CN107917980B - 鉴定榆树树龄的生物标志物、获取方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鉴定榆树树龄的生物标志物、获取方法及其应用，属于树木年龄检测领域，所述生物标志物包括山奈酚、异野漆树苷、表没食子儿茶素、槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯和矢车菊异牡荆黄素。所述生物标志物是通过高效液相色谱结合飞行时间质谱测定5年和10年树龄榆树中化合物的离子信号强度并进一步分析后获得的。利用生物标志物鉴定榆树树龄时，只需测定出待测榆树中生物标志物的离子信号强度，再与对应的预测阈值比较即可鉴定出树龄。本发明是首次披露用于鉴定榆树树龄的生物标志物，通过生物标志物鉴定榆树树龄，方法方便、准确度高，损失少、误差小，适于推广和普及。

Description

鉴定榆树树龄的生物标志物、获取方法及其应用
技术领域
本发明属于树木年龄检测领域，具体地，涉及鉴定榆树树龄的生物标志物、获取方法及其应用。
背景技术
榆树具有众多方面的作用，目前可以供家具、车辆、农具、器具、桥梁、建筑等用。榆树树皮内含淀粉及粘性物，磨成粉称榆皮面，掺合面粉中可食用，并为作醋原料；枝皮纤维坚韧，可代麻制绳索、麻袋或作人造棉与造纸原料；幼嫩翅果与面粉混拌可蒸食，老果含油25％，可供医药和轻、化工业用；叶可作饲料；嫩果(俗称“榆钱”)可食。树皮、叶及翅果均可药用，能安神、利小便。榆树是抗有毒气体(二氧化碳及氯气)较强的树种，植物体含β-固淄醇、植物醇、豆淄醇等多种淄醇类及鞣质，树胶，脂肪油。以果实(榆钱)、树皮、叶、根入药，其中，榆钱，春季未出叶前，采摘未成熟的翅果，去杂质晒干；树皮，剥下树皮晒干，或夏秋剥下树皮，去粗皮、晒干或鲜用；叶，夏秋采摘，晒干或鲜用；根皮秋季采收。另外，榆树树干通直，树形高大，绿荫较浓，适应性强，生长快，是城市绿化、行道树、庭荫树、工厂绿化、营造防护林的重要树种。在干瘠、严寒之地常呈灌木状，有用作绿篱者。又因其老茎残根萌芽力强，可自野外掘取制作盆景。在林业上也是营造防风林、水土保持林和盐碱地造林的主要树种之一。因此，榆树是一种食用、药用、加工及栽培价值均十分显著的树种。
目前市面上对于不同年份的榆树需求很大，对于榆木年龄的鉴定也非常重要。特别地，10年以上的榆树价格是非常昂贵的，经常被不良商家利用5年左右的榆木来冒充，因此，对于榆树年龄的判断就显得尤为重要。而传统的树木年龄测算技术手段落后，建立在伐倒木查树年龄、生长锥转进或在树干上打眼等手工作业的基础上，周期长、破坏性大，效率低，效果不佳，远远不能够适应对森林资源和生态环境的检测需求。利用电子仪器鉴定尚无很大突破，运用CT扫描、力学勘探或C-14测定等现代工具或技术进行某些指标的精准测量，但是问题还远远没有解决到令人满意的程度，如CT扫描利用射线，对树木生长发育会产生影响，而且设备贵，测定成本高。
目前市面上还没有一种非常好的鉴定和判别榆树年龄的方法，也没有可以用于鉴定的生物标志物。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的之一是提供一种可以用于鉴定榆树树龄的生物标志物；本发明的目的之二是利用高效液相色谱结合飞行时间质谱，提供一种鉴定榆树树龄的生物标志物的获取方法；本发明的目的之三是提供一种鉴定榆树树龄的生物标志物在鉴定榆树树龄中的应用。
鉴定榆树树龄的生物标志物，包括山奈酚、异野漆树苷、表没食子儿茶素、槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯和矢车菊异牡荆黄素。
本发明还提供一种上述鉴定榆树树龄的生物标志物的获取方法，该方法如下：采用高效液相色谱结合飞行时间质谱，结合分析软件分别鉴定5年榆树和10年榆树中化合物的种类和离子信号强度平均值，通过差异性分析初步筛选出5年榆树和10年榆树中相同化合物的离子信号强度平均值之间具有显著性差异的初筛化合物；在初筛化合物中进一步筛选5年榆树和10年榆树中初筛化合物的离子信号平均强度均>10000的化合物，同时去掉组件差异CV>3的化合物，得次筛化合物；分别绘制次筛化合物的ROC曲线，选择出敏感性、特异性和AUC均小于1的化合物，即获得生物标志物。
本发明另外还保护一种上述鉴定榆树树龄的生物标志物在鉴定榆树树龄中的应用，即利用所述生物标志物鉴定榆树树龄，其通过以下步骤来实现：
步骤一、在距离地面高度1m处，取榆树冠幅外侧的叶片样品；向叶片样品中加入提取液，研磨至匀浆，漩涡震荡至少30s，超声10min；然后4℃离心，取上清液，将其过滤除菌，得样品液；
步骤二、采用高效液相色谱结合飞行时间质谱对样品液进行测定，采集数据分别获取6种生物标志物的离子信号强度，将生物标志物的离子信号强度与对应的预测阈值对比，当6种生物标志物的离子信号强度均超过其对应的预测阈值时，该榆树被认定为10年树龄。
进一步的，所述提取液为分析纯甲醇，其中含有体积分数为0.1％的甲酸。
更进一步的，每0.1g叶片样品中加入1mL的提取液。
进一步的，所述生物标志物的预测阈值为提取的10年树龄榆树中对应生物标志物的离子信号强度的平均值。
