CA2342963A1

CA2342963A1 - Ozf protein-specific monoclonal antibodies and their diagnostic therapeutic uses

Info

Publication number: CA2342963A1
Application number: CA002342963A
Authority: CA
Inventors: Gerard Goubin; Didier Ferbus; Martine Muleris; Marie-Therese Prosperi
Original assignee: Individual
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Curie
Priority date: 1998-09-08
Filing date: 1999-09-08
Publication date: 2000-03-16
Also published as: FR2782998A1; WO2000014118A1; EP1109832A1; AU5522699A; FR2782998B1

Abstract

The invention concerns an OZF protein-specific monoclonal antibody and a pharmaceutical composition comprising said antibody for preventing, treating or diagnosing pathology related with abnormal OZF protein expression such as cancer. The invention further concerns methods for detecting OZF protein and methods for selecting compounds capable of interacting with the OZF protein.

Description

ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-PROTEINE OZF ET LEURS APPLICATIONS
DANS LE DOMAINE DIAGNOSTIC ET THERAPEUTIQUE.
La présente invention concerne un anticorps monoclonal spécifique de la s protéine OZF ainsi qu'une composition pharmaceutique comprenant ledit anticorps destinée à la prévention, le traitement ou le diagnostic de pathologie liée à
(expression anormale de protéine OZF telle que le cancer. L'invention comprend en outre des méthodes de détection de la protéine OZF ainsi que des méthodes de sélection de composés capables d'interagir avec la protéine OZF.
lo La plupart des protéines à motifs doigt à zinc sont caractérisées par leur capacité à se fixer sur des ARN ou des ADN. Ce motif doigt à zinc a été
retrouvé dans des gènes contrôlant le développement, des gènes de facteur de transcription ou des gènes liés à la formation de tumeurs, attestant ainsi l'importance de cette structure doigt à zinc dans la régulation de l'expression des gènes.
15 Parmi les gènes codant pour oes protéines à motifs doigt à zinc, un gène codant pour une protéine constituée uniquement de motifs doigt à zinc, dénommé
gène OZF (OZF pour « Only Zinc Fingers ») a été isolé (Le Chalony et al., 1994) et fADNc correspondant a été cloné et séquencé. La séquence d'acides aminés de la protéine putative codée par le gène OZF comporte 292 résidus d'acides aminés, dont 10 motifs 2o doigt à zinc de 28 résidus d'acides aminés, pour un poids moléculaire estimé de 33 kDa. L'analyse comparative de ta protéine OZF a montré que le domaine contenant la structure doigt à zinc comporte de grandes homologies avec d'autres protéines à
motifs doigt à zinc.
D'autre part, Ferbus et al. (Ferbus et al., 1996) ont pu mettre en évidence 25 certaines caractéristiques de ta protéine OZF à partir d'une protéine recombinante OZF
produite chez E. soli. En particulier, ces auteurs ont montré que la protéine OZF
recombinante était capable de fixer des ions de zinc, de (ADN et de fhéparine.
En outre, ces auteurs ont également pu montrer, en utilisant un anticorps poiydonal obtenu à partir d'une protéine recombinante OZF fusionnée avec une protéine fixant le 30 maltose (MBP) que la protéine OZF était exprimée dans des cellules mammaires humaines de type épithélial, préférentiellement dans le noyau, alors qu'elle était très faiblement exprimée dans les cellules myoépithéliales et stromatiques de ce tissu mammaire. Ces auteurs ont également pu mettre en évidence que la protéine OZF
était exprimée dans une lignée cellulaire tumorale établie à partir d'une tumeur de 3s pancréas. MONOCLONAL ANTI-PROTEIN OZF ANTIBODIES AND THEIR APPLICATIONS
IN THE DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC FIELD.
The present invention relates to a monoclonal antibody specific for s OZF protein as well as a pharmaceutical composition comprising said antibody intended for the prevention, treatment or diagnosis of pathology related to (expression abnormal OZF protein such as cancer. The invention further comprises of OZF protein detection methods as well as selection methods of compounds capable of interacting with the OZF protein.
lo Most zinc finger patterned proteins are characterized by their ability to bind to RNA or DNA. This zinc finger motif was found in developmental genes, transcription factor genes or some genes linked to tumor formation, attesting to the importance of this structure zinc finger in the regulation of gene expression.
15 Among the genes coding for these proteins with zinc finger motifs, a gene coding for a protein consisting solely of zinc finger motifs, called uncomfortable OZF (OZF for "Only Zinc Fingers") has been isolated (Le Chalony et al., 1994) and cDNA
correspondent has been cloned and sequenced. The amino acid sequence of the protein putative encoded by the OZF gene contains 292 amino acid residues, of which 10 patterns 2o zinc finger with 28 amino acid residues, for a molecular weight estimated from 33 kDa. The comparative analysis of your OZF protein has shown that the domain containing the zinc finger structure has large homologies with others proteins to zinc finger patterns.
On the other hand, Ferbus et al. (Ferbus et al., 1996) were able to highlight 25 certain characteristics of your OZF protein from a protein OZF recombinant produced in E. soli. In particular, these authors have shown that the protein OZF
recombinant was able to fix ions of zinc, DNA and heparin.
In in addition, these authors were also able to show, using an antibody poiydonal obtained from a recombinant OZF protein fused with a protein fixing the 30 maltose (MBP) that the OZF protein was expressed in cells breast human epithelial type, preferably in the nucleus, while it was very weakly expressed in the myoepithelial and stromatic cells of this tissue breast. These authors were also able to demonstrate that the OZF protein was expressed in a tumor cell line established from a tumor of 3rd pancreas.

2 Les inventeurs ont mis en évidence de maniëre surprenante, en utilisant des anticorps polyclonaux anti-protéine OZF, que la protéine OZF était surexprimée dans des tumeurs primaires qui présentaient une amplification du gène OZF mais aussi dans des tumeurs primaires qui ne présentaient pas d'amplification du gène.
D'autre part, les inventeurs ont également mis en évidence que la surexpression de la protéine OZF dans ces tumeurs primaires était restreinte aux cellules tumorales.
Ces résultats montrent ainsi que la protéine OZF apparaît comme un marqueur de cellules tumorales.
lo L'obtention d'anticorps capables de reconnaître de manière spécifique la protéine OZF permettrait ainsi de détecter des cellules tumorales caractérisées par une expression anormale de protéine OZF.
Des anticorps polyclonaux anti-protéine OZF ont déjà été décrits (Ferbus et al., 1996). Ces anticorps ont été préparés par immunisation de tapins contre une protéine recombinante obtenue par fusion de la protéine OZF et de la protéine MBP, puis purifiés sur immunoabsorbant constitué de la protéine recombinante fusionnée OZF-MBP couplée sur colonne de sépharose 4B. Ces anticorps polytonaux peuvent ainsi reconnaitre plusieurs épitoges de la protéine OZF et en particulier certains épitoges communs aux protéines humaines ou de mammifères à motifs de doigt à zinc, compte 2o tenu de la grande homologie de séquence constatée entre la protéine OZF et d'autres protéines à motifs doigt à zinc.
Les inventeurs ont pu ainsi mettre en évidence des réactions non spécifiques obtenues avec certaines protéines à motifs de doigt à zinc pour ces anticorps polyclonaux.
Si ces anticorps polyclonaux peuvent s'avérer de spécificité suffisante pour des applications particulières telles que la détection de protéine OZF dans des cellules ou des tissus homogènes isolés, leur spécificité et éventuellement leur affinité
pourraient s'avérer insuffisantes comme le reconnaissent d'ailleurs les auteurs de la publication décrivant ces anticorps polyclonaux. Ces auteurs précisent en effet dans leur 3o conclusion qu'il serait nécessaire de disposer d'anticorps anti-OZF
permettant d'identifier avec précision les types de cellules exprimant la protéine OZF.
L'obtention de tels anticorps, dirigés contre un épitoge spécifique de la protéine OZF
humaine, permettrait sans aucun doute non seulement d'identifier les types de cellules exprimant normalement ou anormalement la protéine OZF mais également de rechercher ies 2 The inventors have surprisingly demonstrated, using anti-OZF protein polyclonal antibodies, that the OZF protein was overexpressed in primary tumors that had an amplification of the OZF gene but also in primary tumors that did not show amplification of the gene.
On the other hand, the inventors have also demonstrated that the overexpression of the OZF protein in these primary tumors was restricted to the tumor cells.
These results thus show that the OZF protein appears as a marker tumor cells.
lo Obtaining antibodies capable of specifically recognizing the protein OZF would thus detect tumor cells characterized by a abnormal expression of OZF protein.
Polyclonal anti-OZF protein antibodies have already been described (Ferbus and al., 1996). These antibodies were prepared by immunizing tapins against a protein recombinant obtained by fusion of the OZF protein and the MBP protein, then purified on immunoabsorbent consisting of the fused recombinant protein OZF-MBP coupled to a 4B sepharose column. These polytonal antibodies can so recognize several epitoges of the OZF protein and in particular some epitoges common to human or mammalian proteins with zinc finger patterns, account 2o given the great sequence homology observed between the OZF protein and others proteins with zinc finger patterns.
The inventors were thus able to highlight non-specific reactions obtained with certain zinc finger patterned proteins for these antibodies polyclonal.
If these polyclonal antibodies can be of sufficient specificity to of particular applications such as the detection of OZF protein in cells or isolated homogeneous tissues, their specificity and possibly their affinity could prove to be insufficient, as the authors of the publication describing these polyclonal antibodies. These authors indeed specify in their 3o conclusion that it would be necessary to have anti-OZF antibodies allowing identify precisely the types of cells expressing the OZF protein.
Obtaining such antibodies, directed against a specific epitoge of the OZF protein human, would undoubtedly not only identify the types of cells expressing normally or abnormally the protein OZF but also to look for ies

3 séquences nucléiques cibles de la protéine OZF, notamment nuGéaires, et d'identif'~er les gènes susceptibles d'être régulés par la protéine OZF.
Ainsi, il existe aujourd'hui un besoin de disposer d'un anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre la protéine OZF humaine. Un tel anticorps pourrait non seulement être utile pour étudier et ainsi mieux connaître le rôle joué par la protéine OZF dans la régulation des gènes mais également serait utile au regard des résultats présentés par les inventeurs dans la présente invention, pour d'autres applications comme les applications thérapeutiques, diagnostics, notamment in vivo ou in vitro à
partir d'échantillon biologique hétérogène, ou pour le ciblage de composés capables de 1o moduler l'activité biologique de la protéine OZF.
La présente invention est basée sur la découverte de la possibilité d'obtenir par une approche particulière de préparation un anticorps monoclonal caractérisé
par une spécificité jamais encore obtenue antérieurement. II a ainsi été découvert qu'en immunisant une souris avec une protéine OZF recombinante, il est possible d'obtenir un anticorps reconnaissant un épitoge spécifique de la protéine OZF et qui ne reconnaît pas d'autres protéines à motifs doigt à zinc de mammifères.
Ainsi, ta présente invention a pour objet un anticorps monoGonal ou ùn de ses fragments capables de se fixer spécifiquement sur un épitoge de la protéine OZF, de préférence humaine.
2o On entend désigner par épitoge dans la présente description, tout déterminant de !a protéine responsable de l'interaction spécifique avec l'anticorps. Les déterminants épitopiques consistent habituellement en des groupes de molécules présentant des surfaces chimiquement actives telles que des acides aminés ou des chaïnes latérales de sucres et ayant une stucture tridimentionnelle spécifique et/ou une charge spéc~que caractéristique.
Les fragments d'anticorps monoclonal selon l'invention comprennent tout fragment dudit anticorps monoclonal capable de se fixer sur l'épitoge de la protéine OZF sur lequel se fixe l'anticorps monoclonal dont ledit fragment est issu.
Des exemples de tels fragments incluent en particulier des anticorps monoclonaux simple 3o chaîne ou des fragments monovalents Fab ou Fab' et des fragments divalents tels que F(ab')2, qui possèdent 1a même spécificité de fixation que (anticorps monoclonal dont ils sont issus. Un fragment selon l'invention pourra également ëtre un fragment Fv simple chaîne produit par des méthodes connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Skerra et al., 1988 et King et al., 1991. 3 target nucleic sequences of the OZF protein, in particular nuGear, and of identification genes capable of being regulated by the OZF protein.
Thus, there is today a need to have a monoclonal antibody directed specifically against the human OZF protein. Such an antibody could no only be useful to study and thus better understand the role played by the protein OZF in the regulation of genes but also would be useful with regard to results presented by the inventors in the present invention, for others applications such as therapeutic applications, diagnostics, in particular in vivo or in vitro to from heterogeneous biological samples, or for targeting compounds able to 1o modulate the biological activity of the OZF protein.
The present invention is based on the discovery of the possibility of obtaining through a specific approach to preparing a characterized monoclonal antibody by one specificity never previously obtained. He was thus discovered that immunizing a mouse with a recombinant OZF protein, it is possible to get an antibody recognizing an epitoge specific for the OZF protein and which does not not recognize other zinc finger motif mammalian proteins.
Thus, the subject of your present invention is a monoGonal antibody or one of its fragments capable of binding specifically to an epitoge of the protein OZF, from human preference.
2o We mean by epitoge in this description, all determining of the protein responsible for the specific interaction with the antibody. The epitopic determinants usually consist of groups of molecules having chemically active surfaces such as amino acids or of side chains of sugars and having a specific three-dimensional structure and / or a specific charge ~ that characteristic.
The monoclonal antibody fragments according to the invention include any fragment of said monoclonal antibody capable of binding to the epitoge of the protein OZF on which the monoclonal antibody from which said fragment is derived is attached.
Of examples of such fragments include in particular monoclonal antibodies simple 3o chain or Fab or Fab 'monovalent fragments and divalent fragments such as F (ab ') 2, which have the same binding specificity as (antibody monoclonal of which they came from. A fragment according to the invention could also be a Fv fragment simple chain produced by methods known to those skilled in the art and such than described for example by Skerra et al., 1988 and King et al., 1991.

4 Selon la présente invention, des fragments d'anticorps monoclonaux de l'invention peuvent être obtenus à partir des anticorps monoclonaux tels que décrits précédemment par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique.
s D'une autre manière les fragments d'anticorps monoclonaux compris dans la présente invention peuvent être synthétisés par des synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la société Applied Biosystems, etc., ou peuvent être préparés manuellement en utilisant des techniques connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Geysen et al., 1978.
1o En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux ou leurs fragments, on pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans !e manuel « Antibodies » (Harlow et al., 1988) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite par Kohler et Mllstein en 1975.
Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être obtenus par exemple 15 à partir de cellule d'un animal immunisé contre la protéine OZF, ou un de ses fragments, comportant fépitope reconnu spécifiquement par lesdits anticorps monoclonaux selon !'invention. Ladite protéine OZF, ou un de sesdits fragments, pourra notamment être produite, selon les modes opératoires usuels, par recombinaison génétique à partir d'une séquence d'acide nucléique contenue dans la 2o séquence de l'ADNc codant pour la protéine OZF ou par synthèse peptidique à
partir d'une séquence d'acides aminés comprise dans la séquence peptidique de la protéine OZF.
Les anticorps monoGonaux selon (invention pourront par exemple être purifiés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été immobilisée la protéine OZF
25 ou un de ses fragments comportant l'épitope reconnu spécifiquement par lesdits anticorps monoclonaux selon l'invention.
De préférence, l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon la présente invention se fixe sur l'épitope linéaire ou conformationnel du domaine N-terminal de !a protéine OZF humaine dont la séquence présente un faible taux d'homologie 3o comparée avec les séquences d'autres protéines à motifs doigt à zinc.
De manière plus préférée, (anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention se fixe sur un épitope situé sur les quinze premiers acides aminés, du domaine N-terminal de la protéine OZF telle que décrite par Le Chalony et al., 1994, aux figures 1 B et 1 C page 400.

