CN112881562A - 葡糖醛酸作为慢性肾脏病早期诊断标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了葡糖醛酸作为慢性肾脏病早期诊断标志物的应用，同时公开了检测所述的代谢组合物的方法。本发明运用LC‑MS技术，检测CKD1‑4期患者的血浆样本，从代谢组学水平分析不同CKD分期患者血浆葡糖醛酸差异表达，为疾病的早期诊断、早期干预以及延缓肾脏疾病的进展提供更多手段。可简化临床诊断过程，实现早发现、早诊断、早治疗的二级预防；亦可通过葡糖醛酸的分析揭示其发病机制，从而为治疗靶点的发现提供新的思路。

Description

葡糖醛酸作为慢性肾脏病早期诊断标志物的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及葡糖醛酸作为慢性肾脏病早期诊断标志物的应用。

背景技术

目前临床上常用的肾脏功能及肾损伤的诊断方法仍以实验室检查、影像学检查及肾组织活检为主，其中，尿检、eGFR、肾组织活检是最常用的手段。eGFR主要反映肾小球清除代谢产物的功能，但Scr影响因素众多，且多于肾小球滤过功能减退至正常的50%时才开始升高，并不能反映早期肾损伤情况；而肾组织活检作为一项有创性检查，难以轻易被无任何临床不适症状的患者接受，并且行肾组织活检时，不同的医生取材部位亦不同，可能导致不同的结果，影响临床医生对疾病的诊断及治疗方案的选择。这些问题的存在迫切要求人们寻找到更加准确，实用性更强和更便捷的可以早期评估肾功能的生物标志物。

代谢组学作为一门新兴学科，已逐渐成为国内外研究的中心热点。其主要研究的是机体代谢产物及相应代谢途径，通过定性或定量分析组织或体液中小分子代谢产物的变化，进而发现与变化最具有相关性的机体异常代谢途径，更深入地理解疾病发生发展过程中的病理生理机制，并寻找疾病特征性的生物标志物。代谢组学分析代谢产物常用的技术包括核磁共振(NMR)技术、质谱(MS)技术、色谱-质谱联用技术，以及多种分析平台的联用。通过分析一系列样本的谱图，结合模式识别，判断生物体的病理生理状态，从而有可能找出与之相关的生物标志物，为相关疾病提供一个预警信号。

运用代谢组学技术并进而分析其可能的发病机制，因而近年来在医学领域的研究方兴未艾，不仅集中于心血管疾病、肿瘤和糖尿病等疾病领域，肾脏领域的相关报道日益增多，尤其在慢性肾脏病或慢性肾功能衰竭的生理、病理变化方面，如运用液相色谱-质谱（LC-MS）技术对慢性肾功能衰竭的大鼠尿液进行分析时发现12种代谢物数量增多，其中包括氨基酸代谢异常及磷脂代谢通路异常；基于LC-MS技术的高尿酸性肾损伤早期诊断标志物及其应用；发现尿素磷酸盐、吲哚丙烯酸、色氨酸、琥珀酸单薄荷酯、磷脂酰胆碱等早期标志物。越来越多的研究表明代谢组学在CKD早期诊断、早期防治等方面具有独特的优势，有助于临床检测CKD的发生，及时预防和治疗。

葡糖醛酸系磷酸戊糖途径代谢产物，磷酸戊糖途径是葡萄糖氧化分解的方式之一，为生物合成提供还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，被认为是机体潜在的自我保护机制，对延缓CKD肾功能进展有一定作用。

发明内容

为了实现上述目的，本发明提供了一种葡糖醛酸作为慢性肾脏病早期诊断标志物的应用。

本发明采用以下方法实现：采集47例CKD1-4期患者和30健康志愿者的血浆样本，对样本进行质量控制。建立稳定的LC-MS分析平台。运用多元统计方法绘制正负离子下PCA及OPLS-DA得分图，鉴定不同分期间患者葡糖醛酸变化趋势，采用ROC曲线评价其灵敏度和特异性，运用MetPA数据库分析相关代谢通路，解析差异代谢物的生物学意义。

本发明公开了葡糖醛酸在制备慢性肾脏病早期诊断试剂的应用。

进一步的，所述的代谢物组合来自于血浆。

本发明还公开了一种检测本发明所述的葡糖醛酸的方法，所述的检测方法为LC-MS方法；

色谱条件：流动相：正离子0.1%甲酸水A-0.1%甲酸乙腈B；负离子5mM甲酸胺水C-乙腈D；洗脱程序：0 min ~1 min，2%B/D；1min~9 min，（2%~50%）B/D；9min~14 min，（50%~98%）B/D；14min~15 min，98%B/D；15min~15.5 min，98%~2%B/D；15.5min~17 min，2%B/D；

