EP0510075A1 - Recepteur humain de la tsh. sequence codant pour ce recepteur - Google Patents

Recepteur humain de la tsh. sequence codant pour ce recepteur

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EP0510075A1
EP0510075A1 EP91902982A EP91902982A EP0510075A1 EP 0510075 A1 EP0510075 A1 EP 0510075A1 EP 91902982 A EP91902982 A EP 91902982A EP 91902982 A EP91902982 A EP 91902982A EP 0510075 A1 EP0510075 A1 EP 0510075A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sequence
protein
nucleic acid
receptor
amino acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP91902982A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Edwin Milgrom
Micheline Misrahi
Hugues Loosfelt
Michel Atger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Publication of EP0510075A1 publication Critical patent/EP0510075A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors

Definitions

  • the present invention relates to the human TSH receptor and the nucleic acid encoding this receptor.
  • the TSH receptor is the thyroid stimulating hormone (TSH) receptor. This receptor is involved in many diseases of the thyroid and in particular in autoimmune diseases such as Graves' disease, or other disorders of the functioning of the thyroid.
  • TSH thyroid stimulating hormone
  • the inventors have now cloned and isolated the nucleotide sequence (nucleic acid) coding for the TSH receptor. They also located the gene encoding this receptor.
  • the invention therefore relates to a nucleic acid encoding the human TSH receptor or a part of this receptor.
  • the invention also relates to the protein having receptor properties, encoded by the above nucleic acid. It also relates to recombinant vectors comprising, as an exogenous sequence, the nucleic acid coding for the human TSH receptor. It also relates to hosts transformed cells capable of expressing the human TSH receptor.
  • the invention also provides means for the diagnosis or the control, or even the treatment of certain thyroid diseases such as for example Graves' disease, these means consisting notably in the production of the receptor by expression in a prokaryotic cellular system or in a system eukaryotic cell, in order to detect and possibly measure the antibodies directed against this receptor existing in various thyroid diseases, in particular Graves' disease, in nucleotide probes for the detection of genetic abnormalities of the TSH receptor gene, or for detection of receptor abnormalities in the case of certain cancers; these means also consist of antibodies directed against the human TSH receptor, these antibodies possibly being able to be modified to acquire toxicity.
  • Other means targeted by the invention are peptides capable of binding to antibodies directed against the human receptor for
  • TSH antibodies which are formed during certain thyroid diseases, and in particular Graves' disease and thus prevent natural antibodies from attaching to the receptor and activating or inhibiting it.
  • this variant or this fragment codes for a protein or a polypeptide having the structural properties and / or the functional properties and / or the antigenic properties of the human receptor of the TSH.
  • the encoded protein or polypeptide contains the sites contained in the amino acid sequence deduced from the nucleic acid of sequence I, and the presence of which is necessary so that, when this fragment is exposed on the surface of a cell, it is capable of behaving like the human TSH receptor (of binding TSH, of participating in the activation of adenylate cyclase, or of another transduction system):
  • the encoded protein or polypeptide is capable of being recognized by antibodies which recognize either the amino acid sequence II given below or which recognize a secreted, circulating form of the human TSH receptor;
  • the encoded protein or polypeptide is capable of generating antibodies which recognize the amino acid sequence II below and form with these antibodies a complex of the antibody-antigen type.
  • nucleic acid according to the invention is carried by a gene located on the human chromosome 14 in position q31.
  • the nucleic acid according to the invention is particularly advantageous insofar as it is characteristic of the human TSH receptor. Indeed, in the hypothesis of the use of this nucleic acid or of its expression products in diagnostic and, possibly therapeutic, applications in humans, it is important to have genetic material compatible with the use in humans, whether for diagnostic, pharmacological or therapeutic purposes.
  • the nucleic acid of the invention is advantageously the nucleic acid coding for a mature protein corresponding to the human TSH receptor, this mature protein being characterized in that the signal peptide has been released.
  • the invention also relates to the nucleic acid fragments corresponding to the following sequences:
  • nucleotide sequence coding for the amino acid sequence between the amino acid in position 661 and the amino acid in position 743.
  • variant or part of this protein has the structural or functional or antigenic properties of sequence II, or these combined properties.
  • the invention also relates to a protein characterized in that it responds to all or part of the amino acid sequence II given above, since the protein thus formed has structural and / or functional and / or antigenic properties of the human TSH receptor, or these combined properties.
  • this protein corresponds to the human TSH receptor.
  • the protein of the invention can on the contrary, according to another embodiment of the invention, be devoid of the binding site of the human TSH receptor.
  • the invention relates in particular to the protein corresponding to the human TSH receptor, this protein being devoid of the signal peptide.
  • the invention therefore relates both to the human TSH receptor protein or to polypeptide or peptide fragments of this protein, in glycosylated form or not.
  • the peptide fragments are advantageously obtained by chemical synthesis according to conventional methods or optionally by cleavage of the protein with appropriate enzymes.
  • peptides can advantageously be chosen within the most hydrophilic regions of the protein corresponding to the human TSH receptor.
  • Particularly interesting polypeptides are the polypeptides constituted by the amino acid sequences between positions 19 and 243, 246 and 526, 604 and 764.
  • Other advantageous polypeptides or peptides are those which contain the above sequences or which are included in the above sequences as soon as they retain the antigenic properties of these sequences.
  • peptides can for example be used to produce polyclonal or monoclonal antibodies by the conventional methods of production of monoclonal antibodies.
  • the invention also relates to recombinant vectors characterized in that they comprise, as exogenous nucleic acid, one of the nucleic acids defined above, inserted at a site which is not essential for the replication of the vector.
  • Preferred vectors are: the vector pUR292 modified for example by a recombinant nucleic acid comprising the ⁇ -galactosidase gene and a nucleotide fragment coding for one of the amino acid sequences 19-243, 246-526 and 604 -764,
  • These recombinant vectors are preferably vectors for the expression and cloning of exogenous nucleic acid.
  • Preferred recombinant vectors are for example plasmids, phages, cosmids, viral derivatives such as for example Baculovirus.
  • Recombinant vectors which are particularly advantageous for carrying out the invention are those in which the exogenous nucleic acid is placed under the control of regulatory elements allowing its expression in a determined cell host.
  • regulatory elements are chosen for their ability to be recognized by the enzyme system of the chosen cell host.
  • nucleic acid sequence of the invention and its derivatives, in particular any recombinant vector can be used in prokaryotic cell systems such as bacteria, in particular E. coli, eukaryotic cell systems, in particular yeasts, cells animal, for example insect cells, especially Drosophila cells or mammalian cells.
  • prokaryotic cell systems such as bacteria, in particular E. coli, eukaryotic cell systems, in particular yeasts, cells animal, for example insect cells, especially Drosophila cells or mammalian cells.
  • Mammalian cells of interest are, for example, CHO cells.
  • the invention also relates to a cell host characterized in that it is transformed by a vector chosen from the vectors described above, under conditions such that it allows the expression of the exogenous nucleic acid inserted into the vector.
  • the preferred cellular hosts for carrying out the invention are systems prokaryotes, in particular bacteria such as E. coli, eukaryotic systems, in particular yeasts, or even insect cells, in particular those of Drosophila, or animal cells in particular of mammalian cells, such as CHO cells.
  • a particularly preferred cellular host consists of drosphile cells transformed by a vector of the baculovirus type, itself modified by a nucleic acid of the invention.
  • the cellular host which is chosen to express the human TSH receptor can also be a host capable of expressing the human TSH receptor in its native conformation or a part of this receptor.
  • the TSH receptor thus produced or a part of this receptor is therefore in a three-dimensional conformation similar to that which it presents in situ.
  • the cellular host is characterized in that the human TSH receptor which it makes it possible to express has undergone the post-translational modifications naturally carried out in situ.
  • the invention also relates to the TSH receptor or a fragment of this receptor, as expressed by a cellular host, transformed by a recombinant vector described in the preceding pages.
  • the invention also relates to polyclonal or monoclonal antibodies characterized in that they have the capacity to specifically recognize the human TSH receptor according to the definitions given above.
  • Monoclonal antibodies can be obtained by conventional methods, in particular by operating according to the following steps:
  • Advantageous antibodies are antibodies directed against the extracellular domain of the human TSH receptor.
