JPH08506801A - Peptides corresponding to CD44 exon 6, antibodies specific to the peptides, and methods of using these antibodies for tumor diagnosis - Google Patents

Peptides corresponding to CD44 exon 6, antibodies specific to the peptides, and methods of using these antibodies for tumor diagnosis

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JPH08506801A JP6512889A JP51288994A JPH08506801A JP H08506801 A JPH08506801 A JP H08506801A JP 6512889 A JP6512889 A JP 6512889A JP 51288994 A JP51288994 A JP 51288994A JP H08506801 A JPH08506801 A JP H08506801A
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Abstract

(57)【要約】 腫瘍では、対応する正常組織に比較して、ＣＤ４４遺伝子の多数のスプライシングされた変異型が著しく過度に発現する。この観察は、体組織、体液、老廃物の試料を分析することによって腫瘍形成を診断する方法の基礎を成す。129塩基対から成る新規のエキソン６が、位置づけられ配列された。このエキソン６に特異的な抗体が調製されたので、ＣＤ４４タンパク質の検出と腫瘍のin vivo撮像および治療に使用するために適した新規の化合物の特許を請求する。   (57) [Summary] Tumors have a marked overexpression of multiple spliced variants of the CD44 gene as compared to the corresponding normal tissues. This observation underlies the method of diagnosing tumorigenesis by analyzing samples of body tissue, body fluids, and waste products. A new exon 6 consisting of 129 base pairs has been located and sequenced. Having prepared an antibody specific for this exon 6, we claim a novel compound suitable for use in the detection of CD44 protein and in vivo imaging and treatment of tumors.

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＤ４４エキソン６に対応するペプチド、そのペプチドに特異的な抗体、および 、腫瘍診断にそれらの抗体を使用する方法背景 本発明は、ＣＤ４４遺伝子またはＣＤ４４遺伝子の一部の発現を用いて、腫瘍 形成を検査することに関する。このような検査には、体組織、体液、その他の試 料を患者から採取し、診断を行い、予後を定め、既に実行されている療法を評価 することを含む。特に、本発明は、患者に苦痛を与えずに得ることができる体液 試料またはその他の試料を用いて、腫瘍形成をルーチンとしてスクリーニングす る単純な方法を提供する。 現在、腫瘍を診断する通常の方法は、細胞または組織薄片を顕微鏡で観察する ことによって行われ、非常に効果的である場合が多いが、いくつかの顕著な制約 がある。試料が小さい場合、診断が非常に困難になって、多数の細胞が利用でき なくなるが、患者から大型の試料を得ることは望ましくなかったり、不可能であ ったりする。信頼できる診断を下すことができずじまいの例が５０％にも及び、 明かに癌であるという証拠や、患者が実際に癌ではないという確信が持てない場 合がある。確たる診断方法を下すには、患者に苦痛を与えるような検査が必要で ある。 予後の判定は、顕微鏡下で検視された場合の細胞の外観に依存する。一般に、 一次腫瘍の細胞が異様であるほど、転移の可能性が多くなるが、相関関係は決し て完全ではない。何が最も効果的な処置であるかを判断するには、転移が起こる 可能性があるか否かを正確に予知できることが有効であることは明かであろう。 ヒトＣＤ４４遺伝子は、サイズの異なる種々のグリコシル化細胞表面タンパク 質をコードし、それらの機能の多くは未だ十分に確証されていないが、ＣＤ４４ モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の存在によってそれと認識されるエピトープを共 有する。ヒトＣＤ４４遺伝子は、造血細胞や他の多くの細胞タイプに発現される 標準的な部分から成り、その中へさらにエキソンから成る生成物が種々に組み合 わされてスプライシングされ、様々なタンパク質を生成することが知られている 。これは、核生物においてはっきりと認められるメカニズムであり、機能上は関 係のない場合が多い複数のタンパク質を同じ遺伝子から生成するためのもので、 オルタナティヴスプライシングとして知られている。 これまでに、広く知られる２つのＣＤ４４のイソ型、すなわち、ｉ）重クリコ シル化された37kDの中心コアから成る90kD型と、ii）基部膜外ドメインに挿入さ れた135個のアミノ酸を余分に有し、さらに重グリコシル化された180kD型が精製 され特徴付けられている（Stamenkovic et al. 1989）。免疫細胞化学的試験と 免疫沈降試験によって、多種多様な細胞および組織に90kD型と180kD型が広範囲 に分布することがわかっている。90kD型は、循環白血球、骨髄細胞およびその他 多数の細胞タイプに存在する造血型または標準型として知られている。180kD型 は、上皮変異型として知られており、複数の上皮細胞タイプで検出することがで きる。両イソ型とも、同型接着相互作用および異型接着相互作用を仲介する受容 体として機能し、細胞を相互にまたは隣接細胞外スカホールドに接着すると考え られる。 以前、ある種のHermes-3モノクローナル抗体の存在によって認識されたＣＤ４ ４エピトープは、循環白血球が周辺リンパ節を認識し通り抜けすることを可能に する周辺リンパ節受容体を構成するものとして特定された。さらに、後にこの抗 原に対するモノクローナル抗体が利用できるようになり、Stamenkovic et al.（ 1989）は、その一つを使用してＣＯＳ細胞の発現ライブラリーから取り出した標 準型分子をコードするｃＤＮＡをクローニングした。彼らは、さらにノーザンブ ロット法によって、この遺伝子がリンパ系細胞だけではなく、種々の癌細胞系や 代表的な固形癌腫によっても発現され、その中で２つのクローン癌腫が正常なク ローン上皮に比べ多く発現するように思われた。 Birch et al.は、ヌードマウスの場合、Hermes-3抗体によって認識される80-9 0kD型のＣＤ４４抗原を強く発現するメラノーマ細胞クローンは、ＣＤ４４抗原 を弱く発現するクローンよりも相当転移性が高いことを報告した（1991）。Sy e tal. は、ヌードマウスにおけるヒトリンパ腫細胞の転移能力は、上皮変異型をコ ードする構成体によってトランスフェクトされた後ではなく、ヒトリンパ腫細胞 が標準型ＣＤ４４遺伝子によってトランスフェクトされた後に穏やかに高まるこ と を述べた（1991）。Gunthert et al.は、ラットＣＤ４４抗原に刺激された新た な抗体によって認識されるリンパ腫帰巣受容体の変異型は、ラット膵臓腺癌細胞 が転移行動するために必要であることを示唆する結果を得た（1991）。この抗体 を使用して、彼らは、ＣＤ４４の変異型に対応するｃＤＮＡ配列をクローニング し、以前に確認されていないエキソンを含むことを発見した。転移細胞系に特有 のｃＤＮＡ配列を過度に発現するよう設計された構成体によって同一細胞系由来 の非転移性クローンをトランスフェクトすると、転移行動が誘発されると思われ る（Gunthert et al.、1991）。 上述の所見のため、種々の組織発生源から由来するその他の培養された転移性 ヒト腫瘍細胞系および非転移性ヒト腫瘍細胞系は、ＣＤ４４生成物を特異的に発 現させた。細胞または組織における遺伝子の発現は、遺伝子生成物に対応するｃ ＤＮＡ部分に優先してアニーリングさせるために選択された特異的オリゴヌクレ オチドプライマーを用いて、ｃＤＮＡを細胞メッセンジャーＲＮＡから生成し当 該の領域をポリメラーゼ連鎖反応によって拡大することによって最高の効率と感 受性で研究することができる。しかし、この方法を用いたHofmann et al.および 本出願人による後の研究では、ＣＤ４４の発現は、ヌードマウスの転移能力、あ るいは、上述の細胞培養系の腫瘍形成能力でさえ、終始一貫として確実に相関す るわけではないという結果を得た。このころ、３つのグループ（Hofmann et al. 、1991；Stamenkovic et al.、1991；Jackson et al.、1992）は、彼らが種々の ヒト細胞系におけるこの遺伝子によって発現されることを発見した別のスプライ ス変異型に関する配列のデータを公表した。本発明 本発明は、乳癌患者および結腸癌患者とその転移部分から採取した新鮮組織試 料および新鮮体液試料におけるＣＤ４４遺伝子の種々の部分の発現を調査する試 験結果から生ずる驚くべき発見に基づく。試験結果は、ＣＤ４４の発現について i）転移（悪性）腫瘍、ii）非転移性の局部侵入性腫瘍および良性腫瘍、iii）正 常組織の間には、一目瞭然の差異があることを示した。グループi）とグループi i）の差異は、療法の適否判断に重要であり、グループii）とグループiii）の差 異は、初期 の診断とスクリーニングに重要である。 本発明の一部は、1993年７月20日に提出された発明者らの国際特許出願PCT/GB 93/01520の対象であり、ひとつの態様として、腫瘍形成診断方法を提供し、その 方法は試料中のＣＤ４４遺伝子発現の分析から成る。 さらにひとつの態様として、上述の出願は、ＣＤ４４遺伝子またはその一部か ら成る生成物について試料を検定する方法を提供し、この検定方法は、ｃＤＮＡ を試料中のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から生成し、ＣＤ４４遺伝子また はその一部に対応する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）部分を増幅させ、増幅されたｃ ＤＮＡの検出から成り、増幅されたｃＤＮＡを腫瘍形成診断に使用することを特 徴とする。 腫瘍形成の診断は、腫瘍組織の初期検出にほかならないとも言えれば、また転 移腫瘍と非転移腫瘍を識別するステップであるとも言える。従って、本出願で使 用される用語「診断」については、理解できよう。 この方法は、特に固形腫瘍、特に、具体的には癌などの悪性腫瘍の診断に利用 できる。検定が実行される試料は、体組織または体液であり、in vitro培養細胞 ではないことが好ましい。試料は、固形腫瘍から採った組織の小片または細胞の 微細針状吸引物（ＦＮＡ）で良い。あるいは、血液、尿またはその他の体液から 成る試料や、頚管掻爬や、痰、尿または便など患者に苦痛を与えずに得られた試 料でも良い。 ｃＤＮＡは、標識付けされた特異的オリゴヌクレオチドプローブを一つ以上使 用することによって検出され、その際、このプローブは増幅されたｃＤＮＡ配列 の一部にアニーリングさせるように選択される。あるいは、標識付けされたオリ ゴヌクレオチドプライマーおよびモノヌクレオチドまたはその一方を用いること もできよう。放射性標識など、使用できる適切な検出可能な標識は多数ある。 次に添付の図面について説明する。 図１から図５までは、以下に報告される種々の実験結果を示すオートラジオグ ラフである。 図６は、エキソン、プローブおよびプライマーを示すＣＤ４４遺伝子のマップ である。エキソンの番号はG・R・Screaton et al.のつけたものと一致する。 図７は、図６に示されるエキソン６の核酸配列と、それに対応するアミノ酸配 列を示す図である。 図８は、別の実験結果を示す一連のオートラジオグラフである。 図９は、HIV2（gp32）−ＣＤ４４エキソン６融合遺伝子のＤＮＡ配列を示す図 である。 図１０は、HIV2（gp32）−ＣＤ４４エキソン６融合抗原のタンパク質配列を示 す図である。 図６は、エキソン６−１４を示すＣＤ４４遺伝子のマップである。理論的には 、塩基性タンパク質すなわち標準タンパク質は、これらの９つの特別なエキソン のいずれか１つ、複数またはすべてに由来する転写物の挿入によって修飾するこ とができる。エキソン６は、本特許出願の優先日には未知であったが、本発明に 係る別の態様を構成するものである。エキソン６は、腫瘍において過度に発現さ れるが、正常組織においては発現されず、エキソン７−９付近に位置する。エキ ソン６の配列は、図７に示されている。この配列は、129の塩基対を含み、標準 ＣＤ４４配列はこの配列の5'側にあり、エキソン７は常に3'側にある。 エキソン９−１１とは対照的に、エキソン６から成る生成物（新たに配列され たエキソン）は、正常組織の試料ではほとんど検出できない。これは、エキソン ６が腫瘍形成の診断において無類の価値があることを示唆する。 別の態様では、本発明は、新規の化合物として、図７に示すようなエキソン６ の核酸配列、その標徴フラグメント、縮重された配列および対立遺伝子変異を示 す配列またはその一方、相同核酸配列、プローブ、プライマーおよびそれらの配 列および相同体を用いてハイブリッド形成することができるその他の試薬を提供 する。これらの化合物および試薬は、すべて、上述の方法においても有用であろ う。 本発明によれば、図７に示されるようなＣＤ４４エキソン６に対応するペプチ ド配列、対立遺伝子変異、その二次修飾体、その標徴フラグメントを使用し、in vitro診断とin vivo診断に有用な抗体を生成することができる。上記の抗体は 、図７に示されるＣＤ４４エキソン６、その対立遺伝子変異、二次修飾体および その標徴フラグメントに対応するペプチドに特異的であり、すなわち、このよう な 抗体はこのペプチドに結合し、その他関連するＣＤ４４タンパク質やその他のタ ンパク質に対する交又感受が低い。上記の抗体は、モノクローナル抗体かポリク ローナル抗体である。この抗体は、単数の抗原として図７に示されるＣＤ４４エ キソン６に対応する完全なペプチド配列を使用することによって、また、複数の 抗原として、好ましくはＣＤ４４エキソン６に対応するペプチド配列の部分をコ ード化する最低の長さである６個のアミノ酸から成る短いペプチドを使用するこ とにによって生成することができる。抗原として使用されるペプチドは、当業者 に知られている方法によって、組換えてまたは化学的に生成することができる。 例えば、本発明によるペプチド抗原は、Merryfield，JACS 85（1964），2146に 従って合成することができる。免疫原合成の場合、これらのペプチドをキーホー ルリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）など の担体分子に結合することができる。ビオチン化が必要な場合、これは、PNAS U SA 80（1983），4045などに従って実行することができる。 ＣＤ４４エキソン６またはその対立変異型に対応するペプチドを原核宿主に発 現させるには、ＣＤ４４エキソン６の融合遺伝子または原核宿主における発現レ ベルが高い遺伝子を持つ対立遺伝子変異を用意することが好ましい。例えば、HI V2のタンパク質gp32をコード化する遺伝子の一部は、大腸菌（E.Coli）に適切で ある。それによって、エキソン６またはその対立遺伝子変異に準じてペプチド配 列を一部として有する融合タンパク質が得られる。融合遺伝子のＣＤ４４エキソ ン６遺伝子を複製するなどして、融合タンパク質などのＣＤ４４エキソン６に対 応するペプチドエピトープ数を増加させることも好ましい。 ＣＤ４４エキソン６、その対立遺伝子変異、その二次修飾体、標徴フラグメン トに対応するペプチド配列に対抗するポリクローナル抗体は、適切な実験動物に 効果的な量のペプチドまたは抗原成分を注射し、その動物から血清を採取し、既 知の特異抗体吸着体技術によって特異抗原を単離することによって、調製される 。この方法によって生成されるポリクローナル抗体は、免疫検定のいずれにも使 用することができるが、一般には不均質になることがあるので、あまり好ましく はない。 in vitro診断テストにモノクローナル抗体を使用することは、大量の抗体すべ てが同様の特異性を持つように生成することがてきるので、特に好ましい。モノ クローナル抗体生成のためのハイブリドーマ細胞系の調製は、不死化された細胞 系と抗体産生リンパ球を融合することによって行われる。これは、当業者によっ て知られる既知の技術によって行われる（Harlow，E．and Lane，D.，Antibodie s：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Press 1988，Bessler et al．I mmnobiol．170（1985），239-244，Jung et al.，Angew．Chimie 97（1985），8 83やCianfriglia et al，Hybridoma Vol.2，（1983），451-457などを参照のこ と）。 図７に示されるＣＤ４４エキソン６の発現産物または標徴エピトープなどのそ のフラグメントに対抗する産生モノクローナル抗体である以下のハイブリドーマ 細胞系は、ＤＳＭ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg lb，D-3300 Braunschweig，Federal Republic of Germ anyにおけるブダペスト条約に基づき1993年11月16日に寄託された。 MAK〈CD44〉M-1.1.12 MAK〈CD44〉M-2.42.3 MAK〈CD44〉M-4.3.16 MAK〈CD44〉M-1.1.12については、アミノ酸9-23に対応する合成ペプチドを、M AK〈CD44〉M-2.42.3についてはアミノ酸29-43に対応する合成ペプチドを、MAK〈 CD44〉M-4.3.16については図７に示すアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソン６ のアミノ酸1-13に対応する合成ペプチドを使用した。細胞系MAK〈CD44〉M-1.1.1 2によって生成される抗体は、肺腫瘍、結腸腫瘍、膀胱腫瘍と、免疫組織化学に よって検出された細胞系ZR75-1（ヒト乳癌種−−ATCC CRL 1500）の細胞に特異 性を示す。特異的反応と表現したのは、強い反応が腫瘍組織を用いて観察される が、正常組織では弱い反応しか示さないということである。同じ系統では、MAK 〈CD44〉M-4.3.16によって生成される抗体が、結腸腫瘍の組織およびZR75-1細胞 に特異性を示す。 ＣＤ４４タンパク質または試料におけるＣＤ４４エキソン６に準ずるペプチド 配列の存在は、免疫検定のタイプを問わず実質的にはモノクローナルまたはポリ クローナルのいずれかの上述のように調整された抗体を使用して検出することが できる。さまざまな免疫検定技術が、Harlow et al.の参考文献（Antibodies: A Laboratory Mamual，Cold Spring Harbour Press 1988）に見られるように利用 できる。これには、当然、非競合的なタイプの単一点検定、二点検定、「サンド イッチ」法や、競合的な結合測定法などを含む。サンドイッチ法は、その中で最 も有用で一般に使用されている検定方法である。多数のサンドイッチ法の変種が 存在し、そのすべてが本発明によって含まれるように意図されている。上述の検 定の例には、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、ＦＰＩＡやエ レクトロケミルミネッセンスなどの免疫蛍光検定、金ゾル粒子などの色素粒子な どの直接標識を用いる免疫検定、ＣＥＤＩＡあるいはＥＭＩＴなどの均質検定、 ラテックス粒子凝集検定のような濁度測定法、比濁測定法がある。サンドイッチ 法では、本発明に係る２つの抗体を使用することができる。この場合、この２つ の抗体は、ＣＤ４４エキソン６に応じたペプチド配列の異なるエピトープまたは 部位に結合しなければならない。これら２つの抗体は、例えば、異なる２つの合 成ペプチドをＣＤ４４エキソン６に対応するペプチドの異なる標徴フラグメント に対応する免疫原として使用することによって、調製することができよう。サン ドイッチ法では、本発明に係る抗体一つだけを用いることもできる。もうひとつ の抗体は、別のＣＤ４４エキソンに対応する別のペプチドまたはＣＤ４４の標準 型に対応する別のペプチドに対する抗体であっても良い。このような抗体は在来 技術の中にあることが知られている。 例えば、尿、全血、子宮頚部スミア、便や、試料としての生検用体組織、痰細 胞などを使用することができる。多くの場合、ＣＤ４４タンパク質は、天然の形 態で検出することができる。好ましくは、ＣＤ４４タンパク質は、本発明に係る 抗体には線状エピトープまたはその天然の形態でＣＤ４４分子内に隠ぺいされて いるエピトープに好んで結合するものがあるので、検出の前または間に変性させ ることが好ましい。変性方法としては、デタージェントまたはカオトロピック剤 を用いる処置など当業者に知られている方法が適切である。ある場合には、ＣＤ ４４分子が固相に吸着することによって、抗体の結合に十分な部分的な変性が起 こる。 ＣＤ４４タンパク質は、ほとんどの細胞タイプで発現されるが、本発明に係る 抗体を使用した場合、腫瘍組織と正常組織の識別が多くの場合に可能であること が認められた。従って、この抗体を癌診断に使用することができる。抗体は、結 腸組織、膀胱組織または肺組織の癌診断に使用することが好ましい。例えば、ハ イブリドーマ細胞系MAK〈CD44〉M-1.1.12から得られた抗体を用いた場合、強い 反応が、結腸癌組織、膀胱癌組織、肺癌組織を用いた免疫組織化学的方法に観察 されるが、これに対し、前記の部位から採られた正常細胞組織は、かすかに反応 するだけである。 本発明に係る抗体を、Wong et al，Arch．Surg．125（1990），187-191に従っ た方法などの免疫複合体分析に使用することもできる。このため、ＣＤ４４タン パク質またはその標徴部分および自己抗体の腫瘍関連免疫複合体の検出が可能で ある。 本発明に係るペプチド抗原は、ＣＤ４４定量法のための免疫テストに標準化合 物として使用することもできる。従って、本発明は、さらに、本発明に係るペプ チド抗原をＣＤ４４を定量するための免疫テストにおける基準として使用するこ とに関する。ある場合、凝集テストなどでは、配列の異同を問わず本発明に係る 複数のペプチドを担体分子に結合させるためのは好都合である。本発明に係るペ プチドは、競合的な免疫検定において本発明に係る抗体に対する結合相手として 使用することもできる。この場合、ペプチドは標識付けされ、当業者に知られる 方法によって直接もしくは間接に（ストレプト）アビジン／バイオチンなどの特 異的結合相手を介し固相に結合される。 本発明のもう一つの態様は、緩衝剤、デタージェント、安定剤、固相などの免 疫検定に必要なその他の化合物がある中で、図７に示されるアミノ酸配列を有す るＣＤ４４エキソン６、その対立遺伝子変異、その二次修飾体、その標徴フラグ メントに対応するペプチドに対抗すべく意図された抗体を少なくとも１つ含むテ ストキットである。必要に応じて、本発明に係るペプチド抗原を標準として含む こともできる。 さらに別の態様では、本発明は、腫瘍の療法およびin vivo撮像のための手段 を提供する。この手段に有用な薬剤は、現在の技術水準で製造することができる 。悪性疾患患者から得られた試料のＣＤ４４遺伝子の種々の部分の発現を調査す る試験から得られたデータは、驚いたことに、ＣＤ４４の可変部のエキソン６を 相当過度に発現することを示している。正常組織と比較して悪性腫瘍にエキソン ６ を含むＣＤ４４スプライス変異型が相対的に多量であり、正常組織と比較して腫 瘍細胞の表面上でエキソン６によってコード化されたペプチド配列を含むＣＤ４ ４タンパク質が増加することによって、治療、in vivo診断、in vitro診断、in vivo撮像のための腫瘍特異抗原としてエキソン６によるコード化されたペプチド 配列を使用する道が開ける。 好ましくは、モノクローナル抗体（Kohler and Milstein（1975），Nature 15 6,495-497）またはその誘導体を診断または治療の目的で使用する。本発明では 、ＣＤ４４のエキソン６によってコード化されたエピトープに対抗するモノクロ ーナル抗体が提供される。さらに、これらの抗体が腫瘍細胞に選択的に結合する ことを示すデータが提示される。 本発明に係る抗体は、図７に示すアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソン６、 その対立遺伝子変異、燐酸化生成物、グリコシル化生成物およびその標徴フラグ メントに対応するペプチドを認識する。このような抗体は、その他のＣＤ４４エ キソンに対応するその他のペプチドの存在下においても、ＣＤ４４エキソン６に 対応するペプチドに特異的である。治療の目的上、この特異性は本発明に係る抗 体が、エキソン６によってコード化されるタンパク質以外のタンパク質にはわず かしか結合しないだけに決定的である。この非特異的な結合は、本発明に係る抗 体が腫瘍治療またはin vivo診断に使用される場合に、大きな損傷が健康な細胞 に生じない程度にとどめなければならない。 抗体は、適切な方法でエキソン６タンパク質に結合している限りは、全体とし て抗体そのもの、そのフラグメント（Ｆｖ、（Ｆｖ）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ （ａｂ）2など）、キメラ抗体、ヒューマナイズド抗体またはキメラヒト型抗体 を使用することができる。エキソン６ペプチドを特異的に結合するＣＤＲ領域ま たはその部分しか含まない短連鎖フラグメントも、特に、抗体が標識付けされた ものである場合に、適切である。 本文では、抗体をそのまま悪性疾患の療法に使用する（Hale et al.，Lancet2 （1988）1394-1399; Cobbold et al.，Prog．Clin．Biol．Res.（1990）333,139 -151）。別の方法では、抗体またはその一部を、毒素分子（immunotoxin）に接 合または翻訳融合するため、腫瘍細胞の特異的な死滅がもたらされる（Brinkman n et al．1991，Proc Natl．Acad．Sci．USA 88，8616-8620; Pastan et al.（199 1），Cancer Res.51，3781-3787; FitzGerald and Pastan（1989），J．Natl．C ancer Inst．81，1455-1461）。本発明に係る好ましい実施例では、ポリペプチ ド鎖のin vitro再結合、ハイブリッドハイブリドーマ生成またはdiabodyの構成 によって（Holliger et al.