质谱条件：正离子喷雾电压为3.80 kV，负离子喷雾电压为2.50 kV，鞘气45arb，辅助气15arb；毛细管温度325℃，以分辨率70000进行全扫描，扫描范围81~1000，采用HCD进行二级裂解，碰撞电压为30eV，动态排除去除无必要的MS/MS信息。

有益效果：本发明提供了葡糖醛酸作为慢性肾脏病早期诊断标志物的应用，本发明运用LC-MS技术，检测CKD1-4期患者的血浆样本，从代谢组学水平分析不同CKD分期患者葡糖醛酸的差异表达，为疾病的早期诊断、早期干预以及延缓肾脏疾病的进展提供更多手段。

本发明通过非侵入性手段检测CKD患者葡糖醛酸变化趋势，可简化临床诊断过程，实现早发现、早诊断、早治疗的二级预防。

附图说明

图1 为血浆BPC图。

图2 为对照组与实验组正负离子模式下OPLS-DA得分图。

图3 为受试者于不同时期的ROC曲线图。

图4 为CKD早期葡糖醛酸的变化趋势图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

一、实验材料和方法

1.1 研究对象及样本采集、处理

纳入苏州大学附属第一医院肾内科住院CKD1-4期非透析患者47例，诊断及分期标准参照KDIGO慢性肾脏病诊断标准。对照组选取同期本院体检中心体检的健康成年人30例（18-79岁），收集所有患者及健康对照组临床基本资料。考虑到实验分组的因素，CKD3期以上患者细胞代谢可能与CKD1-2期患者不同。故将CKD1-2期合并为CKD前期组，CKD3-4期合并为CKD后期组，进一步行混合编组的再次数据分析及鉴定。

所有受试者采血前1天避免饮用浓茶和酒，避免过度运动。（1）生化指标：入院次日清晨抽取空腹静脉血3mL于一次性真空试管中，采用AU2700全自动生化分析仪（日本OLYMPUS）自动分析，按照既定标准流程检测。（2）血常规：入院次日清晨抽取空腹静脉血2mL置于EDTA管，充分混匀后采用血液分析仪LH750（美国BECKMAN）自动分析，按照既定标准流程检测。

样本前处理：入院次日清晨采集空腹静脉血3mL置于EDTA管。样本室温下静置20min，离心10 min（3000r /min，4 ℃）。取上清液500μL至2mL冻存管中，-80℃冰箱冻存待测。

4℃条件融化样本，取800 µL 甲醇（沃凯公司）与200 µL样品于离心管混匀振荡60 s，离心10 min（12000 r /min，4℃），取全部上清液至新的 1.5 mL离心管, 真空条件下干燥浓缩后加入300µL 80%甲醇复溶残渣，使用 0.22 µm 膜过滤上清液，获得待测样本。

1.2 建立稳定LC-MS代谢组学全谱分析平台

色谱条件：采用 Thermo Ultimate 3000液相色谱仪（美国 Thermo），使用ACQUITYUPLC® HSS T3 1.8 µm（2.1mm×150 mm）色谱柱，流动相：正离子0.1%甲酸水（德国 Merck）（A）-0.1%甲酸乙腈（美国 Thermo）（B）；负离子5mM甲酸胺水（美国 Sigma）（C）-乙腈（D）。洗脱程序：0 min ~1 min，2%B/D；1min~9 min，（2%~50%）B/D；9min~14 min，（50%~98%）B/D；14min~15 min，98%B/D；15min~15.5 min，98%~2%B/D；15.5min~17 min，2%B/D。

质谱条件：Thermo Q Exactive Focus质谱仪（美国 Thermo）进行LC-MS分析，电喷雾离子源（ESI)，正负离子电离模式。正离子喷雾电压为3.80 kV，负离子喷雾电压为2.50kV，鞘气45arb，辅助气15arb。毛细管温度325℃，以分辨率70000进行全扫描，扫描范围81~1000，采用HCD进行二级裂解，碰撞电压为30eV，动态排除去除无必要的MS/MS信息。

