CA2342963A1 - Anticorps monoclonaux anti-proteine ozf et leurs applications dans le domaine diagnostic et therapeutique - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un anticorps monoclonal spécifique de la protéine OZF ainsi qu'une composition pharmaceutique comprenant ledit anticorps, destinée à la prévention, le traitement ou le diagnostic de pathologie liée à l'expression anormale de protéine OZF telle que le cancer. L'invention comprend en outre des méthodes de détection de la protéine OZF ainsi que des méthodes de sélection de composés capables d'interagir avec la protéine OZF.
Description
ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-PROTEINE OZF ET LEURS APPLICATIONS
DANS LE DOMAINE DIAGNOSTIC ET THERAPEUTIQUE.
La présente invention concerne un anticorps monoclonal spécifique de la s protéine OZF ainsi qu'une composition pharmaceutique comprenant ledit anticorps destinée à la prévention, le traitement ou le diagnostic de pathologie liée à
(expression anormale de protéine OZF telle que le cancer. L'invention comprend en outre des méthodes de détection de la protéine OZF ainsi que des méthodes de sélection de composés capables d'interagir avec la protéine OZF.
lo La plupart des protéines à motifs doigt à zinc sont caractérisées par leur capacité à se fixer sur des ARN ou des ADN. Ce motif doigt à zinc a été
retrouvé dans des gènes contrôlant le développement, des gènes de facteur de transcription ou des gènes liés à la formation de tumeurs, attestant ainsi l'importance de cette structure doigt à zinc dans la régulation de l'expression des gènes.
15 Parmi les gènes codant pour oes protéines à motifs doigt à zinc, un gène codant pour une protéine constituée uniquement de motifs doigt à zinc, dénommé
gène OZF (OZF pour « Only Zinc Fingers ») a été isolé (Le Chalony et al., 1994) et fADNc correspondant a été cloné et séquencé. La séquence d'acides aminés de la protéine putative codée par le gène OZF comporte 292 résidus d'acides aminés, dont 10 motifs 2o doigt à zinc de 28 résidus d'acides aminés, pour un poids moléculaire estimé de 33 kDa. L'analyse comparative de ta protéine OZF a montré que le domaine contenant la structure doigt à zinc comporte de grandes homologies avec d'autres protéines à
motifs doigt à zinc.
D'autre part, Ferbus et al. (Ferbus et al., 1996) ont pu mettre en évidence 25 certaines caractéristiques de ta protéine OZF à partir d'une protéine recombinante OZF
produite chez E. soli. En particulier, ces auteurs ont montré que la protéine OZF
recombinante était capable de fixer des ions de zinc, de (ADN et de fhéparine.
En outre, ces auteurs ont également pu montrer, en utilisant un anticorps poiydonal obtenu à partir d'une protéine recombinante OZF fusionnée avec une protéine fixant le 30 maltose (MBP) que la protéine OZF était exprimée dans des cellules mammaires humaines de type épithélial, préférentiellement dans le noyau, alors qu'elle était très faiblement exprimée dans les cellules myoépithéliales et stromatiques de ce tissu mammaire. Ces auteurs ont également pu mettre en évidence que la protéine OZF
était exprimée dans une lignée cellulaire tumorale établie à partir d'une tumeur de 3s pancréas.
DANS LE DOMAINE DIAGNOSTIC ET THERAPEUTIQUE.
La présente invention concerne un anticorps monoclonal spécifique de la s protéine OZF ainsi qu'une composition pharmaceutique comprenant ledit anticorps destinée à la prévention, le traitement ou le diagnostic de pathologie liée à
(expression anormale de protéine OZF telle que le cancer. L'invention comprend en outre des méthodes de détection de la protéine OZF ainsi que des méthodes de sélection de composés capables d'interagir avec la protéine OZF.
lo La plupart des protéines à motifs doigt à zinc sont caractérisées par leur capacité à se fixer sur des ARN ou des ADN. Ce motif doigt à zinc a été
retrouvé dans des gènes contrôlant le développement, des gènes de facteur de transcription ou des gènes liés à la formation de tumeurs, attestant ainsi l'importance de cette structure doigt à zinc dans la régulation de l'expression des gènes.
15 Parmi les gènes codant pour oes protéines à motifs doigt à zinc, un gène codant pour une protéine constituée uniquement de motifs doigt à zinc, dénommé
gène OZF (OZF pour « Only Zinc Fingers ») a été isolé (Le Chalony et al., 1994) et fADNc correspondant a été cloné et séquencé. La séquence d'acides aminés de la protéine putative codée par le gène OZF comporte 292 résidus d'acides aminés, dont 10 motifs 2o doigt à zinc de 28 résidus d'acides aminés, pour un poids moléculaire estimé de 33 kDa. L'analyse comparative de ta protéine OZF a montré que le domaine contenant la structure doigt à zinc comporte de grandes homologies avec d'autres protéines à
motifs doigt à zinc.
D'autre part, Ferbus et al. (Ferbus et al., 1996) ont pu mettre en évidence 25 certaines caractéristiques de ta protéine OZF à partir d'une protéine recombinante OZF
produite chez E. soli. En particulier, ces auteurs ont montré que la protéine OZF
recombinante était capable de fixer des ions de zinc, de (ADN et de fhéparine.
En outre, ces auteurs ont également pu montrer, en utilisant un anticorps poiydonal obtenu à partir d'une protéine recombinante OZF fusionnée avec une protéine fixant le 30 maltose (MBP) que la protéine OZF était exprimée dans des cellules mammaires humaines de type épithélial, préférentiellement dans le noyau, alors qu'elle était très faiblement exprimée dans les cellules myoépithéliales et stromatiques de ce tissu mammaire. Ces auteurs ont également pu mettre en évidence que la protéine OZF
était exprimée dans une lignée cellulaire tumorale établie à partir d'une tumeur de 3s pancréas.
2 Les inventeurs ont mis en évidence de maniëre surprenante, en utilisant des anticorps polyclonaux anti-protéine OZF, que la protéine OZF était surexprimée dans des tumeurs primaires qui présentaient une amplification du gène OZF mais aussi dans des tumeurs primaires qui ne présentaient pas d'amplification du gène.
D'autre part, les inventeurs ont également mis en évidence que la surexpression de la protéine OZF dans ces tumeurs primaires était restreinte aux cellules tumorales.
Ces résultats montrent ainsi que la protéine OZF apparaît comme un marqueur de cellules tumorales.
lo L'obtention d'anticorps capables de reconnaître de manière spécifique la protéine OZF permettrait ainsi de détecter des cellules tumorales caractérisées par une expression anormale de protéine OZF.
Des anticorps polyclonaux anti-protéine OZF ont déjà été décrits (Ferbus et al., 1996). Ces anticorps ont été préparés par immunisation de tapins contre une protéine recombinante obtenue par fusion de la protéine OZF et de la protéine MBP, puis purifiés sur immunoabsorbant constitué de la protéine recombinante fusionnée OZF-MBP couplée sur colonne de sépharose 4B. Ces anticorps polytonaux peuvent ainsi reconnaitre plusieurs épitoges de la protéine OZF et en particulier certains épitoges communs aux protéines humaines ou de mammifères à motifs de doigt à zinc, compte 2o tenu de la grande homologie de séquence constatée entre la protéine OZF et d'autres protéines à motifs doigt à zinc.
Les inventeurs ont pu ainsi mettre en évidence des réactions non spécifiques obtenues avec certaines protéines à motifs de doigt à zinc pour ces anticorps polyclonaux.
Si ces anticorps polyclonaux peuvent s'avérer de spécificité suffisante pour des applications particulières telles que la détection de protéine OZF dans des cellules ou des tissus homogènes isolés, leur spécificité et éventuellement leur affinité
pourraient s'avérer insuffisantes comme le reconnaissent d'ailleurs les auteurs de la publication décrivant ces anticorps polyclonaux. Ces auteurs précisent en effet dans leur 3o conclusion qu'il serait nécessaire de disposer d'anticorps anti-OZF
permettant d'identifier avec précision les types de cellules exprimant la protéine OZF.
L'obtention de tels anticorps, dirigés contre un épitoge spécifique de la protéine OZF
humaine, permettrait sans aucun doute non seulement d'identifier les types de cellules exprimant normalement ou anormalement la protéine OZF mais également de rechercher ies
D'autre part, les inventeurs ont également mis en évidence que la surexpression de la protéine OZF dans ces tumeurs primaires était restreinte aux cellules tumorales.
Ces résultats montrent ainsi que la protéine OZF apparaît comme un marqueur de cellules tumorales.
lo L'obtention d'anticorps capables de reconnaître de manière spécifique la protéine OZF permettrait ainsi de détecter des cellules tumorales caractérisées par une expression anormale de protéine OZF.
Des anticorps polyclonaux anti-protéine OZF ont déjà été décrits (Ferbus et al., 1996). Ces anticorps ont été préparés par immunisation de tapins contre une protéine recombinante obtenue par fusion de la protéine OZF et de la protéine MBP, puis purifiés sur immunoabsorbant constitué de la protéine recombinante fusionnée OZF-MBP couplée sur colonne de sépharose 4B. Ces anticorps polytonaux peuvent ainsi reconnaitre plusieurs épitoges de la protéine OZF et en particulier certains épitoges communs aux protéines humaines ou de mammifères à motifs de doigt à zinc, compte 2o tenu de la grande homologie de séquence constatée entre la protéine OZF et d'autres protéines à motifs doigt à zinc.
Les inventeurs ont pu ainsi mettre en évidence des réactions non spécifiques obtenues avec certaines protéines à motifs de doigt à zinc pour ces anticorps polyclonaux.
Si ces anticorps polyclonaux peuvent s'avérer de spécificité suffisante pour des applications particulières telles que la détection de protéine OZF dans des cellules ou des tissus homogènes isolés, leur spécificité et éventuellement leur affinité
pourraient s'avérer insuffisantes comme le reconnaissent d'ailleurs les auteurs de la publication décrivant ces anticorps polyclonaux. Ces auteurs précisent en effet dans leur 3o conclusion qu'il serait nécessaire de disposer d'anticorps anti-OZF
permettant d'identifier avec précision les types de cellules exprimant la protéine OZF.
L'obtention de tels anticorps, dirigés contre un épitoge spécifique de la protéine OZF
humaine, permettrait sans aucun doute non seulement d'identifier les types de cellules exprimant normalement ou anormalement la protéine OZF mais également de rechercher ies
3 séquences nucléiques cibles de la protéine OZF, notamment nuGéaires, et d'identif'~er les gènes susceptibles d'être régulés par la protéine OZF.
Ainsi, il existe aujourd'hui un besoin de disposer d'un anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre la protéine OZF humaine. Un tel anticorps pourrait non seulement être utile pour étudier et ainsi mieux connaître le rôle joué par la protéine OZF dans la régulation des gènes mais également serait utile au regard des résultats présentés par les inventeurs dans la présente invention, pour d'autres applications comme les applications thérapeutiques, diagnostics, notamment in vivo ou in vitro à
partir d'échantillon biologique hétérogène, ou pour le ciblage de composés capables de 1o moduler l'activité biologique de la protéine OZF.
La présente invention est basée sur la découverte de la possibilité d'obtenir par une approche particulière de préparation un anticorps monoclonal caractérisé
par une spécificité jamais encore obtenue antérieurement. II a ainsi été découvert qu'en immunisant une souris avec une protéine OZF recombinante, il est possible d'obtenir un anticorps reconnaissant un épitoge spécifique de la protéine OZF et qui ne reconnaît pas d'autres protéines à motifs doigt à zinc de mammifères.
Ainsi, ta présente invention a pour objet un anticorps monoGonal ou ùn de ses fragments capables de se fixer spécifiquement sur un épitoge de la protéine OZF, de préférence humaine.
2o On entend désigner par épitoge dans la présente description, tout déterminant de !a protéine responsable de l'interaction spécifique avec l'anticorps. Les déterminants épitopiques consistent habituellement en des groupes de molécules présentant des surfaces chimiquement actives telles que des acides aminés ou des chaïnes latérales de sucres et ayant une stucture tridimentionnelle spécifique et/ou une charge spéc~que caractéristique.
Les fragments d'anticorps monoclonal selon l'invention comprennent tout fragment dudit anticorps monoclonal capable de se fixer sur l'épitoge de la protéine OZF sur lequel se fixe l'anticorps monoclonal dont ledit fragment est issu.
Des exemples de tels fragments incluent en particulier des anticorps monoclonaux simple 3o chaîne ou des fragments monovalents Fab ou Fab' et des fragments divalents tels que F(ab')2, qui possèdent 1a même spécificité de fixation que (anticorps monoclonal dont ils sont issus. Un fragment selon l'invention pourra également ëtre un fragment Fv simple chaîne produit par des méthodes connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Skerra et al., 1988 et King et al., 1991.
Ainsi, il existe aujourd'hui un besoin de disposer d'un anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre la protéine OZF humaine. Un tel anticorps pourrait non seulement être utile pour étudier et ainsi mieux connaître le rôle joué par la protéine OZF dans la régulation des gènes mais également serait utile au regard des résultats présentés par les inventeurs dans la présente invention, pour d'autres applications comme les applications thérapeutiques, diagnostics, notamment in vivo ou in vitro à
partir d'échantillon biologique hétérogène, ou pour le ciblage de composés capables de 1o moduler l'activité biologique de la protéine OZF.
La présente invention est basée sur la découverte de la possibilité d'obtenir par une approche particulière de préparation un anticorps monoclonal caractérisé
par une spécificité jamais encore obtenue antérieurement. II a ainsi été découvert qu'en immunisant une souris avec une protéine OZF recombinante, il est possible d'obtenir un anticorps reconnaissant un épitoge spécifique de la protéine OZF et qui ne reconnaît pas d'autres protéines à motifs doigt à zinc de mammifères.
Ainsi, ta présente invention a pour objet un anticorps monoGonal ou ùn de ses fragments capables de se fixer spécifiquement sur un épitoge de la protéine OZF, de préférence humaine.
2o On entend désigner par épitoge dans la présente description, tout déterminant de !a protéine responsable de l'interaction spécifique avec l'anticorps. Les déterminants épitopiques consistent habituellement en des groupes de molécules présentant des surfaces chimiquement actives telles que des acides aminés ou des chaïnes latérales de sucres et ayant une stucture tridimentionnelle spécifique et/ou une charge spéc~que caractéristique.
Les fragments d'anticorps monoclonal selon l'invention comprennent tout fragment dudit anticorps monoclonal capable de se fixer sur l'épitoge de la protéine OZF sur lequel se fixe l'anticorps monoclonal dont ledit fragment est issu.
Des exemples de tels fragments incluent en particulier des anticorps monoclonaux simple 3o chaîne ou des fragments monovalents Fab ou Fab' et des fragments divalents tels que F(ab')2, qui possèdent 1a même spécificité de fixation que (anticorps monoclonal dont ils sont issus. Un fragment selon l'invention pourra également ëtre un fragment Fv simple chaîne produit par des méthodes connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Skerra et al., 1988 et King et al., 1991.
4 Selon la présente invention, des fragments d'anticorps monoclonaux de l'invention peuvent être obtenus à partir des anticorps monoclonaux tels que décrits précédemment par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique.
s D'une autre manière les fragments d'anticorps monoclonaux compris dans la présente invention peuvent être synthétisés par des synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la société Applied Biosystems, etc., ou peuvent être préparés manuellement en utilisant des techniques connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Geysen et al., 1978.
1o En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux ou leurs fragments, on pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans !e manuel « Antibodies » (Harlow et al., 1988) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite par Kohler et Mllstein en 1975.
Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être obtenus par exemple 15 à partir de cellule d'un animal immunisé contre la protéine OZF, ou un de ses fragments, comportant fépitope reconnu spécifiquement par lesdits anticorps monoclonaux selon !'invention. Ladite protéine OZF, ou un de sesdits fragments, pourra notamment être produite, selon les modes opératoires usuels, par recombinaison génétique à partir d'une séquence d'acide nucléique contenue dans la 2o séquence de l'ADNc codant pour la protéine OZF ou par synthèse peptidique à
partir d'une séquence d'acides aminés comprise dans la séquence peptidique de la protéine OZF.
Les anticorps monoGonaux selon (invention pourront par exemple être purifiés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été immobilisée la protéine OZF
25 ou un de ses fragments comportant l'épitope reconnu spécifiquement par lesdits anticorps monoclonaux selon l'invention.
De préférence, l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon la présente invention se fixe sur l'épitope linéaire ou conformationnel du domaine N-terminal de !a protéine OZF humaine dont la séquence présente un faible taux d'homologie 3o comparée avec les séquences d'autres protéines à motifs doigt à zinc.