  • These antibodies can also be obtained from hybridomas resulting from the fusion of mouse spleen cells, previously immunized with peptides derived from the human TSH receptor, optionally coupled to a macromolecule, these cells being fused with myeloma cells.
  • the peptides used can be peptides derived from the TSH receptor, or even peptides obtained by chemical synthesis according to conventional methods.
  • monoclonal antibodies according to the invention are obtained from hybridomas resulting from the fusion of myeloma cells with spleen cells of animals (for example mice) immunized with recombinant proteins comprising a characteristic amino acid chain of the TSH receptor and a carrier protein such as ⁇ -galactosidase or human ubiquitin.
  • mAbs specifically directed against acid chains amino acids 19-243, 246-526 and 604-764 of sequence II of the TSH receptor.
  • the invention also relates to the hybridomas producing these mAbs as described in the examples.
  • monoclonal antibodies are those which specifically recognize fragments included in the above sequences or which include these sequences, since they have the antigenic and, where appropriate, immunogenic properties of the above sequences.
  • Preferred fragments according to the invention, capable of exhibiting antigenic or even immunogenic properties, where appropriate when associated with a carrier protein, are those which have more than 9, preferably more than 20 amino acids.
  • the fragments used for the preparation of the antibodies can comprise the entire sequence of the TSH receptor, they advantageously comprise less than 250 amino acids.
  • the monoclonal or polyclonal antibodies of interest in the context of the invention can also be in the form of immunotoxins, obtained by modification of the antibody by a toxic molecule, for example diphtheria toxin or by a radioactive product.
  • immunotoxins can in this case form therapeutic agents which can be used for the treatment of certain pathologies and in particular of certain thyroid cancers.
  • the antibodies of the invention in particular the monoclonal antibodies, can be used for the immunocytochemistry analysis of the receptors of the thyroid tissue, for example by immunofluorescence, gold labeling, immunoperoxidase.
  • They can also be used for the identification of metastases of thyroid origin.
  • a “sandwich” type test can be carried out for the in vitro detection of autoantibodies.
  • the monoclonal antibodies according to the invention are used to fix antigens corresponding for example to one of the polypeptides or peptides described above, extracted from the human thyroid or produced by modified cells.
  • the antigens thus anchored on the antibodies of the invention are used to detect autoantibodies in the serum of patients.
  • Antigen-antibody bonds are the usual bonds for this type of complex or covalent bypass.
  • mAbs Another application of mAbs is the immunopurification of antigens produced for example by recombinant cells.
  • the antibodies of the invention are also suitable for monitoring thyroid diseases such as the disease of
  • the new antibodies obtained could serve as a trap against circulating autoantibodies.
  • the antibodies formed by injection of the mAbs of the invention have a region complementary to the TSH receptor and may prove to be therefor for the binding of circulating autoantibodies.
  • the invention also relates to a process for the preparation of a human TSH receptor comprising:
  • the invention also relates to a method for the in vitro diagnosis on a biological sample of the presence of antibodies directed against the human TSH receptor, characterized by:
  • the invention also relates to a kit for the in vitro diagnosis on a biological sample of the presence of antibodies directed against the human TSH receptor, comprising:
  • this support possibly consisting of an mAb according to the invention
  • Such a diagnostic kit can be used to detect anti-TSH receptor antibodies produced in the case of a condition due for example to Graves' disease, Ashimoto's disease or another thyroid disease.
  • the invention also relates to nucleotide probes, synthetic or not, characterized in that they hybridize with a nucleic acid according to the invention, or with its complementary sequence or with the corresponding RNA.
  • Such probes can be used for operations to diagnose genetic abnormalities of the human TSH receptor or even for the detection of abnormalities present at the receptor level in certain cancers.
  • transfected cells are brought into contact with, for example, the patient's blood. It is then detected whether the fixation of the TSH radioactive is inhibited or if adenylate cyclase or any other transduction system is activated.
  • the invention relates to any system using the expression of the cDNA or of the TSH receptor gene for a functional test for the presence of antibodies.
  • the invention further relates to any biological measurement method of TSH by expression of the TSH receptor.
  • Figure 1 Schematic representation of the structure of the human TSH receptor.
  • the hatched regions represent the potential signal peptide and the 7 membrane regions.
  • E1-5 are the potential extracellular domains and 11.2 the intracellular domains.
  • the amino acid numbering is given above and below the figure.
  • FIG. 2 Sequence of the human TSH receptor (hTSHR) and of the deduced protein Position +1 is that of the first nucleotide of the initiation codon. The numbering of the nucleotides (above) and the amino acids (below) is given. The nitrogen-linked glycosylation sites of the extracellular domain are underlined, a potential phosphorylation site by kinase C is indicated by a dotted line. Changes appear for some clones.
  • hTSHR human TSH receptor
  • Figure 3 Analysis of the RNA fingerprints of the TSH receptor mRNA - the polyadenylated RNAs (20 ⁇ g) of the human thyroid (line 1), of the testes (line 1)
  • FIG. 4 Expression of the TSH receptor cDNA in COS 7 cells.
  • COS 7 cells were transfected with a vector coding for the TSH receptor.
  • the binding of 125 I-bTSH was studied as described in "Methods" in the presence of increasing concentrations of unlabelled bTSH (o) pLH (o) and hFSH
  • cDNAs Randomly primed complementary DNAs (cDNAs) were prepared from polyadenylated human thyroid RNAs. Selection by size of CDNA and cloning into a vector ⁇ gt10 have been described by Loosfelt H. et al; (1989, Science 245,
  • the cDNA library (1.5 ⁇ 10 6 clones) was screened with the LH / hCG receptor cDNA
  • hTSHR human TSH hormone receptor
  • the cDNA was inserted into the vector pKSV10 (Pharmacia) and used to transfect COS7 cells as described by Guiochon-Mantel A. et al. (1988, Nature 336, 695-698). The cells were used 48 hours after transfection.
  • the suspension was spread on 400 ⁇ l of PSA, 1M of sucrose buffer and centrifuged at 10,000 g for
  • Polyadenylated RNAs (poly (A + ) were isolated from human thyroids and used to prepare a cDNA library in a vector ⁇ gt10. The library was screened at low stringency with a probe corresponding to the LH / hCG receptor of pigs as described by Loosfelt H. et al. (1989, Science 245, 525-528).
  • the nucleotide sequence has an ATG codon which is preceded by a stop codon upstream of the frame, thus defining an open reading phase of 764 amino acids ( Figure 2).
  • the N-terminal part codes for a sequence of
  • the mature protein probably consists of a sequence of 743 amino acids with a calculated molecular weight of 84501 daltons.
  • the membrane domain contains around 266 amino acids and could include 7 transmembrane segments.
  • the first segment of this part presents homologies with the LH / hCG receptor.
  • the second segment is divergent, in particular at the level of its C-terminal part.
  • the intracellular domain comprises a large proportion of amino acids of the serine and threonine type and a consensus site for phosphorylation by protein kinase C (FIG. 2). Phosphorylation by specific kinases may play a role in the specific decoupling of receptors with G proteins.
  • RNAs from different organs and shows the presence in the thyroid of predominant messenger types of 4300 nucleotides and a less abundant band of 3900 nucleotides. The smaller and minority species of 1700 and 1100 nucleotides were also highlighted. No messengers were observed in the testes, ovaries, spleen and liver.
  • the entire length of the coding region was reconstructed from ⁇ HTSHR 2 and AHTSHR 3 (FIG. 1c), inserted into the expression vector pKSV10 and transfected into COS7 cells (described by Katamine S. et al. 1988, Mol. Cell Biol. 8, 259-266).
  • nucleotide sequences resulting from the fusion were used to modify vectors for cloning and expression. During this fusion, the 1023 amino acids of beta-galactosidase and the 76 amino acids of ubiquitin were preserved on the one hand.
  • Each of these cDNA sequences has been fused to the C-terminal end of the complete gene coding for ⁇ -galactosidase on the one hand and of the complete gene coding for human ubiquitin on the other hand.