本发明的有益效果：
1、本发明利用高效液相色谱结合飞行时间质谱，通过设定特定的参数指标和数据分析，鉴定出一批化合物；通过与5年、10年树龄榆树3个批次pool的平均值的差异性分析，进行进一步筛选化合物；最后通过限定平均信号强度、选择合适的组间差异范围和ROC曲线判断等多重指标的梯度筛选，获得能够准确判断出榆树区段树龄的生物标志物，通过上述方法本发明首次寻找到可以用于鉴定榆树树龄的生物标志物，以获得的生物标志物的测定离子强度为预测阈值进行榆树树龄判定，准确率可达100％。
2、本发明所述鉴定方法是首次利用高效液相色谱结合飞行时间质谱，得到样品中生物标志物的离子强度，以及未来的使用区间。进行树龄判定时，以采集的榆树叶片进行测定，对树木的损害较小，最大程度的执行了“非损失”，不破坏树形的要求，而且方法简单、灵敏度高；测定时人为操作步骤少，可减少人为误差；对获得的生物标志物进行测定，能准确判定出10年以上树龄的榆树，具有较大的市场加价值，适于推广和普及。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的解释说明。
本发明所述生物标志物的获取方法以及利用该获取的生物标志物鉴定榆树年龄的方法如下：
1、代谢物的提取
样品选择：样品分别选择5年和10年的榆树叶片。叶片选取位置：距离地面高度1米，冠幅外侧的叶片。
提取方法：将定量的榆树叶片样品置于试管中，每0.1g榆树叶片样品加入1mL的提取液(甲醇+0.1％甲酸)，研磨至匀浆，在漩涡仪上振荡30s以上，超声10min，然后在10000rpm下4度离心10min，取上清液，过0.22um的有机相微孔滤膜，转入至进样品中，保存在-20℃冰箱中待测。
2、液相方法
色谱柱：BEH C18(Waters)，1.7μm,2.1x 50mm
流动相：A，H2O+0.1％甲酸；B，乙腈+0.1％甲酸
进样体积：2μL
柱温：30度
样品温度：10度
洗脱梯度：
Figure BDA0001467861310000031
Figure BDA0001467861310000041
3、质谱方法
使用高分辨质谱Xevo G2-S QTof进行检测，采用TOF MSe分辨率模式采集数据，每隔0.2s扫描一次，主要参数如下：
离子源：电离喷雾源(ESI)
毛细管电压：3.0KV
锥孔电压：30.0V
碰撞能：15-45V
源温度：120.0度
脱溶剂温度：500度
锥孔气流速度：50L/H
脱溶剂气流速度：800L/H
采集分子量范围：50-1200Da
4、数据采集和处理
使用Waters公司的MassLynx4.1采集和处理数据，采集后的数据(每个样品大约1G)使用Progenesis QI进行分析，主要有数据导入、峰对齐、归一化、峰提取、去卷积、定量和统计分析。数据库采用HMDB数据库进行自动搜索和人工判断。
其中，所用仪器和软件如下：
1.冷冻离心机：型号D3024R，Scilogex公司；
2.漩涡振荡器：型号MX-S，Scilogex公司，美国；
3.高分辨质谱仪：ESI-QTOF/MS；型号：Xevo G2-S Q-TOF；厂家：Waters,Manchester,UK；
4.超高效液相色谱：UPLC；型号：ACQUITY UPLC I-Class系统；厂家：Waters,Manchester,UK；
5.数据采集软件：MassLynx4.1；厂家：Waters；
6.分析鉴定软件：Progenesis QI；厂家：Waters；
7.中文出报告软件：UNIFI；厂家：Waters。
利用上述高效液相色谱结合飞行时间质谱的方法，一共鉴定到1574个化合物，以及5年榆树叶片对应的化合物的鉴定强度(3个重复)，10年榆树叶片对应的化合物的鉴定强度(3个重复)；计算出5年榆树叶片化合物的平均强度，10年榆树叶片化合物的平均强度；最后进行T-test检验。其中，所述3个重复为3个批次的pool。
通过T-test检验，我们发现5年和10年有显著性差异(0.01<P≤0.05)的化合物有409个。因为在实际应用中，一般信号强度大于10000的化合物扮演着更重要的作用，因此从这413个化合物中，筛选出平均信号强度>10000的化合物，同时去掉组间差异大的化合物(CV>0.3，SD/MEAN)，获得8个化合物，分别为：Kaempferol 3-[glucosyl-(1->3)-rhamnosyl-(1->6)-galactoside]山奈酚(R1)、Isorhoifolin异野漆树苷(R2)、(-)-Epigallocatechin表没食子儿茶素(R3)、Quercetin 3-(2G-rhamnosylgentiobioside)槲皮素(R4)、Sucrose蔗糖(R5)、Epigallocatechin gallate表没食子儿茶素没食子酸酯(R6)、Isovitexin 2”-O-arabinoside矢车菊异牡荆黄素(R7)和Isovitexin 2”-O-glucoside葡萄糖苷异牡荆黄素(R8)，将R1-R8作为特异鉴定榆树年龄的化合物，结果如下表1所示。
表1：5年和10年树龄榆树中R1-R8化合物的离子信号强度表