Ainsi, l'invention concerne un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon (invention, caractérisé en ce que fépitope de la protéine OZF est située sur la partie N-terminale.
De manière préférée, l'invention concerne un anticorps monoclonal ou un de 4 According to the present invention, fragments of monoclonal antibodies of the invention can be obtained from monoclonal antibodies such as described previously by methods such as enzyme digestion, such as the pepsin or papain and / or by cleavage of the disulfide bridges by reduction chemical.
s In another way, the fragments of monoclonal antibodies included in the present invention can be synthesized by automatic synthesizers of peptides such than those supplied by the company Applied Biosystems, etc., or may be prepared manually using techniques known to those skilled in the art and such than described for example by Geysen et al., 1978.
1o In general, for the preparation of monoclonal antibodies or their fragments, we may refer to the techniques which are in particular described in! e manual "Antibodies" (Harlow et al., 1988) or to the technique of preparation from of hybridomas described by Kohler and Mllstein in 1975.
The monoclonal antibodies according to the invention can be obtained for example 15 from the cell of an animal immunized against the OZF protein, or one of his fragments, comprising the epitope recognized specifically by said antibodies monoclonals according to the invention. Said OZF protein, or one of its said fragments, may in particular be produced, according to the usual operating methods, by genetic recombination from a contained nucleic acid sequence in the 2o sequence of the cDNA coding for the protein OZF or by peptide synthesis to go of an amino acid sequence included in the peptide sequence of the protein OZF.
The monoGonal antibodies according to (invention can for example be purified on an affinity column on which the immobilizer has previously been immobilized OZF protein 25 or one of its fragments comprising the epitope specifically recognized by said monoclonal antibodies according to the invention.
Preferably, the monoclonal antibody or a fragment thereof according to the present invention is fixed on the linear or conformational epitope of the N- domain terminal of! a human OZF protein with a low homology sequence 3o compared with the sequences of other proteins with zinc finger motifs.
More preferably, (monoclonal antibody or one of its fragments according to the invention is fixed on an epitope located on the first fifteen acids amines, N-terminal domain of the OZF protein as described by Le Chalony et al., 1994, Figures 1 B and 1 C page 400.

Thus, the invention relates to a monoclonal antibody or a fragment thereof according to (invention, characterized in that the epitope of the OZF protein is located on the N-terminal part.
Preferably, the invention relates to a monoclonal antibody or one of

5 ses fragments selon l'invention, caractérisé en ce que fépitope de la protéine OZF est situé sur la partie N-terminale comprenant le résidu tyrosine situé en position 10 de la séquence de la protéine OZF humaine telle que décrite par Le Chalony et al., 1994, à
la figure 1 B page 400, de préférence ledit épitope est porté par le fragment de séquence aa7-aa17 de ladite séquence OZF humaine.
lo De manière également préférée, l'invention concerne un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est capable de reconnaître en outre la protéine OZF humaine dont la séquence présente un polymorphisme lysinelarginine en position 8 de la séquence de la protéine OZF
humaine telle que décrite par Le Chalony et al., 1994, à la figure 1 B page 400.
Parmi les anticorps monoGonaux selon l'invention, on préfère notamment l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments caractérisé en ce qu'il est produit par une cellule telle que déposée au Centre National de Culture de Microorganisme (CNCM) (Institut Pasteur, Paris, France) le 6 Septembre 1999 sous le numéro I-2308.
L'hybridome tel que déposé â la CNCM le 6 Septembre 1999 sous le numéro I-2308, fait également partie de la présente invention.
L'invention comprend en outre un anticorps monoGonal ou un de ses fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les anticorps humanisés, chimériques ou anti-idiotypes.
Les anticorps monoclonaux humanisés selon l'invention ou leurs fragments peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme de l'art (Carter et al., 1992 ; Singer et al., 1992 et Mountain et al., 1992). De tels anticorps monoclonaux humanisés selon l'invention sont préférés pour leur utilisation dans des méthodes de diagnostic in vivo et thérapeutiques.
Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments de type chimérique selon l'invention peuvent être réalisés en utilisant les techniques de recombinaison génétique. Par exemple, l'anticorps monoclonal chimérique pourra être réalisé
en clonant un ADN recombinant comportant un promoteur et une séquence codant pour la région variable d'un anticorps monoclonal selon l'invention et une séquence codant pour la région constante d'anticorps humain. Un anticorps chimérique de l'invention codé par un tel gène recombinant sera par exemple une chimère souris-homme, la WO 00/14118 PC'f/FR99/02133 5 its fragments according to the invention, characterized in that the epitope of the OZF protein is located on the N-terminal part comprising the tyrosine residue located in position 10 of the sequence of the human OZF protein as described by Le Chalony et al., 1994, to Figure 1 B page 400, preferably said epitope is carried by the fragment of aa7-aa17 sequence of said human OZF sequence.
lo Also preferably, the invention relates to a monoclonal antibody or one of its fragments according to the invention, characterized in that it is capable of further recognize the human OZF protein whose sequence has a lysinelarginine polymorphism at position 8 of the OZF protein sequence human as described by Le Chalony et al., 1994, in Figure 1 B page 400.
Among the monoGonal antibodies according to the invention, it is particularly preferred the monoclonal antibody or a fragment thereof, characterized in that it is produced by a cell as deposited at the National Center of Culture of Microorganism (CNCM) (Institut Pasteur, Paris, France) on September 6, 1999 under number I-2308.
The hybridoma as deposited at the CNCM on September 6, 1999 under the number I-2308, is also part of the present invention.
The invention further comprises a monoGonal antibody or a fragment thereof according to the invention, characterized in that it is chosen from antibodies humanized, chimeric or anti-idiotypes.
Humanized monoclonal antibodies according to the invention or their fragments can be prepared by techniques known to those skilled in the art (Carter et al., 1992; Singer et al., 1992 and Mountain et al., 1992). Such antibodies monoclonals humanized according to the invention are preferred for their use in methods of in vivo and therapeutic diagnosis.
Monoclonal antibodies or their chimeric type fragments according to the invention can be achieved using recombination techniques genetic. For example, the chimeric monoclonal antibody can be produced in cloning a recombinant DNA comprising a promoter and a sequence coding for the variable region of a monoclonal antibody according to the invention and a sequence coding for the constant region of human antibody. A chimeric antibody of the invention encoded by such a recombinant gene will be for example a mouse-human chimera, the WO 00/14118 PC'f / FR99 / 02133

6 spécificité de cet anticorps étant déterminée par la région variable dérivée de l'ADN
marin et son isotype déterminé par la région constante dérivée de l'ADN humain (Verhoeyn et al., 1988).
Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon la présente invention incluent également des anticorps anti-idiotypes produits par des méthodes connues de l'homme de l'art {Cozenza, et al., 1976 et Harlow et al., 1988).
Sont également compris dans l'invention, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon la présente invention obtenus par recombinaison génétique ou par synthèse chimique.
lo L'invention comprend également un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est marqué.
Les anticorps monoclonaux selon l'invention ou leurs fragments peuvent également, selon l'invention, se présenter sous forme d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.
Les anticorps monoclonaux marqués selon l'invention ou leurs fragments incluent par exemple des anticorps dits immunoconjugués qui peuvent être conjugués par exemple avec des enzymes telles que la péroxydase, la phosphatase alkaline, la (3-D-galactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, l'anhydrase carbonique, l'acétyl-cholinestérase, le lysozyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6 2o phosphate déhydrogénase ou par une molécule comme la biotine, la digoxigénine ou la 5-bromo-désoxyuridine. Des marqueurs fluorescents peuvent être également conjugués aux anticorps monoclonaux ou leurs fragments de l'invention et incluent notamment la fluorescéine et ses dérivés, le fluorochrome, la rhodamine et ses dérivés, la GFP (GFP pour « Green Fluorescent Protein »), le dansyl, I'umbelliférone etc.. Dans de tels conjugués, les anticorps monoclonaux de l'invention ou leurs fragments peuvent être préparés par des méthodes connues de l'homme de l'art.
Ils peuvent être couplés aux enzymes ou aux marqueurs fluorescents directement ou par l'intermédiaire d'un groupe espaceur ou d'un groupe de liaisons tel qu'un polyaldéhyde, comme le glutaraldéhydeque, l'acide éthylénediaminetétraacétique (EDTA), l'acide 3o diéthylénetriaminepentaacétique (DPTA), ou en présence d'agents de couplage tels que le périodate etc.. Les conjugués comportant des marqueurs de type fluoréscéine peuvent être préparés par réaction avec un isothiocyanate.
D'autres conjugués peuvent inclure également des marqueurs chimioluminescents tels que le luminol et les dioxétanes ou des marqueurs bioluminescents tels que la luciférase et la luciférine. 6 specificity of this antibody being determined by the variable region derived DNA
marine and its isotype determined by the constant region derived from human DNA
(Verhoeyn et al., 1988).
Monoclonal antibodies or their fragments according to the present invention also include anti-idiotype antibodies produced by methods known to those skilled in the art (Cozenza, et al., 1976 and Harlow et al., 1988).
Also included in the invention are the monoclonal antibodies or their fragments according to the present invention obtained by genetic recombination or through chemical synthesis.
lo The invention also comprises a monoclonal antibody or one of its fragments according to the invention, characterized in that it is marked.
The monoclonal antibodies according to the invention or their fragments can also, according to the invention, be in the form of labeled antibodies so obtain a detectable and / or quantifiable signal.
Monoclonal antibodies labeled according to the invention or their fragments include, for example, so-called immunoconjugate antibodies which may be conjugates for example with enzymes such as peroxidase, phosphatase alkaline, the (3-D-galactosidase, glucose oxidase, glucose amylase, anhydrase carbonic, acetyl cholinesterase, lysozyme, malate dehydrogenase or glucose-6 2o phosphate dehydrogenase or by a molecule such as biotin, digoxigenin or 5-bromo-deoxyuridine. Fluorescent markers can also be conjugated to monoclonal antibodies or their fragments of the invention and include in particular fluorescein and its derivatives, fluorochrome, rhodamine and its derivatives, GFP (GFP for "Green Fluorescent Protein"), dansyl, Umbelliferone etc. In such conjugates, the monoclonal antibodies of the invention or their fragments can be prepared by methods known to those skilled in the art.
They can be coupled to enzymes or fluorescent labels directly or through through a spacer group or a link group such as polyaldehyde, such as glutaraldehydeque, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), acid 3o diethylenetriaminepentaacetic (DPTA), or in the presence of coupling agents such as the periodate, etc. The conjugates comprising type markers fluorescein can be prepared by reaction with an isothiocyanate.
Other conjugates may also include markers chemiluminescent such as luminol and dioxetanes or markers bioluminescent such as luciferase and luciferin.

7 Parmi les marqueurs pouvant être fixés sur l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention, on préfère également les marqueurs radioactifs tels que '4C, ICI, 5'Co, ~Co, 5'Cr,'SZEu, S9Fe, 3H, 'zsl, '3~1, 3zP, ~sS, 'SSE et ~"'Tc qui peuvent être détectés par des moyens connus tels que le compteur gamma ou à
scintillations, s par autoradiographie, etc..
La présente invention comprend également les anticorps monoclonaux marqués ou leurs fragments selon l'invention dans lesquels le conjugué peut être un marqueur détectable choisi parmi les marqueurs pouvant être utilisés dans l'application imagerie in vivo. Des exemples de tels marqueurs selon l'invention sont 'zAs, 6'Cu, l0 6'Ga, ~Ga, ~r31~ ~a.~l~ ts~l~ »yn~ a~Ru~ ss""Tc, zo~Tl et ~Zr.
Le terme u imagerie in vivo » doit être entendu dans la présente description comme toute méthode permettant la détection d'un anticorps monoclonal marqué
selon la présente invention ou un de ses fragments qui se fixe spécifiquement sur l'épitope de la protéine OZF dans le corps du patient. Le patient sera de préférence un homme 15 susceptible de présenter des cellules tumorales exprimant de manière anormale la protéine OZF.
La présente invention comprend également les anticorps monoGonaux marqués ou leurs fragments selon l'invention dans lesquels le conjugué peut être un marqueur choisi parmi les marqueurs paramagnétiques pouvant être utilisés dans 2o l'application imagerie in vivo. De tels marqueurs selon l'invention sont par exemple les isotopes paramagnétiques particulièrement utilisés dans l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et qui incluent notamment SzCr, '6zDy, ~Fe,'S'Gd et ~Mn.
Tel que mentionné précédemment, pour la préparation de conjugués d'anticorps monoclonaux, le marqueur isotopique ou paramagnétique pourra être fixé
25 sur l'anticorps selon l'invention ou un de ses fragments soit directement ou soit indirectement en utilisant un groupe fonctionnel intermédiaire. Selon l'invention, l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments peut être marqué par toute technique connue de l'homme de l'art telle que par exemple celles décrites par Wagner et al., 1979 et Saha et al., 1976. Les conjugués monoclonaux radiomarqués selon la 3o présente invention peuvent par exemple être iodinés par contact avec du iodure de sodium ou de potassium et d'un agent chimique oxydant tel que l'hypochlorite de sodium ou un agent oxydant enzymatique tel que la lactopéroxydase.
Le type de détection de l'instrument utilisé sera un facteur majeur dans la sélection du marqueur. Par exemple, les isotopes radioactifs ou paramagnétiques 35 seront choisis, en particulier pour l'imagerie in vivo, en fonction du type d'instrument WO 00/14117 Among the markers that can be attached to the monoclonal antibody or one of its fragments according to the invention, radioactive markers are also preferred such as '4C, HERE, 5'Co, ~ Co, 5'Cr,' SZEu, S9Fe, 3H, 'zsl,' 3 ~ 1, 3zP, ~ sS, 'SSE and ~ "' Tc which can be detected by known means such as the gamma counter or scintillations, s by autoradiography, etc.
The present invention also includes monoclonal antibodies marked or fragments thereof according to the invention in which the conjugate can be a detectable marker chosen from the markers that can be used in the application in vivo imaging. Examples of such markers according to the invention are 'zAs, 6'Cu, l0 6'Ga, ~ Ga, ~ r31 ~ ~ a. ~ l ~ ts ~ l ~ »yn ~ a ~ Ru ~ ss""Tc, zo ~ Tl and ~ Zr.
The term "in vivo imaging" should be understood in the present description like any method allowing the detection of a labeled monoclonal antibody according to the present invention or a fragment thereof which specifically binds to the epitope of the OZF protein in the patient's body. The patient will preferably be a man 15 likely to have tumor cells expressing so abnormal OZF protein.
The present invention also includes the monoGonal antibodies.
marked or fragments thereof according to the invention in which the conjugate can be a marker chosen from paramagnetic markers that can be used in 2o in vivo imaging application. Such markers according to the invention are for example the paramagnetic isotopes particularly used in imaging by resonance magnetic (MRI) and which include SzCr, '6zDy, ~ Fe,'S'Gd and ~ Mn.
As previously mentioned, for the preparation of conjugates monoclonal antibodies, the isotopic or paramagnetic marker can be fixed 25 on the antibody according to the invention or one of its fragments either directly or either indirectly using an intermediate functional group. According to the invention, the monoclonal antibody or one of its fragments can be labeled with any technical known to those skilled in the art such as for example those described by Wagner and al., 1979 and Saha et al., 1976. The radiolabelled monoclonal conjugates according to the 3o present invention can for example be iodinated by contact with iodide sodium or potassium and an oxidizing chemical such as hypochlorite of sodium or an enzymatic oxidizing agent such as lactoperoxidase.
The type of detection of the instrument used will be a major factor in the marker selection. For example, radioactive isotopes or paramagnetic 35 will be chosen, in particular for in vivo imaging, depending on the type instrument WO 00/1411