  • Fusion vectors were then prepared by inserting each of the recombinant DNAs obtained in the vector pUR292 (described by Ruther et al) and in the vector pNMHUB (described by Monia et al)
  • Cloning was done at the level of the vector polylinkers.
  • the recombinant vectors obtained in the previous step were used to transfect E coli cells. Cells producing more
  • the E.coli inclusion bodies were prepared by centrifugation of the cell lysate, stringent washing of the pellet (1M NaCl, 1% Triton ⁇ 100, 6 M guanidine chloride in the presence of 0.5 M ⁇ -mercaptoethanol), finally by extensive dialysis against 8 M urea with sodium phosphate buffer
  • Protein extracts were analyzed at this stage by denaturing electrophoresis and selected according to the relative abundance of fusion proteins. When fusion proteins were more than 20% of the total proteins, no additional purification was carried out, otherwise the fusion proteins were purified by electrophoresis then electroelution according to SPIKER et al
  • the fusion proteins obtained according to the preceding steps were injected into mice. * fragment 19-243 / ⁇ -galactosidase
  • 5 injections (100 ⁇ g / injection) were made subcutaneously 15 days apart, followed, after the fifth subcutaneous injection, by an intraperitoneal and intravenous injection, with a dose of recombinant protein corresponding to fragment 19 to 243 of sequence II of the TSH receptor, fused with ⁇ -galactosidase, and purified by electrophoresis and electroelution.
  • Spleen cells from mice thus immunized were fused 3 days later with myeloma cells to form selected hybridomas in a medium containing azacerine and hypoxanthine.
  • the recombinant protein comprising the fragment
  • mice After solubilization, these i.nclusi.on bodies which contained approximately 30% of recombinant protein relative to the total proteins, were injected into mice according to a procedure identical to that which has been described for the recombinant protein resulting from fusion of fragment 19-243 to ⁇ -galactosidase.
  • Hybridomas were similarly prepared from spleen cells from immunized mice and from myeloma cells and the monoclonal antibodies produced were selected.
  • Four monoclonal antibodies have been selected: They react specifically in an ELISA test with the antigen used to immunize mice and with the fusion protein corresponding to the 19-243 / ⁇ -galactosidase fragment and do not react with non-recombinant ubiquitin.
  • hybridomas producing the 6 specific monoclonal antibodies described above were cloned by limiting dilution and ascites were produced in mice according to conventional techniques and the mAbs were then purified on
  • Protein A-sepharose These antibodies are directed against the N-terminal part of the TSH receptor.
  • the fragment between amino acids 604 and 764 corresponds mainly to the intracellular region of the receptor.
  • the recombinant protein corresponding to this fragment fused with ⁇ -galatosidase was produced in the form of E coli inclusion bodies in a proportion of approximately 50% relative to the total proteins.
  • mice After solubilization, the inclusion bodies were injected into mice (5 injections:

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Abstract

L'invention concerne un acide nucléique codant pour le récepteur humain de la TSH, un variant ou une partie de cet acide nucléique dès lors qu'il a les propriétés structurales et/ou fonctionnelles et/ou antigéniques du récepteur. L'invention vise aussi des anticorps dirigés contre le récepteur. L'invention concerne aussi des moyens pour le diagnostic de certaines maladies thyroïdiennes.

Description

RECEPTEUR HUMAIN DE LA TSH. SEQUENCE CODANT
POUR CE RECEPTEUR
La présente invention concerne le récepteur humain de la TSH ainsi que l'acide nucléique codant pour ce récepteur.
Le récepteur de la TSH est le récepteur de l'hormone thyréotrope (TSH pour thyroid stimulating hormone). Ce récepteur est impliqué dans de nombreuses maladies de la thydroïde et notamment dans des maladies auto-immunes telles que la maladie de Basedow, ou autres dérèglements du fonctionnement de la thyroïde.
Les différentes données disponibles jusqu'à présent sur le récepteur de la TSH, ne permettent pas d'établir avec certitude sa structure. Les poids moléculaires connus varient entre 30000 et 200000 selon les données. Cette divergence montre les nombreuses incertitudes qui subsistent pour connaître ces molécules, leurs propriétés biologiques et phamarcologiques.
Les inventeurs ont maintenant clone et isolé la séquence de nucléotides (acide nucléique) codant pour le récepteur de la TSH. Ils ont par ailleurs localisé le gène codant pour ce récepteur.
L'invention concerne donc un acide nucléique codant pour le récepteur humain de la TSH ou une partie de ce récepteur.
L'invention concerne également la protéine ayant des propriétés de récepteur, codée par le susdit acide nucléique. Elle vise aussi des vecteurs recombinants comprenant à titre de séquence exogène l'acide nucléique codant pour le récepteur de la TSH humaine. Elle se rapporte également à des hôtes cellulaires transformés capables d'exprimer le récepteur de la TSH humaine.
L'invention offre également des moyens pour le diagnostique ou le contrôle, voire le traitement de certaines maladies thyroïdiennes telle que par exemple la maladie de Basedow, ces moyens consistant notamment en la production du récepteur par expression dans un système cellulaire procaryote ou dans un système cellulaire eucaryote, afin de détecter et éventuellement de mesurer les anticorps dirigés contre ce récepteur existant dans diverses maladies thyroïdiennes, en particulier la maladie de Basedow, en des sondes nucléotidiques pour la détection d'anomalies génétiques du gène du récepteur de la TSH, ou pour la détection d'anomalies des récepteurs dans le cas de certains cancers ; ces moyens consistent également en des anticorps dirigés contre le récepteur humain de la TSH, ces anticorps pouvant éventuellement être modifiés pour acquérir une toxicité. D'autres moyens visés par l'invention sont des peptides capables de se fixer à des anticorps dirigés contre le récepteur humain de la
TSH, anticorps qui se forment au cours de certaines maladies thyroïdiennes, et en particulier la maladie de Basedow et d'empêcher ainsi les anticorps naturels de se fixer sur le récepteur et de l'activer ou de l'inhiber.
L'acide nucléique de l'invention est caractérisé en ce qu'il répond à la séquence nucléotidique I suivante :
ou un variant de cet acide nucléique ou un fragment de cet acide nucléique dès lors que ce variant ou ce fragment code pour une protéine ou un polypeptide présentant les propriétés structurales et/ou les propriétés fonctionnelles et/ou les propriétés antigéniques du récepteur humain de la TSH.
Entrent donc dans le cadre de l'invention des variants de l'acide nucléique répondant à la séquence
I ou des parties de cet acide nucléique, lorsque la protéine codée résultante vérifie au moins ou plusieurs des conditions suivantes :
* la protéine ou le polypeptide codé contient les sites contenus dans la séquence d'acides aminés déduite de l'acide nucléique de séquence I, et dont la présence est nécessaire pour que, lorsque ce fragment est exposé à la surface d'une cellule, il soit capable de se comporter commme le récepteur TSH humain (de lier la TSH, de participer à l'activation de l'adénylate cyclase, ou d'un autre système de transduction):
* la protéine ou le polypeptide codé est susceptible d'être reconnu par des anticorps qui reconnaissent soit la séquence d'acides aminés II donnée ci-après ou qui reconnaissent une forme sécrétée, circulante du récepteur humain TSH ;
* la protéine ou le polypeptide codé est susceptible de générer des anticorps qui reconnaissent la séquence d'acides aminés II ci-après et forment avec ces anticorps un complexe du type anticorps-antigène.
Il est à signaler que l'acide nucléique selon l'invention est portée par un gène localisé sur le chromosome humain 14 en position q31.
L'acide nucléique selon l'invention est particulièrement avantageux dans la mesure où il est caractéristique du récepteur humain de la TSH. En effet, dans l'hypothèse de l'utilisation de cet acide nucléique ou de ses produits d'expression dans des applications diagnostiques et, éventuellement thérapeutiques chez l'homme, il est important de disposer d'un matériel génétique compatible avec l'utilisation chez l'homme, que ce soit dans un but diagnostique, pharmacologique ou thérapeutique.
L'acide nucléique de l'invention est avantageusement l'acide nucléique codant pour une protéine mature correspondant au récepteur humain de la TSH, cette protéine mature étant caractérisée en ce que le peptide signal a été libéré.