De manière plus préférée, (anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention se fixe sur un épitope situé sur les quinze premiers acides aminés, du domaine N-terminal de la protéine OZF telle que décrite par Le Chalony et al., 1994, aux figures 1 B et 1 C page 400.
Ainsi, l'invention concerne un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon (invention, caractérisé en ce que fépitope de la protéine OZF est située sur la partie N-terminale.
De manière préférée, l'invention concerne un anticorps monoclonal ou un de
s D'une autre manière les fragments d'anticorps monoclonaux compris dans la présente invention peuvent être synthétisés par des synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la société Applied Biosystems, etc., ou peuvent être préparés manuellement en utilisant des techniques connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Geysen et al., 1978.
1o En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux ou leurs fragments, on pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans !e manuel « Antibodies » (Harlow et al., 1988) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite par Kohler et Mllstein en 1975.
Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être obtenus par exemple 15 à partir de cellule d'un animal immunisé contre la protéine OZF, ou un de ses fragments, comportant fépitope reconnu spécifiquement par lesdits anticorps monoclonaux selon !'invention. Ladite protéine OZF, ou un de sesdits fragments, pourra notamment être produite, selon les modes opératoires usuels, par recombinaison génétique à partir d'une séquence d'acide nucléique contenue dans la 2o séquence de l'ADNc codant pour la protéine OZF ou par synthèse peptidique à
partir d'une séquence d'acides aminés comprise dans la séquence peptidique de la protéine OZF.
Les anticorps monoGonaux selon (invention pourront par exemple être purifiés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été immobilisée la protéine OZF
25 ou un de ses fragments comportant l'épitope reconnu spécifiquement par lesdits anticorps monoclonaux selon l'invention.
De préférence, l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon la présente invention se fixe sur l'épitope linéaire ou conformationnel du domaine N-terminal de !a protéine OZF humaine dont la séquence présente un faible taux d'homologie 3o comparée avec les séquences d'autres protéines à motifs doigt à zinc.
De manière plus préférée, (anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention se fixe sur un épitope situé sur les quinze premiers acides aminés, du domaine N-terminal de la protéine OZF telle que décrite par Le Chalony et al., 1994, aux figures 1 B et 1 C page 400.
Ainsi, l'invention concerne un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon (invention, caractérisé en ce que fépitope de la protéine OZF est située sur la partie N-terminale.
De manière préférée, l'invention concerne un anticorps monoclonal ou un de
5 ses fragments selon l'invention, caractérisé en ce que fépitope de la protéine OZF est situé sur la partie N-terminale comprenant le résidu tyrosine situé en position 10 de la séquence de la protéine OZF humaine telle que décrite par Le Chalony et al., 1994, à
la figure 1 B page 400, de préférence ledit épitope est porté par le fragment de séquence aa7-aa17 de ladite séquence OZF humaine.
lo De manière également préférée, l'invention concerne un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est capable de reconnaître en outre la protéine OZF humaine dont la séquence présente un polymorphisme lysinelarginine en position 8 de la séquence de la protéine OZF
humaine telle que décrite par Le Chalony et al., 1994, à la figure 1 B page 400.
Parmi les anticorps monoGonaux selon l'invention, on préfère notamment l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments caractérisé en ce qu'il est produit par une cellule telle que déposée au Centre National de Culture de Microorganisme (CNCM) (Institut Pasteur, Paris, France) le 6 Septembre 1999 sous le numéro I-2308.
L'hybridome tel que déposé â la CNCM le 6 Septembre 1999 sous le numéro I-2308, fait également partie de la présente invention.
L'invention comprend en outre un anticorps monoGonal ou un de ses fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les anticorps humanisés, chimériques ou anti-idiotypes.
Les anticorps monoclonaux humanisés selon l'invention ou leurs fragments peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme de l'art (Carter et al., 1992 ; Singer et al., 1992 et Mountain et al., 1992). De tels anticorps monoclonaux humanisés selon l'invention sont préférés pour leur utilisation dans des méthodes de diagnostic in vivo et thérapeutiques.
Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments de type chimérique selon l'invention peuvent être réalisés en utilisant les techniques de recombinaison génétique. Par exemple, l'anticorps monoclonal chimérique pourra être réalisé
en clonant un ADN recombinant comportant un promoteur et une séquence codant pour la région variable d'un anticorps monoclonal selon l'invention et une séquence codant pour la région constante d'anticorps humain. Un anticorps chimérique de l'invention codé par un tel gène recombinant sera par exemple une chimère souris-homme, la WO 00/14118 PC'f/FR99/02133
la figure 1 B page 400, de préférence ledit épitope est porté par le fragment de séquence aa7-aa17 de ladite séquence OZF humaine.
lo De manière également préférée, l'invention concerne un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est capable de reconnaître en outre la protéine OZF humaine dont la séquence présente un polymorphisme lysinelarginine en position 8 de la séquence de la protéine OZF
humaine telle que décrite par Le Chalony et al., 1994, à la figure 1 B page 400.
Parmi les anticorps monoGonaux selon l'invention, on préfère notamment l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments caractérisé en ce qu'il est produit par une cellule telle que déposée au Centre National de Culture de Microorganisme (CNCM) (Institut Pasteur, Paris, France) le 6 Septembre 1999 sous le numéro I-2308.
L'hybridome tel que déposé â la CNCM le 6 Septembre 1999 sous le numéro I-2308, fait également partie de la présente invention.
L'invention comprend en outre un anticorps monoGonal ou un de ses fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les anticorps humanisés, chimériques ou anti-idiotypes.
Les anticorps monoclonaux humanisés selon l'invention ou leurs fragments peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme de l'art (Carter et al., 1992 ; Singer et al., 1992 et Mountain et al., 1992). De tels anticorps monoclonaux humanisés selon l'invention sont préférés pour leur utilisation dans des méthodes de diagnostic in vivo et thérapeutiques.
Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments de type chimérique selon l'invention peuvent être réalisés en utilisant les techniques de recombinaison génétique. Par exemple, l'anticorps monoclonal chimérique pourra être réalisé
en clonant un ADN recombinant comportant un promoteur et une séquence codant pour la région variable d'un anticorps monoclonal selon l'invention et une séquence codant pour la région constante d'anticorps humain. Un anticorps chimérique de l'invention codé par un tel gène recombinant sera par exemple une chimère souris-homme, la WO 00/14118 PC'f/FR99/02133
6 spécificité de cet anticorps étant déterminée par la région variable dérivée de l'ADN
marin et son isotype déterminé par la région constante dérivée de l'ADN humain (Verhoeyn et al., 1988).
Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon la présente invention incluent également des anticorps anti-idiotypes produits par des méthodes connues de l'homme de l'art {Cozenza, et al., 1976 et Harlow et al., 1988).
Sont également compris dans l'invention, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon la présente invention obtenus par recombinaison génétique ou par synthèse chimique.
lo L'invention comprend également un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est marqué.
Les anticorps monoclonaux selon l'invention ou leurs fragments peuvent également, selon l'invention, se présenter sous forme d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.
Les anticorps monoclonaux marqués selon l'invention ou leurs fragments incluent par exemple des anticorps dits immunoconjugués qui peuvent être conjugués par exemple avec des enzymes telles que la péroxydase, la phosphatase alkaline, la (3-D-galactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, l'anhydrase carbonique, l'acétyl-cholinestérase, le lysozyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6 2o phosphate déhydrogénase ou par une molécule comme la biotine, la digoxigénine ou la 5-bromo-désoxyuridine. Des marqueurs fluorescents peuvent être également conjugués aux anticorps monoclonaux ou leurs fragments de l'invention et incluent notamment la fluorescéine et ses dérivés, le fluorochrome, la rhodamine et ses dérivés, la GFP (GFP pour « Green Fluorescent Protein »), le dansyl, I'umbelliférone etc.. Dans de tels conjugués, les anticorps monoclonaux de l'invention ou leurs fragments peuvent être préparés par des méthodes connues de l'homme de l'art.
Ils peuvent être couplés aux enzymes ou aux marqueurs fluorescents directement ou par l'intermédiaire d'un groupe espaceur ou d'un groupe de liaisons tel qu'un polyaldéhyde, comme le glutaraldéhydeque, l'acide éthylénediaminetétraacétique (EDTA), l'acide 3o diéthylénetriaminepentaacétique (DPTA), ou en présence d'agents de couplage tels que le périodate etc.. Les conjugués comportant des marqueurs de type fluoréscéine peuvent être préparés par réaction avec un isothiocyanate.
D'autres conjugués peuvent inclure également des marqueurs chimioluminescents tels que le luminol et les dioxétanes ou des marqueurs bioluminescents tels que la luciférase et la luciférine.
marin et son isotype déterminé par la région constante dérivée de l'ADN humain (Verhoeyn et al., 1988).
Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon la présente invention incluent également des anticorps anti-idiotypes produits par des méthodes connues de l'homme de l'art {Cozenza, et al., 1976 et Harlow et al., 1988).
Sont également compris dans l'invention, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon la présente invention obtenus par recombinaison génétique ou par synthèse chimique.
lo L'invention comprend également un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est marqué.
Les anticorps monoclonaux selon l'invention ou leurs fragments peuvent également, selon l'invention, se présenter sous forme d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.
Les anticorps monoclonaux marqués selon l'invention ou leurs fragments incluent par exemple des anticorps dits immunoconjugués qui peuvent être conjugués par exemple avec des enzymes telles que la péroxydase, la phosphatase alkaline, la (3-D-galactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, l'anhydrase carbonique, l'acétyl-cholinestérase, le lysozyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6 2o phosphate déhydrogénase ou par une molécule comme la biotine, la digoxigénine ou la 5-bromo-désoxyuridine. Des marqueurs fluorescents peuvent être également conjugués aux anticorps monoclonaux ou leurs fragments de l'invention et incluent notamment la fluorescéine et ses dérivés, le fluorochrome, la rhodamine et ses dérivés, la GFP (GFP pour « Green Fluorescent Protein »), le dansyl, I'umbelliférone etc.. Dans de tels conjugués, les anticorps monoclonaux de l'invention ou leurs fragments peuvent être préparés par des méthodes connues de l'homme de l'art.
Ils peuvent être couplés aux enzymes ou aux marqueurs fluorescents directement ou par l'intermédiaire d'un groupe espaceur ou d'un groupe de liaisons tel qu'un polyaldéhyde, comme le glutaraldéhydeque, l'acide éthylénediaminetétraacétique (EDTA), l'acide 3o diéthylénetriaminepentaacétique (DPTA), ou en présence d'agents de couplage tels que le périodate etc.. Les conjugués comportant des marqueurs de type fluoréscéine peuvent être préparés par réaction avec un isothiocyanate.
D'autres conjugués peuvent inclure également des marqueurs chimioluminescents tels que le luminol et les dioxétanes ou des marqueurs bioluminescents tels que la luciférase et la luciférine.
7 Parmi les marqueurs pouvant être fixés sur l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention, on préfère également les marqueurs radioactifs tels que '4C, ICI, 5'Co, ~Co, 5'Cr,'SZEu, S9Fe, 3H, 'zsl, '3~1, 3zP, ~sS, 'SSE et ~"'Tc qui peuvent être détectés par des moyens connus tels que le compteur gamma ou à
scintillations, s par autoradiographie, etc..
La présente invention comprend également les anticorps monoclonaux marqués ou leurs fragments selon l'invention dans lesquels le conjugué peut être un marqueur détectable choisi parmi les marqueurs pouvant être utilisés dans l'application imagerie in vivo. Des exemples de tels marqueurs selon l'invention sont 'zAs, 6'Cu, l0 6'Ga, ~Ga, ~r31~ ~a.~l~ ts~l~ »yn~ a~Ru~ ss""Tc, zo~Tl et ~Zr.
Le terme u imagerie in vivo » doit être entendu dans la présente description comme toute méthode permettant la détection d'un anticorps monoclonal marqué
selon la présente invention ou un de ses fragments qui se fixe spécifiquement sur l'épitope de la protéine OZF dans le corps du patient. Le patient sera de préférence un homme 15 susceptible de présenter des cellules tumorales exprimant de manière anormale la protéine OZF.
La présente invention comprend également les anticorps monoGonaux marqués ou leurs fragments selon l'invention dans lesquels le conjugué peut être un marqueur choisi parmi les marqueurs paramagnétiques pouvant être utilisés dans 2o l'application imagerie in vivo. De tels marqueurs selon l'invention sont par exemple les isotopes paramagnétiques particulièrement utilisés dans l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et qui incluent notamment SzCr, '6zDy, ~Fe,'S'Gd et ~Mn.
Tel que mentionné précédemment, pour la préparation de conjugués d'anticorps monoclonaux, le marqueur isotopique ou paramagnétique pourra être fixé
25 sur l'anticorps selon l'invention ou un de ses fragments soit directement ou soit indirectement en utilisant un groupe fonctionnel intermédiaire. Selon l'invention, l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments peut être marqué par toute technique connue de l'homme de l'art telle que par exemple celles décrites par Wagner et al., 1979 et Saha et al., 1976. Les conjugués monoclonaux radiomarqués selon la 3o présente invention peuvent par exemple être iodinés par contact avec du iodure de sodium ou de potassium et d'un agent chimique oxydant tel que l'hypochlorite de sodium ou un agent oxydant enzymatique tel que la lactopéroxydase.
Le type de détection de l'instrument utilisé sera un facteur majeur dans la sélection du marqueur. Par exemple, les isotopes radioactifs ou paramagnétiques 35 seront choisis, en particulier pour l'imagerie in vivo, en fonction du type d'instrument
scintillations, s par autoradiographie, etc..
La présente invention comprend également les anticorps monoclonaux marqués ou leurs fragments selon l'invention dans lesquels le conjugué peut être un marqueur détectable choisi parmi les marqueurs pouvant être utilisés dans l'application imagerie in vivo. Des exemples de tels marqueurs selon l'invention sont 'zAs, 6'Cu, l0 6'Ga, ~Ga, ~r31~ ~a.~l~ ts~l~ »yn~ a~Ru~ ss""Tc, zo~Tl et ~Zr.
Le terme u imagerie in vivo » doit être entendu dans la présente description comme toute méthode permettant la détection d'un anticorps monoclonal marqué
selon la présente invention ou un de ses fragments qui se fixe spécifiquement sur l'épitope de la protéine OZF dans le corps du patient. Le patient sera de préférence un homme 15 susceptible de présenter des cellules tumorales exprimant de manière anormale la protéine OZF.
La présente invention comprend également les anticorps monoGonaux marqués ou leurs fragments selon l'invention dans lesquels le conjugué peut être un marqueur choisi parmi les marqueurs paramagnétiques pouvant être utilisés dans 2o l'application imagerie in vivo. De tels marqueurs selon l'invention sont par exemple les isotopes paramagnétiques particulièrement utilisés dans l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et qui incluent notamment SzCr, '6zDy, ~Fe,'S'Gd et ~Mn.
Tel que mentionné précédemment, pour la préparation de conjugués d'anticorps monoclonaux, le marqueur isotopique ou paramagnétique pourra être fixé
25 sur l'anticorps selon l'invention ou un de ses fragments soit directement ou soit indirectement en utilisant un groupe fonctionnel intermédiaire. Selon l'invention, l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments peut être marqué par toute technique connue de l'homme de l'art telle que par exemple celles décrites par Wagner et al., 1979 et Saha et al., 1976. Les conjugués monoclonaux radiomarqués selon la 3o présente invention peuvent par exemple être iodinés par contact avec du iodure de sodium ou de potassium et d'un agent chimique oxydant tel que l'hypochlorite de sodium ou un agent oxydant enzymatique tel que la lactopéroxydase.
Le type de détection de l'instrument utilisé sera un facteur majeur dans la sélection du marqueur. Par exemple, les isotopes radioactifs ou paramagnétiques 35 seront choisis, en particulier pour l'imagerie in vivo, en fonction du type d'instrument
8 PCT/FR99/02133 utilisé qui guidera la sélection de ces marqueurs. De préférence, les marqueurs radioactifs choisis devront avoir une période qui est détectable par le type d'instrument choisi. Ces anticorps monoclonaux pourront ainsi ëtre utilisés par exemple comme agent d'imagerie, in vivo ou ex vivo sur des prélèvements biologiques dans toute s méthode conventionnelle permettant de visualiser par image un diagnostic de pathologie lié à l'expression anormale de la protéine OZF. Ces agents d'imagerie ou les réactifs pour diagnostic in vitro caractérisés en ce qu'ils comprennent un anticorps monoclonal marqué selon l'invention ainsi que leurs utilisations dans des méthodes de diagnostic in vitro ou de diagnostic par imagerie in vivo pour le diagnostic de pathologie lo liée à l'expression anormale de la protéine OZF font bien entendu partie de la présente invention.