8 PCT/FR99/02133 utilisé qui guidera la sélection de ces marqueurs. De préférence, les marqueurs radioactifs choisis devront avoir une période qui est détectable par le type d'instrument choisi. Ces anticorps monoclonaux pourront ainsi ëtre utilisés par exemple comme agent d'imagerie, in vivo ou ex vivo sur des prélèvements biologiques dans toute s méthode conventionnelle permettant de visualiser par image un diagnostic de pathologie lié à l'expression anormale de la protéine OZF. Ces agents d'imagerie ou les réactifs pour diagnostic in vitro caractérisés en ce qu'ils comprennent un anticorps monoclonal marqué selon l'invention ainsi que leurs utilisations dans des méthodes de diagnostic in vitro ou de diagnostic par imagerie in vivo pour le diagnostic de pathologie lo liée à l'expression anormale de la protéine OZF font bien entendu partie de la présente invention.
L'invention comprend également un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est couplé à un composé
cytotoxique.
1s Les agents cytotoxiques qui peuvent ètre conjugués aux anticorps monoclonaux selon l'invention incluent notamment, mais sans s'y limiter, des composés alkylants tels que la méchloréthamine, la méthylène phosphoramide, la triaziquone, la camustine, la sémustine, le méthotrexate, la mercaptopurine, la cytarabine, le fluorouracile, des antibiotiques tels que l'actinomycine, des hormones ou 2o des antagonistes d'hormones tels que les corticostéroïdes, comme la prednisone ou les progestines. Les conjugués anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être préparés en conjuguant des substances cytotoxiques contenant soit la toxine intacte ou soit leur chaîne A dérivée avec l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon des techniques de l'homme de l'art (Chaudry et al., 1993 ; Sung et al., 1993 et 2s Selvaggi et al., 1993).
L'anticorps monoclonal selon l'invention peut également étre un anticorps monoctonal hétéroconjugué tel qu'une molécule hybride composée de deux ou plusieurs anticorps. Un hétéroconjugué inclut par exemple un anticorps monoclonal simple chaîne selon l'invention et un anticorps monoclonal simple chaîne qui est 3o spécifique d'un récepteur cellulaire (Kerr et al., 1990 et Hsieh-Ma et al., 1992).
Sous un autn: aspect, l'invention a pour objet une composition pharmaceutique pour ie traitement, la prévention ou pour le diagnostic in vivo de pathologie liée à
l'expression anormale de la protéine OZF, caractérisée en ce qu'elle comprend a) un anticorps monoclonal ou un de ses fragments, selon l'invention ; et 35 b) un excipient pharmaceutiquement acceptable. 8 PCT / FR99 / 02133 used that will guide the selection of these markers. Preferably, markers radioactive materials chosen should have a period which is detectable by type instrument selected. These monoclonal antibodies can thus be used for example as imaging agent, in vivo or ex vivo on biological samples in all s conventional method for visualizing a diagnosis of pathology linked to the abnormal expression of the OZF protein. These agents imaging or reagents for in vitro diagnosis, characterized in that they include a antibody monoclonal labeled according to the invention and their uses in methods of in vitro diagnostic or in vivo diagnostic imaging for diagnosis pathology lo linked to the abnormal expression of the protein OZF are of course part of the current invention.
The invention also comprises a monoclonal antibody or one of its fragments according to the invention, characterized in that it is coupled to a compound cytotoxic.
1s Cytotoxic agents which can be conjugated to antibodies monoclonals according to the invention include in particular, but are not limited to, alkylating compounds such as mechlorethamine, methylene phosphoramide, triaziquone, camustine, semustine, methotrexate, mercaptopurine, the cytarabine, fluorouracil, antibiotics such as actinomycin, hormones or 2o hormone antagonists such as corticosteroids, such as prednisone or progestins. The monoclonal antibody conjugates according to the invention can to be prepared by conjugating cytotoxic substances containing either the toxin intact or either their chain A derived with the monoclonal antibody or one of its fragments according techniques of a person skilled in the art (Chaudry et al., 1993; Sung et al., 1993 and 2s Selvaggi et al., 1993).
The monoclonal antibody according to the invention can also be an antibody heterogeneous monoctonal such as a hybrid molecule composed of two or several antibodies. A heteroconjugate includes for example an antibody monoclonal single chain according to the invention and a single chain monoclonal antibody which East 3o specific for a cellular receptor (Kerr et al., 1990 and Hsieh-Ma et al., 1992).
In another aspect: the invention relates to a pharmaceutical composition for treatment, prevention or in vivo diagnosis of pathology linked to the abnormal expression of the OZF protein, characterized in that it comprises a) a monoclonal antibody or a fragment thereof, according to the invention; and B) a pharmaceutically acceptable excipient.

9 De préférence, la composition pharmaceutique selon l'invention, est caractérisée en ce que ladite pathologie est choisie parmi les cancers, notamment le cancer du pancréas, du côlon ou du sein.
L'invention a également pour objet futilisaüon d'un anticorps monoGonal ou un de ses fragments selon (invention pour la fabrication d'un médicament destiné
à la prévention ou au traitement du cancer, notamment le cancer du pancréas, le cancer du côlon ou le cancer du sein.
En général, la dose d'anticorps monoclonaux marqués ou un de leurs fragments pour le diagnostic in vivo de pathologie liée à (expression anormale de ia lo protéine OZF, pourra varier en fonction de paramètres tels que l'âge, les conditions, le sexe, de l'étendue de fa maladie du patient, de contre-indications s'il en existe, de thérapies concomittantes ou d'autres variables qu'un homme de l'art saura ajuster.
L'administration de ces composés au patient peut ëtre locale ou systémique et accomplie par voie intraveineuse, infra-artérielle, par !'intermédiaire du liquide spinal, etc.. L'administration peut ëtre également effectuée par voie intradermique ou par voie intracavitaire, orale ou nasale, en fonction de la partie du corps qui doit ëtre examinée.
Après un temps suffisant permettant à l'anticorps monoclonal de se fixer sur la protéine OZF, par exemple de 30 minutes à 48 heures, on examine la partie du corps qui doit ëtre examinée par les techniques d'imagerie classiques telles que fIRM, ou l'imagerie 2o par scintillation. Le protocole exact dépendra nécessairement de facteurs spécifiques liés au patient, de la partie du corps à examiner, de la méthode d'administration et du type des marqueurs utilisés. Les procédures spécifiques pourront être déterminées par l'homme de l'art. La distribution des isotopes radioactifs fixés et leur décroissance avec le temps sera ensuite enregistrée et contrôlée. En comparant les résultats obtenus avec ceux obtenus pour des individus cliniquement normaux, la présence et la localisation de cellules tumorales pourront être déterminées et contrôlées.
La quantité d'anticorps monoclonaux comprise dans les compositions pharmaceutiques selon la présente invention et nécessaire pour une thérapie efficace dépendra de différents facteurs tels que le mode d'administration, la partie du corps 3o ciblée, l'état physiologique du patient, de l'administration d'autres médicaments, des éventuels effets secondaires, etc.. Le dosage pour de telles préventions ou traitements thérapeutiques devra être réalisé de manière à optimiser sa sécurité et son efficacité.
En général, les dosages utilisés in vitro peuvent fournir une indication pour les quantités utilisées pour l'administration d'anticorps monoclonaux in situ et ainsi des 3s modèles animaux peuvent être utilisés pour déterminer les quantités efficaces d'anticorps monoclonaux selon l'invention pour le traitement de pathologie particulière.
Ces méthodes sont en particulier discutées dans les ouvrages tels que Gilman et al.
(1990) et Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) pour des méthodes d'administration telles que les méthodes par voie orale, intraveineuse, intrapéritonale, 5 intramusculaire ou transdermique. Les excipients pharmaceutiquement acceptables incluent notamment l'eau, les solutions saunes, les tampons ou tout autre composé
décrit par exemple dans l'Index de Merck.
L'invention comprend en outre l'utilisation d'un anticorps monoclonal ou un de ses fragments pour le traitement, la prévention ou pour le diagnostic in vifro ou in vivo lo de pathologie liée à l'expression anormale de la protéine OZF, notamment pour le traitement, la prévention ou le diagnostic de cancer comme le cancer du pancréas, du côlon ou du sein, ladite utilisation étant comprise dans l'invention.
L'invention concerne également une méthode de détection et/ou de dosage de la protéine OZF dans un échantillon biologique caractérisée en ce qu'elle comprend les 1s étapes suivantes a) la mise en contact d'un échantillon biologique avec un anticorps monoclonal selon l'invention ; et b) la détection et/ou le dosage de la fixation dudit anticorps sur la protéine OZF
contenue dans (échantillon biologique.
2o Par ailleurs, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon l'invention, peuvent également être utilisés pour l'identification, ia localisation, notamment tissulaire ou cellulaire, et/ou le dosage de la protéine OZF, ladite utilisation étant comprise dans l'invention.
Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon l'invention constituent 25 également un moyen d'analyse immunocytochimique ou immunohistochimique de l'expression de la protéine OZF sur des coupes de tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, par marquage enzymatique, radioactif ou à l'or. Ils permettent notamment de mettre en évidence et de quantifier la présence spécifique normale ou anormale de la protéine OZF dans les tissus ou prélèvements biologiques, ce qui les 3o rend utiles pour (identification et la localisation de l'expression de la protéine OZF, pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de la protéine OZF
mais également pour le suivi de l'évolution de méthodes de prévention ou de traitement de pathologie nécessitant ladite détection ou ledit dosage.
Plus généralement, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon 35 l'invention peuvent ëtre avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où

l'expression de la protéine OZF doit être observée de manière qualitative et/ou quantitative.
De préférence, l'échantillon biologique est constitué par un fluide biologique, tel que le sérum, le sang total, des cellules, un échantillon de tissu ou des biopsies d'origine humaine.
Toute procédure ou test classique peut être mise en oeuvre pour réaliser une telle détection et/ou dosage. Ledit test peut être un test par compétition ou par sandwich, ou tout test connu de l'homme de l'art dépendant de la formation d'un complexe immun anticorps-antigène. Suivant les applications selon l'invention, l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments peut être immobilisé ou marqué.
Cette immobilisation peut être réalisée sur de nombreux supports connus de l'homme de l'art. Ces supports peuvent notamment inclure le verre, le polystyrène, le polypropylène, ie polyéthylène, le dextran, le nylon, ou des celluloses naturelles ou modifiées. Ces supports peuvent être soit solubles ou insolubles.
A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus immunoenzymatiques selon la technique ELISA, par immunofluorescence, ou radio-immunologique (RIA) ou équivalent.
L'invention comprend également une trousse pour la détermina~on de la présence de protéine OZF dans un échantillon biologique comprenant un anticorps ou 2o un de ses fragments selon l'invention.
Entre également dans le cadre de l'invention, une trousse pour la détection et/ou le dosage de la protéine OZF selon l'invention dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants a) un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention ;
b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ;
c) les réacüfs permettant la détection des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique.
Sous un dernier aspect, l'invention a pour objet une méthode pour évaluer l'affinité d'un composé à tester pour la protéine OZF, caractérisée en ce qu'elle comprend a) la mise en contact d'un échantillon contenant ladite protéine OZF avec i) un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention ; et ü) ledit composé à tester ; et b) la mesure de la quantité dudit anticorps monoGonal ou l'un de ses fragments, ladite quantité étant inversement proportionnelle à la quantité de composés à
tester fixés sur ladite protéine OZF.
Les anticorps monoclonaux selon l'invention ou leurs fragments peuvent être utilisés également dans des méthodes in vitro pour la sélection de composés susceptibles de se fixer à la protéine OZF avec l'affinité recherchée. Ainsi, la présente invention comprend également des méthodes de sélection par compétition de composés pharmaceutiques dans lesquelles les anticorps monoclonaux de l'invention ou leurs fragments entrent en compétition avec le composé à tester susceptible de se 1o fixer à la protéine OZF. De cette manière, (anticorps monoclonal ou ses fragments est utilisé pour détecter la présence de tout composé tel qu'un polypeptide ou tout autre composé organique qui peuvent présenter un ou plusieurs sites de reconnaissance de fépitope de la protéine OZF reconnu par les anticorps selon l'invention. Ainsi ces composés, identifiés par la méthode selon l'invention pourront être utilisés pour occuper ces sites de fixation sur la protéine OZF et agir en tant qu'agent modulateur ou antagoniste de l'activité biologique de la protéine OZF.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après.
LEGENDES DES FIGURES
FIGURES 1A et 1B. Analyse par Southem blot de lignées cellulaires pancréatiques et de tumeurs primaires.
Figure 1A : Hybridation par Southem blot des ADN totaux génomiques de placenta et de douze lignées cellulaires d'adénocarcinomes pancréatiques digérés par Bglll. Trois lignées cellulaires, AtCPC-1, BxPC-3, Su.86.86 présentent une co-amplification d'OZF
avec RAC. PANG1 présente une amplification de RAC uniquement.
Figure 1 B : Hybridation par Southem blot de i'ADN total génomique de AICPC-1 (figure 1A), de placenta (P) et de douze tumeurs primaires d'adénocarcinomes pancréatiques 3o digérées par Bglll. La comparaison des intensités des signaux d'hybridation d'OZF
avec ceux obtenus après réhybridation avec une sonde N-myc montre une augmentation du nombre de copies du gène dans les échantillons tumoraux T6 et T9.
FIGURE 2. Expression de fARNm d'OZF dans les lignées cellulaires pancréatiques.
L'ARN, des douze lignées cellulaires d'adénocarcinomes pancréatiques analysées par Southem blot dans les figures 1A et 1 B, était analysé par Northern blot avec une sonde d'ADNc contenant la phase ouverte de lecture d'OZF. AICPC-1, BxPC-3, Su.86.86 ayant OZF amplifié, présentent un haut niveau d'expression. De hauts niveaux d'expression d'OZF sont observés en absence d'amplification dans Capan-1, -2, MlA
PaCa-2 et PANC-1. L'absence ou une très faible expression a été observée dans un échantillon de pancréas normal adulte (Clontech). Le gel correspondant, coloré
avant transfert au bromure d'éthidium, est montré en dessous, avec les bandes d'ARN
ribosomiques 28S et 18S.
FIGURES 3A, 3B et 3C. Analyse par Western blot de lignées cellulaires pancréatiques et de tumeurs primaires. Des quantités identiques de protéine (10 Ng), déterminées par lo coloration des extraits après électrophorèse sur gel SDS (non montré) ont été
transférées sur nitrocellulose. La nitrocellulose a été alors bloquée et hybridée avec un anticorps polyclonal anti-OZF.
Figure 3A : Lignées cellulaires pancréatiques précédemment analysées par Southern et Northem blot (figure 1A et figure 2).
Figure 3B : Immunotransfert d'OZF d'échantillons de tumeurs primaires d'adénocarcinomes pancréatiques.
Figure 3C : Immunotransfert d'OZF de pancréas normal humain. Les protéines ont été
extraites dans les mêmes conditions pour les quatre échantillons indépendants de pancréas normaux (P1-P4), la lignée MIA PaCa-1 (MP) et pour un carcinome pancréatique (T6) exprimant OZF. La nitroceHulose a été hybridée avec des anticorps polyclonaux anti-OZF et anti-pag afin de vérifier l'intégrité des protéines.
Les anticorps anti-pag sont des anticorps de poule purifiés dans les mémes conditions que les anti-OZF.
FIGURES 4A, 4B et 4C. Détection par immunohistochimie d'OZF dans les carcinomes 2s pancréatiques humains. La coloration à la péroxydase a été obtenue avec un anticorps anti-OZF purifié par affinité. Les anticorps anti-OZF montrent une coloration granulaire nucléaire dans les cellules AICPC-1 greffées chez la souris athymique (figure 4A), dans un adénocarcinome exprimant OZF (figure 4B), et l'absence de coloration dans du pancréas sain n'exprimant pas OZF (figure 4C) (grossissement : 1000X).
3o FIGURE 5. Analyse par Western blot d'extraits bruts de cellules humaines 293 non transfectées et transfectées par un vecteur d'expression OZF. Détection de la protéine OZF endogène (à gauche) et après détection transitoire par un vecteur d'expression du gène OZF (à droite) en triplicata, avec un anticorps monoclonal anti-OZF et un anticorps secondaire anti-souris couplé à la péroxydase, par chimio-luminescence.