（1993），Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90，6444-6 448; Holliger and Winter（1993），Current Opin．Biotechnol．4，446-449） 、構成することができる二重特異性抗体を腫瘍治療に使用する（Bonino et al（ 1992），BFE 9，719-723）。 さらに、放射性物質または蛍光性物質に結合された抗体は、呼吸器系、胃腸系 、尿性器の癌腫や、眼球癌、皮膚癌などの腫瘍の検出および治療に好ましい（Pr ofio（1988），Proc．Soc．Photoopt．Instr．Eng．907，150-156; Jiang et al ．（1991），J．Natl．Cancer Inst．83，1218-1225）。 免疫応答を阻止するために、ヒト由来の抗体に可及的に近似する抗体を使用す ることが好ましい（Glaasy and Dillman（1988），Mol．Biother．1，7-13）。 例えば、このような抗体は、キメラ抗体、ヒューマナイズド（ＣＤＲ移植）抗体 である。このような抗体は通常、げっ歯類のモノクローナル抗体から作られてい る（Morrison（1992），Annu．Rev．Immunol．10，239-265; Winter and Milste in（1991），Nature 349，293-299などを参照）。本発明に係る具体的に好まし い実施例では、腫瘍特異性ヒト型抗体（Borrebaeck et al.（1988），Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 85，3995-3999; Borrebaeck（1988），Immunol．Today 9，3 55-359）が治療目的で使用される。さらに、ヒトＭａｂｓを、Griffithらによる EMBO J．12（1993）725-734などに記載されているように、ファージ表示ライブ ラリによって調製することが特に好ましい。 治療の目的上、エフエクター機能（ＡＤＣＣ、ＣＤＣ）を提供する抗体を使用 することが特に好ましい（Bruggemann et al.，J．Exp．Med．166（1987）1357- 1361）。特に好ましくは、ヒト同位体IgG 1抗体を使用する。 免疫毒素に関しては、本発明に係る抗体をシュードモナス外毒素、ジフテリア 毒素や、その他の毒素に結合することが好ましい（FitzGerald and Pastan（198 9））。抗体をドキソルビシンなどの化学療法剤や、細胞障害効果を有する放射 性標 識物質に結合することも好ましい。 放射性物質または蛍光性物質を用いるなどしてin vivo撮像する場合、特に、 ヒトの抗体においては、本発明に係る抗体の接合体も好ましい。 本発明の治療用化合物は、既知の薬学的技術を用いて、脈管内、腹腔内、皮下 、筋内などに非経口投与することができる。本発明に係る活性薬剤成分は、液状 、粉末状、凍結乾燥状の形態で使用され、水、生理食塩水、水溶性デキストロー ス、水溶性緩衝剤などの希釈剤や担体と組み合わせることができる。保存薬も添 加することができる。 選択された投与経路のいかんに関わらず、本発明に係る化合物は、当業者らに 知られる従来の薬学的に許容できる剤形に構成される。この化合物は、薬学的に 許容できる酸添加塩または塩基添加塩を用いて形成することもできる。さらに、 化合物またはその塩は、適切に水酸化させた形態にして使用することもできる。 選択された投与経路のいかんに関わらず、本発明に係る毒性がないが治療的に 効果的な量の一つ以上の化合物をいかなる治療にも使用することができる。治療 用の投薬方法は、体型、年齢、体重、性別、患者の医学的状態、腫瘍タイプ、投 与経路、治療に使用された特定の化合物などの種々の因子に従って選択される。 一般的な水準の医師ならば、既知の抗体治療方法の際に必要な効果的な薬剤量を を即座に決定し処方することができる（Hale（1988），Cobbold（1990））。そ のような処置では、医師は初め相対的に低量の投薬をし、後に、最大の反応が得 られるまで増量する。 腫瘍におけるＣＤ４４遺伝子の多数のスプライシングされた変異型が無秩序に 過発現するということは、特定のエキソンが特定の細胞試料によって過発現され たり、過発現されなかったり、全く発現されなかったりするということである。 従って、どのようなエキソンによってでも発現されるペプチドに対する抗体を使 用する免疫検定は、間違った結果を導くこともある。従って、本発明は、腫瘍形 成の免疫学的診断のため、２つ以上のＣＤ４４エキソン好ましくは、９つすべて のエキソンに対する抗体を混合使用する方法を含む。 以下の例では、ヒトＣＤ４４遺伝子の発現が、正常な体組織と比較すると、種 々の固形腫瘍において、一貫して弁別的に増加することが認められた。悪性（す なわちすでに転移している）腫瘍は、局所侵入性腫瘍や良性の腫瘍とは、観察さ れる変化のパターンおよび大きさにおいて異なる。試験は、46のの腫瘍から得ら れた試料について行われ、そのうち、44の腫瘍が局所侵入性、あるいは転移性で あり、２つの腫瘍が良性であった。ＣＤ４４の発現に関する分析は、ＰＣＲを用 いて新鮮な外科的生検試料から抽出されたＲＮＡの逆転写によって作成されたｃ ＤＮＡを増幅することによって行われた。特異的にＣＤ４４の遺伝子のいくつか の部分をアニーリングさせるオリゴヌクレオチドプライマーを選択すると、上述 の結果から、診断および予後の上で重要な意味を持つＣＤ４４遺伝子部分を増幅 することができる。 今述べたような修飾ＣＤ４４の発現と腫瘍形成の間の強い関連を見たからとい って、遺伝子の個々のエキソンのいずれもが腫瘍形成時または転移性腫瘍に進行 する際にのみ発現されることを示していると考える必要はない。近年、多くの実 験室で得られた証拠（Knudson 1985，Tarin 1992，Hayle et al 1992などを参照 ）は、これらの異常プロセスは細胞増殖および移動などの正常な細胞活動をコー ドする遺伝子の調節が妨げられた結果であろうと示唆する。従って、どのような 遺伝子または遺伝子部分でも、腫瘍形成または転移をプログラムするだけしか機 能を持ってないとは思われない。 正常組織のエキソン10/11から得られた転写物の本試験の所見は、転移能力が ある腫瘍からのＰＣＲ生成物において放射性標識付けされたプローブＥ４をハイ ブリッド形成するバンドの数およびシグナル強度が著しく増加した場合でも、こ のエキソンが転移行動にのみ関与しているわけではないことを示唆する。従って 、別の裏付けとなる現象が、ＣＤ４４エキソン10/11が発現して転移活動が行わ れると考えるためには必要であると考えられる。それにも関わらず、このエキソ ンから得られた転写物が転移性腫瘍から得られた試料において過度に発現したと の観察結果は、予後判断の非常に有用な指標として有望である。 さらに調査しても、個々のエキソンのいずれかからの天然の（非突然変異の） 生成物が、腫瘍細胞にだけユニークに存在し、正常な細胞には存在しないことが 発見されるとは思われない。それどころか、ＣＤ４４遺伝子座に関して今に報告 されたように、過発現と遺伝子の産物の不適切な組み合わせから成る遺伝子活動 の異常パターンが、悪性化に関与すると思われる。これらの変化自体が悪性変換 のために必要なのかもしれないし、またこのような変換を生じるその他の遺伝的 障害の結果なのかもしれない。たとえそうであるとしても、この問題を解決せず ともこれらの技術を使用する観察者は、腫瘍形成範ちゅうのものなのか、それと も非腫瘍形成範ちゅうのものなのか、試料を振り分ける方法に関して情報を得る ことができる。 例 方法 直径0.5-1cmの新鮮な組織試料を乳癌および結腸癌の患者34名から治療時に除 去された外科的切除標本から得た。試料は、病理学的標本受入場所に到着後10分 以内に液体窒素で急速冷凍して、使用するまで液体窒素に保存した。診断用に切 除された組織にリンパ節転移巣および血行性転移巣があれば、その一部も収集し た。正常な胸部組織、正常な結腸粘膜、胸の腫瘍に隣接する正常なリンパ節、正 常な肝臓も外科的に切除された標本やその他の非腫瘍形成状態との比較のために 切除された標本から収集された。正常の末梢血白血球を、10名の志願者から得て 、骨髄を３名の志願者から得た。腫瘍およびその臨床段階の組織学的特徴は、表 １に記載した。 組織試料からの細胞性ＲＮＡの抽出は全て、ChomizynskiおよびSacci（1987） によって記載された方法に従って行われた。液体試料からの抽出は、Invitrogen によって市販されているMicrofasttrackキットを使用した。ｃＤＮＡ合成および その後のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅は、このキットに供給され る緩衝剤および試薬を用いてSuperscriptTM前増幅装置（BRL Life Technologies Inc.，Middlesex，UK）を使用して行われた。すなわち、これは、テンプレート および供給されたヌクレオチドトリホスフェートとしてＲＮＡ試料を使い、逆転 転写酵素を用いて行う一次鎖ｃＤＮＡ合成の最初のステップに関係する。後のＰ ＣＲの場合、各試料は、油を薄く塗って、５分間94℃で加熱し、核酸を変性させ 、ＰＣＲの30サイクルを、以下のサイクルパラメータで行った。すなわち、94℃ で１分間、55℃で１分間、72℃で２分間で行った。反応混合物にテンプレートｃ Ｄ ＮＡが存在しない負の遺伝子制御を各バッチに対し型通りに実施した。ヒトＣＤ ４４ｃＤＮＡに関して公表された配列情報（Hofmann et al，1991，Stamenkovic et al，1991，Jackson et al，1992）（図６）を用いて発明者らが考案したプ ライマーおよびプローブ配列は以下の通りであった。 P1＝5'GACACATATTGCTTCAATGCTTCAGC P4＝5'GATGCCAAGATGATCAGCCATTCTGGAAT Ｐ１は（1989年にStamenkovic et al.によって公表された配列のヌクレオチド 782および783の間の）標準ＣＤ４４分子の挿入部位から324bp上流に起点を置き 、Ｐ４はこの部位から158bp下流に起点を置く。試料が標準ＣＤ４４（いわゆる 造血ＣＤ４４）を発現する場合は、これらのプライマーは、482bpのＰＣＲフラ グメントを生成し、試料が選択的にスプライシングされた転写物を含む場合には 、ＣＤ４４およびその他のバンドの上皮形態に関しては878bpのＰＣＲフラグメ ントを生成する。10μlの各ＰＣＲ生成物は、1.2%の寒天ゲル中で電気泳動され 、Hybond N+（Amersham UK，Little Chalfont，UK）ナイロン膜に移され、オリ ゴヌクレオチド・プローブＥ４（＝5'TGAGATTGGGTTGAAGAAATC-3'）をハイブリッ ド形成する（図６参照）。ブロッティングおよびオートラジオグラフィーを、検 出感度および解像力向上のために行われた。プローブは、ポリヌクレオチドキナ ーゼの存在下でy32P-ATPで放射性標識を付けた。プレハイブリッド形成後、10％ のデキストラン、６×ＮＥＴ、５×Denhardt溶液、0.5％のNP40および100μg/ml のサケ精子ＤＮＡ内で42℃で一晩のハイブリッド形成を行った。次に、フィルタ ーを２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣおよび0.1％ＳＤＳを含めた0.5％ＳＳＣ内で２度連 続各15分間42℃で洗浄した。フィルターをKodakＸ線フィルムに2-16時間暴露し た。この後、フィルターは、プローブをストリッピングするために0.5％ＳＤＳ で煮沸し、別の放射性標識プローブすなわち発明者らがＣＤ４４の標準部分をア ニーリングさせるように設計したＰ２（＝5'CCTGAAGAAGATTGTACATCAGTCACAGAC） （図６）で再ハイブリッド形成した。ハイブリッド形成、洗浄およびオートラジ オグラフィに使用される条件は、上述と同様である。 小数の細胞を検出するための方法の感度校正は次のように行った。塩化アンモ ニウム緩衝液（沈層赤血球1ml当たり50mlの溶菌緩衝液）を添加することによっ て沈層赤血球を溶解した15分後に遠心分離することによって末梢血リンパ球（Ｐ ＢＬ）は全て20mlの全血から精製した。白血球ペレットを４本の試験管に分け、 HT29結腸癌腫細胞の懸濁液（１ml当たり5000細胞）をそれぞれの試験管に0μl、 1μl、10μl、100μずつ入れた。次に、ＲＮＡすべてを抽出したが、各試験管の 収量は約20μgだった。ｃＤＮＡ合成は、各試験管から得られたＲＮＡの４μgの 分別アリコートに対して行い、分別した試料一点当たりそれぞれの腫瘍細胞は、 0個、1個、10個、100個であった。ＰＣＲは、上述の試料、正の遺伝子制御（腫 瘍細胞のみ）、負の遺伝子制御（ＤＮＡ無）に対して、発明者らが図６のエキソ ン６および１４を特異的にアニーリングさせる設計をしたプライマーＤ１および Ｄ５を用いて行われた。先の試験から、HT29細胞は、両方のエキソンやその他の エキソンをＰＢＬから容易に区別できるパターンで発現し、発明者らは増幅すべ きセグメントを短縮することによって感度を高めたかったので、オリゴヌクレオ チドプライマーＤ１およびＤ５を選択した。これらのプライマーを使用すること で、この特異的な目的のためにプライマーＰ１およびＰ４を用いる問題が回避で きると結論されたが、その理由は、これらの大半が遺伝子の標準部分をアニーリ ングさせることによって浸漬されるからである。ＰＣＲのサイクルパラメータ、 ブロッティング条件、プローブ条件、洗浄条件は上述の通りである。プローブに 使用されるオリゴヌクレオチド配列は、32P標識付けしたＥ４であった。結果の概観 プライマー（Ｐ１、Ｐ４）は、スプライス生成物挿入部位を越えて増幅するの で、標準分子の介在部分に加え、付加的なエキソンド・メインから得られた転写 物を含む選択的にスプライシングされた変異型のいずれかが増幅される。このた め、この座から同定される配列の可能な組み合わせすべてを考慮すれば標準型に 対するプローブ（例えば、Ｐ２）などを用いて検出できると思われる生成物の総 数は大きい。プローブＥ４を用いて、上述の16の組み合わせ、すなわち、エキソ ン１１から得られたＥ４転写物を含む組み合わせは、電気泳動によって解像され る異なる分子サイズのバンドとして視覚化することができると思われる。実際に は、可能な組み合わせのすべての範囲を上述の結果では検出できなかったが、複 数（９つまで）の選択的スプライシング変異型が各プローブでハイブリッド形成 した腫瘍形成組織において観察された。胸部、結腸部、およびリンパ節から得ら れた体組織は、ある種のＥ４含有転写物（図１および図３）の他、標準分子（図 ２および図４）も発現したが、末梢血リンパ球（図５）および肝蔵（図４）は、 プローブおよびプライマーのこの組み合わせを用いた場合には、後者のみ検出可 能状態で発現した。 例１ 胸部組織資料 胸部組織試料の試験から得られた結果を図１および図２に示す。転移腫瘍沈着 物とすべての症例から得られたそれら沈着物に対応する原発腫瘍は、エキソン１ １から得られた転写物含有の複数の選択的スプライシング生成物を過発現した（ 図１ａ）。少なくも、８つのバンドが、すべての腫瘍において1500bpと1650bpで 存在する二重縞と一緒に頻繁に観察された。正常胸部組織および正常リンパ節は 、このプローブによって２つのバンド（1150bpおよび860bp）を呈した。上述の 二重縞は、正常試料には一切認められなかった。 バンドの数、サイズ、結合プローブからの信号強度の差異は、正常範ちゅうと 悪性範ちゅうの間では、試験されたすべての試料において明かであった。偶々採 取した予定外の試料については、長期間Ｘ線フィルムにフィルターを暴露し、弁 別的な差異を観察しなければならなかったが、この所見は試験されたすべてにつ いて確認された。 転移関連の臨床的証拠がない局所侵入性腫瘍から得られた試料と２つの繊維腺 腫から得られた試料も、正常組織に比べてエキソン10/11から得られた転写物を 含むスプライス生成物を過度に発現したが、この程度は、悪性腫瘍とその転移巣 を用いて得られた結果とは容易に区別された。正常組織に認められるパターンか らの区別も容易である（図１ｂ）。ただし、一つの試料だけは、悪性腫瘍と類似 す る結果を示した（レーン１４）（以下参照）。２つの繊維腺腫は非転移性癌腫か ら得られたパターンと類似したバンド・パターン示し、胸部の嚢胞疾患例から得 られた試料は、正常の非腫瘍形成胸部組織のパターンと類似していた。これは、 本方法による最も確実な診断の第１の例である。組織片は、当直の死亡診断医に よって良性腫瘍すなわち肉眼によるむ初期の視診では肉眼的外観上は繊維腺腫か ら得られたものとして提供された。次に、この組織片は、そのｃＤＮＡのＰＣＲ 増幅後、明確に非腫瘍性であるとして特徴付けられ、その後、組織片顕微鏡検査 によってこれが確認された。 プローブＥ４によって認められる差異が有効であり、技術的な人工産物でない ことを確認するために、同じフィルターがプローブＰ２でハイブリッド形成され た場合に得られた結果を図２に示す。これは、i）すべての試験組織が遺伝子の 標準型を発現し、ii）エキソン10/11由来の転写物を含まないその他のエキソン スプライス生成物が腫瘍および転移巣に存在し、iii）上述の差異がこの複合フ ィルター上の種々のパネルおよびレーンのトラック（track）を不均等にローデ ィングしたことによるものではなく、選択的なスプライシングから生じたもであ ることを示す。この実験におけるすべての条件は、フィルターをＸ腺フィルムに 暴露する露光時間（図１の場合、１０時間露光、図３では1.5時間）を除いて、 Ｅ４を用いてハイブリッド形成した場合の条件と同じである。 例２ 結腸試料 結腸癌腫に関する所見は、乳癌に関する所見と一致した。このため、すべての 場合において、結腸癌腫組織は、正常の結腸粘膜やその他の正常組織よりもプロ ーブＥ４よって強く標識付けられた分子量の大きいバンド数の増加を示した。乳 癌腫の場合のように、プローブＰ２によるハイブリッド形成は、分子の標準型の 発現度において差異を示さなかった（図４）。 例３ 方法の感度の校正 既知数のHT29結腸癌腫細胞を接種した末梢血白血球のＰＣＲ産物のオートラジ オグラムを精査した結果、107個の白血球中の腫瘍細胞が10個のレベルまで腫瘍 細胞特有のバンドの存在を示せることがわかった。検定条件を微細に調整するこ とによって、10mlの血液中のただ１つの腫瘍細胞をも検出することが可能である と考えられる。 上述のシリーズでは、腫瘍形成細胞の試料すべてが、ＣＤ４４遺伝子の選択的 スプライシングされた生成物を過発現し、非腫瘍性組織から得られた試料では、 全く発現を示さなかった。従って、正常組織由来または腫瘍組織由来の試料とＣ Ｄ４４の発現パターンは完全に対応した。ある例では、転移巣の臨床的証拠が現 在ない患者（患者Ｂ１６、図１のレーン１４）から除去された腫瘍は、転移能力 を示す発現パターンを有することが認められた。現在、これが偽陽性であるのか 、転移が差し迫っている徴候であるのかを知ることは不可能である。この患者は 、現在フォローアップクリニックで観察下にある。 例４ 発明者らは、以下のように発明者らの所見に従ってオリゴヌクレオチドプライ マーを設計し合成した。 標準部分に関しては以下の通りである（Stamenkovic 1989）。 プライマーＰ１＝5'-GACACATATTGCTTCAATGCTTCAGC（458-484） プライマーＰ２＝5'-CCTGAAGAAGATTGTACATCAGTCACAGAC（488-518） プライマーＰ３＝5'-TGGATCACCGACAGCACAGAC（746-767） プライマーＰ４＝5'-GATGCCAAGATGATCAGCCATTCTGGAAT（912-941） エキソンに関しては以下の通りである（Hofmann 1991）。 プライマーＥ１＝5'-TTGATGAGCACTAGTGCTACAGCA プライマーＥ２＝5'-CATTTGTGTTGTTGTGTGAAGATG プライマーＥ３＝5'-AGCCCAGAGGACAGTTCCTGG（534-554） プライマーＥ４＝5'-TGAGATTGGGTTGAAGAAATC（558-578） プライマーＥ５＝5'-TCCTGCTTGATGACCTCGTCCCAT（585-608） D1：5’GAC AGA CAC CTC AGT TTT TCT GGA（63-86） D5：5’TTC CTT CGT GTG TGG GTA ATG AGA（888-911） Ｅ１およびＥ２は、エキソン６上に存在する。 直径0.5-1cmの新鮮な組織片試料を外科的切除標本からまたは剖検時に得た。 この研究に使用される試料はすべて診断試料が採取された後に残存する組織残部 から得られたが、本来ならば廃棄されたはずのものである。試料は、病理学的標 本受付場所に到着後10分以内に液体窒素で急速冷凍され、使用されるまで液体窒 素で凍結される。ｃＤＮＡは、テンプレートとして細胞ＲＮＡの全量5μgを用い てウイルス逆転転写酵素によって合成し、プライマーＰ１およびプライマーＰ４ を用いるＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅、電気泳動およびハイブリッド形成は、標 準条件下で行われた。 ＰＣＲ産物を放射性標識付けしたＥ２またはＥ４によってハイブリッド形成し た場合、癌腫から得られた試料すべてが複数のスプライス変異型を過発現したが 、各プローブによって観察されたバンドのパターンは異なった。このため、エキ ソン６生成物に対するオリゴネクレオチドプローブは、腫瘍形成試料を非腫瘍性 試料から区別する場合に有効であるが、少なくとも固形組織から得られた試料に ついてはＥ４に比べて著しく感受性が大きいというわけでなく、播種性転移細胞 または確定した転移巣の由来器官を検出するために有用であろう。その後、同じ フィルターをストリッピングし、プローブＰ２によってハイブリッド形成したと ころ、正常組織を含むすべての試料がＣＤ４４の標準部分を産生することがわか った。これによって、Ｅ２およびＥ４を用いて探査された正常試料および腫瘍試 料を用いて得られた結果間に観察された差異は、ＰＣＲ生成物の不均等なローデ ィングによるものではないことが確認された。累積結果を表３にまとめたが、こ れは、これらのの変化がさまざまな普通型癌に観察されることを示すものである 。 発明者らは、ある種の骨格筋の悪性腫瘍を調査し、骨肉腫にいて多数のスプラ イシングされた変異型が著しく過度に発現することを観察した。 例５ 臨床的に収集された尿試料のＰＣＲ検定による 癌診断 約50mlの自然排尿を各人から得て、実験室に可能な限り急速に運んだ。患者90 名から得た標本を試験したが、その内訳は、生検済膀胱癌患者から44例と膀胱が 非腫瘍性炎症（膀胱炎）患者および正常志願者46から得られた46例である。各尿 試料を完全に混和した後1mlずつ採取し、細胞学的検査を行った。別の1mlの尿を フルオレセイン・ジアセテート・エチジウム・ブロミド染色によってチェックし 、試料中の細胞の生存度を評価した。残りの尿を2000rpmで、10分間、遠心分離 を行い、細胞ペレットを使用するまで-70℃で保持した。ｍＲＮＡの抽出をオリ ゴｄＴセルロース錠（Invitrogen）を用いて行った。ｃＤＮＡは、ＡＭＶ逆転写 酵素（Invitrogen）を用いて合成された。完成したｃＤＮＡ溶液を均等に２本の 試験管に分配したが、一方はＥ１およびＥ５を用いたＰＣＲ用であり、特定のｃ ＤＮＡ転写物を増幅し、発明者らは、診断価値の高いことを認め、他方は、Ｐ１ およびＰ４を用いるＰＣＲ用であり、内的制御物としてスプライス変異型すべて を有するか有しないＣＤ４４の標準型を増幅した。 ＰＣＲの35サイクルを実行した。サイクル条件は、95℃１分間、55℃１分間、 72℃２分間であった。「ホットスタート」法をすべての試料に採用した。結果は 図８に示されている。 等しい容積のＰＣＲ生成物を1.2％の寒天ゲルの各レーンにローディングしエ チヂウムブロミドで染色した。尿中の細胞がエキソン６からエキソン１４までの すべてを発現するものであれば、現在のＰＣＲプロトコルの場合、プライマーＥ １およびＥ４を使用することによって735bpのバンドを生じることが予想された 。正常尿から得られたｃＤＮＡまたは非腫瘍性膀胱炎患者のｃＤＮＡを含むトラ ック（track）にはバンドがないが（レーン１−８）、ＰＣＲをプライマーＥ１ およびＥ５を用いて行った場合（上部パネル）、鮮明な735バンドが膀胱癌患者 から得ら れた尿試料すべてにおいて観察されている（レーン９−１６）。 ＣＤ４４型の標準型を表す482bpのバンドは、ＰＣＲをＰ１およびＰ４を用い て実行した場合（下部のパネル）、すべての場合にほぼ均等に得られた。これは 、膀胱癌患者から得られた尿と対照から得られた尿との間の診断的に有意な差異 は、トラック（track）の不均等なローディングによって引き起こされるのでは なく、ＣＤ４４遺伝子の選択的スプライシングによって生じることを示唆する。 レーン１−４：正常尿。レーン５−８：膀胱炎の尿。レーン９−１６：膀胱癌患 者１−８から得られた尿。 全体の結果では、735bpバンドは、正常な７尿標本中７標本と膀胱炎の９尿標 本中９標本には存在しなかった。すなわち、０％の偽陽性である。また、膀胱癌 患者から得られた19尿試料中14試料（74％）は、陽性の結果（すなわち26％の偽 陰性）を示した。偽陰性の試料では、フルオレセイン・ジアセテート・エチジウ ム・ブロミド染色によって示されるように生存可能な癌細胞が不足していた。 例６ 患者12名から得られた便を本文に記載された技術によって検定した。結腸直腸 がん患者９名から得られた試料中５試料は、陽性の結果を示した。正常な患者３ 名から得られた試料すべてが陰性の結果を示した。前処理を課さない細菌に満ち た試料から得られた数値は、細菌生存可能診断検定法を容易に開発することがで きると確信させるものである。 この方法を用いて腫瘍細胞を検出する発明者の更なる実験では、以下の観察結 果がその診断的ポテンシャルを調査するその他の実験に有用となろう。結果の信 頼性および再現性は試料から得られたｍＲＮＡの質および技術を実施する際のケ アに決定的に依存することを重大な考察として認識すべきである。主な必要条件 は、質の高いｍＲＮＡが日常的に得られることを確実にし、内部標準をすべての 反応に用いてＰＣＲ増幅ステップをモニタリングして偽陰性の結果が出ることを 排除することである。偽陽性の結果はあまり多く観察されないのであれば、同じ 試料または更に採取した試料に対する複製検定とその他の臨床データを参照すれ ば、偽陽性と認識することができるので、重要な問題ではない。 発明者らは、腫瘍細胞を含有する小型臨床試料の中から異常なＣＤ４４遺伝子 の活性を機械的にＰＴ−ＰＣＲ検出することを確実にするために必要な手順を検 討した。組織片試料をアリコートに分割し、その半数を液体窒素中で直後に凍結 し、残りは周囲温度で放置した場合、ＣＤ４４スプライス変異型を検出する能力 が、標本処理の時間とモード次第ではどのように低下するかを示すことができる 。切除30分以内にｍＲＮＡ抽出した新鮮試料は、最も信頼できる結果を示し、新 鮮組織片を周囲温度に放置された場合には、次の数時間で質が次第に低下する。 試料が最初に急速冷凍された場合には、解凍直後にＲＮＡを抽出しさえすれば満 足できるものである。だが、最初の15分間で急速に低下し始め、大型の変異転写 物が最初に損失し最終的には標準型までも損失する結果が得られた。急速に冷凍 された細胞および組織片の試料が-70℃で保管された場合、ｍＲＮＡが解凍直後 に抽出された場合でさえも、結果は４週間後に低下した。従って、冷凍中に破壊 された細胞から放出されたリボヌクレアーゼによるＲＮＡの質低下は、この温度 でさえも、速度は遅いとは言え、継続する。