L'invention comprend également un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est couplé à un composé
cytotoxique.
1s Les agents cytotoxiques qui peuvent ètre conjugués aux anticorps monoclonaux selon l'invention incluent notamment, mais sans s'y limiter, des composés alkylants tels que la méchloréthamine, la méthylène phosphoramide, la triaziquone, la camustine, la sémustine, le méthotrexate, la mercaptopurine, la cytarabine, le fluorouracile, des antibiotiques tels que l'actinomycine, des hormones ou 2o des antagonistes d'hormones tels que les corticostéroïdes, comme la prednisone ou les progestines. Les conjugués anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être préparés en conjuguant des substances cytotoxiques contenant soit la toxine intacte ou soit leur chaîne A dérivée avec l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon des techniques de l'homme de l'art (Chaudry et al., 1993 ; Sung et al., 1993 et 2s Selvaggi et al., 1993).
L'anticorps monoclonal selon l'invention peut également étre un anticorps monoctonal hétéroconjugué tel qu'une molécule hybride composée de deux ou plusieurs anticorps. Un hétéroconjugué inclut par exemple un anticorps monoclonal simple chaîne selon l'invention et un anticorps monoclonal simple chaîne qui est 3o spécifique d'un récepteur cellulaire (Kerr et al., 1990 et Hsieh-Ma et al., 1992).
Sous un autn: aspect, l'invention a pour objet une composition pharmaceutique pour ie traitement, la prévention ou pour le diagnostic in vivo de pathologie liée à
l'expression anormale de la protéine OZF, caractérisée en ce qu'elle comprend a) un anticorps monoclonal ou un de ses fragments, selon l'invention ; et 35 b) un excipient pharmaceutiquement acceptable.
L'invention comprend également un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est couplé à un composé
cytotoxique.
1s Les agents cytotoxiques qui peuvent ètre conjugués aux anticorps monoclonaux selon l'invention incluent notamment, mais sans s'y limiter, des composés alkylants tels que la méchloréthamine, la méthylène phosphoramide, la triaziquone, la camustine, la sémustine, le méthotrexate, la mercaptopurine, la cytarabine, le fluorouracile, des antibiotiques tels que l'actinomycine, des hormones ou 2o des antagonistes d'hormones tels que les corticostéroïdes, comme la prednisone ou les progestines. Les conjugués anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être préparés en conjuguant des substances cytotoxiques contenant soit la toxine intacte ou soit leur chaîne A dérivée avec l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon des techniques de l'homme de l'art (Chaudry et al., 1993 ; Sung et al., 1993 et 2s Selvaggi et al., 1993).
L'anticorps monoclonal selon l'invention peut également étre un anticorps monoctonal hétéroconjugué tel qu'une molécule hybride composée de deux ou plusieurs anticorps. Un hétéroconjugué inclut par exemple un anticorps monoclonal simple chaîne selon l'invention et un anticorps monoclonal simple chaîne qui est 3o spécifique d'un récepteur cellulaire (Kerr et al., 1990 et Hsieh-Ma et al., 1992).
Sous un autn: aspect, l'invention a pour objet une composition pharmaceutique pour ie traitement, la prévention ou pour le diagnostic in vivo de pathologie liée à
l'expression anormale de la protéine OZF, caractérisée en ce qu'elle comprend a) un anticorps monoclonal ou un de ses fragments, selon l'invention ; et 35 b) un excipient pharmaceutiquement acceptable.
9 De préférence, la composition pharmaceutique selon l'invention, est caractérisée en ce que ladite pathologie est choisie parmi les cancers, notamment le cancer du pancréas, du côlon ou du sein.
L'invention a également pour objet futilisaüon d'un anticorps monoGonal ou un de ses fragments selon (invention pour la fabrication d'un médicament destiné
à la prévention ou au traitement du cancer, notamment le cancer du pancréas, le cancer du côlon ou le cancer du sein.
En général, la dose d'anticorps monoclonaux marqués ou un de leurs fragments pour le diagnostic in vivo de pathologie liée à (expression anormale de ia lo protéine OZF, pourra varier en fonction de paramètres tels que l'âge, les conditions, le sexe, de l'étendue de fa maladie du patient, de contre-indications s'il en existe, de thérapies concomittantes ou d'autres variables qu'un homme de l'art saura ajuster.
L'administration de ces composés au patient peut ëtre locale ou systémique et accomplie par voie intraveineuse, infra-artérielle, par !'intermédiaire du liquide spinal, etc.. L'administration peut ëtre également effectuée par voie intradermique ou par voie intracavitaire, orale ou nasale, en fonction de la partie du corps qui doit ëtre examinée.
Après un temps suffisant permettant à l'anticorps monoclonal de se fixer sur la protéine OZF, par exemple de 30 minutes à 48 heures, on examine la partie du corps qui doit ëtre examinée par les techniques d'imagerie classiques telles que fIRM, ou l'imagerie 2o par scintillation. Le protocole exact dépendra nécessairement de facteurs spécifiques liés au patient, de la partie du corps à examiner, de la méthode d'administration et du type des marqueurs utilisés. Les procédures spécifiques pourront être déterminées par l'homme de l'art. La distribution des isotopes radioactifs fixés et leur décroissance avec le temps sera ensuite enregistrée et contrôlée. En comparant les résultats obtenus avec ceux obtenus pour des individus cliniquement normaux, la présence et la localisation de cellules tumorales pourront être déterminées et contrôlées.
La quantité d'anticorps monoclonaux comprise dans les compositions pharmaceutiques selon la présente invention et nécessaire pour une thérapie efficace dépendra de différents facteurs tels que le mode d'administration, la partie du corps 3o ciblée, l'état physiologique du patient, de l'administration d'autres médicaments, des éventuels effets secondaires, etc.. Le dosage pour de telles préventions ou traitements thérapeutiques devra être réalisé de manière à optimiser sa sécurité et son efficacité.
En général, les dosages utilisés in vitro peuvent fournir une indication pour les quantités utilisées pour l'administration d'anticorps monoclonaux in situ et ainsi des 3s modèles animaux peuvent être utilisés pour déterminer les quantités efficaces d'anticorps monoclonaux selon l'invention pour le traitement de pathologie particulière.
Ces méthodes sont en particulier discutées dans les ouvrages tels que Gilman et al.
(1990) et Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) pour des méthodes d'administration telles que les méthodes par voie orale, intraveineuse, intrapéritonale, 5 intramusculaire ou transdermique. Les excipients pharmaceutiquement acceptables incluent notamment l'eau, les solutions saunes, les tampons ou tout autre composé
décrit par exemple dans l'Index de Merck.
L'invention comprend en outre l'utilisation d'un anticorps monoclonal ou un de ses fragments pour le traitement, la prévention ou pour le diagnostic in vifro ou in vivo lo de pathologie liée à l'expression anormale de la protéine OZF, notamment pour le traitement, la prévention ou le diagnostic de cancer comme le cancer du pancréas, du côlon ou du sein, ladite utilisation étant comprise dans l'invention.
L'invention concerne également une méthode de détection et/ou de dosage de la protéine OZF dans un échantillon biologique caractérisée en ce qu'elle comprend les 1s étapes suivantes a) la mise en contact d'un échantillon biologique avec un anticorps monoclonal selon l'invention ; et b) la détection et/ou le dosage de la fixation dudit anticorps sur la protéine OZF
contenue dans (échantillon biologique.
2o Par ailleurs, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon l'invention, peuvent également être utilisés pour l'identification, ia localisation, notamment tissulaire ou cellulaire, et/ou le dosage de la protéine OZF, ladite utilisation étant comprise dans l'invention.
Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon l'invention constituent 25 également un moyen d'analyse immunocytochimique ou immunohistochimique de l'expression de la protéine OZF sur des coupes de tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, par marquage enzymatique, radioactif ou à l'or. Ils permettent notamment de mettre en évidence et de quantifier la présence spécifique normale ou anormale de la protéine OZF dans les tissus ou prélèvements biologiques, ce qui les 3o rend utiles pour (identification et la localisation de l'expression de la protéine OZF, pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de la protéine OZF
mais également pour le suivi de l'évolution de méthodes de prévention ou de traitement de pathologie nécessitant ladite détection ou ledit dosage.
Plus généralement, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon 35 l'invention peuvent ëtre avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où
l'expression de la protéine OZF doit être observée de manière qualitative et/ou quantitative.
De préférence, l'échantillon biologique est constitué par un fluide biologique, tel que le sérum, le sang total, des cellules, un échantillon de tissu ou des biopsies d'origine humaine.
Toute procédure ou test classique peut être mise en oeuvre pour réaliser une telle détection et/ou dosage. Ledit test peut être un test par compétition ou par sandwich, ou tout test connu de l'homme de l'art dépendant de la formation d'un complexe immun anticorps-antigène. Suivant les applications selon l'invention, l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments peut être immobilisé ou marqué.
Cette immobilisation peut être réalisée sur de nombreux supports connus de l'homme de l'art. Ces supports peuvent notamment inclure le verre, le polystyrène, le polypropylène, ie polyéthylène, le dextran, le nylon, ou des celluloses naturelles ou modifiées. Ces supports peuvent être soit solubles ou insolubles.
A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus immunoenzymatiques selon la technique ELISA, par immunofluorescence, ou radio-immunologique (RIA) ou équivalent.
L'invention comprend également une trousse pour la détermina~on de la présence de protéine OZF dans un échantillon biologique comprenant un anticorps ou 2o un de ses fragments selon l'invention.
Entre également dans le cadre de l'invention, une trousse pour la détection et/ou le dosage de la protéine OZF selon l'invention dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants a) un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention ;
b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ;
c) les réacüfs permettant la détection des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique.
Sous un dernier aspect, l'invention a pour objet une méthode pour évaluer l'affinité d'un composé à tester pour la protéine OZF, caractérisée en ce qu'elle comprend a) la mise en contact d'un échantillon contenant ladite protéine OZF avec i) un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention ; et ü) ledit composé à tester ; et b) la mesure de la quantité dudit anticorps monoGonal ou l'un de ses fragments, ladite quantité étant inversement proportionnelle à la quantité de composés à
tester fixés sur ladite protéine OZF.
Les anticorps monoclonaux selon l'invention ou leurs fragments peuvent être utilisés également dans des méthodes in vitro pour la sélection de composés susceptibles de se fixer à la protéine OZF avec l'affinité recherchée. Ainsi, la présente invention comprend également des méthodes de sélection par compétition de composés pharmaceutiques dans lesquelles les anticorps monoclonaux de l'invention ou leurs fragments entrent en compétition avec le composé à tester susceptible de se 1o fixer à la protéine OZF. De cette manière, (anticorps monoclonal ou ses fragments est utilisé pour détecter la présence de tout composé tel qu'un polypeptide ou tout autre composé organique qui peuvent présenter un ou plusieurs sites de reconnaissance de fépitope de la protéine OZF reconnu par les anticorps selon l'invention. Ainsi ces composés, identifiés par la méthode selon l'invention pourront être utilisés pour occuper ces sites de fixation sur la protéine OZF et agir en tant qu'agent modulateur ou antagoniste de l'activité biologique de la protéine OZF.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après.
LEGENDES DES FIGURES
FIGURES 1A et 1B. Analyse par Southem blot de lignées cellulaires pancréatiques et de tumeurs primaires.
Figure 1A : Hybridation par Southem blot des ADN totaux génomiques de placenta et de douze lignées cellulaires d'adénocarcinomes pancréatiques digérés par Bglll. Trois lignées cellulaires, AtCPC-1, BxPC-3, Su.86.86 présentent une co-amplification d'OZF
avec RAC. PANG1 présente une amplification de RAC uniquement.
Figure 1 B : Hybridation par Southem blot de i'ADN total génomique de AICPC-1 (figure 1A), de placenta (P) et de douze tumeurs primaires d'adénocarcinomes pancréatiques 3o digérées par Bglll. La comparaison des intensités des signaux d'hybridation d'OZF
avec ceux obtenus après réhybridation avec une sonde N-myc montre une augmentation du nombre de copies du gène dans les échantillons tumoraux T6 et T9.
FIGURE 2. Expression de fARNm d'OZF dans les lignées cellulaires pancréatiques.
L'ARN, des douze lignées cellulaires d'adénocarcinomes pancréatiques analysées par Southem blot dans les figures 1A et 1 B, était analysé par Northern blot avec une sonde d'ADNc contenant la phase ouverte de lecture d'OZF. AICPC-1, BxPC-3, Su.86.86 ayant OZF amplifié, présentent un haut niveau d'expression. De hauts niveaux d'expression d'OZF sont observés en absence d'amplification dans Capan-1, -2, MlA
PaCa-2 et PANC-1. L'absence ou une très faible expression a été observée dans un échantillon de pancréas normal adulte (Clontech). Le gel correspondant, coloré
avant transfert au bromure d'éthidium, est montré en dessous, avec les bandes d'ARN
ribosomiques 28S et 18S.
FIGURES 3A, 3B et 3C. Analyse par Western blot de lignées cellulaires pancréatiques et de tumeurs primaires. Des quantités identiques de protéine (10 Ng), déterminées par lo coloration des extraits après électrophorèse sur gel SDS (non montré) ont été
transférées sur nitrocellulose. La nitrocellulose a été alors bloquée et hybridée avec un anticorps polyclonal anti-OZF.
Figure 3A : Lignées cellulaires pancréatiques précédemment analysées par Southern et Northem blot (figure 1A et figure 2).
Figure 3B : Immunotransfert d'OZF d'échantillons de tumeurs primaires d'adénocarcinomes pancréatiques.
Figure 3C : Immunotransfert d'OZF de pancréas normal humain. Les protéines ont été
extraites dans les mêmes conditions pour les quatre échantillons indépendants de pancréas normaux (P1-P4), la lignée MIA PaCa-1 (MP) et pour un carcinome pancréatique (T6) exprimant OZF. La nitroceHulose a été hybridée avec des anticorps polyclonaux anti-OZF et anti-pag afin de vérifier l'intégrité des protéines.
Les anticorps anti-pag sont des anticorps de poule purifiés dans les mémes conditions que les anti-OZF.
FIGURES 4A, 4B et 4C. Détection par immunohistochimie d'OZF dans les carcinomes 2s pancréatiques humains. La coloration à la péroxydase a été obtenue avec un anticorps anti-OZF purifié par affinité. Les anticorps anti-OZF montrent une coloration granulaire nucléaire dans les cellules AICPC-1 greffées chez la souris athymique (figure 4A), dans un adénocarcinome exprimant OZF (figure 4B), et l'absence de coloration dans du pancréas sain n'exprimant pas OZF (figure 4C) (grossissement : 1000X).
3o FIGURE 5. Analyse par Western blot d'extraits bruts de cellules humaines 293 non transfectées et transfectées par un vecteur d'expression OZF. Détection de la protéine OZF endogène (à gauche) et après détection transitoire par un vecteur d'expression du gène OZF (à droite) en triplicata, avec un anticorps monoclonal anti-OZF et un anticorps secondaire anti-souris couplé à la péroxydase, par chimio-luminescence.
FIGURE 6. Marquage immunocytochimique de la protéine OZF dans les cellules de la lignée AICPC-1 issue d'un adénocarcinome pancréatique surexprimant la protéine OZF. Les cellules sont cultivées sur lamelle, fixées par 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS, puis perméabilisées par 0,1 % de triton X100. Les sites non spécifiques sont saturés par 2 % de BSA. Les cellules sont incubées 1 h avec l'anticorps monoclonal anti-OZF (1/200), lavées puis mises en contact 30 mn avec le second anticorps anti-souris couplé à un fluorochrome, lavées et incubées 4 mn au DAPI (0,2 Ng/ml) qui marque spécifiquement les noyaux (photos de gauche). Un marquage nucléaire spécifique d'OZF est observé (photos de droite). A faible grossissement en haut et à
1o fort grossissement en bas.
FIGURE 7. Expression du gène OZF dans les cancers du côlon. Analyse par Western blot.
A l'aide des anticorps monoclonaux, nous avons examiné l'expression de la protéine OZF dans les cancers du côlon. L'étude a porté sur 16 échantillons coliques.
Sur les 16 échantillons, 10 proviennent d'une tumeur colique (T1 - T3 - T5 - T6 - T7 -T10 - T11 - T12), et 6 de muqueuses coliques saines (C2 - C4 - C5 - C6 - C8 -C12).