FIGURE 6. Marquage immunocytochimique de la protéine OZF dans les cellules de la lignée AICPC-1 issue d'un adénocarcinome pancréatique surexprimant la protéine OZF. Les cellules sont cultivées sur lamelle, fixées par 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS, puis perméabilisées par 0,1 % de triton X100. Les sites non spécifiques sont saturés par 2 % de BSA. Les cellules sont incubées 1 h avec l'anticorps monoclonal anti-OZF (1/200), lavées puis mises en contact 30 mn avec le second anticorps anti-souris couplé à un fluorochrome, lavées et incubées 4 mn au DAPI (0,2 Ng/ml) qui marque spécifiquement les noyaux (photos de gauche). Un marquage nucléaire spécifique d'OZF est observé (photos de droite). A faible grossissement en haut et à
1o fort grossissement en bas.
FIGURE 7. Expression du gène OZF dans les cancers du côlon. Analyse par Western blot.
A l'aide des anticorps monoclonaux, nous avons examiné l'expression de la protéine OZF dans les cancers du côlon. L'étude a porté sur 16 échantillons coliques.
Sur les 16 échantillons, 10 proviennent d'une tumeur colique (T1 - T3 - T5 - T6 - T7 -T10 - T11 - T12), et 6 de muqueuses coliques saines (C2 - C4 - C5 - C6 - C8 -C12).
Les échantillons T5 et C5 proviennent d'un même patient, de méme que T6 - C6, C8, et T12 - C12. Nous avons déposé dans les puits d'électrophorèse des quantités équivalentes de protéine pour chaque échantillon colique, les échantillons sont séparés 2o par migration sur gel de polyacrylamide, puis transférés sur une membrane de PVDF.
La protéine OZF est révélée par l'anticorps monoclonal anti-OZF et un anti-anticorps de souris couplé à la péroxydase.
Dans les quatre cas où nous avions un échantillon colique sain et un échantillon colique cancéreux prélevés chez une mëme personne, nous avons constaté une accumulation plus importante de la protéine OZF dans le tissu tumoral que dans le tissu normal.
En comparant la quantité de protéine OZF accumulée, nous constatons que les tissus tumoraux T1 - T3 - T5 - T7 - T8 - T9 - T10 - T12 présentent une quantité
supérieure de protéine OZF par rapport aux tissus sains.
3o FIGURE 8. Comparaison des séquences d'acides aminés N-terminales des protéines OZF suivant leur origine et leur réactivité avec les anticorps monoclonaux.
Comparaison de la région N-terminale de deux allèles de la protéine OZF
humaine (hu-OZF) qui diffèrent par un polymorphisme à la position 8 (KIR) avec la protéine OZF
d'origine mucine (mu-OZF) et bovine (bo-OZF). La séquence du peptide synthétique utilisé dans les expériences d'inhibition compétitive est indiquée au-dessus (PEPTIDE).

Le résidu tyrosine en position 10 est souligné. La séquence de la protéine porteuse MBP est indiquée en petites lettres majuscules pour la protéine MBP-OZF. Le chaînon consensus HIC {"H/C link") précédent le premier doigt de zinc correspond à la position 11-17.
s * indique les positions parfaitement conservées ;
° indique le polymorphisme K/R.
La réactivité avec l'anticorps monoGonal 5B8 selon l'invention est indiquée dans la colonne de droite (+ : positive ; - : négative).
lo EXEMPLES
Matériels et méthodes Echantillons tumoraux et lignées cellulaires. Onze lignées de cellules d'adénocarcinomes de pancréas ont été obtenues de fAmerican Type Culture Collection (Rockville, USA) et cultivées comme prescrit par le fournisseur.
Une lignée ls cellulaire additionnelle (AICPC-1) a été établie au laboratoire à partir de la tumeur primitive d'une patiente agée de soixante ans atteint d'un adénocarcinome du pancréas. Les cellules ont été cultivées dans du milieu Dubelcco modifié
supplémenté
avec 20 % (vol/vol) de sérum de veau foetal. Des tissus tumoraux ont aussi été
obtenus de patients atteints de carcinome primaire du pancréas exocrine (n =
13 ; 6 2o hommes et 7 femmes).
Analyse par Southem et par Northern blot. L'extraction d'ADN a été effectuée suivant les méthodes standards pour les lignées cellulaires et pour les tumeurs congelées (Sambrook et al., 1989). Les fragments obtenus après digestion de l'ADN
génomique (5 Ng) avec fendonucléase Bgll ont été séparés par électrophorèse sur gel 2s d'agarose à 0,7 %, transférés sur nitrocellulose (BA85, Schleicher et Schuell) et hybridés avec des sondes marquées au P32 (Le Chalony et al., 1996). Les lignées de cellules tumorales ont été hybridées avec une sonde OZF obtenue après amplification par PCR à l'aide d'amorces internes pour générer un fragment de 1 kb contenant toute la phase ouverte de lecture (847-1840). Les carcinomes pancréatiques primaires ont 3o été hybridés avec un fragment cloné Xbal/Scal (652-1852) (Le Chalony et al., 1994).
La sonde RAC (2,2 kb) a été préparée à partir d'un clone pUC-RAC à l'aide d'amorces universelles situées de part et d'autre du site multiple de clonage (Cheng et al., 1992).
L'évaluation quantitative des signaux d'hybridation a été faite au phosphorimager (BioRad). Les ARN totaux ont été extraits à l'aide du kit Rneasy {Qiagen).
Pour les 35 analyses en Northem blot, 10 Ng d'ARN ont été déposés sur gel d'agarose 1 %
I 2,2 M

formaldéhyde, transférés après migration sur membrane de nitrocellulose (BA85, Schleicher et Schuell) et hybridés avec la sonde Xbal/Scal.
Production des anticorps polyclonaux. Les antisérums ont été développés chez la poule en utilisant la protéine OZF purifiée comme immunogène (Ferbus et al., 1996).
s Les immunoglobulines IgY de jaune d'oeuf de poule ont été préparés comme décrit (Akita et al., 1992). Les anticorps spécifiques ont été obtenus à partir des IgY anti-OZF
après purification par affinité sur une colonne de MBP-OZF couplé au sépharose (Pharmacia) (Ferbus et al., 1996). La spécificité des anticorps anti-OZF a été
vérifiée par immunoélectrophorèse. Une bande unique de 33 kDa a été observée dans les 1o extraits nucléaires des cellules exprimant OZF.
Méthode de préparation de l'anticorps monoclonal. La protéine recombinante de fusion MBP-OZF produite chez E. soli a été purifiée sur colonne d'amylose par affinité
pour le MBP (Ferbus et al., 1996). Des souris ont été immunisées avec la protéine MBP-OZF purifiée. L'immunisation de souris Balblc est réalisée par trois injections 15 sous-cutanées à deux semaines d'intervalle de 50 Ng de protéine MBP-OZF
purifiée.
La réponse immune anti-OZF est contr8lée par ELISA et immunoblot en utilisant la protéine MBP-OZF. Trois jours avant la fusion, 100 pg de protéine MBP-OZF sont injectés par voie intraveineuse aux souris ayant les plus hauts titres d'anti-sérum.
Après le test de criblage en ELISA, nous avons sélectionné pour l'étape de fusion la 2o souris qui présentait la meilleure réponse. Les leucocytes spléniques ont été fusionnés avec les cellules de la lignée myélomateuse P3X63/8.653 en présence de polyéthylèneglycol à 50 %. Après "HAT' sélection dans la culture bn.ite, les hybridomes sont encapsulés individuellement dans des gouttelettes d'agarose biotinylé et marqués par la protéine MBP-OZF conjuguée à fisothiocyanate de fluorescine (+) et par la 25 protéine MBP-PAG conjuguée à la phycoérythrine (-). La suspension de gouttelettes est ensuite analysée par cytométrie de flux et seuls les hybridomes réagissant avec le conjugué MBP-OZF sont isolés et Gonés suivant la technique de "sécrétion capture report web" (SCRW) (Kenney et al., 1995).
Les anticorps monoclonaux sont purifiés à partir du surnageant de culture des 3o hybridomes par chromatographie d'affinité sur colonne protéine G Sépharose (Pharmacia).
Les immunoglobulines produites sont en majorité des IgG1.
L'anticorps monoclonal spécifique de la protéine OZF humaine reconnaït celle-ci à (état natif ou dénaturé (en ELISA, en Western, en immunohistochimie, par 35 immuno-précipitation).