さらに、ＲＮＡ抽出用に採取された 試料は、壊死部分または繊維症部分から得られる場合には、生存可能な腫瘍組織 に観察される典型的な結果を得られないとも考えられる。このため、試料選択お よび標本処理における注意は、信頼できるデータを得るために必要である。 このようなことから、発明者らは新鮮な試料が、ｍＲＮＡを抽出するために凍 結または処理される前に24時間以上放置されないこと、解凍試料がｍＲＮＡ抽出 のために処理される前に２時間以上放置されないことが好ましいと考える。 本文に記載される診断方法は、一日で行うことができ、数時間でおこなうこと ができる場合もあり、自動化することもできる。この診断方法の使用は、さまざ まな試料に関して多種多用な癌を検出するために、また、血液試料および尿試料 に関しても証明してきた。従って、発明者らは、この方法を癌のスクリーニング および診断にとって便利で実践的な方法として提供する。原則として、この診断 方法は、癌の検出プログラムと予防プログラムに広く一般的に適用できるので、 疫学的価値および公衆衛生的価値がある。この方法の感度、特異度、簡易性を適 切に利用することによって、初期の癌診断の他、体内の疾患の程度の評価、処置 の効率の判定、腫瘍再発の早期検出ができるようになろう。図の記号説明 注記： Ｎ＝正常、 Ｔ＝原発腫瘍、 Ｍ＝転移図１ 胸部組織片試料から得られたＰＣＲ生成物のオートラジオグラムをＥ４を用い て探査そた（試料フィルターをＸ線フィルムに１０時間照射）。パネルＡ：転移 巣を有する悪性原発乳癌。トラック１、２、３：患者Ｂ１、トラック４、５、６ ：患者Ｂ２、トラック７、８、９：患者Ｂ３、トラック１０、１１：患者Ｂ４、 トラック１２、１３：患者Ｂ５。標準胸部組織片と比較して、原発癌腫およびそ の転移沈着物は、複数のスプライス変異型を過発現した。1500bpおよび1650bp（ 矢印）におけるダブレットは、トラック５に最も良く観察されることに注目され たい。これは、腫瘍および転移巣のすべてに存在するが、今回の露光によってそ の他のトラックではかぶり画像となっている。はるかに長い露光時間（23時間） でさえ、正常試料では検出されなかった。パネルＢ：転移の臨床的証拠がない乳 癌腫。トラック１４−２０は、患者Ｂ１５−２１から得られた。腫瘍はすべて種 々の変異型を過発現したが、トラック１６（患者Ｂ１７）以外は、バンド数は少 なく、シグナル強度は弱かった（テキスト参照）。1500/1650bpのダブレット（ 矢印）は、トラック１５、１６、１８では露光の長さにおいて容易に認識するこ とができ、長い露光についてはその他すべての腫瘍含有トラックにおいて検出で きるようになった。しかし、図では、強いシグナルを有するトラックがかぶり映 像となるのを防ぐためには短い露光がよいことを示す。パネルＣ：繊維腺腫瘍（ ＦＡ）および嚢胞性乳腺症（Ｃｙｓｔ）。トラック２１、２２は、良性腫瘍試料 （試料Ｂ２２、２３）を含み、トラック２３（試料Ｂ２４）における非腫瘍性（ 嚢胞性疾患）試料よりも多く発現した。図２ プローブＰ２を用いて探査された胸部組織片試料から得られたＰＣＲ生成物の オートラジオグム（試料フィルターをＸ線フィルムに1.5時間露光）。この結果 は、図１に使用されたものと同じフィルターを、以前のプローブをストリツピン グした後再探査することによって得られた。ここでは、i）図１に観察される差 異は、トラックの不均等なローディングによるものではなく、ii）分子の標準型 の発現は、どの変異型よりも量的に多く、iii）標準型は、調査されたすべての 組織片に発現され、iv）エキソン３転写物を含まない変異型も更に存在し、腫瘍 細胞に過発現される。1500/1650bpダブレットは、パネルＡの腫瘍に認められる が、パネルＢおよびパネルＣで検出できるようにするには長時間の露光が必要で ある。 図３ Ｅ４を用いて探査した結腸組織片試料から得られたＰＣＲ生成物のオートラジ オグラム（試料フィルターを写真フィルムに１０時間露光）。トラック１、２、 ３：患者Ｃ１、トラック４、５、６：患者Ｃ２、トラック７、８、９：患者Ｃ３ 、トラック１０、１１：患者Ｃ４、トラック１２、１３：患者Ｃ５、トラック１ ４：正常肝試料。画像は、図１の説明に記載した特徴と同じであり、所見は結腸 の癌腫に適合することを示す。1500/1650bpダブレット（矢印）は、複数の腫瘍 トラック（２および８−１２）で容易に目止められ、トラック３、５、６、１３ に対応する位置の微弱なシグナルは、露光時間が長い場合には強くなった。しか し、トラック１、４、７、１４（正常組織）ではこの近傍に一切認められなかっ た。 図４ Ｐ２を用いて探査された結腸組織片試料から得られたＰＣＲ生成物のオートラ ジオグラム（試料フィルターを写真フィルムに1.5時間露光）。これは各トラッ クは均等にローディングされたことを確証し、また、図２に示されたようにその 他のポイントは結腸癌腫にあてはまることを確証している。正常肝臓は、ＣＤ４ ４の標準型を発現することに留意されたい。 図５ 正常末梢血白血球、ＰＢＬ（３名から得られた）および、Ｅ４（パネルＡ；写 真フィルムに８時間露光）とＰ２（パネルＢ；写真フィルムに５時間露光）を用 いてプローブされたその他の正常組織から得られたＰＣＲ生成物のオートラジオ グラム。トラック６は、乳癌（患者Ｂ）から得られたＰＣＲ生成物を正の遺伝子 制御として含む。プライマーおよびプローブのこの組み合わせを用いれば、白血 球がＣＤ４４分子の標準型を発現することがわかるが、スプライス変異型は検出 されない。トラック４および５の試料は以下のように、臨床的に腫瘍形成の証拠 がない個体から得られた。すなわち、トラック４は細菌性心内膜炎で死亡した女 性の身体から剖検によって得られた胸部組織、トラック５は軸捻のために切除さ れた結腸である。 参考文献 例７ Ｉ．ペプチド合成 図７に示されるＣＤ４４エキソン６に対応するペプチド配列のアミノ酸１−１ ３、９−２３、１９−３３、２９−４３、１−４３に対応する５つのペプチドを 、Applied Biosystems，Inc.社のモデル431Aペプチドシンセサイザーにかけて専 売の標準スケール（0.25mmol）Fmoc化学オプションを用いて9-フルオロエニルメ チロキシカルボニル（Fmoc）化学固相ペプチド合成（Atherton and Sheppard，1 989）によって合成した。このために、403mgの4-（2'，4'-ジメトキシフェニル −Fmoc-アミノメチル）-フェノキシ樹脂（Rink，1987）を0.62mmol/gの樹脂と置 換して用いる。アミド樹脂は、最初のカップリングサイクル以前にN,N-ジメチル ホルムアミド（ＤＭＦ）中の20％のピペリジンを用いて処理することによって脱 保護化（Fmoc開裂）する。ペプチドを合成するには、4mol過剰な以下のFmoc-ア ミノ酸誘導体とその他のカルボキシル酸を用いる。 N-Fmoc-L-アラニン N-α-Fmoc-NG-（2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル）-L-アル ギニン N-α-Fmoc-N-β-（トリチル）-L-アスキパラギン N-α-Fmoc-L-アスパラギン酸-β-t-ブチルエステル N-Fmoc-S-トリチル-L-システイン N-α-Fmoc-N-γ-（トリチル）-L-グルタミン N-α-Fmoc-L-グルタミン酸-γ-t-ブチルエステル N-α-Fmoc-N-im-トリチル-L-ヒスチジン N-α-Fmoc-L-ロイシン N-α-ブチロキシカルボニル-N-ε-Fmoc-L-リシン N-α-Fmoc-N-ε-ブチロキシカルボニル-Fmoc-L-リシン N-Fmoc-L-ノルロイシン N-Fmoc-L-プロリン N-Fmoc-O-t-ブチル-L-セリン N-Fmoc-O-t-ブチル-L-トレオニン N-α-FMoc-N-ε-ブチロキシカルボニル-L-トリプトファン N-Fmoc-γ-アミノブチル酸 N-Fmoc-ε-アミノカプロン酸 （+）-ビオチン カップリングを行う前に、アミノ酸誘導体をＤＭＦに溶解し、１当量のN-ヒド ロキシベンゾトリアゾル（HOBt）をN-メチルピロロリジノン（ＮＭＰ）に添加し 、１当量のN,N'-ジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ）をＮＭＰに添加することに よって活性化させる。HOBt-エステルアミノ酸の20分間のカップリングをＤＭＦ 中で実行する。カップリングに続き、N-末端の脱保護化（Fmoc開裂）をＤＭＦに 20％のピペリジンで３分、続いて10分処置することによって達成する。ペプチド 鎖は、活性化／カップリング／脱保護化サイクルを繰り返すことによって延伸す る。後に免疫原合成に使用されるペプチドにN-末端アミノカプロン酸スペーサお よびシステインを供給し、それによってペプチドは担体タンパク質につながれる 。スクリーニング試薬として使用されるペプチドに関し、異なるN-末端が合成さ れ、３つのγ-アミノブチル酸成分、リシン、（リシンのε−アミノ基に取り付 けられている）ビオチンを含む。合成に続き、ペプチドは、トリフルオロ酢酸（ ＴＦＡ）切除によって樹脂支持体から除去される。ペプチド含有樹脂を１時間室 温（ＲＴ）で20mlのトリフルオル酢酸、1mlの水、1mlのチオアニソール、0.5ml のエタンジチオール、1.5gのフェノールを含む開裂カクテルと反応させる。アル ゴン下で行われた酸-不安定側鎖保護基の除去は、上述のカクテル溶液内でさら に2.4時間の反応時間後室温で完了される。短時間冷却した後、脱保護化された ペプチドは、ジイソピルエーテルの添加によって沈降させる。沈澱物をろ過し、 ジイソプロピルエーテルで洗浄し、50％酢酸で溶解し、凍結乾燥させた。ペプチ ドの純度は、逆相ＨＰＬＣ（カラム−Vydac 218tp54、Ｃ18、300Å、5μm、4.6 ×250mm、移動相−Ａ：0.1％ＴＦＡ含有の水、Ｂ：0.1％ＴＦＡ含有の水／アセ トニトリル（35/65、容積/容積）；勾配−90分間で0-100％Ｂ、流量−1ml/分、 検出−226nm）。純度が60％未満の上述のペプチドを逆相ＨＰＬＣ（カラム−Wat ers DeltaPak Ｃ18、100Å、15μm、50×300mm、移動相−Ａ：0.1％ＴＦＡ含有 の水、Ｂ：0.1％ＴＦＡ 含有の水／アセトニトリル（35/65、容積/容積）；勾配−130分間で0.50％Ｂ、 流量−15ml/分、検出−226nm）。ペプチドの素性は、プラズマ脱着質量分析によ って検証される。免疫原合成に使用されるペプチドに関する特徴的なＨＰＬＣ維 持時間特性および質量分析データを表２に記載した。 II．担体タンパク質の活性化 免疫原分析に関して、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウ シ血清アルブミン（ＢＳＡ）のいずれかの担体タンパク質をヘテロ二官能架橋試 薬であるN-スクシニミジル3-マレイミドプロピオネート（ＭＰＳ）を用いてリシ ンのε-アミンを介して修飾する。このことがスルフヒドリルペプチドが後に共 役される「ハンドル」付きの担体タンパク質を付与する。ＫＬＨの場合、10μM のＫＬＨ溶液をpH8.35の0.1Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液によって調製する。懸濁 液のpHは、8.3に調整され、簡単に遠心分離される。bicinchoninic酸（ＢＣＡ） タンパク質検定（Smith，et al.，1985）によってタンパク質濃度を測定した後 、ジメチルスルホキシドに含めた3000当量の0.3モルＭＰＳ溶液をかくはんされ たＫＬＨ溶液に滴下し、室温で１時間反応させた。溶液のpHは、0.1モルのHCLに よって7.0に調整され、活性化された担体タンパク質は、サイズ排除クロマトグ ラフィーによって過剰のＭＰＳから分離された（カラム−AcA202、IBF Biotechn ics、5×12cm）室温；緩衝液−0.1MのKH2PO4/K2HPO4、pH7.0、0.1MのNaCl；流量 -6ml/分、検出−226nm）。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質検定によって再 度測定され、活性化KLHのマレイミドプロピオアミド（ＭＰ）置換の程度（KLH-M P）をエルマン試薬ＤＴＮＢを用いて測定した（Ellman、1959）。ＢＳＡに関し ては、190μMのＢＳＡ溶液を0.1モルのKH2PO4/K2HPO4、pH7.0に含めて調製し、1 00当量のＭＰＳ（1,4-ジオキサン中40mM）に滴下した。反応混合物を2時間室温 でかくはんした後、サイズ排除カラムにローディングした。活性化されたＢＳＡ （ＢＳＡ−ＭＰ）を精製し、ＫＬＨ−ＭＰに似たような方法で分析した。20-35: 1および200-600:1の置換値は、活性化された担体タンパク質であるＢＳＡ−ＭＰ とＫＬＨ−ＭＰに関して各々機械的に達成された。 III.ペプチドと活性担体タンパク質の 共役 チオエーテル結合の形成によって、チオ含有ペプチドは、ＭＰ活性化担体に共 役される。ＢＳＡ−ＭＰの場合、pH7.0の0.1MのKH2PO4/K2PO4に含めた74μMのBS A-MP溶液を（ＭＰに関して）１当量の4mMペプチド溶液を同じ燐酸緩衝液に含め て反応させた。溶液をゆっくりとかくはんし、室温で一晩反応させた。遠心分離 後、可溶性ＢＳＡ-ＭＰペプチド共役体をサイズ排除クロマトグラフィー（II． 節のと同じクロマトグラフィー条件）によって未結合ペプチドを分離した。タン パク質共役体の分析には、ＢＣＡによるタンパク質濃度決定の他、エルマン試薬 を用いての未反応ＭＰ-基の残存数を確認することを含む。ＫＬＨ−ＭＰペプチ ド共役体は、活性担体タンパク質およびペプチドの濃度それぞれ3μMと18μMを 除いて、分析した。参考文献 略号 ＢＣＡ − bicinchoninic酸 ＢＳＡ − ウシ血清アルブミン ＢＳＡ−ＭＰ N-スクシニミジル 3-マレイミドプロピオネートで活性化され たウシ血清アルブミン ＤＣＣ − N,N'-ジシクロカルボジイミド ＤＭＦ − N,N'-ジメチルホルムアミド ＤＴＮＢ − ジチオ-bis-（2-ニトロ安息香酸）、 エルマン試薬 Fmoc − 9-フルオレニルメチロキシカルボニル HOBt − N-ヒドロキシベンゾトリアゾル ＫＬＨ − キーホール リンペット ヘモシアニン ＫＬＨ−ＭＰ − N-スクシニミジル 3-マレイミドプロピオネートで活性化 されたキーホール リンペット ヘモシアニン ＭＰ − マレイミドプロピオンアミド ＭＰＳ − N-スクシニミジル 3-マレイミドプロピオネート ＮＭＰ − N-メチルピロロリジノン ＲＴ − 室温 ＴＦＡ -トリフルオロ酢酸 例８ 組換HIV2（gp32）-ＣＤ４４エキソン６抗原／免疫原の 製造 ＣＤ４４遺伝子のエキソン６は、図７に示すように43個のアミノ酸から成るペ プチドをコードする。 ペプチドおよびアミノ酸100個未満の小型タンパク質は、概して、む微生物の 細胞質発現によって組換えることができない。このため、大腸菌において容易に 発現可能な遺伝子（HIV2レトロウイルスのエンベロープタンパク質gp32の一部） とＣＤ４４エキソン６-ＤＮＡを含む融合遺伝子を作成した。 融合タンパク質のＣＤ４４エキソン６エピトープを増加させるために、（ＣＤ ４４のエキソン５の３つのＣ末端アミノ酸をコードする）適切なリンカーを用い てＤＮＡレベルでＣＤ４４エキソン６を複製した。 金属キレートアフィニィティクロマトグラフィによってより簡単に抗原／免疫 原を単離するために、６個のヒスチジン残基（コドン）をＤＮＡレベルでHIV2（ gp32）-ＣＤ４４エキソン６融合タンパク質のN-末端領域に挿入した。 組換ＤＮＡ技術 標準的な方法を用いてMolecular Cloning: A laboratory manualCold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York（1989）においてSambrook，J．e t al. によって記載されたようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造 業者のマニュアルに従って使用した。 HIV2（gp32）-部分的遺伝子（プラスミドpUC18 HIV2-gp32）の作成 HIV2-gp32遺伝子のアミノ酸48-162のコード部をオーバーラップ化学遺伝子合 成（overlap chemical gene synthesis）によって合成した後、プラスミドpUC18 を用いてサブクローニングした。プラスミドpUC18HIV2-gp32の生成と分類記載に ついては、欧州特許出願第0 440 207号に開示されている。大腸菌 発現ベクターpDS56-6HIS-HIV2-gp32の 作成 以下のプラスミド作成では、アミノ酸配列MRGSHHHHHHTDPEFのN-末端（ポリ-Hi sテイル）をコードする融合遺伝子と、選択されたHIV2-gp32抗原を作成した。 この目的のため、ベクターpQE-10を制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびHindI IIによって消化し、約3.4kbpの長さのBamHI/HindIII-pQE-10ベクターフラグメン トを寒天ゲル電気泳動によって単離した。pQE-10ベクター［同義：pDS56/RBSIII 、６×His（-1）］は、ドイツ国のDiagenから供給され、Stuber，D．et al．（1 990）Immunol.Methods IV: 121-152に記載されているものである。別の調製では 、プラスミドpUC18 HIV2-gp32を制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびHindIIIに よって消化し、約400-bpの長さのBamHI/HindIII-HIV2-gp32フラグメントを単離 し、約3.4bpの長さのBamHI/HindIII-PQE-10ベクターフラグメントに結合した。 所望のプラスミドは、制限マッピングを用いた同定により、pDS56-6HIS-HIV2-gp 32であると判明した。大腸菌 発現ベクターpDS56-HIV2-ＣＤ４４エキソン６の 作成 アミノ酸配列MRGSHHHHHHTDPEFに対するN-末端（ポリ-Hisティル）をコードする 融合遺伝子と、選択されたHIV2-gp32抗原と、ＣＤ４４エキソン６抗原の２つの コピーを作成した。 ＣＤ４４エキソン６遺伝子の２つのコピーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）によって生成した［Mullis，K.B．and Faloona，F.A．（1987）Methods Enzym ol. 155: 355-350］。 最初のＰＣＲ反応では、塩基対の位置397-538から得られたＣＤ４４エキソン ５−６のＤＮＡ配列を増幅し（図９：HIV2（gp32）-CD44エキソン６融合遺伝子 のＤＮＡ配列）、適切な個別の部位に制限エンドフクレアーゼ開裂（BamHIおよ びHaeIII）を形成した。増幅はサブクローニングされたＣＤ４４ｃＤＮＡ（エキ ソン５− １１）および以下のプライマー対を用いて行った。 BamHIプライマー （1）:5'-aaaaaaCGATTCccgctgccacttttgatgagcactagtgctac-3' ProAlaThrThrLeuMetSerThrSerAla.． エキソン５ エキソン６ HaeIIIプライマー （2）:5'-aaaaaaCGCCGGagccatttgtgttgttgtgtg-3' 約160-bpの長さのＰＣＲ生成物をBamHIおよびHaeIIIを用いて消化し、約150-b pの長さのBamHI/HaeIII-ＣＤ４４エキソン６フラグメントを寒天ゲル電気泳動に よって単離した。 ２回目のＰＣＲ反応では、塩基対の位置が539-672番目のＣＤ４４エキソン５ −６ＤＮＡ配列（図９参照：HIV2（gp32）-ＣＤ４４エキソン６融合遺伝子のＤ ＮＡ配列）を増幅し、テンプレートＤＮＡとしてサブクローニングされたＣＤ４ ４ｃＤＮＡエキソン５−１１を用いるとともに下記のプライマー対を使用して、 増幅されたＤＮＡ配列に対して適切な単一の制限ヌクレアーゼ開裂部位を与えた 。 HaeIIIプライマー （3）:5'-aaaaaaCCGGCCACCACTttgatgagcactagtgctac-3' ProAlaThrThrLeuMetSerThrSerAla.． エキソン５ エキソン６ HindIIIプライマー （4）:5'-aaaaaaAAGCTTTTATCAgccatttgtgttgttgtgtg-3' 約150-bpの長さのＰＣＲ生成物をHaeIIIおよびHindIIIによって消化し、約140 -bpの長さのBamHI/HaeIII-ＣＤ４４（エキソン６）のフラグメントを寒天ゲル電 気泳動によって単離した。 その後、最初のＰＣＲ反応から得られたBamHI/HaeII-ＣＤ４４エキソン６フラ グメントと２回目のＰＣＲ反応から得られたHaeIII/HindIII-ＣＤ４４エキソン を３つのフラグメントで結合することによって約3.8bpの長さのBgIII/HundIII-p DS56-6HIS-HIV2-gp32ベクターフラグメントとした。所望のプラスミドは、制限 マッピングによって同定され、ＰＣＲ合成ＤＮＡ領域は、ＤＮＡ配列（構造：pD S56-HIV2-ＣＤ４４エキソン６）によってチェックされた。大腸菌 におけるHIV2（gp32）-ＣＤ４４エキソン６抗原 の発現 大腸菌においてHIV2（gp32）-ＣＤ４４エキソン６抗原を発現するために、大 腸菌 Ｋ１２株RM82（メチオニン復帰突然変異体であるEX8654、Murry、N.E．et a l ．（1977）Mol．Gen．Genet．150: 53-61）を、HIV（gp32）-ＣＤ４４エキソン ６発現プラスミドpDS56-HIV2-ＣＤ４４エキソン６（耐性アンピシリン）およびI acIリプレッサープラスミドpUHA1（耐性カナマイシン）を用いて形質転換した。 プラスミドｐＵＨＡ１の生成および分類記載はStuber，D．et al．（1990） 45 Immunol.Methods IV: 121-152に記載されている。 RM82/pUHA1/pDS56-HIV2-CD44エキソン６細胞をＤＹＴ媒体（1％（w/v）酵母エ キス、１％（w/v）Bacto Tryptone、Difco、0.5％塩化ナトリウム）内で、50mg/ lのアンピリシンおよび50mg/lのカナマイシンを用いて、550nmにおいて光密度が 0.6-0.9になるまで培養し、IPTG（最終濃度1-5mmol/l）を用いて誘導した。4-8 時間の誘導期の後、細胞を遠心分離によって収集し、pH6.8、10mmol/lの燐酸緩 衝液で洗浄し、さらに処理を行うまで−２０℃で保管した。 1mlの培地から得られた細胞ペレット（RM82/pUHA2/pDS56-HIV-ＣＤ４４エキソ ン６細胞）を0.25ml,10mmol/l、pH6.8の燐酸緩衝液と1mmol/l EDTAに含めて再度 懸濁し、細胞をフレンチプレスによって機械的に溶菌した。遠心分離後、1/5容 量の5×SDS試料緩衝液：pH6.8、50mmol/lのトリス-塩酸、1％SDS、1％メルカプ トエタノール、10％グリセロールおよび0.001％ブロモフェノールブルー）を上 澄みに添加した。不溶性細胞破片分画を0.3mlの1×SDS試料緩衝液中で6-8M尿素 を用いて 再懸濁した。次に、試料を5分間95℃でインキュベートし、遠心分離を行った。 その後、タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって分 離して（Laemmli，U.K.（1070）Nature227: 680-685）、クーマシーブリリアン トブルーＲ色素を用いて染色した。 大腸菌で合成されたHIV（gp32）-CD44エキソン６抗原（図１０）は均質であり 、不溶性細胞分画にのみ観察される。HIV2（gp32）-ＣＤ４４エキソン６抗原に 関する発現レベルは、大腸菌の総タンパク質に対して30-50％であった。大腸菌 由来のHIV2（gp32）-ＣＤ４４エキソン６抗原の 調製 封入体（ＩＢ）の細胞溶菌および調製。 20g（生重量）のRM82/pUHA1/pDS56-HIV2-ＣＤ４４エキソン６細胞をpH7.0、10 0m10.1mol/lのトリス-塩酸で0℃で再懸濁した。30mgのリゾチームを添加し、混 合物を20分間0℃でインキュベートした。次に、細胞を機械的高圧分散によって 完全に溶菌し、ＤＮＡを2mmol/lの塩化マグネシウムおよび1mgのデオキシリボヌ クレアーゼを添加することによって30分25℃で消化した（Boehringer Mannheim ，Germany，Cat.No.154709）。次に、50m,160mmolのEDTA、6％のトリトンX100と 、1.5mmol/lの塩化ナトリウムをpH7.0で消化溶液に添加し、この混合物をさらに 30分間0℃でインキュベートした。不溶性成分（細胞破片およびＩＢ）をSorvall 遠心分離器にかけて遠心分離した。ペレットを100ml0.1molの燐酸緩衝液内でpH8 .5で再懸し、25℃30分間インキュベートし、ＩＢ生成物を遠心分離によって単離 した。 金属キレートクロマトグラフィーを用いるHIV（gp32）-ＣＤ４４エキソン６抗原 の精製 2.5gのＩＢペレット（生重量）を、25℃2時間かくはんすることによって、25m l6mol/lのグアニジン-塩酸、0.1mol/lの燐酸緩衝液、pH8.5に懸濁した。不溶性 成分は、遠心分離によって分離され、透明な上澄みが6mol/lのグアニジン-HCl、 0.1mmol/l燐酸緩衝液、pH8.5によって平衡化されたNTAカラムに適用された（カ ラム容量：50ml,ドイツ国のDiagen Company製のNTAゲル；Hochuli，E．et al.（ 1988）. Bio/Technology 6: 1321-1325）。 カラムは、約5カラム容量の8mol/l尿、10mmol/lトリス-塩酸、0.01mmo/lの燐 酸緩衝液、pH8.5で洗浄した。その後で、HIV2（gp32）-ＣＤ４４エキソン６抗原 を8mol/lの尿と0.01mol/lの燐酸緩衝液、pH4.0で溶出し、HIV2（gp32）-CD44エ キソン６抗原含有分画をプールした。 大腸菌におけるHIV2（gp32）-担体抗原の 発現および単離 HIV2（gp32）-ＣＤ４４エキソン６抗原と同様に、HIV（gp）32抗原をプラスミ ドpDS56-6HIS-HIV2-gp32を用いて生成した。 HIV2（gp32）-ＣＤ３４エキソン６抗原のビオチン化 ビオチン化は、ビオチニル-＊-アミノカルン酸-N-ヒドロキシ-スクシンイミド （Bi-X-NHS）（Boehringer Mannheim，Germany Cat．No．1003933）を用いて1:3 、1:6、1:10のモル比で行った。8Mの尿、0.1M燐酸ナトリウム緩衝液、10mMトリ ス中に約pH６で7.1mg/mlの濃度で存在している融合タンパク質ＨＩＶ２（gp32） -ＣＤ４４エキソン６を透析緩衝液（0.1M燐酸ナトリウム緩衝液、0.5％ＳＤＳ、 10mMDTT、pH8.5）で希釈し、上述の緩衝液に対して室温で透析し、さらに1mg/ml に希釈した。適切な量のBi-X-NHSを融合タンパク質に添加し、約２時間室温でイ ンキュベートし、反応を1Mリシン/HCL、pH6.5を2mMに添加することによって停止 させた。0.1Mナトリウムの燐酸緩衝液、0.5%のSDS、pH6.0に対して透析した後、 試薬ＨＩＶ２（gp32）-ＣＤ４４エキソン6-Biを−２０℃で保管した。 ペプチドＨＩＶ２（gP32）も同様にビオチン化された。 参考文献 例９ マウスの免疫化 マウスの免疫化を、Cianfriglia et al．（1983）．Hybridoma，Vol.2，No.4: 451-457.に従って行った。