L'invention concerne également les fragments d'acide nucléique correspondant aux séquences suivantes:
- séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés comprise entre l'acide aminé en position 1 et l'acide aminé en position 394,
- séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés comprise entre l'acide aminé en position 395 et l'acide aminé en position 660,
- séquence nucléotidique codant pour la séquence d'acides aminés comprise entre l'acide aminé en position 661 et l'acide aminé en position 743.
Elle vise aussi les fragments nucléotidiques correspondant aux séquences d'acides aminés suivantes :
- séquence comprise entre l'acide aminé en position 19 et l'acide aminé en position 243,
- séquence comprise entre l'acide aminé en position 246 et l'acide aminé en position 526,
- séquence comprise entre l'acide aminé en position 604 et l'acide aminé en position 764. La numérotation ci-dessus fait référence à la séquence II, aux exemples et aux figures qui les illustrent.
L'acide nucléique selon l'invention peut également être caractérisé en ce qu'il code pour une protéine répondant à la séquence d'acides aminés II suivante :
ou pour une variante ou une partie de cette protéine, dès lors que ladite variante ou partie de protéine présente les propriétés structurales ou fonctionnelles ou antigéniques de la séquence II, ou encore ces propriétés combinées.
L'invention concerne également une protéine caractérisée en ce qu'elle répond a tout ou partie de la séquence d'acides aminés II donnée ci-dessus, dès lors que la protéine ainsi formée possède les propriétés structurales et/ou fonctionnelles et/ou antigéniques du récepteur humain de la TSH, ou ces propriétés combinées.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, cette protéine correspond au récepteur humain de la TSH. La protéine de l'invention peut au contraire, suivant un autre mode de réalisation de l'invention, être dépourvue du site de fixation du récepteur humain de la TSH.
Conformément à la définition précédente, l'invention vise en particulier la protéine correspondant au récepteur humain de TSH, cette protéine étant dépourvue du peptide signal.
L'invention vise donc à la fois la protéine du récepteur humain TSH ou des fragments polypeptidiques ou peptidiques de cette protéine, sous forme glycosylée ou non.
Les fragments peptidiques sont avantageusememt obtenus par synthèse chimique selon les méthodes classiques ou éventuellement par clivage de la protéine avec des enzymes appropriées.
On pourra avantageusement choisir ces peptides à l'intérieur des régions les plus hydrophiles de la protéines correspondant au récepteur humain de la TSH. Des polypeptides particulièrement intéressants sont les polypeptides constitués par les enchaînements d'acides aminés entre les positions 19 et 243, 246 et 526, 604 et 764. D'autres polypeptides ou peptides avantageux sont ceux qui contiennent les enchaînements ci-dessus ou qui sont inclus dans les enchaînements ci-dessus dès lors qu'ils conservent les propriétés antigéniques de ces enchaînements.
Ces peptides peuvent par exemple être utilisés pour produire des anticorps polyclonaux ou monoclonaux par les méthodes classiques de production d'anticorps monoclonaux.
La connaissance de la séquence en acides aminés de la protéine récepteur humain de la TSH ainsi que la possibilité de faire exprimer l'ADNc ou le gène du récepteur de la TSH constituent des moyens pour rechercher des molécules apparentées à la TSH mais plus actives, ou encore des antagonistes de la TSH.
Dans cette hypothèse, on peut avoir recours par exemple à des modifications ponctuelles de la TSH.
L'invention vise également des vecteurs recombinants caractérisés en ce qu'ils comprennent à titre d'acide nucléique exogène, l'un des acides nucléiques définis précédemment, inséré en un site non essentiel pour la réplication du vecteur.
Des vecteurs préférés sont: - le vecteur pUR292 modifié par exemple par un acide nucléique recombinant comprenant le gène de la β-galactosidase et un fragment de nucléotides codant pour l'un des enchaînements d'acides aminés 19-243, 246-526 et 604-764,
- le vecteur pNMHUB décrit par Monia et al( J Biol Chem 264,p 4093-4103, 1989), modifié par la recombinaison de 4093-4103, 1989), modifié par la recombinaison de l'ADN codant pour l'ubiquitine humaine( 76 acides aminés) avec chacun des fragments ci-dessus.
Ces vecteurs recombinants sont de préférence des vecteurs d'expression et de clonage de l'acide nucléique exogène.
Des vecteurs recombinants préférés sont par exemple des plasmides, des phages, des cosmides, des dérivés viraux comme par exemple le Baculovirus.
Des vecteurs recombinants particulièrement avantageux pour la réalisation de l'invention sont ceux dans lesquels l'acide nucléique exogène est placé sous le contrôle d'éléments de régulation permettant son expression dans un hôte cellulaire déterminé. De tels éléments de régulation sont choisis pour leur capacité à être reconnus par le système enzymatique de l'hôte cellulaire choisi.
La séquence d'acide nucléique de l'invention et ses dérivés, notamment tout vecteur recombinant, peuvent être mis en oeuvre dans des systèmes cellulaires procaryotes tels que des bactéries, notamment E.coli, des systèmes cellulaires eucaryotes, notamment des levures, des cellules animales, par exemple des cellules d'insectes, notamment des cellules de drosophiles ou encore des cellules de mammifères.
Des cellules de mammifères intéressantes sont par exemple les cellules CHO.
L'invention concerne aussi un hôte cellulaire caractérisé en ce qu'il est transformé par un vecteur choisi parmi les vecteurs précédemment décrits, dans des conditions telles qu'il permet l'expression de l'acide nucléique exogène inséré dans le vecteur.
Les hôtes cellulaires préférés pour la réalisation de l'invention sont des systèmes procaryotes, notamment des bactéries telles que E. coli, des systèmes eucaryotes, notamment des levures, ou encore des cellules d'insectes, notamment celles de la drosophile, ou des cellules animales en particulier de cellules de mammifères, comme les cellules de CHO.
Un hôte cellulaire particulièrement préféré est constitué par des cellules de drosphile transformées par un vecteur du type baculovirus, lui-même modifié par un acide nucléique de l'invention.
L'expression du récepteur de TSH peut être obtenue sous la forme non native. L'hôte cellulaire que l'on choisit pour exprimer le récepteur humain de la TSH, peut également être un hôte capable d'exprimer le récepteur de la TSH humaine dans sa conformation native ou une partie de ce récepteur. Le récepteur de la TSH ainsi produit ou une partie de ce récepteur se trouve donc dans une conformation tridimensionnelle analogue à celle qu'il présente in situ.
Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, l'hôte cellulaire est caractérisé en ce que le récepteur humain de la TSH qu'il permet d'exprimer a subi les modifications posttraductionnelles naturellement réalisées in situ.
L'invention concerne également le récepteur de la TSH ou un fragment de ce récepteur, tel qu'exprimé par un hôte cellulaire, transformé par un vecteur recombinant décrit dans les pages précédentes.
L'invention concerne également des anticorps polyclonaux ou monoclonaux caractérisés en ce qu'ils ont la capacité de reconnaître spécifiquement le récepteur humain de la TSH selon les définitions données précédemment. Des anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par les méthodes classiques, notamment en opérant selon les étapes suivantes :
- fusion de cellules spléniques d'un animal par exemple une souris, préalablement immunisée avec une protéine selon l'invention, avec des cellules de myélome et récupération des hybridomes ainsi formés, - culture des hybridomes et sélection des hybridomes capables de produire des anticorps monoclonaux dirigés contre la susdite protéine.
Des anticorps avantageux sont des anticorps dirigés contre le domaine extra-cellulaire du récepteur humain de la TSH.
Ces anticorps peuvent également être obtenus à partir d'hybridomes résultant de la fusion de cellules spléniques de souris, préalablement immunisées avec des peptides issus du récepteur humain de la TSH, éventuellement couplés à une macromolécule, ces cellules étant fusionnées avec des cellules de myélome. Les peptides utilisés peuvent être des peptides issus du récepteur de la TSH, ou encore des peptides obtenus par synthèse chimique selon les méthodes classiques.
D'autres anticorps monoclonaux selon l'invention sont obtenus à partir d'hybridomes résultant de la fusion de cellules de myélomes avec des cellules spléniques d'animaux (par exemple de souris) immunisés avec des protéines recombinantes comprenant un enchaînement d'acides aminés caractéristique du récepteur de la TSH et une protéine porteuse comme la β-galactosidase ou l'ubiquitine humaine.