Technique EL-ISA pour ia sélection et la caractérisation des anticorps monoclonaux.
- Incubation de microplaques 96 puits pour ELISA en présence de 50 NI par puits d'une solution de MBP-OZF ou MBP-PAG (témoin) à 10 Ng/ml en tampon carbonate-s bircarbonate 0,05 M, pH 9,6, une nuit à 4°C.
- Saturation avec une solution d'albumine bovine sérique à 2 % en tampon phosphate salin pH 7,3 (PBS).
- Addition de 25 Irl de surnageant brut de culture de fhybridome avec 25 ul d'une solution de Tween à 0,1 % en tampon PBS et incubation 2 heures à 37°C.
- Après lavage, addition de 50 NI d'une solution au 1/10 000 d'anticorps de chèvre anti-souris conjugués à la phosphatase alcaline (Sigma, St Louis, MO) et incubation heure à 37°C.
- Détection avec une solution de p-nitrophényl phosphate à 1 mg/ml en tampon diéthanolamine, pH 9,8, MgCl2 0,5 mM.
- Mesure de fabsorbance à 405 nm avec un lecteur microplaque (Titertek Multiscan de chez Labsystem, les Ulis, France).
Les isotypes des anticorps monoclonaux sont déterminés par ELISA en utilisant un kit pour le sous-typage d'hybridome murin (Boehringer-Mannheim, Allemagne).
L'épitope de reconnaissance se situe au niveau de son extrémité NH2 2o terminale. II reconnaît en effet la protéine OZF recombinante tronquée, ne possédant que les deux premiers doigts à zinc, et ne reconnaît pas la protéine murine homologue qui diffère de la protéine humaine au niveau de ses quinze premiers acides aminés.
Extraction des protéines et analyse par Western blot avec anticorps polyclonaux.
Les échantillons tumoraux congelés et les extraits cellulaires ont été
solubilisés dans du tampon SDS en présence de ø-mercaptoéthanol et chauffés à ébullition 5 minutes.
Des quantités égales de protéines (10 Ng) ont été chargées sur gel SDS
polyacrylamide 12 % et transférées après migration sur membrane de PDVF
(Amersham). Les membranes ont été hybridées avec les anticorps anti-OZF puis avec des anti-poules de lapin conjugués à la phosphatase alcaline (Sigma), dilués 3o respectivement 200 et 15 000 fois. La chimioluminescence a été produite par incubation de la membrane avec du CDP star (Dupont) et la protéine a été
révélée par autoradiographie sur un fitm X-OMAT ARS.
Extraction des protéines et analyse par Western blot avec anticorps monoclonaux. Les cellules sont cultivées à confluence, trypsinées, concentrées par centrifugation et lysées avec du tampon (65 mM Tris-HCI, pH 6,8, 0,01 % bleu de bromophénol, 5 % ~i-mercaptoéthanol, 10 % glycérol, 2 % SDS) en présence d'inhibiteurs de protéase, chauffées à ébullition puis soniquées. 50 Ng d'extrait cellulaire ou 0,05 Ng de protéine recombinante sont chargés dans chaque puits.
Les protéines sont séparées par électrophorèse sur un gel polyacrylamide à 12 % en SDS
s et transférées sur membrane PDVF (immobilon-P, Millipore). L'efficacité du transfert de protéine est contr8lée par coloration Ponceau S. L'analyse par Western blot est réalisée selon la technique décrite dans Ferbus et al., 1996. Les blots sont hybridés pendant 2 heures avec des anticorps anti-OZF dilués au 1/500 puis avec des IgG
anti-souris de chèvre conjugués à la phosphatase alcaline dilués au 1/10 000. Les mêmes lo conditions sont utilisées pour le témoin positif avec des anticorps anti-OZF de poulet dilués au 1/200 et des anticorps anti-poulet IgY de lapin au 1/10 000. La phosphatase alcaline est détectée par chimioluminescence avec le réactif CDP-star (NEN
Live Science Products) et visualisée par autoradiographie (X-OMAT AR, Kodak, Rochester, NY).
15 Immunofluorescence. Les cellules sont cultivées dans des lames Lab-Teck à
chambre (Nunc Inc., Naperville, IL) pendant 24 heures. Les lames Lab-Teck sont lavées deux fois en PBS et fixées avec une solution à 4 % de paraformaldéhyde en PBS (p/v) pendant 15 minutes à température ambiante. Les cellules sont ensuite rincées en PBS et incubées deux fois pendant 30 minutes dans une solution à
0,1 M
2o glycine, 0,2 M Tris-HCI pH 7,5 puis perméabilisées dans une solution de triton X100 à
0,1 % (v/v) dans du PBS pendant 5 minutes. Les anticorps anti-OZF purifiés sont incubés pendant une heure à 37°C (dilution au 1/100) en tampon PBS à
0,5 d'albumine bovine sérique (p/v). Après lavage, les cellules sont incubées pendant 30 minutes à 37°C avec des anticorps IgG (H+L) anti-souris de chèvre conjugués à la 25 FITC (isothiocyanate de fiuoréscéine) dilués au 1/80 (Biosys S.A., France).
Les lames sont colorées par contraste avec du DAPI (4'6-diamidino-2-phénylindole) pour la coloration de l'ADN de la chromatine, fixées par une solution (Vectashield, Vector Laboratoires, Inc., Burlingame, CA) et observées sous un microscope à
fluorescence.
Marquage immunohistochimique d'OZF. La coloration a été obtenue par un anti-3o poule couplé à la péroxydase après incubation avec un antisérum anti-OZF de poule purifié, sur des coupes de tissu congelé (5 Nm) comme décrit (Terris et al., 1995).
Transfection des cellules N1H3T3. La surexpression d'OZF est réalisée par transfection d'une lignée cellulaire murine NIH3T3 avec un vecteur plasmidique exprimant la protéine OZF dans des cellules eucaryotes. Le milieu de culture est 35 ensemencé avec une densité cellulaire de 0,8 x 106 cellules dans des boïtes de pétri de diamètre 60 mm puis les cellules sont transfectées 24 h plus tard avec 2 Ng de plasmide en utilisant la technique de calcium-phosphate. 5 à 6 h après la transfection les précipités sont éliminés et les cellules sont remises en milieu de culture. Le jour suivant, les cellules sont transférées dans des lames Lab-Tek à chambre et fixées avant l'analyse par immunofluorescence.
EXEMPLE 1 : Amplification du gène OZF dans les lignées d'adénocarcinomes pancréatiques Pour évaluer le nombre de copies du gène OZF dans les cellules des lignées 1o tumorales et déterminer s'il appartient à famplicon portant le gène RAC, les ADN
génomiques totaux, de 12 lignées cellulaires et d'un placenta, ont été digérés avec l'enzyme de restriction Bglll, séparés sur gel d'agarose et hybridés par Southem blot avec des sondes ADN OZF et RAC. Comme montré dans la figure 1A, trois lignées, AICPC-1, BxPC-3, SU.86.86 présentent un signal d'amplification dans un fragment génomique Bglll de taille de 5,3 kb. La quantification des niveaux d'amplificaüon révèle que le gène OZF est approximativement de 60 copies, 6 copies et 30 copies dans AICPG1, BxPC-3, SU.86.86 respectivement. La co-amplification avec RAC est observée dans ces trois lignées, cependant PANC-1 montre une ampl~cation de RAC
seule. Le nombre de copies des gènes RAC et OZF est similaire dans BxPC-3.
2o L'intensité relative du signal d'amplification est supérieure pour le gène OZF que pour RAC dans AICPC-1 et inférieure dans SU.86.86. Ces expériences montrent que le gène OZF est co-amplifié avec RAC dans trois des quatre lignées cellulaires.
Contrairement à ce qui avait été reporté, l'amplification de RAC dans la lignée AsPG1 n'est pas détectée (Cheng et al., 1996 ; Miwa et al., 1996). Les analyses caryotypiques des lignées cellulaires ont confirmé la ploïdie et la spé~cité du marquage chromosomique de chaque lignée incluant AsPG1 (Curtis et al., à para?tre).
L'amplification précédemment décrite dans AsPC-1 peut être due à un sous clone ou avoir été perdue pendant la propagation en culture.
L'état d'amplification d'OZF a été examiné dans des échantillons tumoraux.
3o Douze adénocarcinomes primaires pancréatiques, pris au hasard, ont été
analysés par Southem blot avec une sonde OZF (figure 1 B). Deux tumeurs (T6 et T9) présentent une augmentation du signal d'hybridation (de 3 à 5 fois) par rapport à l'ADN
placentaire, après normalisation avec le signal obtenu après réhybridation avec une copie unique du gène N-myc. Ce signal est considéré comme significatif pour l'amplification étant donné la forte proportion de cellules non tumorales dans les tissus tumoraux.
EXEMPLE 2 : Expression d'OZF dans les lignées pancréatiques et dans les échantillons tumoraux 5 L'expression d'OZF a été examinée en premier dans les lignées tumorales par Northem blot (figure 2). Différents niveaux d'expression ont été détectés dans toutes les lignées. Les lignées AICPC-1 et SU.86.86 qui présentent les plus hauts niveaux d'ampt~cation expriment les plus hauts niveaux de mRNA OZF. Une expression modérée est observée dans BxPC-3, Capan-1, Capan-2, MIAPaCa-2 et PANC-1, et 1o une plus faible expression est trouvée dans les quatre lignées restantes.
L'expression d'OZF a été aussi recherchée au niveau protéique par Western blot en utilisant un anticorps polyclonal dirigé contre la protéine OZF
recombinante exprimée chez E.ooli (Ferbus et al., 1996). La protéine OZF a été détectée dans toutes les lignées cellulaires (figure 3A). Le plus haut niveau de la protéine est trouvé dans les 15 lignées cellulaires qui présentent une amplification du gène OZF {AICPC-1, BxPC-3 et SU.86.86). Comme le tissu pancréatique présente des ARN souvent dégradés, l'expression d'OZF a été étudiée dans les tumeurs et le pancréas normal par la détermination de l'accumulation de sa protéine. Afin de comparer le taux de la protéine OZF dans le pancréas normal adulte avec ceux trouvés dans les tumeurs, les 2o protéines de quatre échantillons pancréatiques différents ont été extraites selon le protocole standard et analysées par Western blot (figure 3C). L'intégrité des extraits a été contra" lée par l'utilisation d'un anticorps polyclonal dirigé contre la protéine ubiquitaire PAG de 22 kDa qui est exprimée dans les cellules en prolifération (Prospéri et al., 1993). Parmi les huit échantillons d'adénomes pancréatiques primaires étudiés, trois présentent un faible niveau de la protéine OZF comme dans les échantillons de pancréas sains. Cinq tumeurs (T6-T9, T12) présentent les plus hauts niveaux d'OZF
(figures 3B et 3C). Par conséquent le gène OZF est exprimé à hauts niveaux dans plus de la moitié des adénocarcinomes analysés.
EXEMPLE 3 : Restriction de l'expression d'OZF aux cellules tumorales dans les 3o tumeurs pancréatiques L'utilisation possible d'anticorps anti-OZF dans des études immuno-histochimiques a été déterminée. L'expression d'OZF a été détectée (figure 4A) dans une tumeur obtenue après greffe des cellules AICPC-1 chez la souris athymique.
L'immunohistochimie a été effectuée sur des coupes de carcinomes pancréatiques congelés afin de détem3iner si d'autres types cellulaires en plus des cellules tumorales, contribuent à l'expression d'OZF. Un exemple de carcinome pancréatique montrant une expression d'OZF est montré en figure 48. Les anticorps anti-OZF révèlent par coloration une granulation nucléaire qui prédomine dans les cellules tumorales. Les autres types cellulaires comme les fibroblastes et les cellules endothéliates présentent s une très faible ou une absence de coloration. Ainsi dans les tumeurs pancréatiques l'expression d'OZF est restreinte principalement aux cellules tumorales et les anticorps anti-OZF peuvent être utilisés pour détecter les cellules tumorales dans des tumeurs pancréatiques hétérogènes.
EXEMPLE 4 : Expression du gène OZF dans les cancers du c8lon 1o A l'aide des anticorps monoclonaux, (expression de la protéine OZF a été
examinée dans les cancers du côlon. L'étude a porté sur 16 échantillons coliques. Sur les 16 échantillons, 10 proviennent d'une tumeur colique (T1 - T3 - T5 - T6 -T9 - T10 - T11 - T12), et 6 de muqueuses coliques saines (C2 - C4 - C5 - C6 -C12). Les échantillons T5 et C5 proviennent d'un méme patient, de même que T6 -C6, 15 T8-CB,etT12-C12.
Analyse par Western blot Des quantités équivalentes de protéine pour chaque échantillon colique sont déposées dans les puits d'électrophorèse. Les échantillons sont séparés par migration sur gel de polyacrylamide, puis transférés sur une membrane de PVDF. La protéine 2o OZF est révélée par l'anticorps monoclonal anti-OZF et un anti-anticorps de souris couplé à la péroxydase. Le résultat est présenté figure 7.
Dans les quatre cas où l'échantillon colique sain et (échantillon colique cancéreux sont prélevés chez une mëme personne, une accumulation plus importante de ia protéine OZF est constatée dans le tissu tumoral que dans le tissu normal.
2s En comparant la quantité de protéine OZF accumulée, on constate que tes tissus tumoraux T1 - T3 - T5 - T7 - T8 - T9 - T10 - T12 présentent une quantité
supérieure de protéine OZF par rapport aux tissus sains.
D'après les résultats, 50 % des tissus cancéreux analysés présentent une forte surexpression d'OZF et 80 % des échantillons tumoraux analysés ont un niveau 3o d'expression de la protéine OZF supérieur à celui observé dans les tissus normaux.
Ces observations montrent que le gène OZF est surexprimé dans fes cancers du côlon.
Les résultats obtenus dans les exemples précédents montrent que s5 l'amplification du gène OZF a été observée dans 3 des 12 lignées d'adénocarcinomes du pancréas (AICPC-1, BxPC-3 et SU.86.86). L'augmentation du nombre de copies du gène a été aussi trouvée dans 2 des 12 échantillons de tumeurs primaires (T6 et T9), quoiqu'à des niveaux plus faibles que ceux observés dans les lignées. Parce que les tumeurs primaires pancréatiques contiennent généralement un large excès de cellules s normales, l'hybridation du signal en Southem blot peut avoir été atténuée dans les tumeurs T6 et T9. De plus, les échantillons contenant peu de cellules tumorales, présentant un signa! d'amplification modéré, échappent à la détection. Les xénogreffes sur souris athymiques devraient nous permettre une meilleure estimation de l'amplification du gène OZF dans les tumeurs pancréatiques primaires. En addition à
io ces résultats, l'amplification d'OZF a été ident~ée par hybridation in situ en fluorescence dans la tumeur utilisée pour générer la lignée AICPC-1 (Curtis et al., à
paraître). Ainsi, l'amplification d'OZF a lieu dans les tumeurs pancréatiques primaires et dans les lignée cellulaires.
Toutes les lignées d'adénocarcinomes pancréatiques expriment fARNm et la 15 protéine OZF mais à des niveaux différents. Les plus hauts niveaux d'ARNm d'OZF ont été trouvés dans les lignées ayant ampl~é le gène OZF (AICPG1, BxPG3 et SU.86.86). Quoique (estimation de la protéine peut ëtre moins précise, le taux de la protéine OZF a été comparé dans les deux tumeurs primaires présentant une amplification du nombre de copies (T6 et T9), à la lignée cellulaire MIAPaCa-2. Les 2o deux tumeurs expriment de hauts niveaux de protéines OZF. Ainsi, le gène OZF qui est hautement exprimé dans toutes les tumeurs pancréatiques présentant une amplification, n'est pas inactivé dans famplicon 19q13.1.
L'amplification génique est un mécanisme important pour l'augmentation de l'expression de gènes impliqués dans la cancérogenèse même si la surexpression est 25 souvent observée en absence d'amplification. Les études d'expression de quatre échantillons indépendants de pancréas normaux et de trois échantillons de tumeurs primaires montrent des niveaux de protéines OZF très faibles ou indécelables.
Au contraire, toutes les lignées expriment OZF et quatre d'entre elles montrent de hauts niveaux d'ARNm OZF en absence d'amplification. Le cas le plus significatif est celui de 30 la lignée PANC-1 qui possède deux copies du gène OZF et exprime un haut niveau d'ARNm de 2 à 4 fois plus bas que celui de la lignée SU.86.86 qui possède 30 copies du gène OZF. De hauts niveaux de protéine OZF sont aussi observés dans des tumeurs primaires sans amplfication du gène OZF, et fimmunohistochimie montre que la protéine OZF est détectée essentiellement dans les cellules tumorales. En dehors ss du statut d'amplification génique, OZF est surexprimé dans 7 des 12 lignées tumorales et dans 5 des 8 tumeurs primaires. Les plus hauts niveaux d'expression d'OZF
dans un large échantillon de tumeurs comparé au pancréas normal suggèrent que ce gène est impliqué dans le processus oncogénique. De plus il pourrait être utilisé comme un marqueur pour détecter de rares cellules tumorales dans le pancréas.
En dehors du gène OZF, la région q13.1 du chromosome 19 comprend plusieurs gènes candidats. Le mieux caractérisé est le gène RAC, localisé à
proximité
d'OZF, qui code pour une sérine-thréonine kinase (The Human Gene Map, 1997).
Les deux gènes sont coamplifiés dans les lignées cellulaires, cependant seul le gène RAC
a été trouvé amplifié dans PANC-1. Cependant, dans la lignée PANC-1, dans laquelle le gène RAC est amplifié, les niveaux d'ARNm sont seulement légèrement plus bas que ceux observés dans les lignées cellulaires qui présentent une amplification du gène OZF. Cette lignée cellulaire contient aussi une protéine OZF abondante.
Ainsi, la surexpression d'OZF dans PANC-1 peut être due à un mécanisme autre que l'amplification génique comme dans le cas d'autres gènes connus. Par exemple dans 1s les cancers du sein et de l'ovaire, la prévalence de la surexpression HER2/neu intervient plus fréquemment que l'amplification et a été utilisée pour prédire le taux de survie (Slamon et al., 1989).
EXEMPLE 5 : Sélection des hybridomes et caractérisation des anticorps monoclonaux A. Sélection des hvbridomes Après immunisation puis fusion cellulaire les anticorps sécrétés par un seul hybridome sont examinés en utilisant la technique SCRW et sélectionnés une à
une par cytométrie de flux. 22 surnageants réagissant par FACS (trieur automatique de cellules par cytométrie de flux par fluorescence) avec la protéine OZF
recombinante et ne réagissant pas avec la protéine porteuse MBP sont testés pour leur activité
avec la protéine recombinante MBP-OZF. La moitié des lignées cellulaires sont positives par ELISA et immunoblot (cf. tableau 1 ). Aucune réactivité n'est observée après ELISA sur la protéine MBP-PAG indiquant que ces surnageants sont spécifiques du polypeptide 3o OZF (Prospéri M-T et al., 1993). Dans la mesure où certains anticorps monoclonaux peuvent réagir avec des épitoges résultant de la fusion avec la protéine porteuse MBP
la réactivité des surnageants a été examinée avec la protéine OZF produite par des cellules eucaryotes. Après analyse par immunoblot et immunofluorescence en présence de protéines OZF endogènes issues de cellules mammaires humaines HBL

100, six anticorps monoclonaux ont été sélectionnés sur la base de leur forte réactivité
avec la protéine OZF humaine (cf. tableau 1 ci-dessous).
TABLEAU 1 : Criblage et sélection des anticorps monoclonaux anti-OZF.
LIGNES ELISA ELISA IMMUNOBLOT IMMUNOBLOT IFA