免疫源として担体タンパク質（例７参照）に結合さ せたアミノ酸1-13、9-23、19-33、29-43および1-43に対応する合成ペプ チドとHIV2（gp32）-ＣＤ４４エキソン６抗原を使用した。 生後12週のBalb/cマウスを完全フロイントアジュバントに含めて50μg免疫原 によって、融合の15日、８日前に腹膜内注射によって免疫化した。融合3日前に 、マウスをＰＢＳ緩衝液に含めて200μgによって腹膜内注射によって免疫化し、 融合2日前と融合前最終日にマウスを腹膜内注射および静脈注射によって100μ免 疫原をＰＢＳに含めて免疫化した。 融合およびクローニング 脾臓細胞懸濁液の製造 マウスを頚部脱臼させて死亡させて、その脾臓を無菌条件下で除去した。脾細 胞をRPMI1640基礎培地内の結合組織から取りだした。細胞懸濁液をシーブに通し て、RPMI基礎培地の200g（遠心分離管）で遠心分離した。 融合 免疫化マウス由来脾細胞を1+5の比率でP3×63Ag8-653骨髄腫細胞（ATCC CRL 8 375）に混合し、遠心分離した（10分、300g、4℃）。細胞を再びRPMI基礎培地で 洗浄し、400gで遠心分離した。上澄みをデカントし、1mlPEG（Mr4000、Merck） を添加し、ピペット分注によって混合した。水浴1分後、5mlRPMI1640基礎培地を 室温で5-6分にわたって滴下し、混合物と培地（RPMI1640+10%FCS）を併せて50ml にした。この後、これを10分間400g4℃で遠心分離した。沈降細胞をRPMI1640培 地+10%ＦＣＳに添加し、96ウェル培養プレートにウェルあたり2.5×104脾細胞を 200μl選択培地（100μMヒポキサンチン、1μg/mlアザセリンをRPMI1640+10％FC Sに含有）に含めて接種した。［FCS=ウシ胎血清］ 10日後、これらの一次培養について特異抗体合成に関してテストした。適切な 特異性を有する培養をＦＡＣＳ（細胞選別器）を用いて96培養プレート内でクロ ーニングした。増殖因子として、インターロイキン６（Boehringer Mannheim Ca t．No.1271172，100U/ml）を培地に添加した。 このようにし、以下のハイブリドーマ細胞系統を単離した。それらは、Brauns chweig内のDMS設備で析出された。 MAK〈CD44〉M-1.1.12 MAK〈CD44〉-2.42.3 MAK〈CD44〉-4.3.16 図７に示すアミノ酸配列を有するCD44エキソン６のうち、MAK〈CD44〉M-1.1.1 2に対してはアミノ酸9-23に対応する合成ペプチド、MAK〈CD44〉-2.42.3に対し てはアミノ酸29-43を、MAK〈CD44〉-4.3.16に対してはアミノ酸1-13が使用され た。 抗体の生成 腹水からの抗体取得 5×106のハイブリッド細胞を0.5mlのPristanで前処置した２匹のマウスに腹膜 内注射した。1-3週間後、IgG濃度が5-20mgの腹水が得られた。この腹水から抗体 が通常の方法で単離された。 細胞培養上澄みからの抗体の取得 サイブリドーマ細胞をTechne生物学的かくはん機（THERMO-DUX，Wertheim/Mai n，Model MCS-104XL，Cat．No.144-050）によってRPMI1640+10％FCSに含めて1× 105細胞／ｍｌの接種濃度で7日間操作した。培養上澄みの平均濃度は、100μgMA B/mlだった。精製は、標準タンパク質化学法を用いて精製を行った。 例10 生成された抗体特異性の 評価 合成ＣＤ４４ペプチドに対する抗体 ハイブリドーマ細胞培養上澄みの抗体特異性を実証するために、部分的ペプチ ドおよび完全なエキソン６に対する反応性を、阻害テストによって並行して測定 した。96ウェルタイタープレート（Nunc）を200μl/ウェルのストレプタビジン ［10μg、コーティング緩衝剤＝0.2mol/l炭酸/重炭酸ナトリウム］でコーティン グした。ストレプタビジンによるコーティング後、1-13ビオチン、9-23ビオチン 、29-43ビオチン、などのビオチン化ペプチド、ｃ＝2.5μg/mlをインキュベーシ ョン緩衝剤［燐酸ナトリウム緩衝剤、40mM、0.5％Crotein C、100μl/ウェル、1 時間のインキュベーション、室温］に結合させた。自由結合部位を遮断緩衝剤［ 0.9％塩化ナトリウム、1%Crotein C、200μl、30分、室温］で飽和した。 遊離ペプチドエキソン６（1-43）NH2、ｃ＝5μg/mlを用いた試験と用いない試 験に供すべき抗体溶液を添加し、1時間インキュベートした。さらに1回洗浄［0. 9%塩化ナトリウム、0.05%Tween］した後、ヒツジ由来のポリクローナル抗体から マウスκおよびマウスλ［BM、マウスIg測定キット、瓶２および瓶６］に100μl のＰＯＤ標識付けしたFabフラグメントを添加した。これを１時間室温でインキ ュベートした。さらに洗浄した後、着色物質100μl［ABTS、BM:#811769、#68735 9］を30分間室温でインキュベートした。450/490nmにおける吸光度をDynatech M R 700マイクロプレートリーダで測定した。 後に、付着細胞系陽性の抗体すべてをドットブロットおよび免疫組織学的方法 によってスクリーニングした。 組換ＣＤ４４（融合タンパク質）に対する抗体 抗原としての組換ＣＤ４４を有する融合物由来の抗原体特異性を測定するには 、さらに別のスクリーニングテストを行う。抗体試料について、融合タンパク質 との反応性と、平行ELISA検定におけるHIV-gp32との架橋反応を調べるためのテ ストを行った。ストレプタビジンでコートしたマイクロタイタープレート（セク ション１参照）をビオチン化融合タンパク質HIV2（gp32）-ＣＤ４エキソン6-Bi （XOSU）またはHIV2（gp32）-Bi（XOSU）［C=5μg/ml、100μl/ウェル、１時間 室温］を用いてインキュベートした。自由結合部位を遮断緩衝剤［0.9%塩化ナト リウム、1%Croteiｎ C、200μl、30分室温］で遮断した。洗浄ステップ［0.9%塩 化ナトリウム、0.05%Tween］後、ウェルあたり100μ、抗体試料c=5-10μg/mlを インキュベーション緩衝剤（40mMの燐酸ナトリウム緩衝剤）で希釈して、1時間 室温インキュベーショ ンした。以下のステップをペプチド合成に関して上述の例のように行った。 組換ＣＤ４４に対して強い反応をし、HIV2（gp32）タンパク質に対して弱い架 橋反応をする一次培養が得られた。このような培養はドットブロットおよび免疫 組織学的方法によってさらに評価した。 細胞および組織に対する抗体特異性の測定 （免疫染色） 方法Ａ：腫瘍細胞系（ZR-75 1またはMDA 4A4）をフラスコから削って取り出し 、細胞懸濁液をガラススライドに滴下し、乾燥し、メタノールで固定した。 方法Ｂ：腫瘍および正常組織の凍結乾燥部分をアセトンで固定した。 5％スキムミルク-TBSによって37℃60分で遮断し、2分間TBSで洗浄し、試料（ 希釈していない細胞培養上澄み）を120分間37℃で抗体を用いてインキュベート した。慎重にTBS X3で洗浄した後、さらにインキュベーションをビオチン化抗マ ウスIg（Dakopatts）を用いて60分間37℃で行った。さらに洗浄した後（TBS）、 HRPOアビジン-ビオチン錯体（Dakopatts）を添加し、室温で60分間試料を用いて インキュベートした。TBS X1で洗浄した後、1%グルタルアルデヒド溶液を１分間 室温で添加した。さらに洗浄ステップ後、基剤（ＤＡＢ）を添加し試料を用いて インキュベートした（15-20分）。水道水で洗浄後、核をヘマトキシリンで30分 間染色した。試料を乾燥させ、Cristal Mountに埋封した（Kaiserゼリー）。 細胞系MAB〈CD44〉M-1.1.12および4.3.16由来のモノクローナル抗体を用いて 得られた結果を表４に示した。方法Ｂでは、MAB〈CD44〉1.1.12は、肺、結腸お よび膀胱由来の腫瘍組織に対して高い特異性を示し、MAB〈4.3.16〉は結腸由来 の腫瘍組織に対して特異性を示した。方法Ａは、MAB1.1.12およびMAB4.3.16は、 細胞系MDA4A4（エキソン６低生成物）に比べ、細胞系統ZR-75-1（エキソン６高 生成物）、ヒト乳癌細胞系（ATCC CRL 1500）に対する反応は高かった。この細 胞系は、細胞系MDA-MB-435Sのサブクローンである（腺管癌、膀胱、ヒト；ATCCH TB 129；サブクローンは、Bao et al，Differentiaion 52（1993），239-246; M DA4A4は本文の参考 のMDA-MB-435-C2に一致する）。 組換生成ＣＤ４４融合タンパク質を免疫原として得られた一次培養内で（上述 参照）、培養PK 9.00.22は、方法Ｂを用いた場合に結腸腫瘍組織に高い特異性を 示した。方法Ａを用いた場合、この培養細胞系も細胞系ZR75-1に対して顕著な特 性を示した。 ドットブロットによる生成抗体の 特異性測定 細胞抽出物の調製 細胞系HT29（ATCCHTB 38-結腸腺癌）およびMDA4A4をＡＴＣＣカタログに従っ て培地を培養し、プロテアーゼ付加物を選択的に収集した。 プロテアーゼ付加物を用いずに収集した細胞を遠心分離し、２倍の体積の溶菌 緩衝剤（50mM燐酸カリウム緩衝剤、150mM塩化ナトリウム、pH8.0）に添加し、Do unceホモジナイザーに含めてホモジナイズし、タンパク質の量を測定した。この タンパク質値に基づいて、デタージェント［1%トリトンX-100（Boehringer Mann heim，Germany Cat．No．743119）、0.6％ＣＨＡＰＳ（Boehringer Mannheim，G erm any Cat．No．810681）、1%HECAMEG（Boehringer Mannheim，Germany Cat．No． 1382225）、0.9%オクチルグルコシド（Boehringer Mannheim，Germany Cat．No ．411469）または0.05%ドデシルマルトシド（Boehringer Mannheim，Germany Ca t．No．808342）］を選択的に用いて細胞懸濁液を用いて、タンパク質の濃度を1 -2mg/mlに調整し、2時間かくはんした。遠心分離後、ＣＤ４４またはＣＤ４４ｖ を4℃または-20℃で保管し、使用法は変更しなかった。膜を遠心分離した後得ら れた上澄みは、ＣＤ４４（標準型）とＣＤ４４ｖ（別のエキソンを含むＣＤ４４ ）を抗体評価たるために十分含んでいた。細胞のｍＲＮＡ濃度のために、MDA4A4 は、ＣＤ４４標準型を多く含み、エキソン６含有のエキソンＣＤ４４ｖHT29細胞 のいずれもほとんど含まないことが仮定される一方、多くのエキソン６含有ＣＤ ４４ｖを含むことが望ましい。 ＣＤ４４またはＣＤ４４ｖを得ることができる別の単純な方法は、その後に細 胞分離を行い上述の細胞を収集する代わりにトリプシンで細胞を収集することで ある。トリプシン阻害剤を添加し、細胞から遠心分離した後に得られた上澄みも 、ＣＤ４４およびＣＤ４４ｖを抗体評価するために含む。 ドットブロットによる抗体評価 さまざまな溶液（例７に従って図７に示されるアミノ酸配列1-43合成生成ＣＤ ４４エキソン６ペプチド、HT29細胞抽出物、MDA4A4細胞抽出物）は、毛管によっ てニトロセルロースに利用した。Crotein Cによる遮断後、抗体（ＡＢ）を用い たニトロセルロースのインキュベーションを行った。抗体と同様に、様々なMAB 〈CD44〉-M細胞系の上澄みを使用した。結合Abの検出は、アルカリ性ホスフェー トに接合されたポリクローナル抗Ig抗体を用い行われた。結腸反応には、NBT/X ホスフェートを使用した。 反応特異性は、ニトロセルロースのインキュベシーション前に遊離ペプチドを Abに添加することによって示される。反応がエキソン６またはＣＤ４４ｖに特異 的である場合、遊離ペプチドを添加した後にニトロセルロースにＡＢは結合しな いか、非常にわずかにしか結合しない。以下のクローンを用いた結果が最高のも のであった。 MAB〈CD44〉M-1.1.12 MAB〈CD44〉M-2.42.3 以下の化合物は、ニトロセルロース（Schleriher & Schuell 401180）に毛管 を用いてスポットした。 Ａ：合成生成ＣＤエキソン６、1-43-NH2、（0.1mg/ml） Ｂ：HT29抽出物（1.2mg/ml） Ｃ：MDA4A4抽出物（1.35mg/ml） インキュベーション緩衝剤（20mMトリス/HCL、150mMNaCl、1%Crotein C、pH7. 4）を用いてニトロセルロースを遮断した後、各場合に２または３滴の１ブロッ トが、（各ケースについてインキュベーション緩衝剤中希釈または未希釈の1:4 、1:16、1:64、1:256および1:1024の）細胞培養上澄みを用いてインキュベート された。結合抗体は、PAB〈M-Ig〉S-Fab-Apおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インド リル-ホスフェート/4-ニトロブルー-テトラゾリウムクロリド（NBT/Xホスフェー ト）を色素基剤として検出された。 AB特異性をテストするために、遊離エキソン６、1-43ペプチドの10fg/mlの一 つについて抗体のプレインキュベションを行い、テストを二度並行して行った。 阻害は、エキソン６特異反応について観察されることが望ましい。 細胞系MAK〈CD44〉M-1.1.12およびMAK〈CD44〉M-2.42.3によって生成された抗 体は、ドットされたＣＤ４４エキソン６ペプチドおよびHT29細胞の抽出物に結合 することができるが、MDA4A4細胞に結合することはできない。モノクローナル抗 体をドット済みのＣＤ４４エキソン６ペプチドとHT29細胞の抽出物することは、 両方の抗体を合成ＣＤ４４エキソン６によってプレインキュベーションすること によってニトロセルロースに抗原が結合することが阻害されるので、ＣＤ４４ｖ の腫瘍特異変異型に特異的である。（表５） Detailed Description of the Invention A peptide corresponding to CD44 exon 6, an antibody specific for the peptide, and , How to use those antibodies for tumor diagnosisbackground   The present invention uses the expression of the CD44 gene or a portion of the CD44 gene to Regarding inspecting formation. Such tests include body tissue, fluids, and other tests. Fees are collected from patients, diagnosed, prognosis is established, and therapies already in use are evaluated. Including doing. In particular, the present invention provides a body fluid that can be obtained without causing pain to the patient. Routine screening for tumor formation using samples or other samples To provide a simple method.   Currently, the usual method of diagnosing a tumor is to look at cells or tissue slices under a microscope. Are often very effective, but have some significant limitations. There is. If the sample is small, the diagnosis becomes very difficult and many cells are available. However, obtaining large samples from patients is undesirable or impossible. Or It is not possible to make a reliable diagnosis. Clearly there is no evidence of cancer or if the patient is not convinced that it is not. There is a match. To make a definite diagnosis method, a test that is painful to the patient is required. is there.   The determination of prognosis depends on the appearance of cells when viewed under a microscope. In general, The more unusual the cells of the primary tumor, the greater the chance of metastasis, but the correlation is uncertain. Is not perfect. Metastasis occurs to determine what is the most effective treatment It will be clear that it is effective to be able to accurately predict whether or not there is a possibility.   The human CD44 gene is a glycosylated cell surface protein of various sizes. CD44 encodes quality and many of their functions are not yet fully established. An epitope recognized by the presence of a monoclonal antibody (mAb) Have. Human CD44 gene is expressed in hematopoietic cells and many other cell types It consists of standard parts into which the products of further exons are combined in various ways. Known to be spliced to produce various proteins . This is a clearly recognized mechanism in nuclear organisms and is functionally related. It is for producing multiple proteins from the same gene that are often unrelated, Known as alternative splicing.   To date, the two most widely known isoforms of CD44 are: A 90kD form consisting of a silylated central core of 37kD and ii) inserted into the proximal transmembrane domain A 180 kD form that has an additional 135 amino acids and is heavily glycosylated. And characterized (Stamenkovicet al. 1989). Immunocytochemical test and Immunoprecipitation tests have shown a wide range of 90kD and 180kD types in a wide variety of cells and tissues It is known to be distributed in. 90kD type is for circulating white blood cells, bone marrow cells and others It is known as a hematopoietic or standard type that is present in many cell types. 180kD type Is known as an epithelial variant and can be detected in multiple epithelial cell types. Wear. Both isoforms are receptors that mediate homotypic and heterotypic adhesive interactions. Thought to function as the body and adhere cells to each other or to adjacent extracellular scaffolds Can be   CD4 previously recognized by the presence of certain Hermes-3 monoclonal antibodies Four epitopes allow circulating leukocytes to recognize and pass through surrounding lymph nodes Was identified as a component of peripheral lymph node receptors. Moreover, this anti- Monoclonal antibodies against Hara are now available, Stamenkovicet al.( 1989) used one of them to extract a standard from a COS cell expression library. The cDNA encoding the subtype molecule was cloned. They are the Northern By the lot method, this gene can be used not only in lymphoid cells but also in various cancer cell lines and It is also expressed by typical solid carcinomas, of which two clonal carcinomas are normal It appeared to be more abundant than in the Lone epithelium.   Birchet al.80-9 is recognized by the Hermes-3 antibody in nude mice A melanoma cell clone that strongly expresses the 0kD-type CD44 antigen is the CD44 antigen. It was reported that it was considerably more metastatic than the clone expressing weakly (1991). Sye tal. Metastatic capacity of human lymphoma cells in nude mice Human lymphoma cells, but not after being transfected by the Is gently elevated after being transfected with the canonical CD44 gene. When (1991). Gunthertet al.Is a new model stimulated by rat CD44 antigen. Variant of the lymphoma homing receptor recognized by various antibodies is associated with rat pancreatic adenocarcinoma cells We obtained the results that suggest that the larva is necessary for metastatic behavior (1991). This antibody They cloned the cDNA sequence corresponding to the variant form of CD44 using And was found to contain exons that were not previously identified. Unique to metastatic cell lines Derived from the same cell line by a construct designed to overexpress the cDNA sequence of Transfection of a non-metastatic clone of Escherichia coli may induce metastatic behavior (Gunthertet al., 1991).   