Les échantillons T5 et C5 proviennent d'un même patient, de méme que T6 - C6, C8, et T12 - C12. Nous avons déposé dans les puits d'électrophorèse des quantités équivalentes de protéine pour chaque échantillon colique, les échantillons sont séparés 2o par migration sur gel de polyacrylamide, puis transférés sur une membrane de PVDF.
La protéine OZF est révélée par l'anticorps monoclonal anti-OZF et un anti-anticorps de souris couplé à la péroxydase.
Dans les quatre cas où nous avions un échantillon colique sain et un échantillon colique cancéreux prélevés chez une mëme personne, nous avons constaté une accumulation plus importante de la protéine OZF dans le tissu tumoral que dans le tissu normal.
En comparant la quantité de protéine OZF accumulée, nous constatons que les tissus tumoraux T1 - T3 - T5 - T7 - T8 - T9 - T10 - T12 présentent une quantité
supérieure de protéine OZF par rapport aux tissus sains.
3o FIGURE 8. Comparaison des séquences d'acides aminés N-terminales des protéines OZF suivant leur origine et leur réactivité avec les anticorps monoclonaux.
Comparaison de la région N-terminale de deux allèles de la protéine OZF
humaine (hu-OZF) qui diffèrent par un polymorphisme à la position 8 (KIR) avec la protéine OZF
d'origine mucine (mu-OZF) et bovine (bo-OZF). La séquence du peptide synthétique utilisé dans les expériences d'inhibition compétitive est indiquée au-dessus (PEPTIDE).
Le résidu tyrosine en position 10 est souligné. La séquence de la protéine porteuse MBP est indiquée en petites lettres majuscules pour la protéine MBP-OZF. Le chaînon consensus HIC {"H/C link") précédent le premier doigt de zinc correspond à la position 11-17.
s * indique les positions parfaitement conservées ;
° indique le polymorphisme K/R.
La réactivité avec l'anticorps monoGonal 5B8 selon l'invention est indiquée dans la colonne de droite (+ : positive ; - : négative).
lo EXEMPLES
Matériels et méthodes Echantillons tumoraux et lignées cellulaires. Onze lignées de cellules d'adénocarcinomes de pancréas ont été obtenues de fAmerican Type Culture Collection (Rockville, USA) et cultivées comme prescrit par le fournisseur.
Une lignée ls cellulaire additionnelle (AICPC-1) a été établie au laboratoire à partir de la tumeur primitive d'une patiente agée de soixante ans atteint d'un adénocarcinome du pancréas. Les cellules ont été cultivées dans du milieu Dubelcco modifié
supplémenté
avec 20 % (vol/vol) de sérum de veau foetal. Des tissus tumoraux ont aussi été
obtenus de patients atteints de carcinome primaire du pancréas exocrine (n =
13 ; 6 2o hommes et 7 femmes).
Analyse par Southem et par Northern blot. L'extraction d'ADN a été effectuée suivant les méthodes standards pour les lignées cellulaires et pour les tumeurs congelées (Sambrook et al., 1989). Les fragments obtenus après digestion de l'ADN
génomique (5 Ng) avec fendonucléase Bgll ont été séparés par électrophorèse sur gel 2s d'agarose à 0,7 %, transférés sur nitrocellulose (BA85, Schleicher et Schuell) et hybridés avec des sondes marquées au P32 (Le Chalony et al., 1996). Les lignées de cellules tumorales ont été hybridées avec une sonde OZF obtenue après amplification par PCR à l'aide d'amorces internes pour générer un fragment de 1 kb contenant toute la phase ouverte de lecture (847-1840). Les carcinomes pancréatiques primaires ont 3o été hybridés avec un fragment cloné Xbal/Scal (652-1852) (Le Chalony et al., 1994).
La sonde RAC (2,2 kb) a été préparée à partir d'un clone pUC-RAC à l'aide d'amorces universelles situées de part et d'autre du site multiple de clonage (Cheng et al., 1992).
L'évaluation quantitative des signaux d'hybridation a été faite au phosphorimager (BioRad). Les ARN totaux ont été extraits à l'aide du kit Rneasy {Qiagen).
Pour les 35 analyses en Northem blot, 10 Ng d'ARN ont été déposés sur gel d'agarose 1 %
I 2,2 M
formaldéhyde, transférés après migration sur membrane de nitrocellulose (BA85, Schleicher et Schuell) et hybridés avec la sonde Xbal/Scal.
Production des anticorps polyclonaux. Les antisérums ont été développés chez la poule en utilisant la protéine OZF purifiée comme immunogène (Ferbus et al., 1996).
s Les immunoglobulines IgY de jaune d'oeuf de poule ont été préparés comme décrit (Akita et al., 1992). Les anticorps spécifiques ont été obtenus à partir des IgY anti-OZF
après purification par affinité sur une colonne de MBP-OZF couplé au sépharose (Pharmacia) (Ferbus et al., 1996). La spécificité des anticorps anti-OZF a été
vérifiée par immunoélectrophorèse. Une bande unique de 33 kDa a été observée dans les 1o extraits nucléaires des cellules exprimant OZF.
Méthode de préparation de l'anticorps monoclonal. La protéine recombinante de fusion MBP-OZF produite chez E. soli a été purifiée sur colonne d'amylose par affinité
pour le MBP (Ferbus et al., 1996). Des souris ont été immunisées avec la protéine MBP-OZF purifiée. L'immunisation de souris Balblc est réalisée par trois injections 15 sous-cutanées à deux semaines d'intervalle de 50 Ng de protéine MBP-OZF
purifiée.
La réponse immune anti-OZF est contr8lée par ELISA et immunoblot en utilisant la protéine MBP-OZF. Trois jours avant la fusion, 100 pg de protéine MBP-OZF sont injectés par voie intraveineuse aux souris ayant les plus hauts titres d'anti-sérum.
Après le test de criblage en ELISA, nous avons sélectionné pour l'étape de fusion la 2o souris qui présentait la meilleure réponse. Les leucocytes spléniques ont été fusionnés avec les cellules de la lignée myélomateuse P3X63/8.653 en présence de polyéthylèneglycol à 50 %. Après "HAT' sélection dans la culture bn.ite, les hybridomes sont encapsulés individuellement dans des gouttelettes d'agarose biotinylé et marqués par la protéine MBP-OZF conjuguée à fisothiocyanate de fluorescine (+) et par la 25 protéine MBP-PAG conjuguée à la phycoérythrine (-). La suspension de gouttelettes est ensuite analysée par cytométrie de flux et seuls les hybridomes réagissant avec le conjugué MBP-OZF sont isolés et Gonés suivant la technique de "sécrétion capture report web" (SCRW) (Kenney et al., 1995).
Les anticorps monoclonaux sont purifiés à partir du surnageant de culture des 3o hybridomes par chromatographie d'affinité sur colonne protéine G Sépharose (Pharmacia).
Les immunoglobulines produites sont en majorité des IgG1.
L'anticorps monoclonal spécifique de la protéine OZF humaine reconnaït celle-ci à (état natif ou dénaturé (en ELISA, en Western, en immunohistochimie, par 35 immuno-précipitation).
Technique EL-ISA pour ia sélection et la caractérisation des anticorps monoclonaux.
- Incubation de microplaques 96 puits pour ELISA en présence de 50 NI par puits d'une solution de MBP-OZF ou MBP-PAG (témoin) à 10 Ng/ml en tampon carbonate-s bircarbonate 0,05 M, pH 9,6, une nuit à 4°C.
- Saturation avec une solution d'albumine bovine sérique à 2 % en tampon phosphate salin pH 7,3 (PBS).
- Addition de 25 Irl de surnageant brut de culture de fhybridome avec 25 ul d'une solution de Tween à 0,1 % en tampon PBS et incubation 2 heures à 37°C.
- Après lavage, addition de 50 NI d'une solution au 1/10 000 d'anticorps de chèvre anti-souris conjugués à la phosphatase alcaline (Sigma, St Louis, MO) et incubation heure à 37°C.
- Détection avec une solution de p-nitrophényl phosphate à 1 mg/ml en tampon diéthanolamine, pH 9,8, MgCl2 0,5 mM.
- Mesure de fabsorbance à 405 nm avec un lecteur microplaque (Titertek Multiscan de chez Labsystem, les Ulis, France).
Les isotypes des anticorps monoclonaux sont déterminés par ELISA en utilisant un kit pour le sous-typage d'hybridome murin (Boehringer-Mannheim, Allemagne).
L'épitope de reconnaissance se situe au niveau de son extrémité NH2 2o terminale. II reconnaît en effet la protéine OZF recombinante tronquée, ne possédant que les deux premiers doigts à zinc, et ne reconnaît pas la protéine murine homologue qui diffère de la protéine humaine au niveau de ses quinze premiers acides aminés.
Extraction des protéines et analyse par Western blot avec anticorps polyclonaux.
Les échantillons tumoraux congelés et les extraits cellulaires ont été
solubilisés dans du tampon SDS en présence de ø-mercaptoéthanol et chauffés à ébullition 5 minutes.
Des quantités égales de protéines (10 Ng) ont été chargées sur gel SDS
polyacrylamide 12 % et transférées après migration sur membrane de PDVF
(Amersham). Les membranes ont été hybridées avec les anticorps anti-OZF puis avec des anti-poules de lapin conjugués à la phosphatase alcaline (Sigma), dilués 3o respectivement 200 et 15 000 fois. La chimioluminescence a été produite par incubation de la membrane avec du CDP star (Dupont) et la protéine a été
révélée par autoradiographie sur un fitm X-OMAT ARS.
Extraction des protéines et analyse par Western blot avec anticorps monoclonaux. Les cellules sont cultivées à confluence, trypsinées, concentrées par centrifugation et lysées avec du tampon (65 mM Tris-HCI, pH 6,8, 0,01 % bleu de bromophénol, 5 % ~i-mercaptoéthanol, 10 % glycérol, 2 % SDS) en présence d'inhibiteurs de protéase, chauffées à ébullition puis soniquées. 50 Ng d'extrait cellulaire ou 0,05 Ng de protéine recombinante sont chargés dans chaque puits.
Les protéines sont séparées par électrophorèse sur un gel polyacrylamide à 12 % en SDS
s et transférées sur membrane PDVF (immobilon-P, Millipore). L'efficacité du transfert de protéine est contr8lée par coloration Ponceau S. L'analyse par Western blot est réalisée selon la technique décrite dans Ferbus et al., 1996. Les blots sont hybridés pendant 2 heures avec des anticorps anti-OZF dilués au 1/500 puis avec des IgG
anti-souris de chèvre conjugués à la phosphatase alcaline dilués au 1/10 000. Les mêmes lo conditions sont utilisées pour le témoin positif avec des anticorps anti-OZF de poulet dilués au 1/200 et des anticorps anti-poulet IgY de lapin au 1/10 000. La phosphatase alcaline est détectée par chimioluminescence avec le réactif CDP-star (NEN
Live Science Products) et visualisée par autoradiographie (X-OMAT AR, Kodak, Rochester, NY).
15 Immunofluorescence. Les cellules sont cultivées dans des lames Lab-Teck à
chambre (Nunc Inc., Naperville, IL) pendant 24 heures. Les lames Lab-Teck sont lavées deux fois en PBS et fixées avec une solution à 4 % de paraformaldéhyde en PBS (p/v) pendant 15 minutes à température ambiante. Les cellules sont ensuite rincées en PBS et incubées deux fois pendant 30 minutes dans une solution à
0,1 M
2o glycine, 0,2 M Tris-HCI pH 7,5 puis perméabilisées dans une solution de triton X100 à
0,1 % (v/v) dans du PBS pendant 5 minutes. Les anticorps anti-OZF purifiés sont incubés pendant une heure à 37°C (dilution au 1/100) en tampon PBS à
0,5 d'albumine bovine sérique (p/v). Après lavage, les cellules sont incubées pendant 30 minutes à 37°C avec des anticorps IgG (H+L) anti-souris de chèvre conjugués à la 25 FITC (isothiocyanate de fiuoréscéine) dilués au 1/80 (Biosys S.A., France).
Les lames sont colorées par contraste avec du DAPI (4'6-diamidino-2-phénylindole) pour la coloration de l'ADN de la chromatine, fixées par une solution (Vectashield, Vector Laboratoires, Inc., Burlingame, CA) et observées sous un microscope à
fluorescence.
Marquage immunohistochimique d'OZF. La coloration a été obtenue par un anti-3o poule couplé à la péroxydase après incubation avec un antisérum anti-OZF de poule purifié, sur des coupes de tissu congelé (5 Nm) comme décrit (Terris et al., 1995).
Transfection des cellules N1H3T3. La surexpression d'OZF est réalisée par transfection d'une lignée cellulaire murine NIH3T3 avec un vecteur plasmidique exprimant la protéine OZF dans des cellules eucaryotes. Le milieu de culture est 35 ensemencé avec une densité cellulaire de 0,8 x 106 cellules dans des boïtes de pétri de diamètre 60 mm puis les cellules sont transfectées 24 h plus tard avec 2 Ng de plasmide en utilisant la technique de calcium-phosphate. 5 à 6 h après la transfection les précipités sont éliminés et les cellules sont remises en milieu de culture. Le jour suivant, les cellules sont transférées dans des lames Lab-Tek à chambre et fixées avant l'analyse par immunofluorescence.
EXEMPLE 1 : Amplification du gène OZF dans les lignées d'adénocarcinomes pancréatiques Pour évaluer le nombre de copies du gène OZF dans les cellules des lignées 1o tumorales et déterminer s'il appartient à famplicon portant le gène RAC, les ADN
génomiques totaux, de 12 lignées cellulaires et d'un placenta, ont été digérés avec l'enzyme de restriction Bglll, séparés sur gel d'agarose et hybridés par Southem blot avec des sondes ADN OZF et RAC. Comme montré dans la figure 1A, trois lignées, AICPC-1, BxPC-3, SU.86.86 présentent un signal d'amplification dans un fragment génomique Bglll de taille de 5,3 kb. La quantification des niveaux d'amplificaüon révèle que le gène OZF est approximativement de 60 copies, 6 copies et 30 copies dans AICPG1, BxPC-3, SU.86.86 respectivement. La co-amplification avec RAC est observée dans ces trois lignées, cependant PANC-1 montre une ampl~cation de RAC
seule. Le nombre de copies des gènes RAC et OZF est similaire dans BxPC-3.
2o L'intensité relative du signal d'amplification est supérieure pour le gène OZF que pour RAC dans AICPC-1 et inférieure dans SU.86.86. Ces expériences montrent que le gène OZF est co-amplifié avec RAC dans trois des quatre lignées cellulaires.
Contrairement à ce qui avait été reporté, l'amplification de RAC dans la lignée AsPG1 n'est pas détectée (Cheng et al., 1996 ; Miwa et al., 1996). Les analyses caryotypiques des lignées cellulaires ont confirmé la ploïdie et la spé~cité du marquage chromosomique de chaque lignée incluant AsPG1 (Curtis et al., à para?tre).
L'amplification précédemment décrite dans AsPC-1 peut être due à un sous clone ou avoir été perdue pendant la propagation en culture.
L'état d'amplification d'OZF a été examiné dans des échantillons tumoraux.
3o Douze adénocarcinomes primaires pancréatiques, pris au hasard, ont été
analysés par Southem blot avec une sonde OZF (figure 1 B). Deux tumeurs (T6 et T9) présentent une augmentation du signal d'hybridation (de 3 à 5 fois) par rapport à l'ADN
placentaire, après normalisation avec le signal obtenu après réhybridation avec une copie unique du gène N-myc. Ce signal est considéré comme significatif pour l'amplification étant donné la forte proportion de cellules non tumorales dans les tissus tumoraux.
EXEMPLE 2 : Expression d'OZF dans les lignées pancréatiques et dans les échantillons tumoraux 5 L'expression d'OZF a été examinée en premier dans les lignées tumorales par Northem blot (figure 2). Différents niveaux d'expression ont été détectés dans toutes les lignées. Les lignées AICPC-1 et SU.86.86 qui présentent les plus hauts niveaux d'ampt~cation expriment les plus hauts niveaux de mRNA OZF. Une expression modérée est observée dans BxPC-3, Capan-1, Capan-2, MIAPaCa-2 et PANC-1, et 1o une plus faible expression est trouvée dans les quatre lignées restantes.