1.3 质量控制：由每个待测样本中各取20µL混合得到质控样本，以校正混合样品分析结果的偏差及由于分析仪器自身原因所造成的失误。

二、实验结果

2.1 数据处理

采集一级质谱数据，获得实验组和对照组样本基峰色谱图。通过Proteowizard软件（v3.0.8789）将获得的原始数据转换成mzXML格式。利用R（v3.3.2）XCMS程序包进行峰识别，峰过滤，峰对齐，主要参数：bw=5，ppm=15，peakwidth=c(10,20)，mzwid=0.015，

mzdiff=0.01，method=centWave。获得包含质核比和保留时间及峰面积等信息的数据矩阵。对数据峰面积的批次进行归一化处理，从而可使不同量级的数据进行对比。质控样本变异系数（RSD）＜30%的特征峰比例达到70%左右说明数据良好。正负离子模式下，两种CKD分组方法中，血浆BPC图如图1所示，图1a为正离子模式对照组与CKD1-4期患者血浆BPC图，图1b为负离子模式对照组与CKD1-4期患者血浆BPC图，图1c为正离子模式对照组与CKD前后期组患者血浆BPC图，图1d为负离子模式对照组与CKD前后期患者血浆BPC图。各组色谱峰个数多，峰形对称，各峰分离度较好，表明实验过程中分离效果良好。

对导出获得数据行正交-偏最小二乘判别分析(Orthogonal Partial LeastSquares Discriminant Analysis,OPLS-DA），绘制对照组与实验组正负离子模式下OPLS-DA得分图。如图2所示，图1a为正离子模式对照组与CKD1-4期患者血浆OPLS-DA图，图1b为负离子模式对照组与CKD1-4期患者血浆OPLS-DA图，图1c为正离子模式对照组与CKD前后期组患者血浆OPLS-DA图，图1d为负离子模式对照组与CKD前后期患者血浆OPLS-DA图。正负离子模式下，血浆样本分布均基本位于95%置信区间内，且各组分布区域明显分离，表明各组代谢物差异明显。

选择变量重要性投影（VIP）（VIP值≥1.0，P<0.05）作为组别间差异代谢物的筛选标准。两组CKD分组方法下，葡糖醛酸VIP值分别为2.762，1.780（均P<0.05），符合筛选标准。

首先确认显著差异代谢物的精确分子量（分子量误差<20ppm），后根据MS/MS模式所得碎片信息于Human Metabolome Database(HMDB)，massbank,LipidMaps等数据库中匹配获得代谢物。

采用R(v3.2.1)的pROC程序包进行绘画得到受试者曲线（ROC），采用ROC下面积（AUC值）评价筛选潜在的生物标志物，AUC值0.5-1时，表明有预测价值。如图3所示，对照组与CKD1期(图3 a)，CKD1期/CKD2期(图3 b)，CKD2期/CKD3期(图3 c)，CKD3期/CKD4期(图3d)，对照组与CKD前期(图3 e)，CKD前期/CKD后期(图3 f)AUC值均大于0.5。表示对CKD的发生及进展具有一定的敏感性和特异性。

研究发现，在CKD早期即有葡糖醛酸显著升高，其变化趋势图如图4（a,b），具体为：CKD2期较对照组显著升高，CKD后期较前期显著升高，且随CKD分期增加呈逐渐升高趋势。葡糖醛酸可能与CKD的进展相关。葡糖醛酸可作为CKD早期诊断及进展新的生物标志物。

Claims (3)

1.葡糖醛酸在制备慢性肾脏病早期诊断试剂的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的代谢物组合来自于血浆。

3.一种检测权利要求1中所述的葡糖醛酸的方法，其特征在于，所述的检测方法为LC-MS方法；

色谱条件：流动相：正离子0.1%甲酸水A-0.1%甲酸乙腈B；负离子5mM甲酸胺水C-乙腈D；洗脱程序：0 min ~1 min，2%B/D；1min~9 min，（2%~50%）B/D；9min~14 min，（50%~98%）B/D；14min~15 min，98%B/D；15min~15.5 min，98%~2%B/D；15.5min~17 min，2%B/D；

质谱条件：正离子喷雾电压为3.80 kV，负离子喷雾电压为2.50 kV，鞘气45arb，辅助气15arb；毛细管温度325℃，以分辨率70000进行全扫描，扫描范围81~1000，采用HCD进行二级裂解，碰撞电压为30eV，动态排除去除无必要的MS/MS信息。

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