Due to the above findings, other cultured metastatics derived from various tissue sources Human tumor cells and non-metastatic human tumor cell lines specifically develop CD44 products. Made it appear. Expression of a gene in a cell or tissue corresponds to the gene product c A specific oligonucleotide selected for preferential annealing to the DNA portion. CDNA is generated from cell messenger RNA using the otide primer. By extending the region by the polymerase chain reaction, maximum efficiency and sensitivity can be obtained. Can be researched by acceptability. However, Hofmann using this methodet al.and In a later study by the Applicant, CD44 expression was found to increase the metastatic potential of nude mice. Or even the tumorigenic potential of the cell culture systems mentioned above is consistently and consistently correlated. I got the result that it does not. Around this time, three groups (Hofmannet al. , 1991; Stamenkovicet al., 1991; Jacksonet al., 1992) that they Another splice found to be expressed by this gene in human cell lines Published sequence data for S variants.The present invention   The present invention is directed to fresh tissue samples taken from breast and colon cancer patients and their metastases. To investigate the expression of various parts of the CD44 gene in food and fresh body fluid samples Based on the surprising findings resulting from the test results. The test results show the expression of CD44 i) metastatic (malignant) tumors, ii) non-metastatic locally invasive and benign tumors, iii) positive It was shown that there are obvious differences between the normal tissues. Group i) and group i The difference in i) is important for determining the suitability of therapy, and the difference between group ii) and group iii) Difference is early Is important for diagnosis and screening.   A portion of the invention is part of the inventors' international patent application PCT / GB filed July 20, 1993. The object of 93/01520 is to provide a method for diagnosing tumor formation as one embodiment, The method consists of analysis of CD44 gene expression in the sample.   In a further embodiment, the above-mentioned application is directed to the CD44 gene or a part thereof. Providing a method of assaying a sample for a product consisting of From the messenger RNA (mRNA) in the sample, Amplifies a complementary DNA (cDNA) part corresponding to a part of the amplified c It consists of the detection of DNA and is characterized by the use of the amplified cDNA in the diagnosis of tumorigenesis. To collect.   The diagnosis of tumor formation is nothing but the initial detection of tumor tissue. It can be said that this is the step of distinguishing a tumor from a metastatic tumor and a non-metastatic tumor. Therefore, it is used in this application. One can understand the term "diagnosis" used.   This method is particularly useful for diagnosing solid tumors, particularly malignant tumors such as cancer. it can. The sample on which the assay is performed is body tissue or fluid,in vitroCultured cells Preferably not. Samples are small pieces of tissue or cells taken from a solid tumor A fine needle-shaped aspirate (FNA) may be used. Alternatively, from blood, urine or other body fluids Sample or a trial obtained without causing patient pain such as cervical curettage, sputum, urine or stool. Fees are fine.   cDNA uses one or more labeled specific oligonucleotide probes. Detected by the use of this probe, the probe being the amplified cDNA sequence. Selected to anneal to a portion of. Alternatively, labeled ori Using gonucleotide nucleotides and / or mononucleotides You can also There are many suitable detectable labels that can be used, such as radioactive labels.   Next, the attached drawings will be described.   1 to 5 are autoradiographs showing various experimental results reported below. It's rough.   FIG. 6 is a map of the CD44 gene showing exons, probes and primers. Is. Exon number is GR, Screatonet al.It matches the one attached.   FIG. 7 shows the nucleic acid sequence of exon 6 shown in FIG. 6 and the corresponding amino acid sequence. It is a figure which shows a row.   FIG. 8 is a series of autoradiographs showing the results of another experiment.   FIG. 9 is a diagram showing the DNA sequence of the HIV2 (gp32) -CD44 exon 6 fusion gene. Is.   FIG. 10 shows the protein sequence of HIV2 (gp32) -CD44 exon 6 fusion antigen. It is a figure.   FIG. 6 is a map of the CD44 gene showing exons 6-14. Theoretically , The basic or standard proteins are these nine special exons Can be modified by insertion of transcripts derived from any one, more or all of You can Exon 6 was unknown on the priority date of this patent application, It constitutes such another aspect. Exon 6 is overexpressed in tumors However, it is not expressed in normal tissues and is located near exons 7-9. Exhaust The sequence of Son 6 is shown in FIG. This sequence contains 129 base pairs and is a standard The CD44 sequence is 5'to this sequence and exon 7 is always 3 '.   In contrast to exons 9-11, the product consisting of exon 6 (newly sequenced Exons) are almost undetectable in normal tissue samples. This is exon 6 suggests incomparable value in the diagnosis of tumorigenesis.   In another aspect, the present invention provides a novel compound, exon 6 as shown in FIG. Nucleic acid sequence, its signature fragment, degenerate sequence and allelic variation. Sequence or one of the two, homologous nucleic acid sequences, probes, primers and their sequences. Provides other reagents that can hybridize with rows and homologs To do. All of these compounds and reagents should also be useful in the methods described above. U   According to the present invention, a peptid corresponding to CD44 exon 6 as shown in FIG. Sequence, allelic variation, its secondary modification, its signature fragment,  Antibodies useful for in vitro and in vivo diagnostics can be generated. The above antibody is , CD44 exon 6 shown in FIG. 7, allelic variants, secondary modifications and Is specific for the peptide corresponding to its signature fragment, ie What Antibodies bind to this peptide and are associated with other related CD44 proteins and other proteins. The feeling of communication with the quality of the material is low. The above antibodies are either monoclonal or poly It is a lonal antibody. This antibody corresponds to the CD44 antibody shown in FIG. 7 as a single antigen. By using the complete peptide sequence corresponding to exon 6 As an antigen, preferably a portion of the peptide sequence corresponding to CD44 exon 6 is It is possible to use a short peptide consisting of 6 amino acids, which is the smallest length to be encoded. It can be generated by and. Peptides used as antigens are well known to those skilled in the art. Can be produced recombinantly or chemically by methods known in. For example, the peptide antigen according to the present invention is described in Merryfield, JACS 85 (1964), 2146. Therefore, it can be synthesized. For immunogen synthesis, these peptides are the key Lurinpet hemocyanin (KLH) or bovine serum albumin (BSA), etc. Can be attached to the carrier molecule. If biotinylation is required, this is PNAS U It can be carried out according to SA 80 (1983), 4045, etc.   A peptide corresponding to CD44 exon 6 or its allelic form was produced in a prokaryotic host. For expression, the fusion gene of CD44 exon 6 or expression level in prokaryotic host It is preferable to prepare an allelic variant having a high bell gene. For example, HI A portion of the gene encoding the V2 protein gp32 is suitable for E. coli. is there. As a result, peptide distribution according to exon 6 or its allelic variation A fusion protein is obtained which has a row as a part. Fusion gene CD44 exo For example, by duplicating the gene It is also preferable to increase the number of corresponding peptide epitopes.   CD44 exon 6, its allelic variants, its secondary modifications, and fragrance markers Polyclonal antibody against the peptide sequence corresponding to An effective amount of peptide or antigen component is injected, serum is collected from the animal, and Prepared by isolating specific antigens by known specific antibody adsorbent technology . Polyclonal antibodies produced by this method can be used in any immunoassay. Can be used, but it is generally less preferable because it may cause heterogeneity. There is no.   in vitroThe use of monoclonal antibodies in diagnostic tests should Are particularly preferred because they can be produced with the same specificity. mono Preparation of hybridoma cell line for clonal antibody production This is done by fusing the system with antibody-producing lymphocytes. This is Known techniques known in the art (Harlow, E. and Lane, D., Antibodie s: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press 1988, Bessler et al. I mmnobiol. 170 (1985), 239-244, Jung et al., Angew. Chimie 97 (1985), 8 83, Cianfriglia et al, Hybridoma Vol.2, (1983), 451-457, etc. When).   The CD44 exon 6 expression product shown in FIG. The following hybridomas, which are monoclonal antibodies produced against The cell line is DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen  GmbH, Mascheroder Weg lb, D-3300 Braunschweig, Federal Republic of Germ Deposited on 16 November 1993 under the Budapest Treaty on any.         MAK <CD44> M-1.1.12         MAK <CD44> M-2.42.3         MAK <CD44> M-4.3.16   For MAK <CD44> M-1.1.12, a synthetic peptide corresponding to amino acids 9-23 was For AK <CD44> M-2.42.3, a synthetic peptide corresponding to amino acids 29-43 For CD44> M-4.3.16, CD44 exon 6 having the amino acid sequence shown in FIG. A synthetic peptide corresponding to amino acids 1-13 of was used. Cell line MAK <CD44> M-1.1.1 Antibodies produced by 2 are used in lung, colon, bladder and immunohistochemistry Therefore, it is specific to the cells of the detected cell line ZR75-1 (human breast cancer type --ATCC CRL 1500). Shows sex. Expressed as a specific reaction, a strong reaction is observed using tumor tissue. However, normal tissue shows only weak reaction. In the same line, MAK <CD44> M-4.3.16 produced antibodies to colon tumor tissue and ZR75-1 cells Shows specificity.   CD44 protein or peptide conforming to CD44 exon 6 in sample The presence of a sequence is essentially monoclonal or poly Clonal can be detected using any of the antibodies prepared above. it can. Harlow, a variety of immunoassay techniqueset al.References (Antibodies: A  Used as seen in Laboratory Mamual, Cold Spring Harbor Press 1988) it can. This includes, of course, the non-competitive types of single-point, two-point, and Itch method and competitive binding assay. The sandwich method is the most Is also a useful and commonly used assay method. There are numerous sandwich variants Exist and are all intended to be included by the present invention. Inspection of the above Specific examples include radioimmunoassays, enzyme immunoassays, FPIA and Immunofluorescence assay such as Lectrochemiluminescence, dye particles such as gold sol particles Immunoassay using any direct label, homogeneous assay such as CEDIA or MIT, There are turbidity measuring methods such as latex particle agglutination assay and nephelometric measuring methods. sandwich In the method, two antibodies according to the invention can be used. In this case, these two Antibody of different peptide epitopes depending on CD44 exon 6 or Must bind to a site. These two antibodies are, for example, two different antibodies. Different peptide fragments of the peptide corresponding to CD44 exon 6 Could be prepared by using as an immunogen corresponding to. Sun In the Deutsch method, it is possible to use only one antibody according to the present invention. Another Antibody of another peptide corresponding to another CD44 exon or a standard of CD44 It may be an antibody against another peptide corresponding to the type. Such antibodies are conventional It is known to be in technology.   For example, urine, whole blood, cervical smear, stool, biopsy tissue as a sample, sputum Cells or the like can be used. Often, the CD44 protein is in its native form It can be detected in the state. Preferably the CD44 protein according to the invention The antibody has a linear epitope or its natural form hidden in the CD44 molecule. Some epitopes may preferentially bind to existing epitopes, so denature them before or during detection. Preferably. Detergent or chaotropic agent Methods known to those of skill in the art are suitable, such as treatment with. CD in some cases Adsorption of 44 molecules to the solid phase results in partial denaturation sufficient for antibody binding. Koru   The CD44 protein is expressed in most cell types, but according to the present invention When using antibodies, it is often possible to distinguish between tumor and normal tissue Was recognized. Therefore, this antibody can be used for cancer diagnosis. Antibody It is preferably used for cancer diagnosis of intestinal tissue, bladder tissue or lung tissue. For example, Strong when using antibodies obtained from the ibridoma cell line MAK <CD44> M-1.1.12 Reaction observed by immunohistochemical method using colon cancer tissue, bladder cancer tissue, lung cancer tissue However, in contrast to this, normal cell tissues taken from the above-mentioned site slightly responded. Just do.   