L'expression d'OZF a été aussi recherchée au niveau protéique par Western blot en utilisant un anticorps polyclonal dirigé contre la protéine OZF
recombinante exprimée chez E.ooli (Ferbus et al., 1996). La protéine OZF a été détectée dans toutes les lignées cellulaires (figure 3A). Le plus haut niveau de la protéine est trouvé dans les 15 lignées cellulaires qui présentent une amplification du gène OZF {AICPC-1, BxPC-3 et SU.86.86). Comme le tissu pancréatique présente des ARN souvent dégradés, l'expression d'OZF a été étudiée dans les tumeurs et le pancréas normal par la détermination de l'accumulation de sa protéine. Afin de comparer le taux de la protéine OZF dans le pancréas normal adulte avec ceux trouvés dans les tumeurs, les 2o protéines de quatre échantillons pancréatiques différents ont été extraites selon le protocole standard et analysées par Western blot (figure 3C). L'intégrité des extraits a été contra" lée par l'utilisation d'un anticorps polyclonal dirigé contre la protéine ubiquitaire PAG de 22 kDa qui est exprimée dans les cellules en prolifération (Prospéri et al., 1993). Parmi les huit échantillons d'adénomes pancréatiques primaires étudiés, trois présentent un faible niveau de la protéine OZF comme dans les échantillons de pancréas sains. Cinq tumeurs (T6-T9, T12) présentent les plus hauts niveaux d'OZF
(figures 3B et 3C). Par conséquent le gène OZF est exprimé à hauts niveaux dans plus de la moitié des adénocarcinomes analysés.
EXEMPLE 3 : Restriction de l'expression d'OZF aux cellules tumorales dans les 3o tumeurs pancréatiques L'utilisation possible d'anticorps anti-OZF dans des études immuno-histochimiques a été déterminée. L'expression d'OZF a été détectée (figure 4A) dans une tumeur obtenue après greffe des cellules AICPC-1 chez la souris athymique.
L'immunohistochimie a été effectuée sur des coupes de carcinomes pancréatiques congelés afin de détem3iner si d'autres types cellulaires en plus des cellules tumorales, contribuent à l'expression d'OZF. Un exemple de carcinome pancréatique montrant une expression d'OZF est montré en figure 48. Les anticorps anti-OZF révèlent par coloration une granulation nucléaire qui prédomine dans les cellules tumorales. Les autres types cellulaires comme les fibroblastes et les cellules endothéliates présentent s une très faible ou une absence de coloration. Ainsi dans les tumeurs pancréatiques l'expression d'OZF est restreinte principalement aux cellules tumorales et les anticorps anti-OZF peuvent être utilisés pour détecter les cellules tumorales dans des tumeurs pancréatiques hétérogènes.
EXEMPLE 4 : Expression du gène OZF dans les cancers du c8lon 1o A l'aide des anticorps monoclonaux, (expression de la protéine OZF a été
examinée dans les cancers du côlon. L'étude a porté sur 16 échantillons coliques. Sur les 16 échantillons, 10 proviennent d'une tumeur colique (T1 - T3 - T5 - T6 -T9 - T10 - T11 - T12), et 6 de muqueuses coliques saines (C2 - C4 - C5 - C6 -C12). Les échantillons T5 et C5 proviennent d'un méme patient, de même que T6 -C6, 15 T8-CB,etT12-C12.
Analyse par Western blot Des quantités équivalentes de protéine pour chaque échantillon colique sont déposées dans les puits d'électrophorèse. Les échantillons sont séparés par migration sur gel de polyacrylamide, puis transférés sur une membrane de PVDF. La protéine 2o OZF est révélée par l'anticorps monoclonal anti-OZF et un anti-anticorps de souris couplé à la péroxydase. Le résultat est présenté figure 7.
Dans les quatre cas où l'échantillon colique sain et (échantillon colique cancéreux sont prélevés chez une mëme personne, une accumulation plus importante de ia protéine OZF est constatée dans le tissu tumoral que dans le tissu normal.
2s En comparant la quantité de protéine OZF accumulée, on constate que tes tissus tumoraux T1 - T3 - T5 - T7 - T8 - T9 - T10 - T12 présentent une quantité
supérieure de protéine OZF par rapport aux tissus sains.
D'après les résultats, 50 % des tissus cancéreux analysés présentent une forte surexpression d'OZF et 80 % des échantillons tumoraux analysés ont un niveau 3o d'expression de la protéine OZF supérieur à celui observé dans les tissus normaux.
Ces observations montrent que le gène OZF est surexprimé dans fes cancers du côlon.
Les résultats obtenus dans les exemples précédents montrent que s5 l'amplification du gène OZF a été observée dans 3 des 12 lignées d'adénocarcinomes du pancréas (AICPC-1, BxPC-3 et SU.86.86). L'augmentation du nombre de copies du gène a été aussi trouvée dans 2 des 12 échantillons de tumeurs primaires (T6 et T9), quoiqu'à des niveaux plus faibles que ceux observés dans les lignées. Parce que les tumeurs primaires pancréatiques contiennent généralement un large excès de cellules s normales, l'hybridation du signal en Southem blot peut avoir été atténuée dans les tumeurs T6 et T9. De plus, les échantillons contenant peu de cellules tumorales, présentant un signa! d'amplification modéré, échappent à la détection. Les xénogreffes sur souris athymiques devraient nous permettre une meilleure estimation de l'amplification du gène OZF dans les tumeurs pancréatiques primaires. En addition à
io ces résultats, l'amplification d'OZF a été ident~ée par hybridation in situ en fluorescence dans la tumeur utilisée pour générer la lignée AICPC-1 (Curtis et al., à
paraître). Ainsi, l'amplification d'OZF a lieu dans les tumeurs pancréatiques primaires et dans les lignée cellulaires.
Toutes les lignées d'adénocarcinomes pancréatiques expriment fARNm et la 15 protéine OZF mais à des niveaux différents. Les plus hauts niveaux d'ARNm d'OZF ont été trouvés dans les lignées ayant ampl~é le gène OZF (AICPG1, BxPG3 et SU.86.86). Quoique (estimation de la protéine peut ëtre moins précise, le taux de la protéine OZF a été comparé dans les deux tumeurs primaires présentant une amplification du nombre de copies (T6 et T9), à la lignée cellulaire MIAPaCa-2. Les 2o deux tumeurs expriment de hauts niveaux de protéines OZF. Ainsi, le gène OZF qui est hautement exprimé dans toutes les tumeurs pancréatiques présentant une amplification, n'est pas inactivé dans famplicon 19q13.1.
L'amplification génique est un mécanisme important pour l'augmentation de l'expression de gènes impliqués dans la cancérogenèse même si la surexpression est 25 souvent observée en absence d'amplification. Les études d'expression de quatre échantillons indépendants de pancréas normaux et de trois échantillons de tumeurs primaires montrent des niveaux de protéines OZF très faibles ou indécelables.
Au contraire, toutes les lignées expriment OZF et quatre d'entre elles montrent de hauts niveaux d'ARNm OZF en absence d'amplification. Le cas le plus significatif est celui de 30 la lignée PANC-1 qui possède deux copies du gène OZF et exprime un haut niveau d'ARNm de 2 à 4 fois plus bas que celui de la lignée SU.86.86 qui possède 30 copies du gène OZF. De hauts niveaux de protéine OZF sont aussi observés dans des tumeurs primaires sans amplfication du gène OZF, et fimmunohistochimie montre que la protéine OZF est détectée essentiellement dans les cellules tumorales. En dehors ss du statut d'amplification génique, OZF est surexprimé dans 7 des 12 lignées tumorales et dans 5 des 8 tumeurs primaires. Les plus hauts niveaux d'expression d'OZF
dans un large échantillon de tumeurs comparé au pancréas normal suggèrent que ce gène est impliqué dans le processus oncogénique. De plus il pourrait être utilisé comme un marqueur pour détecter de rares cellules tumorales dans le pancréas.
En dehors du gène OZF, la région q13.1 du chromosome 19 comprend plusieurs gènes candidats. Le mieux caractérisé est le gène RAC, localisé à
proximité
d'OZF, qui code pour une sérine-thréonine kinase (The Human Gene Map, 1997).
Les deux gènes sont coamplifiés dans les lignées cellulaires, cependant seul le gène RAC
a été trouvé amplifié dans PANC-1. Cependant, dans la lignée PANC-1, dans laquelle le gène RAC est amplifié, les niveaux d'ARNm sont seulement légèrement plus bas que ceux observés dans les lignées cellulaires qui présentent une amplification du gène OZF. Cette lignée cellulaire contient aussi une protéine OZF abondante.
Ainsi, la surexpression d'OZF dans PANC-1 peut être due à un mécanisme autre que l'amplification génique comme dans le cas d'autres gènes connus. Par exemple dans 1s les cancers du sein et de l'ovaire, la prévalence de la surexpression HER2/neu intervient plus fréquemment que l'amplification et a été utilisée pour prédire le taux de survie (Slamon et al., 1989).
EXEMPLE 5 : Sélection des hybridomes et caractérisation des anticorps monoclonaux A. Sélection des hvbridomes Après immunisation puis fusion cellulaire les anticorps sécrétés par un seul hybridome sont examinés en utilisant la technique SCRW et sélectionnés une à
une par cytométrie de flux. 22 surnageants réagissant par FACS (trieur automatique de cellules par cytométrie de flux par fluorescence) avec la protéine OZF
recombinante et ne réagissant pas avec la protéine porteuse MBP sont testés pour leur activité
avec la protéine recombinante MBP-OZF. La moitié des lignées cellulaires sont positives par ELISA et immunoblot (cf. tableau 1 ). Aucune réactivité n'est observée après ELISA sur la protéine MBP-PAG indiquant que ces surnageants sont spécifiques du polypeptide 3o OZF (Prospéri M-T et al., 1993). Dans la mesure où certains anticorps monoclonaux peuvent réagir avec des épitoges résultant de la fusion avec la protéine porteuse MBP
la réactivité des surnageants a été examinée avec la protéine OZF produite par des cellules eucaryotes. Après analyse par immunoblot et immunofluorescence en présence de protéines OZF endogènes issues de cellules mammaires humaines HBL
100, six anticorps monoclonaux ont été sélectionnés sur la base de leur forte réactivité
avec la protéine OZF humaine (cf. tableau 1 ci-dessous).
TABLEAU 1 : Criblage et sélection des anticorps monoclonaux anti-OZF.
LIGNES ELISA ELISA IMMUNOBLOT IMMUNOBLOT IFA
CELLULES CELLULES
4A5 + - + _ _ 5B1 - ' - - _ 5B8 +++ - +++ +++ ++
5B9 + - + _ +
4C3 _ - _ _ _ 4C8 + - + _ 5C10 +++ - +++ +++ +++
5C11 +++ _ _ - +
5D9 +++ _ +++ _ ++
5D10 + _ - _ 5D11 + _ _ _ _ 5E9 ++ - ++ + +
5E10 +++ _ _ _ +
5F1 + _ _ _ _ 5F4 + - _ _ _ 5F8 + - - _ -5G10 +++ - -+++ +++ +
5H2 _ - - _ - _ 5H4 +++ _ +++ _ _ 5H7 +++ - +++ +++ +++
5H8 +++ _ ++ _ +
4H10 +++ _ +++ +++ +++
Légende du Tableau 1 : Les surnageants bruts de culture de 22 clones d'hybridomes sélectionnés par la technique SCRW ont été testés successivement par ELISA
contre les protéines recombinantes MBP-OZF et MBP-PAG, puis ensuite par immunoblot et 1o immunofluorescence {IFA) contre la protéine MBP-OZF et la protéine OZF
endogène issue de cellules HBL 100 humaines. La protéine recombinante MBP-PAG a été
utilisée comme témoin négatif.
B. Caractérisation des anticorps monoclonaux s Après purification sur colonne protéine G Sépharose les sous-types d'immunoglobuline des six anticorps monoclonaux sélectionnés ont été
déterminés.
Cinq anticorps (5B8, 5C10, 5610, 5H7, 4H10) appartiennent au sous-type tgG1 et un anticorps au sous-type IgG3 (5D9). Les anticorps monoGonaux ont également été
testés par immunoblot et immunofluorescence avec différents extraits de cellules de 1o mammifères. L'analyse par Western blot sur des extraits humains (cellules de sein, de rein, de côlon et de pancréas) détectent une bande unique de 33 kDA
caractéristique de la protéine OZF. De manière inattendue, les anticorps monoclonaux ne reconnaissent pas les protéines OZF bovine et mucine en dépit de leur forte identité
(95 %) avec la protéine OZF humaine (Le Chalony, C. et al., 1996 ; Blottière L. et al., 1s 1999). L'absence de réactivité ne résulte pas du processus de traduction dans la mesure où les protéines OZF mucine traduites in vitro ne sont pas non plus détectées.
Les mêmes résultats sont observés par immunofluorescenoe (cf. tableau 2 ci-dessous), une forte expression nucléaire d'OZF est observée après transfection des cellules mucines NIH3T3 avec le vecteur d'expression. Aucune fluorescence n'est 2o visible sur les cellules mucines NIH3T3 non transfectées. Par conséquent, les six anticorps monoclonaux ainsi produits et caractérisés selon (invention sont hautement spécifiques de la protéine humaine OZF.
EXEMPLE 6 : Détermination de l'épitoge 2s Puisque les anticorps monoclonaux réagissent seulement avec la protéine OZF
humaine, les séquences OZF humaines, bovine et mucine ont été comparées afin de déterminer dans une première étape la localisation de (épitoge.
La plupart des domaines variables sont situés dans les trois premiers doigts de zinc et dans la séquence du peptide leader (PL) de 10 acides aminés précédent le 3o domaine doigt de zinc (Le Chalony et al., 1996 ; Blottière et al., 1999).
Cette première étape suggère que la localisation de (épitoge est située de manière plausible dans la partie N-terminale de la protéine OZF. Compte tenu du fait que la protéine MBP-OZF pour laquelle les cinq premiers acides aminés de la protéine OZF sont manquants, réagit avec les anticorps monoclonaux selon l'invention, il est fort probable que fépitope contre lequel sont dirigés ces anticorps monoclonaux est situé à la jonction entre le peptide leader et le premier doigt de zinc (cf.
figure 8).
Afin de confirmer cette hypothèse, une technique ELISA oar inhibition compétitive est réalisée en présence d'un pep#ide dont la séquence correspond au fragment aa4-aa17 de la protéine OZF humaine. Ce peptide se révèle être un puissant inhibiteur compétitif vis-à-vis des anticorps monoclonaux selon l'invention (cf. tableau 2 ci-après).
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w Légende du tableau 2 : Six anticorps monoclonaux anti-OZF ont été testés par ELISA, immunoblot et immunofluorescence. Les anticorps monoclonaux et (anticorps polyclonal de poulet anti-OZF ont été dilués respectivement au 1/500 et au 1/100. La compétition est réalisée en présence de 0,05 mg/ml du peptide synthétique aa4-aa17 (cf. figure 8).
Pour fimmunoblot, les extraits suivants ont été utilisés - origine humaine : cellules HBL100 du sein, cellules 293 de rein, cellules SU86-86 de pancréas, cellules RC8 et TC7 de côlon ;
- origine mutine : fibroblastes NIH3T3 ;
lo - origine bovine : cellules FBHE d'endothélium et lymphocytes LB9THY.
L'immunofluorescence a été réalisée sur des lignées cellulaires HBL100 et NIH3T3.
L'anticorps polyclonal de poulet anti-OZF a été utilisé comme témoin positif (Y-OZF).
(+) : détection d'OZF ; (-) : pas de détection d'OZF ; nf : non fait.
Ces résultats démontrent que les six anticorps monoclonaux selon (invention testés reconnaissent un épitoge commun de la protéine OZF humaine situé à la jonction entre le peptide leader et le premier doigt de zinc. Dans cette région, la comparaison des séquences humaines et bovine de la protéine OZF met en évidence deux substitutions - une première substitution conservatrice en position 8 résultant d'un polymorphisme lysine/arginine chez (homme qui ne modifie pas la réactivité des anticorps monoclonaux ; et - la substitution d'un résidu tyrosine par un résidu leucine en position 10 dans la séquence bovine.
Dans la séquence de la protéine OZF mutine, un résidu cystéine est trouvé en position 10 et deux substitutions en positions 13 et 14.
Par conséquent, ces résultats montrent que ia présence d'un résidu tyrosine en position 10 est critique pour la reconnaissance des anticorps monoclonaux et influence de manière probable la conformation de cette région épitopique.
3o La comparaison de ta séquence de cet épitoge avec des séquences de protéines issues de banques de données n'a pas permis d'identifier d'autres protéines portant cet épitoge.
Ainsi, six anticorps monoclonaux efficaces pour la détection de la protéine OZF
recombinante et native par ELISA, western blot ou immunofluorescence ont ainsi été
purgés et caractérisés. Cinq anticorps sont de type IgG1 et un de type IgG3.