CELLULES CELLULES

4A5 + - + _ _ 5B1 - ' - - _ 5B8 +++ - +++ +++ ++

5B9 + - + _ +

4C3 _ - _ _ _ 4C8 + - + _ 5C10 +++ - +++ +++ +++

5C11 +++ _ _ - +

5D9 +++ _ +++ _ ++

5D10 + _ - _ 5D11 + _ _ _ _ 5E9 ++ - ++ + +

5E10 +++ _ _ _ +

5F1 + _ _ _ _ 5F4 + - _ _ _ 5F8 + - - _ -5G10 +++ - -+++ +++ +

5H2 _ - - _ - _ 5H4 +++ _ +++ _ _ 5H7 +++ - +++ +++ +++

5H8 +++ _ ++ _ +

4H10 +++ _ +++ +++ +++

Légende du Tableau 1 : Les surnageants bruts de culture de 22 clones d'hybridomes sélectionnés par la technique SCRW ont été testés successivement par ELISA
contre les protéines recombinantes MBP-OZF et MBP-PAG, puis ensuite par immunoblot et 1o immunofluorescence {IFA) contre la protéine MBP-OZF et la protéine OZF
endogène issue de cellules HBL 100 humaines. La protéine recombinante MBP-PAG a été
utilisée comme témoin négatif.
B. Caractérisation des anticorps monoclonaux s Après purification sur colonne protéine G Sépharose les sous-types d'immunoglobuline des six anticorps monoclonaux sélectionnés ont été
déterminés.
Cinq anticorps (5B8, 5C10, 5610, 5H7, 4H10) appartiennent au sous-type tgG1 et un anticorps au sous-type IgG3 (5D9). Les anticorps monoGonaux ont également été
testés par immunoblot et immunofluorescence avec différents extraits de cellules de 1o mammifères. L'analyse par Western blot sur des extraits humains (cellules de sein, de rein, de côlon et de pancréas) détectent une bande unique de 33 kDA
caractéristique de la protéine OZF. De manière inattendue, les anticorps monoclonaux ne reconnaissent pas les protéines OZF bovine et mucine en dépit de leur forte identité
(95 %) avec la protéine OZF humaine (Le Chalony, C. et al., 1996 ; Blottière L. et al., 1s 1999). L'absence de réactivité ne résulte pas du processus de traduction dans la mesure où les protéines OZF mucine traduites in vitro ne sont pas non plus détectées.
Les mêmes résultats sont observés par immunofluorescenoe (cf. tableau 2 ci-dessous), une forte expression nucléaire d'OZF est observée après transfection des cellules mucines NIH3T3 avec le vecteur d'expression. Aucune fluorescence n'est 2o visible sur les cellules mucines NIH3T3 non transfectées. Par conséquent, les six anticorps monoclonaux ainsi produits et caractérisés selon (invention sont hautement spécifiques de la protéine humaine OZF.
EXEMPLE 6 : Détermination de l'épitoge 2s Puisque les anticorps monoclonaux réagissent seulement avec la protéine OZF
humaine, les séquences OZF humaines, bovine et mucine ont été comparées afin de déterminer dans une première étape la localisation de (épitoge.
La plupart des domaines variables sont situés dans les trois premiers doigts de zinc et dans la séquence du peptide leader (PL) de 10 acides aminés précédent le 3o domaine doigt de zinc (Le Chalony et al., 1996 ; Blottière et al., 1999).
Cette première étape suggère que la localisation de (épitoge est située de manière plausible dans la partie N-terminale de la protéine OZF. Compte tenu du fait que la protéine MBP-OZF pour laquelle les cinq premiers acides aminés de la protéine OZF sont manquants, réagit avec les anticorps monoclonaux selon l'invention, il est fort probable que fépitope contre lequel sont dirigés ces anticorps monoclonaux est situé à la jonction entre le peptide leader et le premier doigt de zinc (cf.
figure 8).
Afin de confirmer cette hypothèse, une technique ELISA oar inhibition compétitive est réalisée en présence d'un pep#ide dont la séquence correspond au fragment aa4-aa17 de la protéine OZF humaine. Ce peptide se révèle être un puissant inhibiteur compétitif vis-à-vis des anticorps monoclonaux selon l'invention (cf. tableau 2 ci-après).

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et ' + , + ~ , c + , +

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w Légende du tableau 2 : Six anticorps monoclonaux anti-OZF ont été testés par ELISA, immunoblot et immunofluorescence. Les anticorps monoclonaux et (anticorps polyclonal de poulet anti-OZF ont été dilués respectivement au 1/500 et au 1/100. La compétition est réalisée en présence de 0,05 mg/ml du peptide synthétique aa4-aa17 (cf. figure 8).
Pour fimmunoblot, les extraits suivants ont été utilisés - origine humaine : cellules HBL100 du sein, cellules 293 de rein, cellules SU86-86 de pancréas, cellules RC8 et TC7 de côlon ;
- origine mutine : fibroblastes NIH3T3 ;
lo - origine bovine : cellules FBHE d'endothélium et lymphocytes LB9THY.
L'immunofluorescence a été réalisée sur des lignées cellulaires HBL100 et NIH3T3.
L'anticorps polyclonal de poulet anti-OZF a été utilisé comme témoin positif (Y-OZF).
(+) : détection d'OZF ; (-) : pas de détection d'OZF ; nf : non fait.
Ces résultats démontrent que les six anticorps monoclonaux selon (invention testés reconnaissent un épitoge commun de la protéine OZF humaine situé à la jonction entre le peptide leader et le premier doigt de zinc. Dans cette région, la comparaison des séquences humaines et bovine de la protéine OZF met en évidence deux substitutions - une première substitution conservatrice en position 8 résultant d'un polymorphisme lysine/arginine chez (homme qui ne modifie pas la réactivité des anticorps monoclonaux ; et - la substitution d'un résidu tyrosine par un résidu leucine en position 10 dans la séquence bovine.
Dans la séquence de la protéine OZF mutine, un résidu cystéine est trouvé en position 10 et deux substitutions en positions 13 et 14.
Par conséquent, ces résultats montrent que ia présence d'un résidu tyrosine en position 10 est critique pour la reconnaissance des anticorps monoclonaux et influence de manière probable la conformation de cette région épitopique.
3o La comparaison de ta séquence de cet épitoge avec des séquences de protéines issues de banques de données n'a pas permis d'identifier d'autres protéines portant cet épitoge.
Ainsi, six anticorps monoclonaux efficaces pour la détection de la protéine OZF
recombinante et native par ELISA, western blot ou immunofluorescence ont ainsi été
purgés et caractérisés. Cinq anticorps sont de type IgG1 et un de type IgG3.
Au contraire, des anticorps polyclonaux qui détectent de nombreuses protéines à
doigt de zinc autres que la protéine OZF humaine, ces anticorps monoclonaux selon (invention reconnaissent un épitope unique de la protéine OZF humaine. La séquence de cet épitoge unique situé à la jonction entre les dix premiers acides aminés et le domaine s doigt de zinc n'est pas présent dans les autres protéines de Kruppel, incluant les protéines OZF d'origine mucine et bovine. Ces anticorps monoclonaux selon (invention sont hautement spécifiques de la protéine endogène OZF humaine, à la fois sous sa forme dénaturée et native.

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Sung, et al. J. Cancer Res. 53: 2092-2099, 1993.
2o Terris, B., Baldin, V., Dubois, S., Degott, C., Fléjou, J.F., Hénin, D. and Dejean, A. PML
nuclear bodies are general targets for inflammation and cell proliferation.
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Verhoeyn, et al. BioEssays, 8: 74, 1988.
Wagner, et al. J. Nucl. Med., 20: 428, 1979. 9 Preferably, the pharmaceutical composition according to the invention is characterized in that said pathology is chosen from cancers, including the pancreatic, colon or breast cancer.
A subject of the invention is also the use of a monoGonal antibody or a of its fragments according to (invention for the manufacture of a medicament intended to the prevention or treatment of cancer, including pancreatic cancer, cancer colon or breast cancer.
In general, the dose of labeled monoclonal antibodies or one of their fragments for the in vivo diagnosis of pathology linked to (abnormal expression from ia lo OZF protein, may vary depending on parameters such as age, conditions, the sex, extent of patient's illness, contraindications if any exists, of concomitant therapies or other variables that a person skilled in the art will know adjust.
The administration of these compounds to the patient can be local or systemic and performed intravenously, infra-arterially, through the spinal fluid, etc. The administration can also be carried out intradermally or by way intracavitary, oral or nasal, depending on the part of the body which must to be examined.
After sufficient time allowing the monoclonal antibody to bind to protein OZF, for example from 30 minutes to 48 hours, we examine the part of the body that must be examined by conventional imaging techniques such as fIRM, or imagery 2o by scintillation. The exact protocol will necessarily depend on factors specific related to the patient, the part of the body to be examined, the method administration and type of markers used. Specific procedures may be determined by one skilled in the art. Distribution of fixed radioactive isotopes and their decrease with the time will then be recorded and checked. Comparing the results obtained with those obtained for clinically normal individuals, the presence and location of tumor cells can be determined and controlled.
The amount of monoclonal antibodies included in the compositions pharmaceutical according to the present invention and necessary for therapy effective will depend on different factors such as the method of administration, the part from the body 3o targeted, physiological condition of the patient, administration of other drugs, possible side effects, etc. The dosage for such prevention or treatments therapy should be carried out in such a way as to optimize its safety and efficiency.
In general, the assays used in vitro may provide an indication for the amounts used for administration of monoclonal antibodies in situ and so 3 animal models can be used to determine the quantities effective of monoclonal antibodies according to the invention for the treatment of pathology particular.
These methods are particularly discussed in works such as Gilman et al.
(1990) and Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) for methods administration methods such as oral, intravenous, intraperitoneal, 5 intramuscular or transdermal. Pharmaceutical excipients acceptable include water, sauna solutions, tampons or any other compound described for example in the Merck Index.
The invention further comprises the use of a monoclonal antibody or one of its fragments for treatment, prevention or for in vifro diagnosis or in vivo lo of pathology linked to the abnormal expression of the protein OZF, in particular for the treatment, prevention or diagnosis of cancer like cancer pancreas, colon or breast, said use being included in the invention.
The invention also relates to a method for detecting and / or assaying the OZF protein in a biological sample characterized in that it includes the Next steps a) bringing a biological sample into contact with a monoclonal antibody according to the invention; and b) detection and / or determination of the binding of said antibody to the protein OZF
contained in (biological sample.
2o Furthermore, the monoclonal antibodies or their fragments according to the invention, can also be used for identification, location, especially tissue or cell, and / or the assay of the protein OZF, said use being included in the invention.
The monoclonal antibodies or their fragments according to the invention constitute 25 also a means of immunocytochemical or immunohistochemical analysis of the expression of the OZF protein on sections of specific tissues, by example by immunofluorescence, by enzymatic, radioactive or gold labeling. They allow in particular to highlight and quantify the specific presence normal or abnormal OZF protein in tissues or biological samples, this who 3o makes it useful for (identification and localization of the expression of the OZF protein, for the diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of the protein OZF
but also for monitoring the evolution of prevention or treatment of pathology requiring said detection or said assay.
More generally, the monoclonal antibodies or their fragments according to 35 the invention can be advantageously implemented in any situation or expression of the OZF protein must be observed qualitatively and or quantitative.
Preferably, the biological sample consists of a fluid organic, such that serum, whole blood, cells, a tissue sample or biopsies of human origin.
Any conventional procedure or test can be used to perform a such detection and / or assay. Said test can be a test by competition or through sandwich, or any test known to those skilled in the art depending on the training of a antibody-antigen immune complex. According to the applications according to the invention, the monoclonal antibody or a fragment thereof can be immobilized or labeled.
This immobilization can be carried out on many supports known to man of art. These supports may in particular include glass, polystyrene, polypropylene, ie polyethylene, dextran, nylon, or celluloses natural or modified. These supports can be either soluble or insoluble.
For example, a preferred method involves processes immunoenzymatic according to the ELISA technique, by immunofluorescence, or radio-immunological (RIA) or equivalent.
The invention also includes a kit for the determination of the presence of OZF protein in a biological sample comprising a antibody or 2o one of its fragments according to the invention.
Also within the scope of the invention, a kit for the detection and / or the assay of the OZF protein according to the invention in a sample organic, characterized in that it comprises the following elements a) a monoclonal antibody or a fragment thereof according to the invention;
b) where appropriate, the reagents for constituting the medium suitable for reaction immunological;
c) reagents allowing the detection of antigen-antibody complexes produced by the immunological reaction.
In a last aspect, the invention relates to a method for evaluating the affinity of a compound to be tested for the OZF protein, characterized in what understands a) bringing a sample containing said OZF protein into contact with i) a monoclonal antibody or a fragment thereof according to the invention; and ü) said compound to be tested; and b) measuring the quantity of said monoGonal antibody or one of its fragments, said quantity being inversely proportional to the quantity of compounds to test attached to said OZF protein.
The monoclonal antibodies according to the invention or their fragments can be also used in in vitro methods for the selection of compounds likely to bind to the OZF protein with the desired affinity. So, the current invention also includes competitive selection methods of pharmaceutical compounds in which the monoclonal antibodies of the invention or their fragments compete with the test compound likely to 1o attach to the OZF protein. In this way, (monoclonal antibody or its fragments is used to detect the presence of any compound such as a polypeptide or other organic compound which may have one or more sites of recognition of epitope of the OZF protein recognized by the antibodies according to the invention. So these compounds identified by the method according to the invention can be used for occupy these binding sites on the OZF protein and act as an agent modulator or antagonist of the biological activity of the OZF protein.
Other characteristics and advantages of the invention appear in the after description with examples and figures whose legends are represented below.
LEGENDS OF FIGURES
FIGURES 1A and 1B. Southem blot analysis of cell lines pancreatic and primary tumors.
Figure 1A: Southem blot hybridization of total genomic placenta DNA
and twelve cell lines of pancreatic adenocarcinoma digested by Bglll. Three cell lines, AtCPC-1, BxPC-3, Su.86.86 show co-amplification of OZF
with RAC. PANG1 presents an amplification of RAC only.
Figure 1B: Hybridization by Southem blot of the total genomic DNA of AICPC-1 (figure 1A), placenta (P) and twelve primary adenocarcinoma tumors pancreatic 3o digested with Bglll. Comparison of intensities of hybridization signals of OZF
with those obtained after rehybridization with an N-myc probe shows a increased number of copies of the gene in T6 tumor samples and T9.
FIGURE 2. Expression of OZF fRNA in cell lines pancreatic.
RNA, of the twelve pancreatic adenocarcinoma cell lines analyzed through Southem blot in Figures 1A and 1B, was analyzed by Northern blot with a probe of cDNA containing the open OZF reading phase. AICPC-1, BxPC-3, Su.86.86 having amplified OZF, exhibit a high level of expression. High levels of OZF expression are observed in the absence of amplification in Capan-1, -2, MlA
PaCa-2 and PANC-1. The absence or a very weak expression was observed in a normal adult pancreas sample (Clontech). The corresponding gel, colored before transfer to ethidium bromide, is shown below, with the RNA bands 28S and 18S ribosomes.
FIGURES 3A, 3B and 3C. Western blot analysis of cell lines pancreatic and primary tumors. Identical amounts of protein (10 Ng), determined by lo staining of the extracts after electrophoresis on SDS gel (not shown) summer transferred to nitrocellulose. The nitrocellulose was then blocked and hybridized with a polyclonal anti-OZF antibody.
Figure 3A: Pancreatic cell lines previously analyzed by Southern and Northem blot (Figure 1A and Figure 2).
Figure 3B: OZF immunoblot of primary tumor samples pancreatic adenocarcinoma.
Figure 3C: Immunoblot of human normal pancreas OZF. Proteins have summer extracted under the same conditions for the four independent samples of normal pancreas (P1-P4), the MIA PaCa-1 (MP) line and for carcinoma pancreatic (T6) expressing OZF. NitroceHulose has been hybridized with antibody anti-OZF and anti-pag polyclonal to verify protein integrity.
Antibodies anti-pag are purified chicken antibodies under the same conditions as the anti OZF.
FIGURES 4A, 4B and 4C. Immunohistochemistry detection of OZF in carcinomas 2s human pancreas. Peroxidase staining was obtained with a antibody anti-OZF affinity purified. Anti-OZF antibodies show staining granular nuclear in AICPC-1 cells grafted in athymic mice (Figure 4A), in an adenocarcinoma expressing OZF (FIG. 4B), and the absence of staining in healthy pancreas not expressing OZF (Figure 4C) (magnification: 1000X).
FIG. 5. Western blot analysis of crude extracts of human cells 293 no transfected and transfected with an OZF expression vector. Detection of protein Endogenous OZF (left) and after transient detection by a vector expression of OZF gene (right) in triplicate, with an anti-OZF monoclonal antibody and a secondary anti-mouse antibody coupled to peroxidase, by chemotherapy luminescence.