Antibodies according to the present invention are described in Wong et al, Arch. Surg. According to 125 (1990), 187-191 It can also be used for immune complex analysis such as the method described above. For this reason, CD44 tongue It is possible to detect tumor-associated immune complexes of protein or its signature and autoantibodies. is there.   The peptide antigen according to the present invention is standardized in an immunoassay for the CD44 assay. It can also be used as a thing. Therefore, the present invention further relates to the pep Use of the Tide Antigen as a Reference in an Immunoassay for Quantifying CD44 And about. In some cases, in the agglutination test, etc. It is convenient to attach multiple peptides to a carrier molecule. According to the present invention Ptide is used as a binding partner for the antibody of the present invention in a competitive immunoassay. It can also be used. In this case the peptide is labeled and known to those skilled in the art. Direct or indirect (strept) avidin / biotin etc. depending on the method. It is bound to the solid phase via a heterologous binding partner.   Another aspect of the invention is the use of buffers, detergents, stabilizers, solid phases, etc. It has the amino acid sequence shown in Figure 7, among other compounds required for epidemics. CD44 exon 6, its allelic variants, its secondary modifications, its signature flag A peptide containing at least one antibody intended to counter the peptide corresponding to It is a stock kit. If necessary, the peptide antigen according to the present invention is included as a standard. You can also.   In yet another aspect, the present invention provides a means for tumor therapy and in vivo imaging. I will provide a. Drugs useful for this means can be manufactured according to the state of the art . To investigate the expression of various parts of the CD44 gene in samples obtained from patients with malignant disease Surprisingly, the data obtained from the test showed that exon 6 of the variable part of CD44 It is shown to be overexpressed. Exons for malignant tumors compared to normal tissues 6 Of CD44 splice variants containing the CD4 containing a peptide sequence encoded by exon 6 on the surface of ulcer cells By increasing the 4 protein, treatment, in vivo diagnosis, in vitro diagnosis, in Peptide encoded by exon 6 as tumor-specific antigen for in vivo imaging Open the way to use arrays.   Preferably, a monoclonal antibody (Kohler and Milstein (1975), Nature 15 6,495-497) or its derivatives for diagnostic or therapeutic purposes. In the present invention , Monochrome against the epitope encoded by exon 6 of CD44 Internal antibodies are provided. Furthermore, these antibodies selectively bind to tumor cells Data indicating that is presented.   The antibody according to the present invention comprises CD44 exon 6 having the amino acid sequence shown in FIG. Its allelic variation, phosphorylation product, glycosylation product and its signature flag Recognize the peptide corresponding to the ment. Such antibodies can be used for other CD44 Even in the presence of other peptides corresponding to exons, CD44 exon 6 Specific for the corresponding peptide. For therapeutic purposes, this specificity is The body is not restricted to proteins other than the protein encoded by exon 6 It is decisive because it only binds. This non-specific binding is due to the When the body is used for tumor therapy or in vivo diagnosis, large damage to healthy cells It must be limited to the extent that it does not occur.   Antibodies should be whole as long as they are bound to exon 6 protein in a suitable manner. Antibody itself, its fragment (Fv, (Fv)2, Fab, Fab ', F (Ab)2Etc.), chimeric antibody, humanized antibody or chimeric human antibody Can be used. CDR region that specifically binds exon 6 peptide Or a short chain fragment containing only that part, especially the antibody was labeled If it is one, it is appropriate.   In this paper, the antibody is used as is for the treatment of malignant disease (Hale et al., Lancet2 (1988) 1394-1399; Cobbold et al., Prog. Clin. Biol. Res. (1990) 333,139 -151). Alternatively, the antibody or a portion thereof may be exposed to the toxin molecule (immunotoxin). Resulting in a specific killing of tumor cells due to a fusion or translation fusion (Brinkman n et al. 1991, Proc Natl. Acad. Sci. USA 88, 8616-8620; Pastan et al. (199 1), Cancer Res. 51, 3781-3787; FitzGerald and Pastan (1989), J. Natl. C ancer Inst. 81, 1455-1461). In a preferred embodiment according to the present invention, a polypeptid In vitro recombination of chain, formation of hybrid hybridoma or diabody composition (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6. 448; Holliger and Winter (1993), Current Opin. Biotechnol. 4,446-449) Use configurable bispecific antibodies for tumor therapy (Bonino et al ( 1992), BFE 9, 719-723).   Furthermore, antibodies conjugated to radioactive or fluorescent substances can be used in the respiratory and gastrointestinal systems. , Urogenital carcinoma, ocular cancer, skin cancer and other tumors are preferred for detection and treatment (Pr ofio (1988), Proc. Soc. Photoopt. Instr. Eng. 907, 150-156; Jiang et al ． (1991), J. Natl. Cancer Inst. 83, 1218-1225).   Use antibodies that closely resemble human-derived antibodies to block the immune response. (Glaasy and Dillman (1988), Mol. Biother. 1, 7-13). For example, such antibodies are chimeric antibodies, humanized (CDR-grafted) antibodies Is. Such antibodies are usually made from rodent monoclonal antibodies. (Morrison (1992), Annu. Rev. Immunol. 10, 239-265; Winter and Milste. in (1991), Nature 349, 293-299, etc.). Specifically preferred according to the present invention In another example, a tumor-specific human antibody (Borrebaeck et al. (1988), Proc. Nat. l. Acad. Sci. USA 85, 3995-3999; Borrebaeck (1988), Immunol. Today 9, 3 55-359) is used for therapeutic purposes. In addition, human Mabs were analyzed by Griffith et al. EMBO J. 12 (1993) 725-734, etc., and live phage display. It is particularly preferred to prepare by lari.   Uses antibodies that provide effector functions (ADCC, CDC) for therapeutic purposes Is particularly preferable (Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1357- 1361). Particularly preferably, a human isotope IgG 1 antibody is used.   Regarding the immunotoxin, the antibody according to the present invention may be used as a pseudomonas exotoxin or diphtheria. It is preferable to bind toxins and other toxins (FitzGerald and Pastan (198 9)). Antibodies to chemotherapeutic agents such as doxorubicin, or radiation that has a cytotoxic effect Sex mark It is also preferable to bind to a substance.   When imaging in vivo using radioactive substances or fluorescent substances, For human antibodies, conjugates of the antibody according to the present invention are also preferred.   The therapeutic compounds of the present invention are administered intravascularly, intraperitoneally, subcutaneously using known pharmaceutical techniques. It can be parenterally administered intramuscularly. The active pharmaceutical ingredient according to the present invention is a liquid Used in powder, lyophilized form, water, saline, water-soluble dextrose And a diluent such as a water-soluble buffer and a carrier. Preservatives are also included Can be added.   Regardless of the route of administration chosen, the compounds according to the invention are suitable for the person skilled in the art. It is composed of known conventional pharmaceutically acceptable dosage forms. This compound is pharmaceutically It can also be formed with an acceptable acid addition salt or base addition salt. further, The compound or a salt thereof can also be used in an appropriately hydroxylated form.   Regardless of the route of administration chosen, no toxicity according to the invention but therapeutic Effective amounts of one or more compounds can be used for any treatment. Treatment The dosage regimen for the drug is: body type, age, weight, sex, patient medical condition, tumor type, dose. It will be selected according to a variety of factors such as the route of administration, the particular compound used in the treatment. A physician of ordinary skill will be able to determine the effective drug dose required for a given antibody therapy. Can be immediately determined and prescribed (Hale (1988), Cobbold (1990)). So With treatments such as this, the physician initially administers a relatively low dose and later obtains a maximum response. Increase until you get it.   Disordered multiple spliced variants of the CD44 gene in tumors Overexpression means that a particular exon is overexpressed by a particular cell sample. That is, it is not overexpressed, or is not expressed at all. Therefore, use antibodies against peptides expressed by any exon. The immunoassay used can lead to incorrect results. Therefore, the present invention Two or more CD44 exons, preferably all nine, for adult immunological diagnosis The method of using a mixture of antibodies against exons of   In the following example, the expression of the human CD44 gene was A consistent and differential increase was observed in various solid tumors. Malignant Tumors that have already metastasized) are not observed as locally invasive or benign tumors. Differ in the pattern and magnitude of the changes made. Trials obtained from 46 tumors Of 44 tumors, of which 44 tumors were locally invasive or metastatic Yes, two tumors were benign. PCR was used for analysis of CD44 expression. Prepared by reverse transcription of RNA extracted from a fresh surgical biopsy sample This was done by amplifying the DNA. Some of the genes for CD44 specifically If you select an oligonucleotide primer that anneals the From the results of the above, amplification of the CD44 gene part that has important significance for diagnosis and prognosis can do.   Because of the strong association between the expression of modified CD44 and tumorigenesis as just described. Thus, any of the individual exons of the gene progresses during tumorigenesis or to metastatic tumors. It is not necessary to consider that it is expressed only when Many fruits in recent years Laboratory evidence (see Knudson 1985, Tarin 1992, Hayle et al 1992, etc.) ), These abnormal processes are responsible for normal cellular activities such as cell proliferation and migration. Suggest that this may be the result of impaired regulation of the target gene. Therefore, what Genes or parts of genes can only program tumorigenesis or metastasis. I don't think I have no ability.   The findings of this study of transcripts obtained from exons 10/11 in normal tissues indicate that Higher radiolabeled probe E4 in PCR products from certain tumors Even if the number of bands forming the bridging and the signal intensity increased significantly, this Suggests that the exons of Escherichia coli are not only involved in metastatic behavior. Therefore Another supporting phenomenon is that CD44 exon 10/11 is expressed and metastatic activity occurs. It is considered necessary in order to consider that Nevertheless, this exo That the transcript obtained from the gene was overexpressed in the sample obtained from the metastatic tumor. The observation result of is promising as a very useful index for prognosis judgment.   Further investigation also shows that the native (non-mutated) from any of the individual exons The product is uniquely present only in tumor cells and not in normal cells It doesn't seem to be discovered. On the contrary, we now report on the CD44 locus Activity that consists of overexpression and an inappropriate combination of gene products, as described The abnormal pattern of is thought to be involved in malignant transformation. These changes themselves are malignant transformations May be needed for other genetic changes that result in such conversions. It may be the result of a failure. Even so, without solving this problem Whether observers who use these techniques both belong to the tumorigenesis category. Get information on how to distribute samples, whether they are also non-tumorigenic be able to.                                