Au contraire, des anticorps polyclonaux qui détectent de nombreuses protéines à
doigt de zinc autres que la protéine OZF humaine, ces anticorps monoclonaux selon (invention reconnaissent un épitope unique de la protéine OZF humaine. La séquence de cet épitoge unique situé à la jonction entre les dix premiers acides aminés et le domaine s doigt de zinc n'est pas présent dans les autres protéines de Kruppel, incluant les protéines OZF d'origine mucine et bovine. Ces anticorps monoclonaux selon (invention sont hautement spécifiques de la protéine endogène OZF humaine, à la fois sous sa forme dénaturée et native.
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L'invention a également pour objet futilisaüon d'un anticorps monoGonal ou un de ses fragments selon (invention pour la fabrication d'un médicament destiné
à la prévention ou au traitement du cancer, notamment le cancer du pancréas, le cancer du côlon ou le cancer du sein.
En général, la dose d'anticorps monoclonaux marqués ou un de leurs fragments pour le diagnostic in vivo de pathologie liée à (expression anormale de ia lo protéine OZF, pourra varier en fonction de paramètres tels que l'âge, les conditions, le sexe, de l'étendue de fa maladie du patient, de contre-indications s'il en existe, de thérapies concomittantes ou d'autres variables qu'un homme de l'art saura ajuster.
L'administration de ces composés au patient peut ëtre locale ou systémique et accomplie par voie intraveineuse, infra-artérielle, par !'intermédiaire du liquide spinal, etc.. L'administration peut ëtre également effectuée par voie intradermique ou par voie intracavitaire, orale ou nasale, en fonction de la partie du corps qui doit ëtre examinée.
Après un temps suffisant permettant à l'anticorps monoclonal de se fixer sur la protéine OZF, par exemple de 30 minutes à 48 heures, on examine la partie du corps qui doit ëtre examinée par les techniques d'imagerie classiques telles que fIRM, ou l'imagerie 2o par scintillation. Le protocole exact dépendra nécessairement de facteurs spécifiques liés au patient, de la partie du corps à examiner, de la méthode d'administration et du type des marqueurs utilisés. Les procédures spécifiques pourront être déterminées par l'homme de l'art. La distribution des isotopes radioactifs fixés et leur décroissance avec le temps sera ensuite enregistrée et contrôlée. En comparant les résultats obtenus avec ceux obtenus pour des individus cliniquement normaux, la présence et la localisation de cellules tumorales pourront être déterminées et contrôlées.
La quantité d'anticorps monoclonaux comprise dans les compositions pharmaceutiques selon la présente invention et nécessaire pour une thérapie efficace dépendra de différents facteurs tels que le mode d'administration, la partie du corps 3o ciblée, l'état physiologique du patient, de l'administration d'autres médicaments, des éventuels effets secondaires, etc.. Le dosage pour de telles préventions ou traitements thérapeutiques devra être réalisé de manière à optimiser sa sécurité et son efficacité.
En général, les dosages utilisés in vitro peuvent fournir une indication pour les quantités utilisées pour l'administration d'anticorps monoclonaux in situ et ainsi des 3s modèles animaux peuvent être utilisés pour déterminer les quantités efficaces d'anticorps monoclonaux selon l'invention pour le traitement de pathologie particulière.
Ces méthodes sont en particulier discutées dans les ouvrages tels que Gilman et al.
(1990) et Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) pour des méthodes d'administration telles que les méthodes par voie orale, intraveineuse, intrapéritonale, 5 intramusculaire ou transdermique. Les excipients pharmaceutiquement acceptables incluent notamment l'eau, les solutions saunes, les tampons ou tout autre composé
décrit par exemple dans l'Index de Merck.
L'invention comprend en outre l'utilisation d'un anticorps monoclonal ou un de ses fragments pour le traitement, la prévention ou pour le diagnostic in vifro ou in vivo lo de pathologie liée à l'expression anormale de la protéine OZF, notamment pour le traitement, la prévention ou le diagnostic de cancer comme le cancer du pancréas, du côlon ou du sein, ladite utilisation étant comprise dans l'invention.
L'invention concerne également une méthode de détection et/ou de dosage de la protéine OZF dans un échantillon biologique caractérisée en ce qu'elle comprend les 1s étapes suivantes a) la mise en contact d'un échantillon biologique avec un anticorps monoclonal selon l'invention ; et b) la détection et/ou le dosage de la fixation dudit anticorps sur la protéine OZF
contenue dans (échantillon biologique.
2o Par ailleurs, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon l'invention, peuvent également être utilisés pour l'identification, ia localisation, notamment tissulaire ou cellulaire, et/ou le dosage de la protéine OZF, ladite utilisation étant comprise dans l'invention.
Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon l'invention constituent 25 également un moyen d'analyse immunocytochimique ou immunohistochimique de l'expression de la protéine OZF sur des coupes de tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, par marquage enzymatique, radioactif ou à l'or. Ils permettent notamment de mettre en évidence et de quantifier la présence spécifique normale ou anormale de la protéine OZF dans les tissus ou prélèvements biologiques, ce qui les 3o rend utiles pour (identification et la localisation de l'expression de la protéine OZF, pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de la protéine OZF
mais également pour le suivi de l'évolution de méthodes de prévention ou de traitement de pathologie nécessitant ladite détection ou ledit dosage.
Plus généralement, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon 35 l'invention peuvent ëtre avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où
l'expression de la protéine OZF doit être observée de manière qualitative et/ou quantitative.
De préférence, l'échantillon biologique est constitué par un fluide biologique, tel que le sérum, le sang total, des cellules, un échantillon de tissu ou des biopsies d'origine humaine.
Toute procédure ou test classique peut être mise en oeuvre pour réaliser une telle détection et/ou dosage. Ledit test peut être un test par compétition ou par sandwich, ou tout test connu de l'homme de l'art dépendant de la formation d'un complexe immun anticorps-antigène. Suivant les applications selon l'invention, l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments peut être immobilisé ou marqué.
Cette immobilisation peut être réalisée sur de nombreux supports connus de l'homme de l'art. Ces supports peuvent notamment inclure le verre, le polystyrène, le polypropylène, ie polyéthylène, le dextran, le nylon, ou des celluloses naturelles ou modifiées. Ces supports peuvent être soit solubles ou insolubles.
A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus immunoenzymatiques selon la technique ELISA, par immunofluorescence, ou radio-immunologique (RIA) ou équivalent.
L'invention comprend également une trousse pour la détermina~on de la présence de protéine OZF dans un échantillon biologique comprenant un anticorps ou 2o un de ses fragments selon l'invention.
Entre également dans le cadre de l'invention, une trousse pour la détection et/ou le dosage de la protéine OZF selon l'invention dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants a) un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention ;
b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ;
c) les réacüfs permettant la détection des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique.
Sous un dernier aspect, l'invention a pour objet une méthode pour évaluer l'affinité d'un composé à tester pour la protéine OZF, caractérisée en ce qu'elle comprend a) la mise en contact d'un échantillon contenant ladite protéine OZF avec i) un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention ; et ü) ledit composé à tester ; et b) la mesure de la quantité dudit anticorps monoGonal ou l'un de ses fragments, ladite quantité étant inversement proportionnelle à la quantité de composés à
tester fixés sur ladite protéine OZF.
Les anticorps monoclonaux selon l'invention ou leurs fragments peuvent être utilisés également dans des méthodes in vitro pour la sélection de composés susceptibles de se fixer à la protéine OZF avec l'affinité recherchée. Ainsi, la présente invention comprend également des méthodes de sélection par compétition de composés pharmaceutiques dans lesquelles les anticorps monoclonaux de l'invention ou leurs fragments entrent en compétition avec le composé à tester susceptible de se 1o fixer à la protéine OZF. De cette manière, (anticorps monoclonal ou ses fragments est utilisé pour détecter la présence de tout composé tel qu'un polypeptide ou tout autre composé organique qui peuvent présenter un ou plusieurs sites de reconnaissance de fépitope de la protéine OZF reconnu par les anticorps selon l'invention. Ainsi ces composés, identifiés par la méthode selon l'invention pourront être utilisés pour occuper ces sites de fixation sur la protéine OZF et agir en tant qu'agent modulateur ou antagoniste de l'activité biologique de la protéine OZF.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après.
LEGENDES DES FIGURES
FIGURES 1A et 1B. Analyse par Southem blot de lignées cellulaires pancréatiques et de tumeurs primaires.
Figure 1A : Hybridation par Southem blot des ADN totaux génomiques de placenta et de douze lignées cellulaires d'adénocarcinomes pancréatiques digérés par Bglll. Trois lignées cellulaires, AtCPC-1, BxPC-3, Su.86.86 présentent une co-amplification d'OZF
avec RAC. PANG1 présente une amplification de RAC uniquement.
Figure 1 B : Hybridation par Southem blot de i'ADN total génomique de AICPC-1 (figure 1A), de placenta (P) et de douze tumeurs primaires d'adénocarcinomes pancréatiques 3o digérées par Bglll. La comparaison des intensités des signaux d'hybridation d'OZF
avec ceux obtenus après réhybridation avec une sonde N-myc montre une augmentation du nombre de copies du gène dans les échantillons tumoraux T6 et T9.
FIGURE 2. Expression de fARNm d'OZF dans les lignées cellulaires pancréatiques.
L'ARN, des douze lignées cellulaires d'adénocarcinomes pancréatiques analysées par Southem blot dans les figures 1A et 1 B, était analysé par Northern blot avec une sonde d'ADNc contenant la phase ouverte de lecture d'OZF. AICPC-1, BxPC-3, Su.86.86 ayant OZF amplifié, présentent un haut niveau d'expression. De hauts niveaux d'expression d'OZF sont observés en absence d'amplification dans Capan-1, -2, MlA
PaCa-2 et PANC-1. L'absence ou une très faible expression a été observée dans un échantillon de pancréas normal adulte (Clontech). Le gel correspondant, coloré
avant transfert au bromure d'éthidium, est montré en dessous, avec les bandes d'ARN
ribosomiques 28S et 18S.
FIGURES 3A, 3B et 3C. Analyse par Western blot de lignées cellulaires pancréatiques et de tumeurs primaires. Des quantités identiques de protéine (10 Ng), déterminées par lo coloration des extraits après électrophorèse sur gel SDS (non montré) ont été
transférées sur nitrocellulose. La nitrocellulose a été alors bloquée et hybridée avec un anticorps polyclonal anti-OZF.
Figure 3A : Lignées cellulaires pancréatiques précédemment analysées par Southern et Northem blot (figure 1A et figure 2).
Figure 3B : Immunotransfert d'OZF d'échantillons de tumeurs primaires d'adénocarcinomes pancréatiques.
Figure 3C : Immunotransfert d'OZF de pancréas normal humain. Les protéines ont été
extraites dans les mêmes conditions pour les quatre échantillons indépendants de pancréas normaux (P1-P4), la lignée MIA PaCa-1 (MP) et pour un carcinome pancréatique (T6) exprimant OZF. La nitroceHulose a été hybridée avec des anticorps polyclonaux anti-OZF et anti-pag afin de vérifier l'intégrité des protéines.
Les anticorps anti-pag sont des anticorps de poule purifiés dans les mémes conditions que les anti-OZF.
FIGURES 4A, 4B et 4C. Détection par immunohistochimie d'OZF dans les carcinomes 2s pancréatiques humains. La coloration à la péroxydase a été obtenue avec un anticorps anti-OZF purifié par affinité. Les anticorps anti-OZF montrent une coloration granulaire nucléaire dans les cellules AICPC-1 greffées chez la souris athymique (figure 4A), dans un adénocarcinome exprimant OZF (figure 4B), et l'absence de coloration dans du pancréas sain n'exprimant pas OZF (figure 4C) (grossissement : 1000X).
3o FIGURE 5. Analyse par Western blot d'extraits bruts de cellules humaines 293 non transfectées et transfectées par un vecteur d'expression OZF. Détection de la protéine OZF endogène (à gauche) et après détection transitoire par un vecteur d'expression du gène OZF (à droite) en triplicata, avec un anticorps monoclonal anti-OZF et un anticorps secondaire anti-souris couplé à la péroxydase, par chimio-luminescence.
FIGURE 6. Marquage immunocytochimique de la protéine OZF dans les cellules de la lignée AICPC-1 issue d'un adénocarcinome pancréatique surexprimant la protéine OZF. Les cellules sont cultivées sur lamelle, fixées par 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS, puis perméabilisées par 0,1 % de triton X100. Les sites non spécifiques sont saturés par 2 % de BSA. Les cellules sont incubées 1 h avec l'anticorps monoclonal anti-OZF (1/200), lavées puis mises en contact 30 mn avec le second anticorps anti-souris couplé à un fluorochrome, lavées et incubées 4 mn au DAPI (0,2 Ng/ml) qui marque spécifiquement les noyaux (photos de gauche). Un marquage nucléaire spécifique d'OZF est observé (photos de droite). A faible grossissement en haut et à
1o fort grossissement en bas.
FIGURE 7. Expression du gène OZF dans les cancers du côlon. Analyse par Western blot.
A l'aide des anticorps monoclonaux, nous avons examiné l'expression de la protéine OZF dans les cancers du côlon. L'étude a porté sur 16 échantillons coliques.
Sur les 16 échantillons, 10 proviennent d'une tumeur colique (T1 - T3 - T5 - T6 - T7 -T10 - T11 - T12), et 6 de muqueuses coliques saines (C2 - C4 - C5 - C6 - C8 -C12).
Les échantillons T5 et C5 proviennent d'un même patient, de méme que T6 - C6, C8, et T12 - C12. Nous avons déposé dans les puits d'électrophorèse des quantités équivalentes de protéine pour chaque échantillon colique, les échantillons sont séparés 2o par migration sur gel de polyacrylamide, puis transférés sur une membrane de PVDF.
La protéine OZF est révélée par l'anticorps monoclonal anti-OZF et un anti-anticorps de souris couplé à la péroxydase.
Dans les quatre cas où nous avions un échantillon colique sain et un échantillon colique cancéreux prélevés chez une mëme personne, nous avons constaté une accumulation plus importante de la protéine OZF dans le tissu tumoral que dans le tissu normal.
En comparant la quantité de protéine OZF accumulée, nous constatons que les tissus tumoraux T1 - T3 - T5 - T7 - T8 - T9 - T10 - T12 présentent une quantité
supérieure de protéine OZF par rapport aux tissus sains.
3o FIGURE 8. Comparaison des séquences d'acides aminés N-terminales des protéines OZF suivant leur origine et leur réactivité avec les anticorps monoclonaux.
Comparaison de la région N-terminale de deux allèles de la protéine OZF
humaine (hu-OZF) qui diffèrent par un polymorphisme à la position 8 (KIR) avec la protéine OZF
d'origine mucine (mu-OZF) et bovine (bo-OZF). La séquence du peptide synthétique utilisé dans les expériences d'inhibition compétitive est indiquée au-dessus (PEPTIDE).
Le résidu tyrosine en position 10 est souligné. La séquence de la protéine porteuse MBP est indiquée en petites lettres majuscules pour la protéine MBP-OZF. Le chaînon consensus HIC {"H/C link") précédent le premier doigt de zinc correspond à la position 11-17.
s * indique les positions parfaitement conservées ;
° indique le polymorphisme K/R.
La réactivité avec l'anticorps monoGonal 5B8 selon l'invention est indiquée dans la colonne de droite (+ : positive ; - : négative).
lo EXEMPLES
Matériels et méthodes Echantillons tumoraux et lignées cellulaires. Onze lignées de cellules d'adénocarcinomes de pancréas ont été obtenues de fAmerican Type Culture Collection (Rockville, USA) et cultivées comme prescrit par le fournisseur.
Une lignée ls cellulaire additionnelle (AICPC-1) a été établie au laboratoire à partir de la tumeur primitive d'une patiente agée de soixante ans atteint d'un adénocarcinome du pancréas. Les cellules ont été cultivées dans du milieu Dubelcco modifié
supplémenté
avec 20 % (vol/vol) de sérum de veau foetal. Des tissus tumoraux ont aussi été
obtenus de patients atteints de carcinome primaire du pancréas exocrine (n =
13 ; 6 2o hommes et 7 femmes).
Analyse par Southem et par Northern blot. L'extraction d'ADN a été effectuée suivant les méthodes standards pour les lignées cellulaires et pour les tumeurs congelées (Sambrook et al., 1989). Les fragments obtenus après digestion de l'ADN
génomique (5 Ng) avec fendonucléase Bgll ont été séparés par électrophorèse sur gel 2s d'agarose à 0,7 %, transférés sur nitrocellulose (BA85, Schleicher et Schuell) et hybridés avec des sondes marquées au P32 (Le Chalony et al., 1996). Les lignées de cellules tumorales ont été hybridées avec une sonde OZF obtenue après amplification par PCR à l'aide d'amorces internes pour générer un fragment de 1 kb contenant toute la phase ouverte de lecture (847-1840). Les carcinomes pancréatiques primaires ont 3o été hybridés avec un fragment cloné Xbal/Scal (652-1852) (Le Chalony et al., 1994).