FIGURE 6. Immunocytochemical labeling of the OZF protein in the cells of the AICPC-1 line from a protein-expressing pancreatic adenocarcinoma OZF. The cells are cultured on a slide, fixed with 4% of paraformaldehyde in PBS, then permeabilized with 0.1% triton X100. Non sites specific are saturated with 2% BSA. The cells are incubated for 1 h with the antibody monoclonal anti-OZF (1/200), washed and then put in contact for 30 min with the second antibody anti-mice coupled to a fluorochrome, washed and incubated for 4 min with DAPI (0.2 Ng / ml) who specifically marks the pits (photos on the left). Nuclear labeling specific of OZF is observed (photos on the right). At low magnification in high and to 1o high magnification at the bottom.
FIGURE 7. Expression of the OZF gene in colon cancer. Analysis by Western blot.
Using monoclonal antibodies, we examined the expression of protein OZF in colon cancer. The study involved 16 colonic samples.
On the 16 samples, 10 from a colonic tumor (T1 - T3 - T5 - T6 - T7 -T10 - T11 - T12), and 6 of healthy colic mucosa (C2 - C4 - C5 - C6 - C8 -C12).
The T5 and C5 samples come from the same patient, as well as T6 - C6, C8, and T12 - C12. We have deposited in the electrophoresis wells quantities protein equivalents for each colonic sample, the samples are separated 2o by migration on polyacrylamide gel, then transferred to a membrane of PVDF.
The OZF protein is revealed by the anti-OZF monoclonal antibody and an antibody mouse coupled to peroxidase.
In the four cases where we had a healthy colonic sample and a sample cancer colic taken from the same person, we found a greater accumulation of the OZF protein in tumor tissue than in the normal tissue.
By comparing the amount of OZF protein accumulated, we find that the fabrics T1 - T3 - T5 - T7 - T8 - T9 - T10 - T12 tumors present a quantity superior of OZF protein compared to healthy tissue.
3o FIGURE 8. Comparison of the N-terminal amino acid sequences of protein OZF according to their origin and their reactivity with monoclonal antibodies.
Comparison of the N-terminal region of two alleles of the OZF protein human (hu-OZF) which differ by a polymorphism at position 8 (KIR) with the protein OZF
of mucin (mu-OZF) and bovine (bo-OZF) origin. The peptide sequence synthetic used in competitive inhibition experiments is indicated above (PEPTIDE).

The tyrosine residue in position 10 is underlined. The protein sequence carrier MBP is indicated in small capital letters for the protein MBP-OZF. The link HIC consensus {"H / C link") preceding the first zinc finger corresponds to the position 11-17.
s * indicates perfectly preserved positions;
° indicates the K / R polymorphism.
Reactivity with the monoGonal 5B8 antibody according to the invention is indicated in the right column (+: positive; -: negative).
lo EXAMPLES
Materials and methods Tumor samples and cell lines. Eleven cell lines pancreatic adenocarcinomas were obtained from fAmerican Type Culture Collection (Rockville, USA) and grown as prescribed by the supplier.
A lineage The additional cell (AICPC-1) was established in the laboratory from the tumor image of a sixty year old patient with adenocarcinoma of the pancreas. Cells were grown in modified Dubelcco medium supplemented with 20% (vol / vol) of fetal calf serum. Tumor tissue has also been obtained from patients with primary carcinoma of the exocrine pancreas (n =
13; 6 2o men and 7 women).
Analysis by Southem and by Northern blot. DNA extraction has been performed following standard methods for cell lines and for tumors frozen (Sambrook et al., 1989). The fragments obtained after digestion of DNA
genomics (5 Ng) with fendonuclease Bgll were separated by electrophoresis on gel 2s of 0.7% agarose, transferred to nitrocellulose (BA85, Schleicher and Schuell) and hybridized with P32-labeled probes (Le Chalony et al., 1996). The bloodlines of tumor cells were hybridized with an OZF probe obtained after amplification by PCR using internal primers to generate a 1 kb fragment containing all the open reading phase (847-1840). Primary pancreatic carcinomas have 3o was hybridized with a cloned fragment Xbal / Scal (652-1852) (Le Chalony et al., 1994).
The RAC probe (2.2 kb) was prepared from a pUC-RAC clone using primers universals located on either side of the multiple cloning site (Cheng and al., 1992).
The quantitative evaluation of the hybridization signals was made at phosphorimager (BioRad). Total RNAs were extracted using the Rneasy kit (Qiagen).
For the 35 analyzes in Northem blot, 10 Ng of RNA were deposited on 1% agarose gel I 2.2 M

formaldehyde, transferred after migration on a nitrocellulose membrane (BA85, Schleicher and Schuell) and hybridized with the Xbal / Scal probe.
Production of polyclonal antibodies. Antisera have been developed in the hen using the purified OZF protein as an immunogen (Ferbus et al., 1996).
s IgY hen egg yolk immunoglobulins were prepared as describes (Akita et al., 1992). The specific antibodies were obtained from Anti-OZF IgY
after affinity purification on a column of MBP-OZF coupled to sepharose (Pharmacia) (Ferbus et al., 1996). The specificity of anti-OZF antibodies has been verified by immunoelectrophoresis. A single band of 33 kDa was observed in the 1o nuclear extracts of cells expressing OZF.
Method for preparing the monoclonal antibody. The recombinant protein of MBP-OZF fusion produced in E. soli was purified on an amylose column by affinity for MBP (Ferbus et al., 1996). Mice were immunized with the protein Purified MBP-OZF. The immunization of Balblc mice is carried out by three injections 15 subcutaneous two weeks apart 50 Ng of MBP-OZF protein purified.
The anti-OZF immune response is controlled by ELISA and immunoblotting using the MBP-OZF protein. Three days before the fusion, 100 μg of MBP-OZF protein are injected intravenously into mice with the highest anti-titer serum.
After the ELISA screening test, we selected for the merge the 2o mouse which presented the best answer. Splenic leukocytes have been merged with the cells of the myeloma line P3X63 / 8.653 in the presence of 50% polyethylene glycol. After "HAT 'selection in the bn.ite culture, the hybridomas are individually encapsulated in droplets of biotinylated agarose and marked by the protein MBP-OZF conjugated to fluorescine fisothiocyanate (+) and by the 25 MBP-PAG protein conjugated to phycoerythrin (-). The suspension of droplets is then analyzed by flow cytometry and only the hybridomas reacting with the MBP-OZF conjugates are isolated and Gonated according to the "secretion" technique capture web report "(SCRW) (Kenney et al., 1995).
The monoclonal antibodies are purified from the culture supernatant of 3o hybridomas by affinity chromatography on protein G column Sepharose (Pharmacia).
The immunoglobulins produced are mainly IgG1.
The monoclonal antibody specific for the human OZF protein recognizes this ci to (native or denatured state (in ELISA, in Western, in immunohistochemistry, by 35 immunoprecipitation).

EL-ISA technique for the selection and characterization of antibodies monoclonals.
- Incubation of 96-well microplates for ELISA in the presence of 50 NI by well of a MBP-OZF or MBP-PAG solution (control) at 10 Ng / ml in carbonate buffer-s 0.05 M bircarbonate, pH 9.6, overnight at 4 ° C.
- Saturation with a 2% bovine serum albumin solution in buffer phosphate saline pH 7.3 (PBS).
- Addition of 25 μl of crude hybridoma culture supernatant with 25 μl of a 0.1% Tween solution in PBS buffer and incubation for 2 hours at 37 ° C.
- After washing, addition of 50 NI of a 1/10 000 solution of antibodies to anti goat mice conjugated to alkaline phosphatase (Sigma, St Louis, MO) and incubation hour at 37 ° C.
- Detection with a p-nitrophenyl phosphate solution at 1 mg / ml in buffer diethanolamine, pH 9.8, 0.5 mM MgCl2.
- Fabsorbance measurement at 405 nm with a microplate reader (Titertek Multiscan of at Labsystem, Les Ulis, France).
Isotypes of monoclonal antibodies are determined by ELISA using a kit for the subtyping of murine hybridoma (Boehringer-Mannheim, Germany).
The recognition epitope is located at its NH2 end 2o terminal. It recognizes indeed the truncated recombinant OZF protein, does not possessing than the first two fingers to zinc, and does not recognize the murine protein counterpart which differs from human protein in its first fifteen acids amines.
Protein extraction and Western blot analysis with antibodies polyclonal.
The frozen tumor samples and cell extracts were solubilized in SDS buffer in the presence of ø-mercaptoethanol and heated to boiling 5 minutes.
Equal amounts of protein (10 Ng) were loaded onto SDS gel polyacrylamide 12% and transferred after migration on PDVF membrane (Amersham). The membranes were hybridized with anti-OZF antibodies and then with diluted rabbit anti-hens conjugated with alkaline phosphatase (Sigma) 3o respectively 200 and 15,000 times. Chemiluminescence was produced by incubation of the membrane with CDP star (Dupont) and the protein was revealed by autoradiography on an X-OMAT ARS fitm.
Protein extraction and Western blot analysis with antibodies monoclonals. Cells are grown at confluence, trypsinized, concentrated through centrifugation and lysed with buffer (65 mM Tris-HCI, pH 6.8, 0.01% blue of bromophenol, 5% ~ i-mercaptoethanol, 10% glycerol, 2% SDS) in the presence protease inhibitors, heated to boiling and then sonicated. 50 Ng extract cell or 0.05 Ng of recombinant protein are loaded into each well.
The proteins are separated by electrophoresis on a 12% polyacrylamide gel in SDS
s and transferred to PDVF membrane (immobilon-P, Millipore). The effectiveness of transfer from protein is checked by Ponceau S staining. Western blot analysis East carried out according to the technique described in Ferbus et al., 1996. The blots are hybridized for 2 hours with anti-OZF antibodies diluted to 1/500 then with IgG
anti-goat mice conjugated with alkaline phosphatase diluted to 1 / 10,000.
same lo conditions are used for the positive control with anti-Chicken OZF
diluted to 1/200 and rabbit IgY anti-chicken antibodies to 1: 10,000.
phosphatase alkaline is detected by chemiluminescence with the CDP-star reagent (NEN
Live Science Products) and visualized by autoradiography (X-OMAT AR, Kodak, Rochester, NY).
15 Immunofluorescence. The cells are cultured in Lab-Teck slides at room (Nunc Inc., Naperville, IL) for 24 hours. Lab-Teck blades are washed twice in PBS and fixed with a 4% solution of paraformaldehyde in PBS (w / v) for 15 minutes at room temperature. The cells are then rinsed in PBS and incubated twice for 30 minutes in a solution 0.1M
2o glycine, 0.2 M Tris-HCl pH 7.5 then permeabilized in a solution of newt X100 to 0.1% (v / v) in PBS for 5 minutes. Purified anti-OZF antibodies are incubated for one hour at 37 ° C (1/100 dilution) in PBS buffer at 0.5 bovine serum albumin (w / v). After washing, the cells are incubated for 30 minutes at 37 ° C with goat anti-mouse IgG (H + L) antibodies combined with 25 FITC (fiuorescein isothiocyanate) diluted 1/80 (Biosys SA, France).
The blades are colored in contrast with DAPI (4'6-diamidino-2-phenylindole) to the chromatin DNA staining, fixed by a solution (Vectashield, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) and viewed under a microscope fluorescence.
Immunohistochemical labeling of OZF. The coloring was obtained by an anti 3o hen coupled to peroxidase after incubation with an anti-OZF antiserum of hen purified, on frozen tissue sections (5 Nm) as described (Terris et al., 1995).
Transfection of N1H3T3 cells. OZF overexpression is achieved by transfection of a NIH3T3 murine cell line with a plasmid vector expressing the OZF protein in eukaryotic cells. The culture medium East 35 seeded with a cell density of 0.8 x 106 cells in boxes kneaded 60 mm in diameter then the cells are transfected 24 h later with 2 Ng of plasmid using the calcium phosphate technique. 5 to 6 hours after transfection the precipitates are eliminated and the cells are returned to the middle of culture. The day next, cells are transferred to Lab-Tek chamber slides and fixed before immunofluorescence analysis.
EXAMPLE 1 Amplification of the OZF Gene in the Adenocarcinoma Lines pancreatic To assess the number of copies of the OZF gene in cell lines 1o tumor and determine if it belongs to famplicon carrying the RAC gene, DNA
total genomics, 12 cell lines and a placenta, were digested with the restriction enzyme Bglll, separated on agarose gel and hybridized with Southem blot with OZF and RAC DNA probes. As shown in Figure 1A, three lines, AICPC-1, BxPC-3, SU.86.86 present an amplification signal in a fragment Bglll genomic size 5.3 kb. Quantification of levels of amplification reveals that the OZF gene is approximately 60 copies, 6 copies and 30 copies in AICPG1, BxPC-3, SU.86.86 respectively. Co-amplification with RAC is observed in these three lines, however PANC-1 shows an ampl ~ cation of RAC
alone. The copy number of the RAC and OZF genes is similar in BxPC-3.
2o The relative intensity of the amplification signal is higher for the gene OZF only for RAC in AICPC-1 and lower in SU.86.86. These experiments show that the OZF gene is co-amplified with RAC in three of the four cell lines.
Contrary to what had been reported, the amplification of RAC in the line AsPG1 is not detected (Cheng et al., 1996; Miwa et al., 1996). Analyses karyotypic cell lines confirmed ploidy and spe ~ city of the marking chromosome of each line including AsPG1 (Curtis et al., to appear).
The amplification previously described in AsPC-1 may be due to a subclone or have been lost during propagation in culture.
The state of amplification of OZF was examined in tumor samples.
3o Twelve primary pancreatic adenocarcinomas, taken at random, were analyzed by Southem blot with an OZF probe (Figure 1 B). Two tumors (T6 and T9) present an increase in the hybridization signal (3 to 5 times) compared to DNA
placental, after normalization with the signal obtained after rehybridization with a single copy of the N-myc gene. This signal is considered significant for amplification given the high proportion of non-tumor cells in tissues tumor.
EXAMPLE 2 Expression of OZF in the pancreatic lines and in the tumor samples 5 The expression of OZF was first examined in tumor lines by Northem blot (Figure 2). Different levels of expression have been detected in all the lines. The highest AICPC-1 and SU.86.86 lines levels ampt ~ cation express the highest levels of mRNA OZF. An expression moderate is observed in BxPC-3, Capan-1, Capan-2, MIAPaCa-2 and PANC-1, and 1o a weaker expression is found in the four remaining lines.
The expression of OZF was also sought at the protein level by Western blotting using a polyclonal antibody to the OZF protein recombinant expressed in E.ooli (Ferbus et al., 1996). OZF protein has been detected in all cell lines (Figure 3A). The highest level of protein is found in them 15 cell lines which show an amplification of the OZF gene {AICPC-1, BxPC-3 and SU.86.86). Since pancreatic tissue has RNA that is often degraded, the expression of OZF has been studied in tumors and the normal pancreas by determination of the accumulation of its protein. In order to compare the rate of protein OZF in normal adult pancreas with those found in tumors, 2o proteins from four different pancreatic samples were extracted according to standard protocol and analyzed by Western blot (Figure 3C). The integrity of extracts a been countered by the use of a polyclonal antibody against protein ubiquitous PAG of 22 kDa which is expressed in proliferating cells (Prosperi et al., 1993). Among the eight samples of primary pancreatic adenomas studied, three have a low level of the OZF protein as in samples of healthy pancreas. Five tumors (T6-T9, T12) have the highest levels of OZF
(Figures 3B and 3C). Therefore the OZF gene is expressed at high levels in more than half of the adenocarcinomas analyzed.
EXAMPLE 3 Restriction of OZF expression to tumor cells in 3o pancreatic tumors Possible use of anti-OZF antibodies in immunoassays histochemical was determined. OZF expression was detected (Figure 4A) in a tumor obtained after grafting of AICPC-1 cells in athymic mice.
Immunohistochemistry was performed on sections of pancreatic carcinomas frozen to determine if other cell types in addition to cells tumor, contribute to the expression of OZF. An example of pancreatic carcinoma showing OZF expression is shown in Figure 48. Anti-OZF antibodies reveal through staining a nuclear granulation which predominates in cells tumor. The other cell types like fibroblasts and endotheliate cells present s very little or no color. So in tumors pancreatic OZF expression is mainly restricted to tumor cells and antibody anti-OZF can be used to detect tumor cells in tumors heterogeneous pancreatic.
EXAMPLE 4 Expression of the OZF gene in c8lon cancers 1o Using monoclonal antibodies, (expression of the OZF protein was examined in colon cancer. The study involved 16 samples colic. Sure the 16 samples, 10 come from a colonic tumor (T1 - T3 - T5 - T6 -T9 - T10 - T11 - T12), and 6 of healthy colic mucosa (C2 - C4 - C5 - C6 -C12). Samples T5 and C5 come from the same patient, as well as T6 -C6, 15 T8-CB, and T12-C12.
Western blot analysis Equivalent amounts of protein for each colonic sample are deposited in the electrophoresis wells. The samples are separated by migration on polyacrylamide gel, then transferred to a PVDF membrane. The protein 2o OZF is revealed by the anti-OZF monoclonal antibody and an anti-antibody from mouse coupled with peroxidase. The result is shown in Figure 7.
In the four cases where the healthy colonic sample and (colonic sample are collected from the same person, more important of the OZF protein is found in tumor tissue than in tissue normal.
2s By comparing the amount of OZF protein accumulated, we see that your tumor tissues T1 - T3 - T5 - T7 - T8 - T9 - T10 - T12 have a amount higher protein OZF compared to healthy tissue.
According to the results, 50% of the cancer tissues analyzed have a high OZF overexpression and 80% of the tumor samples analyzed have a level 3o of expression of the OZF protein higher than that observed in the tissues normal.
These observations show that the OZF gene is overexpressed in cancer of the colon.
The results obtained in the previous examples show that s5 amplification of the OZF gene was observed in 3 of the 12 lines adenocarcinomas pancreas (AICPC-1, BxPC-3 and SU.86.86). Increase in number of copies of gene was also found in 2 of 12 primary tumor samples (T6 and T9), albeit at lower levels than those observed in the lines. By that primary pancreatic tumors usually contain a large excess of cells s normal, signal hybridization in Southem blot may have been attenuated in the T6 and T9 tumors. In addition, samples containing few cells tumor, presenting a signa! of moderate amplification, escape detection. The xenografts on athymic mice should allow us a better estimate of amplification of the OZF gene in primary pancreatic tumors. In addition to io these results, the amplification of OZF was identified by in situ hybridization in fluorescence in the tumor used to generate the AICPC-1 line (Curtis and to the appear). Thus, amplification of OZF takes place in pancreatic tumors primary and in cell lines.
All pancreatic adenocarcinoma lines express mRNA and 15 OZF protein but at different levels. Highest levels of mRNA
of OZF have found in lines having amplified the OZF gene (AICPG1, BxPG3 and SU.86.86). Although (protein estimate may be less accurate, the rate of the OZF protein was compared in two primary tumors with amplification of the number of copies (T6 and T9), to the cell line MIAPaCa-2. The 2o two tumors express high levels of OZF proteins. So the gene OZF who is highly expressed in all pancreatic tumors with amplification, is not inactivated in famplicon 19q13.1.
Gene amplification is an important mechanism for increasing expression of genes involved in carcinogenesis even if overexpression East 25 often observed in the absence of amplification. Expression studies by four independent samples of normal pancreas and three samples of tumors primaries show very low or undetectable levels of OZF protein.
At on the contrary, all the lines express OZF and four of them show tall OZF mRNA levels in the absence of amplification. The most significant case is that of 30 the PANC-1 line which has two copies of the OZF gene and expresses a high level mRNA 2 to 4 times lower than that of the line SU.86.86 which has 30 copies of the OZF gene. High levels of OZF protein are also seen in primary tumors without amplification of the OZF gene, and immunohistochemistry shows than the OZF protein is mainly detected in tumor cells. In outside ss of gene amplification status, OZF is overexpressed in 7 of the 12 lines tumor and in 5 of 8 primary tumors. The highest levels of OZF expression in one large sample of tumors compared to normal pancreas suggest that this gene East involved in the oncogenic process. In addition it could be used as a marker to detect rare tumor cells in the pancreas.
Besides the OZF gene, the q13.1 region of chromosome 19 includes several candidate genes. The best characterized is the RAC gene, located at proximity OZF, which codes for a serine-threonine kinase (The Human Gene Map, 1997).
The two genes are co-amplified in cell lines, however only the RAC gene was found amplified in PANC-1. However, in the PANC-1 line, in which RAC gene is amplified, mRNA levels are only slightly higher low than those seen in cell lines that exhibit amplification of OZF gene. This cell line also contains an abundant OZF protein.
So the overexpression of OZF in PANC-1 may be due to a mechanism other than gene amplification as in the case of other known genes. for example in 1s breast and ovarian cancer, the prevalence of overexpression HER2 / neu occurs more frequently than amplification and has been used to predict the rate of survival (Slamon et al., 1989).
EXAMPLE 5 Selection of Hybridomas and Characterization of Antibodies monoclonals A. Selection of hybridomas After immunization then cell fusion the antibodies secreted by a single hybridoma are examined using the SCRW technique and selected one to a by flow cytometry. 22 supernatants reacting with FACS (automatic sorter of fluorescence flow cytometry) with the OZF protein recombinant and not reacting with the MBP carrier protein are tested for their activity with the recombinant protein MBP-OZF. Half of the cell lines are positive by ELISA and immunoblot (see Table 1). No reactivity is observed after ELISA on the protein MBP-PAG indicating that these supernatants are specific for polypeptide 3o OZF (Prospéri MT et al., 1993). To the extent that certain antibodies monoclonals may react with epitoges resulting from fusion with the protein MBP carrier the reactivity of the supernatants was examined with the OZF protein produced by of eukaryotic cells. After analysis by immunoblot and immunofluorescence in presence of endogenous OZF proteins from human HBL breast cells 100, six monoclonal antibodies were selected based on their strong reactivity with the human OZF protein (see Table 1 below).
TABLE 1: Screening and selection of anti-OZF monoclonal antibodies.
ELISA ELISA LINES IMMUNOBLOT IMMUNOBLOT IFA