An example Method   Fresh tissue samples 0.5-1 cm in diameter were removed from 34 breast and colon cancer patients at the time of treatment. Obtained from a surgically resected specimen that had been removed. 10 minutes after arrival at the pathological specimen receiving site It was flash frozen within liquid nitrogen and stored in liquid nitrogen until use. Off for diagnostics If lymph nodes and hematogenous metastases are found in the removed tissue, some of them will also be collected. It was Normal breast tissue, normal colonic mucosa, normal lymph nodes adjacent to breast tumor, positive Permanent liver also for comparison with surgically resected specimens and other non-tumorigenic states Collected from excised specimens. Obtaining normal peripheral blood leukocytes from 10 volunteers , Bone marrow was obtained from 3 volunteers. The histological features of the tumor and its clinical stage are listed in the table. It was described in 1.   Extraction of cellular RNA from tissue samples is all done by Chomizynski and Sacci (1987). Was performed according to the method described by. Invitrogen extraction from liquid samples The Microfast track kit marketed by cDNA synthesis and Subsequent amplification by polymerase chain reaction (PCR) is supplied with this kit. Superscript with buffers and reagentsTMPreamplifier (BRL Life Technologies  Inc., Middlesex, UK). Ie this is the template And using RNA samples as supplied nucleotide triphosphates to reverse Relates to the first step of primary-strand cDNA synthesis performed with transcriptase. Later P For CR, each sample should be lightly oiled and heated at 94 ° C for 5 minutes to denature the nucleic acids. , PCR was performed for 30 cycles with the following cycle parameters. That is, 94 ° C At 55 ° C for 1 minute and 72 ° C for 2 minutes. Template c to the reaction mixture D Negative gene control without NA was routinely performed for each batch. Human cd Sequence information published for 44 cDNA (Hofmannet al， 1991 ， Stamenkovic  et al, 1991, Jacksonet al, 1992) (Fig. 6). The Limer and probe sequences were as follows:               P1 = 5'GACACATATTGCTTCAATGCTTCAGC               P4 = 5'GATGCCAAGATGATCAGCCATTCTGGAAT   P1 is (Stamenkovic in 1989et al.Nucleotides of the sequence published by Origin 324 bp upstream from the insertion site of the standard CD44 molecule (between 782 and 783) , P4 has an origin 158 bp downstream from this site. The sample is a standard CD44 (so-called When expressing hematopoietic CD44), these primers were used for the 482 bp PCR fragment. And the sample contains alternatively spliced transcripts. PCR fragment of 878 bp for epithelial morphology of CD44, CD44 and other bands. Generate an event. 10 μl of each PCR product was electrophoresed in a 1.2% agar gel. , Hybond N+(Amersham UK, Little Chalfont, UK) Transferred to nylon membrane, Hybridize with Gonucleotide nucleotide E4 (= 5'TGAGATTGGGTTGAAGAAATC-3 ') Formed (see FIG. 6). Check blotting and autoradiography. This was done to improve the output sensitivity and resolution. The probe is a polynucleotide In the presence of32Radiolabeled with P-ATP. 10% after prehybridization Dextran, 6xNET, 5x Denhardt's solution, 0.5% NP40 and 100 μg / ml Hybridization was performed overnight in salmon sperm DNA at 42 ° C. Then the filter -2x SSC, 1x SSC and 0.1% SDS in 0.5% SSC twice. Washing was continued for 15 minutes each at 42 ° C. Expose the filter to Kodak X-ray film for 2-16 hours It was After this time, the filter is 0.5% SDS to strip the probe. Boiled at room temperature and another radiolabeled probe, namely the standard portion of CD44 which we P2 designed for kneeling (= 5'CCTGAAGAAGATTGTACATCAGTCACAGAC) Re-hybridized (Fig. 6). Hybridization, washing and autoradiation The conditions used for ography are the same as above.   The sensitivity calibration of the method for detecting a small number of cells was performed as follows. Ammonium chloride Addition of Ni-buffer (50 ml of lysis buffer per ml of sedimented red blood cells) 15 minutes after lysing the sedimented erythrocytes, centrifugation was performed to remove peripheral blood lymphocytes (P BL) were all purified from 20 ml whole blood. Divide the leukocyte pellet into 4 tubes, 0 μl of suspension of HT29 colon carcinoma cells (5000 cells per ml) in each tube, 1 μl, 10 μl, and 100 μ were added. Next, all RNA was extracted, but The yield was about 20 μg. cDNA synthesis was performed using 4 μg of RNA obtained from each tube. Performed on a sorted aliquot, and each tumor cell per sorted sample is The numbers were 0, 1, 10, and 100. PCR was performed on the above sample, positive gene control (tumor Ulcer cells only) and negative gene regulation (no DNA) Primer D1 designed to specifically anneal proteins 6 and 14 and D5 was used. From previous studies, HT29 cells showed that both exons and other Exons are expressed in a pattern that is easily distinguishable from PBLs and Because we wanted to increase sensitivity by shortening the Tide primers D1 and D5 were selected. Using these primers And avoids the problem of using primers P1 and P4 for this specific purpose. The reason for this is that most of them annealed the standard part of the gene. It is because it is immersed by making it stand. PCR cycle parameters, The blotting conditions, probe conditions, and washing conditions are as described above. On the probe The oligonucleotide sequence used is32It was P-labeled E4.Overview of results   Primers (P1, P4) amplify beyond the splice product insertion site In addition to the intervening part of the standard molecule, the transcription obtained from the additional exon main Any of the alternatively spliced variants, including the ones, are amplified. others Therefore, considering all possible combinations of sequences identified from this locus, it becomes a standard form. The total amount of products that could be detected using a corresponding probe (eg P2) The number is large. Using probe E4, the above 16 combinations, namely exo The combination containing the E4 transcript obtained from E. coli 11 was resolved by electrophoresis. Could be visualized as bands of different molecular size. actually Could not detect the full range of possible combinations in the above results, Several (up to 9) alternative splicing variants hybridize with each probe It was observed in the tumorigenic tissues that were found. Obtained from chest, colon, and lymph nodes In addition to certain E4 containing transcripts (Fig. 1 and Fig. 3), standard body molecules (Fig. 2 and FIG. 4) were also expressed, but peripheral blood lymphocytes (FIG. 5) and liver collection (FIG. 4) Only the latter can be detected with this combination of probe and primer Expressed in Noh state.                               Example 1 Chest tissue data   The results obtained from testing breast tissue samples are shown in FIGS. 1 and 2. Metastatic tumor deposition Tumors and their corresponding deposits from all cases were exon 1 Overexpressed multiple transcript-containing alternative splicing products from 1 ( Figure 1a). At least 8 bands at 1500 and 1650 bp in all tumors Frequently observed with the double stripes present. Normal breast tissue and normal lymph nodes , This probe exhibited two bands (1150 bp and 860 bp). Above No double stripes were found in normal samples.   Differences in the number of bands, size, and signal strength from the bound probe are normal. Among the malignant categories it was apparent in all tested samples. By chance For unscheduled samples taken, expose the filter to X-ray film for an extended period and Although another difference had to be observed, this finding was relevant to all tested. Was confirmed.   Sample from a locally invasive tumor with no clinical evidence of metastasis and two fibrous glands Samples from tumors also showed transcripts from exon 10/11 compared to normal tissues. Over-expressed splice products containing, to the extent that malignant tumors and their metastases Was easily distinguished from the results obtained with. Is it a pattern found in normal tissue? It is easy to distinguish them (Fig. 1b). However, only one sample is similar to a malignant tumor You The results are shown (lane 14) (see below). Are the two fibroadenoma a non-metastatic carcinoma? Obtained from a case of cystic disease of the chest showing a band pattern similar to that obtained from The samples obtained resembled the pattern of normal, non-tumorigenic breast tissue. this is, It is the 1st example of the most reliable diagnosis by this method. The piece of tissue is used by the death diagnosis doctor on duty. Therefore, it is a benign tumor, that is, is it a fibroadenoma in the visual appearance in the initial visual inspection with the naked eye? It was provided as obtained. Next, this tissue piece was subjected to PCR of the cDNA. After amplification, characterized as clearly non-neoplastic, followed by histological microscopy This was confirmed by.   The differences observed with probe E4 are valid and not technical artifacts To confirm that the same filter was hybridized with probe P2 The results obtained in the case shown below are shown in FIG. This is because i) all test tissues are genetic Other exons that express the canonical form and do not contain transcripts from ii) exons 10/11 Splice products are present in tumors and metastases, and iii) the differences described above are due to this complex Unevenly load tracks on various panels and lanes on the filter Not due to splicing, but also to alternative splicing. Indicates that All conditions in this experiment were performed with the filter on X-ray film. Except for the exposure time (10 hours exposure in Figure 1 and 1.5 hours in Figure 3), The conditions are the same as when hybridizing using E4.                               Example 2 Colon sample   The findings for colon carcinoma were consistent with those for breast cancer. Because of this, all In some cases, colon carcinoma tissue is more prone than normal colonic mucosa and other normal tissues. Shows the increase in the number of high molecular weight bands that are strongly labeled by the probe E4. milk As in the case of carcinoma, hybridization with probe P2 results in There was no difference in the degree of expression (Fig. 4).                               Example 3 Method sensitivity calibration   Autoradiation of PCR products of peripheral blood leukocytes inoculated with a known number of HT29 colon carcinoma cells As a result of examining Ogram, 107Tumor cells in white blood cells up to 10 levels It was found that the existence of a band peculiar to cells could be shown. Fine adjustment of the test conditions With, it is possible to detect even one tumor cell in 10 ml of blood it is conceivable that.   In the series above, all samples of tumorigenic cells were selected for the CD44 gene. In samples obtained from non-neoplastic tissues that overexpress the spliced product, No expression was shown. Therefore, a sample derived from normal tissue or tumor tissue and C The expression pattern of D44 was perfectly matched. In some cases, clinical evidence of metastases is present. Tumors removed from absent patients (Patient B16, lane 14 in Figure 1) have metastatic potential. It was recognized that it had an expression pattern showing. Is this currently a false positive? It is impossible to know if metastasis is an imminent sign. This patient , Currently under observation at a follow-up clinic.                               Example 4   We have followed the oligonucleotide primer according to our findings as follows. Mar was designed and synthesized.   