAGATGTCAA-3'。
rs758099引物序列：
上游引物(SEQ ID NO.5)：5'-GGAAAGCGGCAGAGGAAGGATA-3'；
下游引物(SEQ ID NO.6)：5'-TGAGCCGAGCCAGGTACACATT-3'。
PCR反应条件为：反应体系总体积(10μl)：首先准备1x GC-I buffer(Takara.)，将Mg2+加入其中，后者要求为3.0mM；再加入dNTP，后者要求为0.3mM；再加入1U HotStarTaqpolymerase(Qiagen Inc.)，再加入同等量的样本DNA和多重PCR引物，二者皆为1μl。
PCR反应循环程序如下，首先为预变性，95℃2分钟。之后再经历变性、退火和延伸三个步骤：94℃变性20秒，65℃退火40秒，72℃延伸1分钟，完成一个循环。一共完成11次循环。之后再调整温度和时间进行变性、退火和延伸几个环节：94℃变性20秒，59℃退火30秒，72℃延伸1分钟，完成一个循环。一共完成24次循环。最后在经历延伸过程，温度为72℃，用时2分钟；4℃保存。
2.6 PCR产物纯化
用Exonuclease I酶2U和SAP酶5U，对10μl PCR产物进行纯化处理，完成后进行温浴，37℃下，共计时60分钟，时间到后进行灭活处理，75℃15分钟。
2.7 SNaPshot多重单碱基延伸反应
延伸反应体系体积(10μl)，其中包括4个部分，首先为延伸引物混合物和超纯水，分别为1μl和2μl。其次为纯化后多重PCR产物，二者分别为5μl和2μl。最后为SNaPshotMultiplex Kit(ABI)，5μl。延伸引物序列如下所示：
rs56255892延伸引物(SEQ ID NO.7)：5'-TTTTTTTTTTTCCCGTGACCCTAAACCACTT-3'；
rs758097延伸引物(SEQ ID NO.8)：5'-TTTTCCCAGTCCCCAGCCTTCCC-3'；
rs758099延伸引物(SEQ ID NO.9)：5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGGAGGGAAAGTCAGGGAT-3'。
PCR反应循环程序为：96℃1分钟；(96℃20秒，55℃5秒，60℃延伸30秒)循环28次；4℃保存。
2.8延伸产物纯化
将1U SAP酶加入到上述延伸产物当中进行纯化处理，完成后进行温浴，37℃下，共计时60分钟，时间到后进行灭活处理，75℃15分钟。
2.9延伸产物测序
首先准备Liz120 SIZE STANDARD，共需要0.5μl，将Hi-Di混合液加入其中，后者用量为9μl。取纯化后的延伸产物，加入到上述混和合物当中，用量为0.5μl。将所有物质进行充分混合，使其均匀，进行变性处理，需要在95℃条件下完成，计时5分钟，时间到后上ABI3730XL测序仪进行电泳测序，将得到的数据引入Gene Mapper 4.1当中来分析。
2.10 ELISA检测精浆中AURKC蛋白水平
准备酶标版，设置标准品孔和样本孔。取不同浓度标准品，将其加入到标准品控当中，各需要50μL；设空白孔，除空白对照孔外，其他按照步骤加入样品和酶标试剂，设置待测样品孔。首先取样品稀释液，将其加入到酶标包被板上待测样品孔中，用量为40μl。准备待测样品，同样加入到上述孔当中，用量为10μl。两种液体混合，药品被稀释，最终达到最初的5倍。将样品加入酶标板孔底部，尽量避开孔壁，加入后轻轻摇动酶标板，使内部的液体能够混合均匀。准备酶标试剂，分别加入孔中，各需要100μl。空白孔不加。取封板膜，用其封板，完成后温育，37℃60分钟。将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍后备用。将封板膜去除，这一过程应小心进行，然后将各孔中的液体到处，进行甩干处理。准备洗涤液，加入到各孔当中，加满后静置，计时30秒，时间到后弃去。这一过程反复进行，共需要5次，处理完成后拍干。准备显色剂A，分别加入到各孔当中，每孔需要50μl。再将显色剂B加入其中，用量相同。对其进行震荡，使液体能够混合均匀，这一过程应轻轻进行，显色过程要避光，37℃、15分钟。上述过程完成后终止反应。取终止液，将其加入到每个孔当中，用量为50μl，此时蓝色发生变化，迅速变成黄色，反应完成。使用DNM-9602酶标分析仪测定。
2.11统计学分析
SPSS 22.0软件，均数±标准差表示计量资料，AURKC基因突变对畸形精子症的相对风险度使用多项Logistic统计分析，非参数秩和检验分析血浆、精浆中AURKC蛋白水平差异。Hardy-Weinberg平衡定律检验基因位点遗传平衡。α＝0.05，双侧检验。
3、结果
3.1一般临床资料分析
畸形精子症组和对照组两组间的年龄、吸烟、饮酒及睡眠差异没有统计学意义(P>0.05)，如表3所示。
表3研究对象一般资料比较
Figure BDA0003249626930000121
3.2畸形精子症组和对照组AURKC精浆蛋白水平分析
Elisa结果显示，畸形精子症患者精浆中AURKC蛋白的浓度(27.48±10.41ng/ml)显着低于对照组(34.12±15.02ng/mL，P＜0.05)。如图2。
3.3 AURKC基因rs56255892、rs758097、rs758099位点基因分型结果
ABI3730XL电泳仪检测AURKC基因SNPs分型结果显示rs56255892和rs758097位点存在AA、AG、GG基因型和A、G等位基因，PCR扩增产物长度分别为83bp、213bp；rs758099位点存在TT、TC、CC基因型和T、C等位基因，PCR扩增产物长度为198bp。畸形精子症组和对照组的三个位点基因型经哈迪温伯格平衡定律检验，P值均大于0.05，提示这两组研究对象群体基因遗传平衡，具有群体代表性。基因测序可以证实我们的SNP基因分型结果，如图3-图5所示。
3.4 AURKC基因多态性与畸形精子症的关联性
畸形精子症组和对照组之间AURKC多态性的基因型和等位基因频率分布如表4所示。rs56255892位点多态性的GG、GA、AA基因型和G、A等位基因的频率在对照组中分别为75.0％、22.5％、2.5％和86.25％、13.75％，畸形精子症组分别为76.0％、23.0％、1.0％和87.5％和12.5％；rs758097位点多态性的GG、GA、AA基因型和G、A等位基因的频率在对照组中分别为41.5％、47.5％、11.0％和65.25％、34.75％，畸形精子症组分别为53.0％、41.0％、6.0％和87.5％、26.5％；rs758099多态性的TT、CT、CC基因型和T、C等位基因的频率在对照组中分别为42.5％、46.5％、11.0％和65.75％、34.25％，而畸形精子症组分别为51.0％、43.0％、6.0％和72.5％、27.5％。