Entrent dans cette catégorie, des AcM dirigés spécifiquement contre les enchaînements d'acides aminés 19-243, 246-526 et 604-764 de la séquence II du récepteur de la TSH.
L'invention vise aussi les hybridomes producteurs de ces AcM tels qu'ils sont décrits dans les exemples.
D'autres anticorps monoclonaux sont ceux qui reconnaissent spécifiquement des fragments compris dans les enchaînements ci-dessus ou encore qui comprennent ces enchaînements, dès lors qu'ils ont les propriétés antigéniques et le cas échéant immunogènes des enchaînements ci-dessus. Des fragments préférés selon l'invention, susceptibles de présenter des propriétés antigéniques, voire immunogènes, le cas échéant lorsqu'ils sont associés à une protéine porteuse, sont ceux qui ont plus de 9, de préférence plus de 20 acides aminés. Les fragments utilisés pour la préparation des anticorps peuvent comprendre la totalité de la séquence du récepteur de la TSH, ils comprennent avantageusement moins de 250 acides aminés.
Les anticorps monoclonaux ou polyclonaux intéressants dans le cadre de l'invention peuvent également se présenter sous forme d'immunotoxines, obtenues par modification de l'anticorps par une molécule toxique, par exemple la toxine diphtérique ou par un produit radioactif. Ces immunotoxines peuvent dans ce cas, former des agents thérapeutiques utilisables pour le traitement de certaines pathologies et notamment de certains cancers de la thyroïde.
Les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux peuvent être utilisés pour l'analyse par immunocytochimie des récepteurs du tissu thyroïdien, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoperoxydase.
Ils peuvent par ailleurs être mis en oeuvre pour l'identification de métastases d'origine thyroïdienne.
D'autres applications de ces anticorps sont par exemple leur utilisation pour la détection d'auto- anticorps dans des maladies autoimmunes de la thyroïde comme la maladie de Basedow (ou maladie de
Graves) ou la maladie d'Ashimoto.
Dans ce cas on peut réaliser un test de type "sandwich" pour la détection in vitro, d'autoanticorps. Les anticorps monoclonaux selon l'invention sont mis en oeuvre pour fixer des antigènes correspondant par exemple à l'un des polypeptides ou peptides décrits ci-dessus, extraits de la thyroïde humaine ou produits par des cellules modifiées. Les antigènes ainsi ancrés sur les anticorps de l'invention sont utilisés pour détecter des auto-anticorps dans le sérum des malades. Les liaisons antigène-anticorps sont les liaisons habituelles pour ce type de complexe ou des pontages covalents.
Une autre application des AcM est l'immunopurification d'antigènes produits par exemple par des cellules recombinantes.
Les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux sont adaptés également au suivi des maladies thyroïdiennes telles que la maladie de
Basedow, la maladie d'Ashimoto. La détermination du taux d'auto-anticorps présents dans le sang des malades, par utilisation des AcM de l'invention couplés à un antigène spécifique du récepteur de la TSH, peut permettre de moduler le traitement de ces malades.
On peut aussi immuniser une population donnée avec des AcM selon l'invention, ces AcM reconnaissant des épitopes du récepteur de la TSH. Dans ce cas les nouveaux anticorps obtenus pourraient servir de piège contre des auto-anticorps circulants. Il s'agit dans ce cas de former des réseaux idiotypes-anti idiotypes. Les anticorps formés par injection des AcM de l'invention présentent une région complémentaire du récepteur de la TSH et peuvent s'avérer à ce dernier pour la fixation des auto-anticorps circulants.
L'invention vise également un procédé pour la préparation d'un récepteur humain de la TSH comprenant:
- la transformation d'un hôte cellulaire compétent avec un vecteur recombinant tel que décrit ci-dessus comprenant un acide nucléique exogène conforme à l'invention, sous le contrôle d'éléments de régulation, notamment d'un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire et permettant l'expression dans cet hôte dudit acide nucléique,
- la culture de l'hôte cellulaire transformé dans des conditions permettant l'expression dudit acide nucléique et, le cas échéant, le transport de la protéine exprimée vers la membrane.
L'invention vise également un procédé pour le diagnostic in vitro sur un échantillon biologique de la présence d'anticorps dirigés contre le récepteur humain de la TSH, caractérisé par :
- la mise en contact de l'échantillon biologique, notamment du plasma, avec la protéine de l'invention correspondant au récepteur humain de la TSH ou à une partie de ce récepteur préalablement fixée sur un support, cette protéine ou partie de protéine étant le cas échéant couplée à un AcM selon l'invention, la détection des complexes anticorps-protéine éventuellement formés.
L'invention vise également un kit pour le diagnostic in vitro sur un échantillon biologique de la présence d'anticorps dirigés contre le récepteur humain de la TSH, comprenant :
- la protéine de l'invention ou partie de cette protéine, fixée sur un support, ce support pouvant être constitué par un AcM selon l'invention,
- des moyens de révélation de la formation du complexe protéine-anticorps.
Un tel kit de diagnostic peut être mis en oeuvre pour détecter des anticorps anti-récepteur de TSH produits dans le cas d'une affection due par exemple à la maladie de Basedow, la maladie d'Ashimoto ou une autre maladie thyroïdienne.
L'invention se rapporte en outre à des sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, caractérisées en ce qu'elles s'hybrident avec un acide nucléique selon l'invention, ou avec sa séquence complémentaire ou avec l'ARN correspondant.
De telles sondes peuvent être utilisées pour des opérations de diagnostic d'anomalies génétiques du récepteur humain de la TSH ou encore pour la détection d'anomalies présentes au niveau du récepteur lors de certains cancers.
On peut aussi préparer un système de détection des anticorps sur des cellules transfectées avec un vecteur selon l'invention. Les cellules transfectées sont mises en contact avec par exemple le sang du malade. On détecte alors si la fixation de la TSH radioactive est inhibée ou si l'adénylate cyclase ou tout autre système de transduction est activée.
A cet égard l'invention vise tout système utilisant l'expression de l'ADNc ou du gène du récepteur de la TSH pour un test fonctionnel de la présence d'anticorps.
L'invention vise de plus toute méthode de mesure biologique de la TSH par expression du récepteur de la TSH.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples et les figures dont les légendes sont présentées ci-après. Figure 1 : Représentation schématique de la structure du récepteur TSH humain.
A : empreinte d'hydropathie (Hoop M.J. et al. 1981, PNAS - USA 78, 3824-3828). Les régions hydrophobes correspondent à des valeurs négatives. I à IV correspondent aux segments transmembranaires potentiels.
B : Comparaison des récepteurs hTSH (récepteur humain de la TSH) et des récepteurs pLH/hCG décrit par Loosfelth et al. (1989, Science 145, 525-528).
Les régions hachurées représentent le peptide signal potentiel et les 7 régions membranaires. E1-5 sont les domaines potentiels extracellulaires et 11,2 les domaines intracellulaires. La numérotation des acides aminés est donnée au-dessus et au-dessous de la figure.
C : Carte des clones d'ADNc utilisés pour le sequençage. λhTSHR sont les clones de λgt10. La phase ouverte de lecture est encadrée.
Figure 2 : Séquence du récepteur humain de TSH (hTSHR) et de la protéine déduite La position +1 est celle du premier nucléotide du codon d'initiation. La numérotation des nucléotides (au-dessus) et des acides aminés (endessous) est donnée. Les sites de glycosylation liée à l'azote du domaine extracellulaire sont soulignés, un site potentiel de phosphorylation par la kinase C est indiqué par un trait en pointillés. Des modifications apparaissent pour certains clones.
Elles sont données au-dessus des séquences. Les modifications des acides aminés sont Leu --> Pro 13,
Leu --> Pro 260, Tyr --> His 414, Phe --> Leu 500,
Phe --> Leu 634, Glu --> Asp 727, Lys --> Asn 744.