CELLS CELLS

4A5 + - + _ _ 5B1 - '- - _ 5B8 +++ - +++ +++ ++

5B9 + - + _ +

4C3 _ - _ _ _ 4C8 + - + _ 5C10 +++ - +++ +++ +++

5C11 +++ _ _ - +

5D9 +++ _ +++ _ ++

5D10 + _ - _ 5D11 + _ _ _ _ 5E9 ++ - ++ + +

5E10 +++ _ _ _ +

5F1 + _ _ _ _ 5F4 + - _ _ _ 5F8 + - - _ -5G10 +++ - - +++ +++ +

5H2 _ - - _ - _ 5H4 +++ _ +++ _ _ 5H7 +++ - +++ +++ +++

5H8 +++ _ ++ _ +

4H10 +++ _ +++ +++ +++

Legend of Table 1: The crude culture supernatants of 22 clones hybridomas selected by the SCRW technique were successively tested by ELISA
against the recombinant proteins MBP-OZF and MBP-PAG, then by immunoblot and 1o immunofluorescence (IFA) against the protein MBP-OZF and the protein OZF
endogenous from human HBL 100 cells. The recombinant protein MBP-PAG has been used as a negative control.
B. Characterization of monoclonal antibodies s After purification on a protein G Sepharose column, the subtypes immunoglobulin of the six selected monoclonal antibodies were determined.
Five antibodies (5B8, 5C10, 5610, 5H7, 4H10) belong to the tgG1 subtype and a antibodies to the IgG3 (5D9) subtype. MonoGonal antibodies have also been immunoblot and immunofluorescence tested with different extracts of cells of 1o mammals. Western blot analysis on human extracts (cells of breast, of kidney, colon and pancreas) detect a single band of 33 kDA
feature of the OZF protein. Unexpectedly, monoclonal antibodies do not do not recognize bovine OZF and mucin proteins despite their high identity (95%) with human OZF protein (Le Chalony, C. et al., 1996; Blottière L. et al., 1s 1999). Lack of responsiveness does not result from the translation process in the as the OZF mucin proteins translated in vitro are also not detected.
The same results are observed by immunofluorescenoe (cf. table 2 below below), a strong nuclear expression of OZF is observed after transfection of NIH3T3 mucin cells with the expression vector. No fluorescence is not 2o visible on NIH3T3 non-transfected mucin cells. Therefore, the six monoclonal antibodies thus produced and characterized according to (invention are highly specific for the human protein OZF.
EXAMPLE 6: Determination of the epitoge 2s Since the monoclonal antibodies react only with the OZF protein human, human, bovine and mucin OZF sequences were compared in order to of determine in a first step the location of (epitoge.
Most variable domains are located in the first three fingers of zinc and in the preceding amino acid leader peptide (PL) sequence of 10 the 3o zinc finger domain (Le Chalony et al., 1996; Blottière et al., 1999).
This first step suggests that the location of (epitoge is located plausibly in the N-terminal part of the OZF protein. Considering because than the protein MBP-OZF for which the first five amino acids of the protein OZF are missing, reacts with the monoclonal antibodies according to the invention, he is very likely that the epitope against which these antibodies are directed monoclonals is located at the junction between the leader peptide and the first zinc finger (cf.
figure 8).
In order to confirm this hypothesis, an ELISA or inhibition technique competitive is performed in the presence of a pep # ide whose sequence corresponds at aa4-aa17 fragment of the human OZF protein. This peptide appears to be a powerful competitive inhibitor against monoclonal antibodies according to the invention (cf. table 2 below).

z ~., ...

and '+, + ~, c +, +

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w Legend to Table 2: Six monoclonal anti-OZF antibodies were tested by ELISA, immunoblot and immunofluorescence. Monoclonal antibodies and (antibodies anti-OZF chicken polyclonal were diluted 1/500 and 1/100. The competition is carried out in the presence of 0.05 mg / ml of the synthetic peptide aa4-aa17 (cf. figure 8).
For fimmunoblot, the following extracts have been used - human origin: breast HBL100 cells, kidney 293 cells, cells SU86-86 of colon pancreas, RC8 and TC7 cells;
- mutine origin: NIH3T3 fibroblasts;
lo - bovine origin: endothelium FBHE cells and LB9THY lymphocytes.
Immunofluorescence was carried out on HBL100 cell lines and NIH3T3.
Anti-OZF chicken polyclonal antibody was used as a positive control (Y-OZF).
(+): detection of OZF; (-): no OZF detection; nf: not done.
These results demonstrate that the six monoclonal antibodies according to (invention tested recognize a common epitoge of the human OZF protein located at the junction between the leader peptide and the first zinc finger. In this region, the comparison of human and bovine OZF protein sequences highlights evidence two substitutions - a first conservative substitution in position 8 resulting from a polymorphism lysine / arginine in (humans who do not change antibody reactivity monoclonals; and - the substitution of a tyrosine residue by a leucine residue in position 10 in the bovine sequence.
In the sequence of the mutine OZF protein, a cysteine residue is found in position 10 and two substitutions in positions 13 and 14.
Consequently, these results show that the presence of a tyrosine residue in position 10 is critical for the recognition of monoclonal antibodies and affecting probably the conformation of this epitopic region.
3o The comparison of your sequence of this epitoge with sequences of proteins from databases did not identify other protein carrying this epitoge.
Thus, six monoclonal antibodies effective for the detection of the protein OZF
recombinant and native by ELISA, western blot or immunofluorescence have thus summer purged and characterized. Five antibodies are of type IgG1 and one of type IgG3.
At on the contrary, polyclonal antibodies which detect many proteins to finger of zinc other than human OZF protein, these monoclonal antibodies according to (invention recognize a unique epitope of the human OZF protein. The sequence of this single epitoge located at the junction between the first ten amino acids and the field s zinc finger is not present in other Kruppel proteins, including the OZF proteins of mucin and bovine origin. These monoclonal antibodies according to (invention are highly specific for the endogenous human OZF protein, both under her denatured and native form.

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Claims

1/ Monoclonal antibody or one of its fragments capable of binding specifically on an epitope of the OZF protein.

2 / monoclonal antibody or one of its fragments according to claim 1 characterized in that the OZF protein is of human origin.

3 / monoclonal antibody or one of its fragments according to claim 1 or 2, characterized in that the epitope of the OZF protein is located on the part N-terminal.

4 / monoclonal antibody or one of its fragments according to claim 3, characterized in that the epitope of the OZF protein is located on the N-terminal comprising the tyrosine residue located at position 10 of the sequence of the OZF protein human.

5/ Monoclonal antibody or one of its fragments according to one of claims 1 to 4, characterized in that it is produced by a cell such as filed with the CNCM on September 6, 1999 under number 1-2308.

6/ Monoclonal antibody or one of its fragments according to one of the claims 1 to 4, characterized in that it is chosen from antibodies humanized, chimerical, anti-idiotypes.

7/ Monoclonal antibody or one of its fragments according to one of the claims 1 to 6, characterized in that it is marked.

8/ Monoclonal antibody or one of its fragments according to one of the claims 1 to 6, characterized in that it is coupled to a compound cytotoxic.

9/ Cell capable of producing a monoclonal antibody according to one of the claims 1 to 5 as filed with the CNCM on September 6, 1999 under the number 1-2308.

10/ Pharmaceutical composition for the treatment or prevention of pathology linked to the abnormal expression of the OZF protein, characterized in that what understand:
a) a monoclonal antibody or one of its fragments according to one of the claims 1 at 6 and 8; and b) a pharmaceutically acceptable excipient.

11/ Pharmaceutical composition for the in vivo diagnosis of pathology linked to the abnormal expression of the OZF protein, characterized in that it understand :

a) a monoclonal antibody or one of its fragments according to one of the claims 1 at 7;and b) a pharmaceutically acceptable excipient.
12 / Pharmaceutical composition according to claim 10 or 11, characterized in that said pathology is chosen from cancers, in particular the pancreatic, colon or breast cancer.
13/ Use of a monoclonal antibody or one of its fragments according to one of claims 1 to 6 and 8, for the manufacture of a medicament intended for treatment or prevention of cancer, including pancreatic cancer, cancer colon or breast cancer.
14/ Use of a monoclonal antibody or one of its fragments according to one of claims 1 to 7, for the in vitro diagnosis of pathology related to the expression abnormal OZF protein.
15/ Method for detecting and/or assaying OZF protein in a biological sample characterized in that it comprises the steps following:
a) bringing a biological sample into contact with an antibody according to one of claims 1 to 7; and b) detecting and/or assaying the binding of said antibody to the protein OZF
contained in the biological sample.
16/ Kit for determining the presence of OZF protein in a biological sample comprising an antibody or one of its fragments according to one of claims 1 to 7.
17/ Method for evaluating the affinity of a compound for the OZF protein characterized in that it comprises:
a) bringing a sample containing said OZF protein into contact with i) a monoclonal antibody or a fragment thereof according to one of the claims

1 to 7; and ii) said test compound; and b) measuring the amount of said monoclonal antibody or one of its fragments, said quantity being inversely proportional to the quantity of compounds to be test fixed on said OZF protein.