代谢物 M-5 M-10 T-TEST CV-5 CV-10
山奈酚(R1) 53000.79 66518.29 0.0208 0.0797 0.0928
异野漆树苷(R2) 11421.15 14560.29 0.0239 0.1069 0.1003
表没食子儿茶素(R3) 43301.77 56032.31 0.0259 0.1237 0.1063
槲皮素(R4) 57624.34 70837.08 0.0312 0.1086 0.0899
蔗糖(R5) 20935.33 29429.82 0.0321 0.1881 0.1443
表没食子儿茶素没食子酸酯(R6) 101277.7 124863.8 0.0361 0.1242 0.0885
矢车菊异牡荆黄素(R7) 11969.54 14477.18 0.0367 0.1127 0.0811
葡萄糖苷异牡荆黄素(R8) 12714.12 15372.61 0.0426 0.1213 0.0832
对R1-R8，进行ROC曲线绘制。通过ROC曲线判断，除了R5和R8，敏感性(sensitivity)，特异性(specificity)，AUC(area under curve)都不到1，其他都适合作为判定标准。所以，以代谢物R1、R2、R3、R4、R6和R7的10年平均值的并集为判定；即对于待测定的榆树样本，只有这6个指标的值，都超过预测阈值(10年平均值)，才能被认定为10年龄树，否则为5年龄区段树。所述6个指标(即为生物标志物)及其预测阈值如下表2所示。
表2：生物标志物及其预测阈值
Figure BDA0001467861310000061
实施例
随机选择10棵5年龄段榆树和10棵10年龄段榆树，按照上述方法提取生物标志物，计算对应生物标志物的平均强度，根据判定方法进行判定，结果如下表3所示。其中，预测结果以是否为10年龄段的榆树为标准。
表3：利用本发明方法鉴定榆树年龄的结果表
Figure BDA0001467861310000062
Figure BDA0001467861310000071
由上表3可知，通过对R1、R2、R3、R4、R6和R7共6种生物标志物10年平均值的并集为判定方式的准确率为100％。因此，通过高效液相色谱结合飞行时间质谱测定：Kaempferol3-[glucosyl-(1->3)-rhamnosyl-(1->6)-galactoside]山奈酚、Isorhoifolin异野漆树苷、(-)-Epigallocatechin表没食子儿茶素、Quercetin 3-(2G-rhamnosylgentiobioside)槲皮素、Epigallocatechin gallate表没食子儿茶素没食子酸酯和Isovitexin 2”-O-arabinoside矢车菊异牡荆黄素这些生物标志物的质谱离子强度，对比相应生物标志物的预测阈值，可以用来判定10年龄榆树，准确率高。
值得一提的事，本发明利用生物标志物判定榆树的5年树龄和10年树龄是出于市场的需要，因为市场上5年和10年的榆树价格相差很大，但是这些年限之间的树苗又很难简单的肉眼区分，所以存在巨大的潜在市场价值。
需要说明的是，上述实施例仅为说明性的，并不以此限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为主，但以本发明精神为基础的、任何的进一步延伸或改进，均属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.鉴定榆树树龄的生物标志物，其特征在于：包括山奈酚、异野漆树苷、表没食子儿茶素、槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯和矢车菊异牡荆黄素。
2.如权利要求1所述的鉴定榆树树龄的生物标志物在鉴定榆树树龄中的应用，其特征在于：所述应用为利用生物标志物鉴定榆树树龄，其通过以下步骤来实现：
步骤一、在距离地面高度1m处，取榆树冠幅外侧的叶片样品；向叶片样品中加入提取液，研磨至匀浆，漩涡震荡至少30s，超声10min；然后4ºC离心，取上清液，将其过滤除菌，得样品液；
步骤二、采用高效液相色谱结合飞行时间质谱对样品液进行测定，采集数据分别获取权利要求1中的6种生物标志物的离子信号强度，将获取的生物标志物的离子信号强度与对应的预测阈值对比，当6种生物标志物的离子信号强度均超过其对应的预测阈值时，该榆树被认定为10年树龄段。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述提取液为分析纯甲醇，其中含有体积分数为0.1%的甲酸。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：每0.1g叶片样品中加入1mL的提取液。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述生物标志物的预测阈值为提取的10年树龄榆树中对应生物标志物的离子信号强度的平均值。
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