Figure 3 : Analyse des empreintes ARN de l'ARNm du récepteur de TSH - les ARNs polyadénylés (20 μg) de la thyroïde humaine (ligne 1) , des testicules (ligne
2), des ovaires (ligne 3), du foie (ligne 4) et de la rate (ligne 5) sont analysés. La taille des marqueurs d'ADN est indiquée en Kb (kilobase).
Figure 4 : Expression de l'ADNc du récepteur de TSH dans des cellules COS 7. Les cellules COS 7 ont été transfectées avec un vecteur codant pour le récepteur de TSH. La fixation de 125I-bTSH a été étudiée comme décrit dans "Méthodes" en présence de concentrations croissante de bTSH non marquée (o) pLH (o) et hFSH
(Δ). Les résultats apparaissent en pourcentage de liaison 125I-bTSH en l'absence d'hormones non marquées (3 tests). Encadré : stimulation de l'adénylate cyclase.
EXEMPLES
CLONAGE DE L'ADNc DU RECEPTEUR DE LA TSH
METHODES
Des ADNs complémentaires (ADNc) amorcés au hasard ont été préparés à partir d'ARNs polyadénylés de thyroïde humaine. La sélection par la taille des ADNc et le clonage dans un vecteur λgt10 ont été décrits par Loosfelt H. et al; (1989, Science 245,
525-528). La banque d'ADNc (1,5 106 clones) a été criblée avec l'ADNc du récepteur de la LH/hCG
(lutéotrophine/choriogonadotrope humaine) du porc, dans sa totalité, marqué au 32P. Des filtres de nitrocellulose ont été hybrides à 37ºC pendant 36 heures avec 5.105 cpm/ml de sonde dans 6xSSC (1xSSC =
0,15M de chlorure de sodium, 0,015M de citrate de sodium), un tampon contenant 30% de formamide, 0,5% de polyvinylpyrrolidone, 0,5% de ficoll, 0,5% de sérum albumine bovine, dénaturé avec de l'ADN de sperme de saumon (150μg/ml) et 0,2% de sodium dodecyl sulfate. Les filtres ont été lavés deux fois pendant
15 minutes à 50ºC dans 6xSSC et deux fois pendant 15 minutes à 25ºC dans 2xSSC et finalement 10 minutes à
45ºC dans 2xSSC. Une centaine de clones positifs ont été examinés pour déterminer leur capacité à hybrider avec soit la région extracellulaire soit la région transmembranaire de l'ADNc du récepteur de la LH/hCG porcine. 8 clones ont été sélectionnés pour procéder au sequençage.
Sequençage.
Le sequençage a été réalisé selon la méthode décrite par Misraki M. et al. (1987, Biochem Biophys. Res. Commun. 143, 740-748) après sous-clonage de clones λTSHR dans un vecteur blue script (stratagène).
Analyse d'ARN blot
Ces analyses ont été réalisées en utilisant des ARNs polyadénylés pour les tissus humains.
L'hybridation a été réalisée avec un insérât d'ADNc
(2,2Kb) de λTSHR3, amorcé au hasard (6x106 cpm/ng,
5x105 cpm/ml). Expression de l'ADNc cloné
La région codante complète dû récepteur de l'hormone TSH humaine (hTSHR) a été construite en utilisant les clones λhTSHR3 et λhTSHR4 (qui s'étendent entre le nucléotide 44 et le nuléotide
2395, la numérotation démarrant au premier codon).
L'ADNc a été inséré dans le vecteur pKSV10 (Pharmacia) et utilisé pour transfecter des cellules COS7 comme décrit par Guiochon-Mantel A. et al. (1988, Nature 336, 695-698). Les cellules ont été utilisées 48 heures après la transfection.
Etude de la fixation de l'iode 125I (125I-bTSH).
De la TSH bovine (bTSH) purifiée (40 i.u/mg), a été iodinisée par la méthode à la lactoperoxydase décrite par Powell-Jones C.H.J. et al. (1980, JBC 255, 4001-4010) et a été purifiée par chromatographie ultrogel ACA44. L'activité spécifique était de 25/ιCi/μg et l'activité maximale de fixation était 30% de la radioactivité totale (mesuré sur des membranes de thyroïde de porc). Les tests de fixation ont été réalisés en 3 exemplaires avec 105 cellules dans 200μl de PSA (20mM phosphate pH 7,4, 0,2% de sérum albumine bovine) 0,25M de tampon sucrose contenant
3x104cpm de 125I-bTSH et différentes quantités de bTSH (30 i.u/mg).
Après 30 minutes d'incubation à 37ºC, la suspension a été étalée sur 400μl de PSA, 1M de tampon de sucrose et centrifugée à 10.000 g pendant
10 minutes. Les surnageants ont été aspirés et les parties inférieures des tubes ont été coupées et mesurées pour la radioactivité. Des expériences de contrôle ont été réalisées avec des cellules transfectées avec le vecteur d'expression de l'ADNc de récepteur de la progestérone de lapin (Guiochon- Mantel A. et al.). Pour tester la spécificité de la fixation de la TSH bovine, des tests de compétition ont été également été effectués en utilisant l'hormone LH (Luteinizin Hormon) de porc purifiée non marquée, et de la FSH (hormone folliculo stimulante) humaine (150 i.u/mg, Metrodin Serono - Suisse).
Stimulation de l'activité adenylate cyclase par la TSH.
6x105 cellules COS 7 ont été étalées par 60nM plaques et transfectées avec 5 μg de pKSV-TSHR et 5 μg d'ADN entraineur. 42 heures plus tard, chaque plaque a été lavée 3 fois avec un milieu Eagle contenant de la gélatine (1 mg/ml). Chaque plaque a ensuite été incubée avec 4,5ml du même milieu contenant 0,5nM de 3-isobutyl-1-methyl xanthine pendant 15 minutes à 37ºC. Différentes concentrations de TSH bovine ont été ajoutées et l'incubation a été poursuivie pendant 5 minutes à 37ºC. Le milieu Eagle a été récupéré et les cellules ont été collectées dans 0,8ml de 1N d'acide perchlorique et centrifugé. Les surnageants ont été neutralisés et testés pour déterminer la présence de AMPc (International CIS).
RESULTATS ET DISCUSSION :
Clonage de l'ADNc du récepteur de TSH :
Les ARN polyadénylés (poly(A+)) ont été isolés à partir des thyroïdes humaines et utilisés pour préparer une banque d'ADNc dans un vecteur λgt10. La banque a été criblée à faible stringence avec une sonde correspondant au récepteur LH/hCG du porc tel que décrit par Loosfelt H. et al. (1989, Science 245, 525-528).
Le criblage des 1,5 106 clones de la banque a conduit à isoler 180 signaux positifs. Huit clones ont été sélectionnés pour l'analyse de la séquence (figure 1c) en utilisant des sondes correspondant aux régions 5' et 3' de l'ADNc du récepteur LH/hCG de porc.
Analyse de la séquence du récepteur TSH :
La séquence de nucléotides présente un codon ATG qui est précédé par un codon stop en amont du cadre, définissant ainsi une phase de lecture ouverte de 764 acides aminés (figure 2).
La partie N-terminale code pour une séquence de
21 acides aminés caractéristique d'un peptide signal avec un site de clivage tel que décrit par Von Heijne
G. (1986) (Nucleic Acid Research, 14, 4683-4686).
Par conséquent, la protéine mature consiste probablement en une séquence de 743 acides aminés avec un poids moléculaire calculé de 84501 daltons.
On peut envisager l'organisation structurale de la protéine de la façon suivante, comme le confirme le profil d'hydropathie du récepteur de la TSH (figure 1a) : un grand domaine extracellulaire s'étend jusqu'à l'acide aminé 394 à partir de l'extrémité N-terminale. Il contient 6 sites potentiels de glycosylation liée par l'azote. Cette région est divisée en 5 segments (figure 1b) E1 à E5. Le domaine E3 (cinquième domaine) est fortement acide (PKi = 4,14) et diverge par sa séquence et par sa longueur de la région correspondante et également acide du récepteur de la LH.
Le domaine membranaire comporte environ 266 acides aminés et pourrait comporter 7 segments transmembranaires.