经多项logistic回归分析，(1)在rs758097位点中，AA和GA/AA基因型与畸形精子症发病风险相关(AA vs.GG：OR＝2.341，95％CI＝1.095-5.005；P＝0.028；GA/AA vs.GG：OR＝1.590，95％CI＝1.071-2.360；P＝0.022)；与G等位基因相比，A等位基因与畸形精子症风险存在显著相关性(OR＝1.383，95％CI＝1.017-1.881，P＝0.039)，两组间基因型频率无统计学意义(P>0.05)。(2)在rs758099位点中，CC基因型与畸形精子症发病风险相关(CCvs.TT：OR＝2.200，95％CI＝1.029-4.704；P＝0.042)；与T等位基因相比，C等位基因与畸形精子症风险存在显著相关性(OR＝1.400，95％CI＝1.035-1.893，P＝0.029)。(3)rs56255892位点的基因型和等位基因频率在两组间差异都无统计学意义(P>0.05)。
表4畸形精子症组与对照组AURKC基因多态性的基因型和等位基因频率比较
Figure BDA0003249626930000131
Figure BDA0003249626930000141
注：OR：odds ratio；95％CI：95％可信区间；P Value：P值
3.5 AURKC基因多态性单倍型分析
3.5.1 AURKC基因rs56255892、rs758097、rs758099位点连锁不平衡分析
使用在线软件SHEsis对rs56255892、rs758097、rs758099位点进行连锁不平衡(Linkage disequilibrium，LD)分析。结果显示rs56255892和rs758097位点D'＝0.983，r2＝0.331；rs56255892和rs758099位点D'＝1.000，r2＝0.338；rs758097和rs758099位点D'＝0.988，r2＝0.965，说明这3个SNP两两之间存在强连锁不平衡，如图6。
3.5.2 AURKC基因rs56255892、rs758097、rs758099位点单倍型分析
根据SHEsis软件结果，在畸形精子症组和对照组间的3个位点构建出3种主要的单倍型，其中G-G-T、A-A-C、G-A-C单倍型在畸形精子症组中的分布频率为0.725％、0.122％、0.143％，在对照组中的分布频率为0.652％、0.137％、0.205％。此外，与对照组相比，携带G-G-T单倍型的畸形精子症患者可能增加了畸形精子症的发病风险(G-G-T：OR＝1.436；95％CI＝1.060-1.946；P<0.05)；与对照组相比，携带G-A-C单倍型的畸形精子症患者可能降低了畸形精子症的发病风险(G-A-C：OR＝0.648；95％CI＝0.447-0939，P<0.05)，见表5。
表5单倍型在畸形精子症组和对照组中的分布
Figure BDA0003249626930000151
注：OR：odds ratio；95％CI：95％可信区间；P Value：P值。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 右江民族医学院附属医院
<120> 与畸形精子症相关的AURKC基因SNP位点及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctgaatcgg acgtgacctt ga 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcccgtgac cctaaaccac t 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaacagccat ccagagggtt ca 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggagagggag gggagatgtc aa 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggaaagcggc agaggaagga ta 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgagccgagc caggtacaca tt 22
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tttttttttt tcccgtgacc ctaaaccact t 31
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttttcccagt ccccagcctt ccc 23
<210> 9
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttcggaggg aaagtcaggg 60
at 62

Claims (3)

1.用于检测AURKC基因rs56255892、rs758097、rs758099位点的试剂在制备畸形精子症辅助诊断试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的用于检测AURKC基因rs56255892、rs758097、rs758099位点的试剂在制备畸形精子症辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于，rs56255892、rs758097、rs758099位点单倍型为G-G-T的个体罹患畸形精子症的风险高于其他单倍型。
3.一种检测AURKC基因rs56255892、rs758097、rs758099位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.9所示的引物。
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