La sonde RAC (2,2 kb) a été préparée à partir d'un clone pUC-RAC à l'aide d'amorces universelles situées de part et d'autre du site multiple de clonage (Cheng et al., 1992).
L'évaluation quantitative des signaux d'hybridation a été faite au phosphorimager (BioRad). Les ARN totaux ont été extraits à l'aide du kit Rneasy {Qiagen).
Pour les 35 analyses en Northem blot, 10 Ng d'ARN ont été déposés sur gel d'agarose 1 %
I 2,2 M
formaldéhyde, transférés après migration sur membrane de nitrocellulose (BA85, Schleicher et Schuell) et hybridés avec la sonde Xbal/Scal.
Production des anticorps polyclonaux. Les antisérums ont été développés chez la poule en utilisant la protéine OZF purifiée comme immunogène (Ferbus et al., 1996).
s Les immunoglobulines IgY de jaune d'oeuf de poule ont été préparés comme décrit (Akita et al., 1992). Les anticorps spécifiques ont été obtenus à partir des IgY anti-OZF
après purification par affinité sur une colonne de MBP-OZF couplé au sépharose (Pharmacia) (Ferbus et al., 1996). La spécificité des anticorps anti-OZF a été
vérifiée par immunoélectrophorèse. Une bande unique de 33 kDa a été observée dans les 1o extraits nucléaires des cellules exprimant OZF.
Méthode de préparation de l'anticorps monoclonal. La protéine recombinante de fusion MBP-OZF produite chez E. soli a été purifiée sur colonne d'amylose par affinité
pour le MBP (Ferbus et al., 1996). Des souris ont été immunisées avec la protéine MBP-OZF purifiée. L'immunisation de souris Balblc est réalisée par trois injections 15 sous-cutanées à deux semaines d'intervalle de 50 Ng de protéine MBP-OZF
purifiée.
La réponse immune anti-OZF est contr8lée par ELISA et immunoblot en utilisant la protéine MBP-OZF. Trois jours avant la fusion, 100 pg de protéine MBP-OZF sont injectés par voie intraveineuse aux souris ayant les plus hauts titres d'anti-sérum.
Après le test de criblage en ELISA, nous avons sélectionné pour l'étape de fusion la 2o souris qui présentait la meilleure réponse. Les leucocytes spléniques ont été fusionnés avec les cellules de la lignée myélomateuse P3X63/8.653 en présence de polyéthylèneglycol à 50 %. Après "HAT' sélection dans la culture bn.ite, les hybridomes sont encapsulés individuellement dans des gouttelettes d'agarose biotinylé et marqués par la protéine MBP-OZF conjuguée à fisothiocyanate de fluorescine (+) et par la 25 protéine MBP-PAG conjuguée à la phycoérythrine (-). La suspension de gouttelettes est ensuite analysée par cytométrie de flux et seuls les hybridomes réagissant avec le conjugué MBP-OZF sont isolés et Gonés suivant la technique de "sécrétion capture report web" (SCRW) (Kenney et al., 1995).
Les anticorps monoclonaux sont purifiés à partir du surnageant de culture des 3o hybridomes par chromatographie d'affinité sur colonne protéine G Sépharose (Pharmacia).
Les immunoglobulines produites sont en majorité des IgG1.
L'anticorps monoclonal spécifique de la protéine OZF humaine reconnaït celle-ci à (état natif ou dénaturé (en ELISA, en Western, en immunohistochimie, par 35 immuno-précipitation).
Technique EL-ISA pour ia sélection et la caractérisation des anticorps monoclonaux.
- Incubation de microplaques 96 puits pour ELISA en présence de 50 NI par puits d'une solution de MBP-OZF ou MBP-PAG (témoin) à 10 Ng/ml en tampon carbonate-s bircarbonate 0,05 M, pH 9,6, une nuit à 4°C.
- Saturation avec une solution d'albumine bovine sérique à 2 % en tampon phosphate salin pH 7,3 (PBS).
- Addition de 25 Irl de surnageant brut de culture de fhybridome avec 25 ul d'une solution de Tween à 0,1 % en tampon PBS et incubation 2 heures à 37°C.
- Après lavage, addition de 50 NI d'une solution au 1/10 000 d'anticorps de chèvre anti-souris conjugués à la phosphatase alcaline (Sigma, St Louis, MO) et incubation heure à 37°C.
- Détection avec une solution de p-nitrophényl phosphate à 1 mg/ml en tampon diéthanolamine, pH 9,8, MgCl2 0,5 mM.
- Mesure de fabsorbance à 405 nm avec un lecteur microplaque (Titertek Multiscan de chez Labsystem, les Ulis, France).
Les isotypes des anticorps monoclonaux sont déterminés par ELISA en utilisant un kit pour le sous-typage d'hybridome murin (Boehringer-Mannheim, Allemagne).
L'épitope de reconnaissance se situe au niveau de son extrémité NH2 2o terminale. II reconnaît en effet la protéine OZF recombinante tronquée, ne possédant que les deux premiers doigts à zinc, et ne reconnaît pas la protéine murine homologue qui diffère de la protéine humaine au niveau de ses quinze premiers acides aminés.
Extraction des protéines et analyse par Western blot avec anticorps polyclonaux.
Les échantillons tumoraux congelés et les extraits cellulaires ont été
solubilisés dans du tampon SDS en présence de ø-mercaptoéthanol et chauffés à ébullition 5 minutes.
Des quantités égales de protéines (10 Ng) ont été chargées sur gel SDS
polyacrylamide 12 % et transférées après migration sur membrane de PDVF
(Amersham). Les membranes ont été hybridées avec les anticorps anti-OZF puis avec des anti-poules de lapin conjugués à la phosphatase alcaline (Sigma), dilués 3o respectivement 200 et 15 000 fois. La chimioluminescence a été produite par incubation de la membrane avec du CDP star (Dupont) et la protéine a été
révélée par autoradiographie sur un fitm X-OMAT ARS.
Extraction des protéines et analyse par Western blot avec anticorps monoclonaux. Les cellules sont cultivées à confluence, trypsinées, concentrées par centrifugation et lysées avec du tampon (65 mM Tris-HCI, pH 6,8, 0,01 % bleu de bromophénol, 5 % ~i-mercaptoéthanol, 10 % glycérol, 2 % SDS) en présence d'inhibiteurs de protéase, chauffées à ébullition puis soniquées. 50 Ng d'extrait cellulaire ou 0,05 Ng de protéine recombinante sont chargés dans chaque puits.
Les protéines sont séparées par électrophorèse sur un gel polyacrylamide à 12 % en SDS
s et transférées sur membrane PDVF (immobilon-P, Millipore). L'efficacité du transfert de protéine est contr8lée par coloration Ponceau S. L'analyse par Western blot est réalisée selon la technique décrite dans Ferbus et al., 1996. Les blots sont hybridés pendant 2 heures avec des anticorps anti-OZF dilués au 1/500 puis avec des IgG
anti-souris de chèvre conjugués à la phosphatase alcaline dilués au 1/10 000. Les mêmes lo conditions sont utilisées pour le témoin positif avec des anticorps anti-OZF de poulet dilués au 1/200 et des anticorps anti-poulet IgY de lapin au 1/10 000. La phosphatase alcaline est détectée par chimioluminescence avec le réactif CDP-star (NEN
Live Science Products) et visualisée par autoradiographie (X-OMAT AR, Kodak, Rochester, NY).
15 Immunofluorescence. Les cellules sont cultivées dans des lames Lab-Teck à
chambre (Nunc Inc., Naperville, IL) pendant 24 heures. Les lames Lab-Teck sont lavées deux fois en PBS et fixées avec une solution à 4 % de paraformaldéhyde en PBS (p/v) pendant 15 minutes à température ambiante. Les cellules sont ensuite rincées en PBS et incubées deux fois pendant 30 minutes dans une solution à
0,1 M
2o glycine, 0,2 M Tris-HCI pH 7,5 puis perméabilisées dans une solution de triton X100 à
0,1 % (v/v) dans du PBS pendant 5 minutes. Les anticorps anti-OZF purifiés sont incubés pendant une heure à 37°C (dilution au 1/100) en tampon PBS à
0,5 d'albumine bovine sérique (p/v). Après lavage, les cellules sont incubées pendant 30 minutes à 37°C avec des anticorps IgG (H+L) anti-souris de chèvre conjugués à la 25 FITC (isothiocyanate de fiuoréscéine) dilués au 1/80 (Biosys S.A., France).
Les lames sont colorées par contraste avec du DAPI (4'6-diamidino-2-phénylindole) pour la coloration de l'ADN de la chromatine, fixées par une solution (Vectashield, Vector Laboratoires, Inc., Burlingame, CA) et observées sous un microscope à
fluorescence.
Marquage immunohistochimique d'OZF. La coloration a été obtenue par un anti-3o poule couplé à la péroxydase après incubation avec un antisérum anti-OZF de poule purifié, sur des coupes de tissu congelé (5 Nm) comme décrit (Terris et al., 1995).
Transfection des cellules N1H3T3. La surexpression d'OZF est réalisée par transfection d'une lignée cellulaire murine NIH3T3 avec un vecteur plasmidique exprimant la protéine OZF dans des cellules eucaryotes. Le milieu de culture est 35 ensemencé avec une densité cellulaire de 0,8 x 106 cellules dans des boïtes de pétri de diamètre 60 mm puis les cellules sont transfectées 24 h plus tard avec 2 Ng de plasmide en utilisant la technique de calcium-phosphate. 5 à 6 h après la transfection les précipités sont éliminés et les cellules sont remises en milieu de culture. Le jour suivant, les cellules sont transférées dans des lames Lab-Tek à chambre et fixées avant l'analyse par immunofluorescence.
EXEMPLE 1 : Amplification du gène OZF dans les lignées d'adénocarcinomes pancréatiques Pour évaluer le nombre de copies du gène OZF dans les cellules des lignées 1o tumorales et déterminer s'il appartient à famplicon portant le gène RAC, les ADN
génomiques totaux, de 12 lignées cellulaires et d'un placenta, ont été digérés avec l'enzyme de restriction Bglll, séparés sur gel d'agarose et hybridés par Southem blot avec des sondes ADN OZF et RAC. Comme montré dans la figure 1A, trois lignées, AICPC-1, BxPC-3, SU.86.86 présentent un signal d'amplification dans un fragment génomique Bglll de taille de 5,3 kb. La quantification des niveaux d'amplificaüon révèle que le gène OZF est approximativement de 60 copies, 6 copies et 30 copies dans AICPG1, BxPC-3, SU.86.86 respectivement. La co-amplification avec RAC est observée dans ces trois lignées, cependant PANC-1 montre une ampl~cation de RAC
seule. Le nombre de copies des gènes RAC et OZF est similaire dans BxPC-3.
2o L'intensité relative du signal d'amplification est supérieure pour le gène OZF que pour RAC dans AICPC-1 et inférieure dans SU.86.86. Ces expériences montrent que le gène OZF est co-amplifié avec RAC dans trois des quatre lignées cellulaires.
Contrairement à ce qui avait été reporté, l'amplification de RAC dans la lignée AsPG1 n'est pas détectée (Cheng et al., 1996 ; Miwa et al., 1996). Les analyses caryotypiques des lignées cellulaires ont confirmé la ploïdie et la spé~cité du marquage chromosomique de chaque lignée incluant AsPG1 (Curtis et al., à para?tre).
L'amplification précédemment décrite dans AsPC-1 peut être due à un sous clone ou avoir été perdue pendant la propagation en culture.
L'état d'amplification d'OZF a été examiné dans des échantillons tumoraux.
3o Douze adénocarcinomes primaires pancréatiques, pris au hasard, ont été
analysés par Southem blot avec une sonde OZF (figure 1 B). Deux tumeurs (T6 et T9) présentent une augmentation du signal d'hybridation (de 3 à 5 fois) par rapport à l'ADN
placentaire, après normalisation avec le signal obtenu après réhybridation avec une copie unique du gène N-myc. Ce signal est considéré comme significatif pour l'amplification étant donné la forte proportion de cellules non tumorales dans les tissus tumoraux.
EXEMPLE 2 : Expression d'OZF dans les lignées pancréatiques et dans les échantillons tumoraux 5 L'expression d'OZF a été examinée en premier dans les lignées tumorales par Northem blot (figure 2). Différents niveaux d'expression ont été détectés dans toutes les lignées. Les lignées AICPC-1 et SU.86.86 qui présentent les plus hauts niveaux d'ampt~cation expriment les plus hauts niveaux de mRNA OZF. Une expression modérée est observée dans BxPC-3, Capan-1, Capan-2, MIAPaCa-2 et PANC-1, et 1o une plus faible expression est trouvée dans les quatre lignées restantes.
L'expression d'OZF a été aussi recherchée au niveau protéique par Western blot en utilisant un anticorps polyclonal dirigé contre la protéine OZF
recombinante exprimée chez E.ooli (Ferbus et al., 1996). La protéine OZF a été détectée dans toutes les lignées cellulaires (figure 3A). Le plus haut niveau de la protéine est trouvé dans les 15 lignées cellulaires qui présentent une amplification du gène OZF {AICPC-1, BxPC-3 et SU.86.86). Comme le tissu pancréatique présente des ARN souvent dégradés, l'expression d'OZF a été étudiée dans les tumeurs et le pancréas normal par la détermination de l'accumulation de sa protéine. Afin de comparer le taux de la protéine OZF dans le pancréas normal adulte avec ceux trouvés dans les tumeurs, les 2o protéines de quatre échantillons pancréatiques différents ont été extraites selon le protocole standard et analysées par Western blot (figure 3C). L'intégrité des extraits a été contra" lée par l'utilisation d'un anticorps polyclonal dirigé contre la protéine ubiquitaire PAG de 22 kDa qui est exprimée dans les cellules en prolifération (Prospéri et al., 1993). Parmi les huit échantillons d'adénomes pancréatiques primaires étudiés, trois présentent un faible niveau de la protéine OZF comme dans les échantillons de pancréas sains. Cinq tumeurs (T6-T9, T12) présentent les plus hauts niveaux d'OZF
(figures 3B et 3C). Par conséquent le gène OZF est exprimé à hauts niveaux dans plus de la moitié des adénocarcinomes analysés.
EXEMPLE 3 : Restriction de l'expression d'OZF aux cellules tumorales dans les 3o tumeurs pancréatiques L'utilisation possible d'anticorps anti-OZF dans des études immuno-histochimiques a été déterminée. L'expression d'OZF a été détectée (figure 4A) dans une tumeur obtenue après greffe des cellules AICPC-1 chez la souris athymique.
L'immunohistochimie a été effectuée sur des coupes de carcinomes pancréatiques congelés afin de détem3iner si d'autres types cellulaires en plus des cellules tumorales, contribuent à l'expression d'OZF. Un exemple de carcinome pancréatique montrant une expression d'OZF est montré en figure 48. Les anticorps anti-OZF révèlent par coloration une granulation nucléaire qui prédomine dans les cellules tumorales. Les autres types cellulaires comme les fibroblastes et les cellules endothéliates présentent s une très faible ou une absence de coloration. Ainsi dans les tumeurs pancréatiques l'expression d'OZF est restreinte principalement aux cellules tumorales et les anticorps anti-OZF peuvent être utilisés pour détecter les cellules tumorales dans des tumeurs pancréatiques hétérogènes.
EXEMPLE 4 : Expression du gène OZF dans les cancers du c8lon 1o A l'aide des anticorps monoclonaux, (expression de la protéine OZF a été
examinée dans les cancers du côlon. L'étude a porté sur 16 échantillons coliques. Sur les 16 échantillons, 10 proviennent d'une tumeur colique (T1 - T3 - T5 - T6 -T9 - T10 - T11 - T12), et 6 de muqueuses coliques saines (C2 - C4 - C5 - C6 -C12). Les échantillons T5 et C5 proviennent d'un méme patient, de même que T6 -C6, 15 T8-CB,etT12-C12.
Analyse par Western blot Des quantités équivalentes de protéine pour chaque échantillon colique sont déposées dans les puits d'électrophorèse. Les échantillons sont séparés par migration sur gel de polyacrylamide, puis transférés sur une membrane de PVDF. La protéine 2o OZF est révélée par l'anticorps monoclonal anti-OZF et un anti-anticorps de souris couplé à la péroxydase. Le résultat est présenté figure 7.