La partie intracellulaire du récepteur de la TSH comporte 83 acides aminés et est très basique (PKi = 9,6). Le premier segment de cette partie présente des homologies avec le récepteur de la LH/hCG. Le second segment est divergent, en particulier au niveau de sa partie C-terminale. Le domaine intracellulaire comprend une grande proportion d'acides aminés du type serine et thréonine et un site consensus pour la phosphorylation par la protéine kinase C (figure 2). La phosphorylation par des kinases spécifiques peut jouer un rôle dans le découplage spécifique de récepteurs avec des protéines G.
Analyse Northern Blot des ARNs poly(A+) (figure 3) et des ARN totaux :
Cette analyse a été faite à partir de plusieurs ARNs de différents organes et montre la présence dans la thyroïde de types de messagers prédominants de 4300 nucléotides et d'une bande moins abondante de 3900 nucléotides. Les espèces plus petites et minoritaires de 1700 et 1100 nucléotides ont également été mises en évidence. Aucun messager n'a été observé dans les testicules, les ovaires, la rate et le foie.
Expression de l'ADNc cloné :
La région codante dans sa longueur totale a été reconstruite à partir de λHTSHR2 et AHTSHR3 (figure 1c), insérée dans le vecteur d'expression pKSV10 et transfectée dans des cellules COS7 (décrit par Katamine S. et al. 1988, Mol. Cell Biol. 8 , 259-266).
Cette opération a conduit à l'obtention sur les membranes des cellules d'une protéine qui fixe la TSH bovine marquée avec l'iode 125 (125I-bTSH). La fixation pouvait être saturée (déplacement avec TSH non marquée) et spécifique (125I-bTSH) ne pouvait pas être déplacée par l'hormone LH de porc (pLH) ou l'hormone FSH humaine (hFSH) (figure 4). De plus. aucune fixation saturable de 125I-bTSH n'a été observée lorsque les cellules ont été transfectées avec le vecteur d'expression pKSV10 de contrôle codant pour le récepteur de la progestérone de lapin. L'incubation avec TSH des cellules transfectées avec le vecteur pKSV-TSHR a montré une accumulation accrue de AMPc (AMP cyclique - figure 4 - encadré). Une telle stimulation de l'adenylate cyclase n'a pas été observée dans les cellules transfectées avec le vecteur d'expression de contrôle.
PREPARATION D'ANTICORPS MONOCLONAUX DIRIGES CONTRE LE
RECEPTEUR DE LA TSH
Préparation de vecteurs recombinants
L'ADNc codant pour le récepteur de la TSH d'une part, des parties de cet ADNc d'une autre part, ont été fusionnés aux gènes codant pour les protéines β- galactosidase ou ubiquitine humaine.
Ces séquences nucléotidiques résultant de la fusion ont été utilisées pour modifier des vecteurs de clonage et d'expression. Lors de cette fusion on a conservé d'une part les 1023 acides aminés de la beta-galactosidase et les 76 acides aminés de l'ubiquitine.
Les ADNc caractéristiques de l'ADN du récepteur de la TSH utilisés étaient les suivants :
- la totalité de l'ADNc du gène du récepteur de la TSH,
- le fragment d'ADNc codant pour l'enchaînement d'acides aminés compris entre les positions 19 (leucine) et 243 (serine) de la séquence II du récepteur,
- le fragment d'ADNc codant pour l'enchaînement d'acides aminés compris entre les positions 246 (leucine) et 526 (alanine) de la séquence II du récepteur,
- le fragment d'ADNc codant pour l'enchaînement d'acides aminés compris entre les positions 604
(isoleucine) et 764 (leucine) de la séquence II du récepteur.
Chacune de ces séquences d'ADNc a été fusionnée à l'extrémité C-terminale du gène complet codant pour la β-galactosidase d'une part et du gène complet codant pour l'ubiquitine humaine d'autre part.
Des vecteurs de fusion ont ensuite été préparés en insérant chacun des ADN recombinants obtenus dans le vecteur pUR292 (décrit par Ruther et al) et dans le vecteur pNMHUB (décrit par Monia et al)
Le clonage a été fait au niveau des polylinkers des vecteurs.
Expression des protéines de fusion
Les vecteurs recombinants obtenus à l'étape précédente ont été utilisés pour transfecter des cellules de E coli. Les cellules produisant plus de
5 % de ces protéines de fusion par rapport aux protéines totales ont été sélectionnées.
Protéines de fusion
Les corps d'inclusion de E.coli ont été préparés par centrifugation du lysat cellulaire, lavage stringent du culot (NaCl 1M, Triton x 100 1 %, chlorure de guanidine 6 M en présence de β-mercaptoéthanol 0,5 M), enfin par dialyse extensive contre de l'urée 8 M avec un tampon de phosphate de sodium
0,01 M et de chlorure de sodium 0,15 M.
Les extraits protéiques ont été analysés à ce stade par électrophorèse dénaturante et sélectionnés en fonction de l'abondance relative des protéines de fusion. Quand les protéines de fusion représentaient plus de 20 % des protéines totales, aucune purification supplémentaire n'était effectuée, sinon les protéines de fusion étaient purifiées par électrophorèse puis électroélution selon SPIKER et al
(Method in Enzymology 91, p 214-236, 1983).
Production des anticorps monoclonaux
Les protéines de fusion obtenues selon les étapes précédentes ont été injectées à des souris. * fragment 19-243/β-galactosidase
En particulier, on a réalisé 5 injections (100 μg/injection) sous-cutanées espacées de 15 jours suivies, après la cinquième injection sous-cutanée, d'une injection intra-péritonéale et intra-veineuse, d'une dose de de la protéine recombinante correspondant au fragment 19 à 243 de la séquence II du récepteur de la TSH, fusionnée avec la β- galactosidase, et purifiée par électrophorèse et électroélution.
Des cellules spléniques de souris ainsi immunisées ont été fusionnées 3 jours plus tard avec des cellules de myélomes pour former des hybridomes sélectionnés dans un milieu contenant de l'azacerine et de l'hypoxanthine.
Les anticorps produits par ces hybridomes dans le milieu de culture ont été testés et on a sélectionné deux anticorps monoclonaux (AcM) correspondant à la spécificité recherchée :
- ils réagissent dans un test de type ELISA (où l'antigène est fixé sur le plastique et mis à réagir avec les surnageants de culture, le complexe Ag-Ac étant ensuite révélé par des anticorps anti-Ig de souris couplés à la peroxidase), avec l'antigène utilisé pour immuniser les souris, avec un antigène constitué par la protéine recombinante constituée par le fragment 19-243 ci-dessus fusionné à l'ubiquitine humaine et, ne réagissent pas avec la β-galactosidase non recombinée,
- ils réagissent dans un test de marquage immunocytochimique de biopsie de thyroïde humaine de malade.
* fragment 19-243/ubiguitine
La protéine recombinante comprenant le fragment
19-243 de la séquence II du récepteur de la TSH, fusionné avec l'ubiquitine humaine a été exprimée et les corps d'inclusion de E coli ont été préparés selon la description précédente.
Après solubilisati.on, ces corps d'i.nclusi.on qui contenaient environ 30 % de protéine recombinante par rapport aux protéines totales, ont été injectés à des souris selon une procédure identique à celle qui a été décrite pour la protéine recombinante résultant de la fusion du fragment 19-243 à la β-galactosidase.
Des hybridomes ont été préparés de la même façon à partir des cellules spléniques des souris immunisées et de cellules de myélomes et les anticorps monoclonaux produits ont été sélectionnés. Quatre anticorps monoclonaux ont été sélectionnés : Ils réagissent spécifiquement dans un test ELISA avec l'antigène utilisé pour immuniser les souris et avec la protéine de fusion correspondant au fragment 19-243/β-galactosidase et ne réagissent pas avec l'ubiquitine non recombinante.
Ils réagissent également dans un test de marquage immunocytochimique avec une biopsie de thyroïde humaine.
Les hybridomes producteurs des 6 anticorps monoclonaux spécifiques ci-dessus décrits ont été clones par dilution limite et des ascites ont été produites chez la souris selon les techniques classiques et les AcM ont ensuite été purifiés sur
Protéine A-sépharose. Ces anticorps sont dirigés contre la partie N-terminale du récepteur de TSH.
* fragment 604-764/β-galactosidase
Le fragment compris entre les acides aminés 604 et 764 correspond principalement à la région intracellulaire du récepteur.
La protéine recombinante correspondant à ce fragemnt fusionné avec la β-galatosidase a été produite sous forme de corps d'inclusion de E coli selon une proportion d'environ 50 % par rapport aux protéines totales.
Après solubilisation les corps d'inclusion ont été injectés à des souris ( 5 injections :
100 μg/injection sous-cutanée espacées de 15 jours suivies d'une injection intraveineuse et intrapéritonéale, 5 jours après).
Après production des hybridomes, 10 anticorps monoclonaux ont été sélectionnés selon les techniques décrites ci-dessus (test ELISA avec l'antigène d'immunisation et la protéine de fusion
604-764/ubiquitine, test immunocytochimique).
Trois de ces anticorps monoclonaux ont donné un marquage puissant (marquage net de régions précises dans la cellule et d'un type cellulaire précis à très basse concentration en anticorps, notamment inférieure à 1 μg/ml) en test immunocytochimique sur des biopsies de thyroïde de malades.
Ces 3 AcM de forte sensibilité puisqu'ils détectent de très faibles quantités de récepteur, seraient particulièrement intéressants pour distinguer au niveau de la thyroïde un état normal d'un état tumoral. Les AcM ci-dessus ont été utilisés pour local ser les récepteurs de la TSH dans la partie basolaterale des membranes externes cellulaires des cellules de la thyroïde.
Ces 3 AcM ont également pu détecter par immunoblot, le récepteur de TSH présent dans des cellules d'insectes transformées par le baculovirus, lui-même modifié par l'ADNc du récepteur de la TSH.

Claims

REVENDICATIONS
1. Anticorps polyclonaux ou monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils ont la capacité de reconnaître spécifiquement une protéine répondant à la séquence d'acides aminés II, ou à une partie de cette séquence capable d'être reconnue par des anticorps dirigés contre la séquence II.
2. Anticorps monolonaux selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent spécifiquement l'un des enchaînements d'acides aminés caractéristiques de la séquence II du récepteur de la TSH et correspondant aux fragments 19 à 243, 246 à 526 ou 604 à 769, ou encore en ce qu'ils reconnaissent une partie de ces enchaînements ou un polypeptide les contenant.
3. Anticorps selon l'une des revendications 1 ou 2 , caractérisés en ce qu'ils sont modifiés chimiquement, par exemple pour former des immunotoxines.
4. Utilisation des anticorps selon l'une quelconque des revendicationsl à 3 soit pour le diagnostic ou la thérapie de maladies autoimmunes, par exemple la maladie de Basedow ou la maladie d'Ashimoto, soit pour la purification de protéines contenant tout ou partie de la séquence d'acides aminés II.
5. Protéine caractérisée en ce qu'elle répond à la séquence d'acides aminés II suivante, ou à une partie de cette séquence le cas échéant modifiée par rapport à la séquence correspondante dans II, suffisante pour que la protéine ainsi formée possède les propriétés structurales et/ou fonctionnelles et/ou antigéniques du récepteur humain de la TSH, ou ces propriétés combinées.
6. Polypeptide selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il s'agit de l'un des enchaînements d'acides aminés de la séquence II correspondant aux fragments 19 à 243, 246 à 526, ou
604 à 764.
7. Acide nucléique, caractérisé en ce qu'il répond à la séquence nucléotidique I suivante :
ou un variant de cet acide nucléique ou un fragment de cet acide nucléique dès lors que ce variant ou ce fragment code pour une protéine ou un polypeptide présentant les propriétés structurales et/ou les propriétés fonctionnelles et/ou les propriétés antigéniques du récepteur humain de la TSH, ou encore ces propriétés combinées.
8. Acide nucléique selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est dépourvu de la séquence codant pour le peptide signal.
9. Acide nucléique selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend l'une des séquences nucléotidiques suivantes :
- séquence codant pour la séquence d'acides aminés comprise entre les positions 1 et 394,
- séquence codant pour la séquence d'acides aminés comrise entre les positions 395 et 660,
- séquence codant pour la séquence d'acides aminés compris entre les positions 661 et 743,
- séquence codant pour la séquence d'acides aminés compris entre les positions 19 et 243,
- séquence codant pour la séquence d'acides aminés compris entre les positions 246 et 526
- séquence codant pour la séquence d'acides aminés compris entre les positions 604 et 764
10. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il code pour la protéine répondant à la séquence d'acides aminés II ou pour une variante ou une partie de cette protéine, dès lors que ladite variante ou partie de protéine présente les propriétés structurales et/ou fonctionnelles et/ou antigéniques de la séquence II, ou encore ces propriétés combinées.
11. Vecteur recombinant en particulier pour l'expression et le clonage, caractérisé en ce qu'il comprend un acide nucléique exogène selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, inséré en un site non essentiel pour sa réplication, et notamment en ce qu'il s'agit d'un plasmide, d'un phage, d'un cosmide, d'un bactériophage, de dérivés viraux notamment du baculovirus, l'acide nucléique contenu dans le vecteur étant sous le contrôle des éléments de régulation permettant de promouvoir et de réguler l'expression de cet acide nucléique dans un hôte cellulaire déterminé.
12. Vecteur recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il a la capacité d'être exprimé dans des systèmes cellulaires procaryotes tels que les bactéries, notamment E.coli, des systèmes cellulaires eucaryotes notamment des levures, des cellules des cellules d'insectes notamment de la drosophile ou des cellules animales par exemple des cellules de mammifères.
13. Hôte cellulaire caractérisé en ce qu'il est transformé par un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12 dans des conditions permettant l'expression de l'acide nucléique exogène inséré dans le vecteur et en particulier, en ce qu'il s'agit d'un système procaryote, notamment de bactéries par exemple E. coli, d'un système eucaryote, notamment de levures ou de cellules d'insectes, par exemple de drosphile ou de cellules animales, en particulier de mammifère, par exemple des cellules CHO.
14. Hôte cellulaire selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il s'agit de cellules d'insectes, par exemple de cellules de drosophile, transformées par un baculovirus lui-même modifié par un acide nucléique ou un fragment d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 7 à 10.
15. Hôte cellulaire selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce qu'il est capable d'exprimer le récepteur humain de la TSH notamment dans sa conformation native ou une partie de cette protéine.
16. Hôte cellulaire selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que le récepteur exprimé comporte le cas échéant les modifications post-traductionnelles naturellement réalisées in situ.
17. Récepteur de la TSH ou fragment de ce récepteur tel qu'exprimé par un hôte cellulaire transformé selon l'une des revendications 13 à 15.
18. Procédé pour la préparation d'une protéine selon la revendication 5 ou la revendication 6 comprenant :
- la transformation d'un hôte cellulaire compétent avec un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique exogène selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, sous le contrôle d'éléments de régulation, notamment d'un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire et permettant l'expression dans cet hôte cellulaire dudit acide nucléique,
- la culture de l'hôte cellulaire transformé dans des conditions permettant l'expression dudit acide nucléique et, le cas échéant, le transport de la protéine exprimée vers la membrane de l'hôte cellulaire.
19. Procédé pour le diagnostic in vitro sur un échantillon biologique de la présence d'anticorps dirigés contre le récepteur humain de la TSH, caractérisé par :
- la mise en contact de l'échantillon biologique, notamment du plasma, avec la protéine selon la revendication 5 ou la revendication 6 préalablement fixée sur un support constitué le cas échéant par un AcM selon l'une des revendications 1 ou 2,
- la détection des complexes protéine-anticorps éventuellement formés.
20. Kit pour le diagnostic in vitro sur un échantillon biologique de la présence d'anticorps dirigés contre le récepteur humain de la TSH, comprenant:
- la protéine ou partie de protéine selon la revendication 5 ou la revendication 6, fixée sur un support constitué le cas échéant par un AcM selon la revendication 1 ou 2,
- des moyens de révélation de la formation du complexe protéine-anticorps.
21. Sonde nucléotidique synthétique ou non, caractérisée en ce qu'elle hybride avec un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 7 à 10 ou avec sa séquence complémentaire ou l'ARN correspondant.
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