Dans les quatre cas où l'échantillon colique sain et (échantillon colique cancéreux sont prélevés chez une mëme personne, une accumulation plus importante de ia protéine OZF est constatée dans le tissu tumoral que dans le tissu normal.
2s En comparant la quantité de protéine OZF accumulée, on constate que tes tissus tumoraux T1 - T3 - T5 - T7 - T8 - T9 - T10 - T12 présentent une quantité
supérieure de protéine OZF par rapport aux tissus sains.
D'après les résultats, 50 % des tissus cancéreux analysés présentent une forte surexpression d'OZF et 80 % des échantillons tumoraux analysés ont un niveau 3o d'expression de la protéine OZF supérieur à celui observé dans les tissus normaux.
Ces observations montrent que le gène OZF est surexprimé dans fes cancers du côlon.
Les résultats obtenus dans les exemples précédents montrent que s5 l'amplification du gène OZF a été observée dans 3 des 12 lignées d'adénocarcinomes du pancréas (AICPC-1, BxPC-3 et SU.86.86). L'augmentation du nombre de copies du gène a été aussi trouvée dans 2 des 12 échantillons de tumeurs primaires (T6 et T9), quoiqu'à des niveaux plus faibles que ceux observés dans les lignées. Parce que les tumeurs primaires pancréatiques contiennent généralement un large excès de cellules s normales, l'hybridation du signal en Southem blot peut avoir été atténuée dans les tumeurs T6 et T9. De plus, les échantillons contenant peu de cellules tumorales, présentant un signa! d'amplification modéré, échappent à la détection. Les xénogreffes sur souris athymiques devraient nous permettre une meilleure estimation de l'amplification du gène OZF dans les tumeurs pancréatiques primaires. En addition à
io ces résultats, l'amplification d'OZF a été ident~ée par hybridation in situ en fluorescence dans la tumeur utilisée pour générer la lignée AICPC-1 (Curtis et al., à
paraître). Ainsi, l'amplification d'OZF a lieu dans les tumeurs pancréatiques primaires et dans les lignée cellulaires.
Toutes les lignées d'adénocarcinomes pancréatiques expriment fARNm et la 15 protéine OZF mais à des niveaux différents. Les plus hauts niveaux d'ARNm d'OZF ont été trouvés dans les lignées ayant ampl~é le gène OZF (AICPG1, BxPG3 et SU.86.86). Quoique (estimation de la protéine peut ëtre moins précise, le taux de la protéine OZF a été comparé dans les deux tumeurs primaires présentant une amplification du nombre de copies (T6 et T9), à la lignée cellulaire MIAPaCa-2. Les 2o deux tumeurs expriment de hauts niveaux de protéines OZF. Ainsi, le gène OZF qui est hautement exprimé dans toutes les tumeurs pancréatiques présentant une amplification, n'est pas inactivé dans famplicon 19q13.1.
L'amplification génique est un mécanisme important pour l'augmentation de l'expression de gènes impliqués dans la cancérogenèse même si la surexpression est 25 souvent observée en absence d'amplification. Les études d'expression de quatre échantillons indépendants de pancréas normaux et de trois échantillons de tumeurs primaires montrent des niveaux de protéines OZF très faibles ou indécelables.
Au contraire, toutes les lignées expriment OZF et quatre d'entre elles montrent de hauts niveaux d'ARNm OZF en absence d'amplification. Le cas le plus significatif est celui de 30 la lignée PANC-1 qui possède deux copies du gène OZF et exprime un haut niveau d'ARNm de 2 à 4 fois plus bas que celui de la lignée SU.86.86 qui possède 30 copies du gène OZF. De hauts niveaux de protéine OZF sont aussi observés dans des tumeurs primaires sans amplfication du gène OZF, et fimmunohistochimie montre que la protéine OZF est détectée essentiellement dans les cellules tumorales. En dehors ss du statut d'amplification génique, OZF est surexprimé dans 7 des 12 lignées tumorales et dans 5 des 8 tumeurs primaires. Les plus hauts niveaux d'expression d'OZF
dans un large échantillon de tumeurs comparé au pancréas normal suggèrent que ce gène est impliqué dans le processus oncogénique. De plus il pourrait être utilisé comme un marqueur pour détecter de rares cellules tumorales dans le pancréas.
En dehors du gène OZF, la région q13.1 du chromosome 19 comprend plusieurs gènes candidats. Le mieux caractérisé est le gène RAC, localisé à
proximité
d'OZF, qui code pour une sérine-thréonine kinase (The Human Gene Map, 1997).
Les deux gènes sont coamplifiés dans les lignées cellulaires, cependant seul le gène RAC
a été trouvé amplifié dans PANC-1. Cependant, dans la lignée PANC-1, dans laquelle le gène RAC est amplifié, les niveaux d'ARNm sont seulement légèrement plus bas que ceux observés dans les lignées cellulaires qui présentent une amplification du gène OZF. Cette lignée cellulaire contient aussi une protéine OZF abondante.
Ainsi, la surexpression d'OZF dans PANC-1 peut être due à un mécanisme autre que l'amplification génique comme dans le cas d'autres gènes connus. Par exemple dans 1s les cancers du sein et de l'ovaire, la prévalence de la surexpression HER2/neu intervient plus fréquemment que l'amplification et a été utilisée pour prédire le taux de survie (Slamon et al., 1989).
EXEMPLE 5 : Sélection des hybridomes et caractérisation des anticorps monoclonaux A. Sélection des hvbridomes Après immunisation puis fusion cellulaire les anticorps sécrétés par un seul hybridome sont examinés en utilisant la technique SCRW et sélectionnés une à
une par cytométrie de flux. 22 surnageants réagissant par FACS (trieur automatique de cellules par cytométrie de flux par fluorescence) avec la protéine OZF
recombinante et ne réagissant pas avec la protéine porteuse MBP sont testés pour leur activité
avec la protéine recombinante MBP-OZF. La moitié des lignées cellulaires sont positives par ELISA et immunoblot (cf. tableau 1 ). Aucune réactivité n'est observée après ELISA sur la protéine MBP-PAG indiquant que ces surnageants sont spécifiques du polypeptide 3o OZF (Prospéri M-T et al., 1993). Dans la mesure où certains anticorps monoclonaux peuvent réagir avec des épitoges résultant de la fusion avec la protéine porteuse MBP
la réactivité des surnageants a été examinée avec la protéine OZF produite par des cellules eucaryotes. Après analyse par immunoblot et immunofluorescence en présence de protéines OZF endogènes issues de cellules mammaires humaines HBL
100, six anticorps monoclonaux ont été sélectionnés sur la base de leur forte réactivité
avec la protéine OZF humaine (cf. tableau 1 ci-dessous).
TABLEAU 1 : Criblage et sélection des anticorps monoclonaux anti-OZF.
LIGNES ELISA ELISA IMMUNOBLOT IMMUNOBLOT IFA
CELLULES CELLULES
4A5 + - + _ _ 5B1 - ' - - _ 5B8 +++ - +++ +++ ++
5B9 + - + _ +
4C3 _ - _ _ _ 4C8 + - + _ 5C10 +++ - +++ +++ +++
5C11 +++ _ _ - +
5D9 +++ _ +++ _ ++
5D10 + _ - _ 5D11 + _ _ _ _ 5E9 ++ - ++ + +
5E10 +++ _ _ _ +
5F1 + _ _ _ _ 5F4 + - _ _ _ 5F8 + - - _ -5G10 +++ - -+++ +++ +
5H2 _ - - _ - _ 5H4 +++ _ +++ _ _ 5H7 +++ - +++ +++ +++
5H8 +++ _ ++ _ +
4H10 +++ _ +++ +++ +++
Légende du Tableau 1 : Les surnageants bruts de culture de 22 clones d'hybridomes sélectionnés par la technique SCRW ont été testés successivement par ELISA
contre les protéines recombinantes MBP-OZF et MBP-PAG, puis ensuite par immunoblot et 1o immunofluorescence {IFA) contre la protéine MBP-OZF et la protéine OZF
endogène issue de cellules HBL 100 humaines. La protéine recombinante MBP-PAG a été
utilisée comme témoin négatif.
B. Caractérisation des anticorps monoclonaux s Après purification sur colonne protéine G Sépharose les sous-types d'immunoglobuline des six anticorps monoclonaux sélectionnés ont été
déterminés.
Cinq anticorps (5B8, 5C10, 5610, 5H7, 4H10) appartiennent au sous-type tgG1 et un anticorps au sous-type IgG3 (5D9). Les anticorps monoGonaux ont également été
testés par immunoblot et immunofluorescence avec différents extraits de cellules de 1o mammifères. L'analyse par Western blot sur des extraits humains (cellules de sein, de rein, de côlon et de pancréas) détectent une bande unique de 33 kDA
caractéristique de la protéine OZF. De manière inattendue, les anticorps monoclonaux ne reconnaissent pas les protéines OZF bovine et mucine en dépit de leur forte identité
(95 %) avec la protéine OZF humaine (Le Chalony, C. et al., 1996 ; Blottière L. et al., 1s 1999). L'absence de réactivité ne résulte pas du processus de traduction dans la mesure où les protéines OZF mucine traduites in vitro ne sont pas non plus détectées.
Les mêmes résultats sont observés par immunofluorescenoe (cf. tableau 2 ci-dessous), une forte expression nucléaire d'OZF est observée après transfection des cellules mucines NIH3T3 avec le vecteur d'expression. Aucune fluorescence n'est 2o visible sur les cellules mucines NIH3T3 non transfectées. Par conséquent, les six anticorps monoclonaux ainsi produits et caractérisés selon (invention sont hautement spécifiques de la protéine humaine OZF.
EXEMPLE 6 : Détermination de l'épitoge 2s Puisque les anticorps monoclonaux réagissent seulement avec la protéine OZF
humaine, les séquences OZF humaines, bovine et mucine ont été comparées afin de déterminer dans une première étape la localisation de (épitoge.
La plupart des domaines variables sont situés dans les trois premiers doigts de zinc et dans la séquence du peptide leader (PL) de 10 acides aminés précédent le 3o domaine doigt de zinc (Le Chalony et al., 1996 ; Blottière et al., 1999).
Cette première étape suggère que la localisation de (épitoge est située de manière plausible dans la partie N-terminale de la protéine OZF. Compte tenu du fait que la protéine MBP-OZF pour laquelle les cinq premiers acides aminés de la protéine OZF sont manquants, réagit avec les anticorps monoclonaux selon l'invention, il est fort probable que fépitope contre lequel sont dirigés ces anticorps monoclonaux est situé à la jonction entre le peptide leader et le premier doigt de zinc (cf.
figure 8).
Afin de confirmer cette hypothèse, une technique ELISA oar inhibition compétitive est réalisée en présence d'un pep#ide dont la séquence correspond au fragment aa4-aa17 de la protéine OZF humaine. Ce peptide se révèle être un puissant inhibiteur compétitif vis-à-vis des anticorps monoclonaux selon l'invention (cf. tableau 2 ci-après).
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w Légende du tableau 2 : Six anticorps monoclonaux anti-OZF ont été testés par ELISA, immunoblot et immunofluorescence. Les anticorps monoclonaux et (anticorps polyclonal de poulet anti-OZF ont été dilués respectivement au 1/500 et au 1/100. La compétition est réalisée en présence de 0,05 mg/ml du peptide synthétique aa4-aa17 (cf. figure 8).
Pour fimmunoblot, les extraits suivants ont été utilisés - origine humaine : cellules HBL100 du sein, cellules 293 de rein, cellules SU86-86 de pancréas, cellules RC8 et TC7 de côlon ;
- origine mutine : fibroblastes NIH3T3 ;
lo - origine bovine : cellules FBHE d'endothélium et lymphocytes LB9THY.
L'immunofluorescence a été réalisée sur des lignées cellulaires HBL100 et NIH3T3.
L'anticorps polyclonal de poulet anti-OZF a été utilisé comme témoin positif (Y-OZF).
(+) : détection d'OZF ; (-) : pas de détection d'OZF ; nf : non fait.
Ces résultats démontrent que les six anticorps monoclonaux selon (invention testés reconnaissent un épitoge commun de la protéine OZF humaine situé à la jonction entre le peptide leader et le premier doigt de zinc. Dans cette région, la comparaison des séquences humaines et bovine de la protéine OZF met en évidence deux substitutions - une première substitution conservatrice en position 8 résultant d'un polymorphisme lysine/arginine chez (homme qui ne modifie pas la réactivité des anticorps monoclonaux ; et - la substitution d'un résidu tyrosine par un résidu leucine en position 10 dans la séquence bovine.
Dans la séquence de la protéine OZF mutine, un résidu cystéine est trouvé en position 10 et deux substitutions en positions 13 et 14.
Par conséquent, ces résultats montrent que ia présence d'un résidu tyrosine en position 10 est critique pour la reconnaissance des anticorps monoclonaux et influence de manière probable la conformation de cette région épitopique.
3o La comparaison de ta séquence de cet épitoge avec des séquences de protéines issues de banques de données n'a pas permis d'identifier d'autres protéines portant cet épitoge.
Ainsi, six anticorps monoclonaux efficaces pour la détection de la protéine OZF
recombinante et native par ELISA, western blot ou immunofluorescence ont ainsi été
purgés et caractérisés. Cinq anticorps sont de type IgG1 et un de type IgG3.
Au contraire, des anticorps polyclonaux qui détectent de nombreuses protéines à
doigt de zinc autres que la protéine OZF humaine, ces anticorps monoclonaux selon (invention reconnaissent un épitope unique de la protéine OZF humaine. La séquence de cet épitoge unique situé à la jonction entre les dix premiers acides aminés et le domaine s doigt de zinc n'est pas présent dans les autres protéines de Kruppel, incluant les protéines OZF d'origine mucine et bovine. Ces anticorps monoclonaux selon (invention sont hautement spécifiques de la protéine endogène OZF humaine, à la fois sous sa forme dénaturée et native.
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Claims
1/ Anticorps monoclonal ou un de ses fragments capable de se fixer spécifiquement sur un épitope de la protéine OZF.
2/ Anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon la revendication 1 caractérisé en ce que la protéine OZF est d'origine humaine.
3/ Anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'épitope de la protéine OZF est situé sur la partie N-terminale.
4/ Anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'épitope de la protéine OZF est situé sur la partie N-terminale comprenant le résidu tyrosine situé en position 10 de la séquence de la proteine OZF
humaine.
5/ Anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est produit par une cellule telle que déposée à la CNCM te 6 Septembre 1999 sous le numéro 1-2308.
6/ Anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les anticorps humanisés, chimériques, anti-idiotypes.
7/ Anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est marqué.
8/ Anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est couplé à un composé
cytotoxique.
9/ Cellule capable de produire un anticorps monoclonal selon l'une des revendications 1 à 5 telle que déposée à la CNCM le 6 Septembre 1999 sous le numéro 1-2308.
10/ Composition pharmaceutique pour le traitement ou la prévention de pathologie liée à l'expression anormale de la protéine OZF, caractérisée en ce qu'elle comprend:
a) un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 6 et 8 ; et b) un excipient pharmaceutiquement acceptable.
11/ Composition pharmaceutique pour le diagnostic in vivo de pathologie liée à l'expression anormale de la protéine OZF, caractérisée en ce qu'elle comprend :
a) un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 7;et b) un excipient pharmaceutiquement acceptable.
12/ Composition pharmaceutique selon la revendication 10 ou 11, caractérisée en ce que ladite pathologie est choisie parmi les cancers, notamment le cancer du pancréas, du côlon ou du sein.
13/ Utilisation d'un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 6 et 8, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention du cancer, notamment le cancer du pancréas, le cancer du côlon ou le cancer du sein.
14/ Utilisation d'un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 7, pour le diagnostic in vitro de pathologie liée à
l'expression anormale de la protéine OZF.
15/ Méthode de détection et/ou de dosage de protéine OZF dans un échantillon biologique caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes:
a) la mise en contact d'un échantillon biologique avec un anticorps selon l'une des revendications 1 à 7; et b) la détection et/ou le dosage de la fixation dudit anticorps sur la protéine OZF
contenue dans l'échantillon biologique.
16/ Trousse pour la détermination de la présence de protéine OZF dans un échantillon biologique comprenant un anticorps ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 7.
17/ Méthode d'évaluation de l'affinité d'un composé pour la protéine OZF
caractérisée en ce qu'elle comprend:
a) la mise en contact d'un échantillon contenant ladite protéine OZF avec i) un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'une des revendications
1 à 7; et ii) ledit composé à tester ; et b) la mesure de la quantité dudit anticorps monoclonal ou l'un de ses fragments, ladite quantité étant inversement proportionnelle à la quantité de composés à
tester fixés sur ladite protéine OZF.
tester fixés sur ladite protéine OZF.
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