The standard part is as follows (Stamenkovic 1989). Primer P1 = 5'-GACACATATTGCTTCAATGCTTCAGC (458-484) Primer P2 = 5'-CCTGAAGAAGATTGTACATCAGTCACAGAC (488-518) Primer P3 = 5'-TGGATCACCGACAGCACAGAC (746-767) Primer P4 = 5'-GATGCCAAGATGATCAGCCATTCTGGAAT (912-941)   The exons are as follows (Hofmann 1991). Primer E1 = 5'-TTGATGAGCACTAGTGCTACAGCA Primer E2 = 5'-CATTTGTGTTGTTGTGTGAAGATG Primer E3 = 5'-AGCCCAGAGGACAGTTCCTGG (534-554) Primer E4 = 5'-TGAGATTGGGTTGAAGAAATC (558-578) Primer E5 = 5'-TCCTGCTTGATGACCTCGTCCCAT (585-608)     D1: 5'GAC AGA CAC CTC AGT TTT TCT GGA (63-86)     D5: 5'TTC CTT CGT GTG TGG GTA ATG AGA (888-911)   E1 and E2 are on exon 6.   Fresh tissue samples 0.5-1 cm in diameter were obtained from surgical resection specimens or at necropsy. All samples used in this study were tissue residues that remained after the diagnostic sample was taken. It was obtained from, but was originally supposed to be discarded. Sample is a pathological marker Within 10 minutes of arriving at this reception place, the product will be flash frozen in liquid nitrogen and liquid nitrogen until used. It is frozen with the raw material. For cDNA, use 5 μg of total cellular RNA as a template. And a primer P1 and a primer P4 PCR was carried out. PCR amplification, electrophoresis and hybridization are standard Done under sub-conditions.   The PCR product was hybridized with radiolabeled E2 or E4 , All of the samples from the carcinoma overexpressed multiple splice variants. , The pattern of bands observed by each probe was different. Because of this, Oligonucleotide probes for the Son 6 product show nontumorigenicity in tumorigenic samples Effective when distinguishing from samples, but at least for samples obtained from solid tissue Therefore, it is not significantly more sensitive than E4, and disseminated metastatic cells Or it may be useful for detecting the origin of a defined metastatic lesion. Then the same The filter was stripped and hybridized with probe P2 Around the time, it turns out that all samples, including normal tissue, produce a standard portion of CD44 It was. This allows normal and tumor samples probed with E2 and E4. The differences observed between the results obtained with the reagents were due to unequal loading of the PCR products. It was confirmed that it was not due to the swing. The cumulative results are summarized in Table 3. These show that these changes are observed in a variety of common cancers. .   The inventors have investigated certain malignant tumors of skeletal muscle and found that in osteosarcoma, many It was observed that the iced variants were significantly overexpressed.                               Example 5 By PCR assay of clinically collected urine samples Cancer diagnosis   About 50 ml of spontaneous voiding was obtained from each person and brought to the laboratory as quickly as possible. Patient 90 We tested a sample from a group of individuals, including 44 patients with bladder cancer who had undergone biopsy and bladder. 46 cases obtained from non-neoplastic inflammation (cystitis) patients and 46 normal volunteers. Each urine After thoroughly mixing the samples, 1 ml aliquots were taken for cytological examination. Another 1 ml of urine Check with fluorescein diacetate ethidium bromide stain , The viability of the cells in the sample was evaluated. Centrifuge the remaining urine at 2000 rpm for 10 minutes The cell pellet was kept at -70 ° C until used. Extract mRNA It was performed using Godo dT cellulose tablets (Invitrogen). cDNA is AMV reverse transcription It was synthesized using an enzyme (Invitrogen). Add the finished cDNA solution to 2 Distributed to tubes, one for PCR with E1 and E5, with specific c Amplifying DNA transcripts, we find high diagnostic value, while P1 For PCR with P4 and P4, all splice variants as internal control A standard version of CD44 with or without was amplified.   35 cycles of PCR were performed. Cycle conditions are 95 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, It was 72 ° C for 2 minutes. The "hot start" method was adopted for all samples. Result is It is shown in FIG.   An equal volume of PCR product was loaded and loaded on each lane of a 1.2% agar gel. It was stained with titanium bromide. Cells in urine from exon 6 to exon 14 In the current PCR protocol, primer E, if all are expressed It was expected that the use of 1 and E4 would result in a band of 735 bp . Tigers containing cDNA from normal urine or cDNA from patients with non-neoplastic cystitis There is no band on the track (lanes 1-8), but PCR is performed using primer E1. And E5 (upper panel) show a clear 735 band for bladder cancer patients Got from Observed in all collected urine samples (lanes 9-16).   For the 482 bp band representing the standard type of CD44 type, PCR was performed using P1 and P4. When performed (lower panel), it was obtained almost equally in all cases. this is , Diagnostically significant difference between urine obtained from patients with bladder cancer and urine obtained from controls Is caused by uneven loading of tracks No, suggesting that it is caused by alternative splicing of the CD44 gene. Lanes 1-4: normal urine. Lanes 5-8: cystitis urine. Lane 9-16: bladder cancer Urine obtained from person 1-8.   Overall, the 735 bp band was found in 7 out of 7 normal urine specimens and 9 urine specimens of cystitis. It was not present in 9 specimens in the book. That is, 0% false positives. Bladder cancer 14 of 19 urine samples (74%) obtained from patients had a positive result (ie 26% of false Negative). False-negative samples include fluorescein diacetate ethidium There was a lack of viable cancer cells as shown by mu bromide staining.                               Example 6   Feces obtained from 12 patients were assayed by the technique described in the text. Colorectal Five of the samples obtained from 9 cancer patients showed positive results. Normal patient 3 All samples obtained from the name gave negative results. Full of bacteria without pretreatment Numerical values obtained from such samples can easily develop a bacterial viability diagnostic assay. It is convinced that you can do it.   In a further experiment by the inventor to detect tumor cells using this method, the following observations were made: The fruit will be useful in other experiments investigating its diagnostic potential. Belief in the result Reliability and reproducibility depend on the quality of the mRNA obtained from the sample and the skill in carrying out the technique. It should be recognized as a serious consideration that it depends critically on a. Main requirements Ensures that high quality mRNA is obtained routinely, Use it in the reaction to monitor the PCR amplification step and check for false negative results. Eliminate. The same if false positive results are not often observed Refer to replication assays and other clinical data on samples or further samples This is not a significant issue, as it can be recognized as a false positive.   The inventors found that the abnormal CD44 gene was found in a small clinical sample containing tumor cells. The procedure necessary to ensure the mechanical PT-PCR detection of the activity of the I killed it. Divide tissue sample into aliquots and freeze half of them immediately in liquid nitrogen The ability to detect CD44 splice variants when the rest are left at ambient temperature Can be shown to decrease depending on the time and mode of sample processing . Fresh samples of mRNA extracted within 30 minutes of resection showed the most reliable results and were If fresh tissue pieces are left at ambient temperature, the quality will gradually deteriorate over the next few hours. If the sample was first deep-frozen, RNA should be extracted immediately after thawing. It can be added. However, in the first 15 minutes, it began to decline rapidly, leading to large mutant transcripts. The result was that the object was lost first and eventually even the standard type. Frozen rapidly Immediately after thawing of mRNA when samples of frozen cells and tissue pieces were stored at -70 ° C The results were reduced after 4 weeks, even when extracted into. Therefore destroyed during freezing RNA degradation due to ribonuclease released from exposed cells is Even though it is slow, it continues. In addition, collected for RNA extraction Viable tumor tissue if the sample is obtained from a necrotic or fibrotic part It may not be possible to obtain the typical results observed in. Therefore, sample selection And care in sample processing is necessary to obtain reliable data.   Therefore, the inventors of the present invention confirmed that the fresh sample was frozen to extract mRNA. Do not leave for more than 24 hours before binding or processing, thawed sample extracted mRNA It is preferred that it not be left for more than 2 hours before being treated for.   The diagnostic methods described in this text can be done in one day and in a few hours. In some cases, it can be done, or it can be automated. There are various uses of this diagnostic method. For the detection of a wide variety of cancers on human samples, as well as blood and urine samples Has also proved. Therefore, the inventors have used this method to screen for cancer. And as a convenient and practical method for diagnosis. As a rule, this diagnosis Since the method has broad and general application to cancer detection and prevention programs, Has epidemiological and public health value. Appropriate sensitivity, specificity and simplicity of this method This is used for the early diagnosis of cancer as well as the evaluation and treatment of disease in the body. It will be possible to determine the efficiency of the disease and detect tumor recurrence at an early stage.Explanation of symbols in figures Note: N = normal, T = primary tumor,         M = TranspositionFigure 1   The autoradiogram of the PCR product obtained from the chest tissue sample was analyzed using E4. And probed (the sample filter was irradiated on the X-ray film for 10 hours). Panel A: Transfer Malignant primary breast cancer with a nest. Tracks 1, 2, and 3: Patient B1, Tracks 4, 5, and 6 : Patient B2, tracks 7, 8, 9: patient B3, tracks 10, 11: patient B4, Tracks 12, 13: Patient B5. Compared to standard breast tissue pieces, the primary carcinoma and its Metastatic deposits overexpressed multiple splice variants. 1500bp and 1650bp ( Note that the doublet in arrow) is best observed on track 5. I want to. It is present in all tumors and metastases, but this exposure does not. It is a fogging image on other tracks. Much longer exposure time (23 hours) Even was not detected in normal samples. Panel B: Milk with no clinical evidence of metastasis carcinoma. Tracks 14-20 were obtained from patient B15-21. All tumors are species However, the number of bands was small except for track 16 (patient B17). None, the signal intensity was weak (see text). 1500 / 1650bp doublet ( The arrow) makes it easy to recognize the length of exposure on tracks 15, 16 and 18. And long exposures can be detected in all other tumor-containing tracks. I can now. However, in the figure, a track with a strong signal is reflected. It shows that a short exposure is good to prevent image formation. Panel C: Fibrous gland tumor ( FA) and cystic mastopathy (Cyst). Tracks 21 and 22 are benign tumor samples (Samples B22, 23) and non-neoplastic in track 23 (Sample B24) ( Cystic disease).Figure 2   PCR products obtained from breast tissue specimens probed with probe P2 Autoradium (sample filter exposed to X-ray film for 1.5 hours). As a result Stripping the previous probe with the same filter used in Figure 1. It was obtained by re-exploring after logging. Where i) the difference observed in Figure 1 The differences are not due to uneven loading of the tracks, but ii) the standard form of the molecule Expression was quantitatively higher than any of the variants, iii) the standard form There is also a variant that is expressed in tissue debris and that does not contain exon 3 transcript, iv) Overexpressed in cells. 1500 / 1650bp doublets are found in panel A tumors However, it requires a long exposure to be detected by panel B and panel C. is there.                               Figure 3   Autoradiation of PCR products obtained from colon tissue samples probed with E4 Ogram (exposure sample filter to photographic film for 10 hours). Tracks 1, 2, 3: patient C1, tracks 4, 5, 6: patient C2, tracks 7, 8, 9: patient C3 , Tracks 10 and 11: Patient C4, Tracks 12 and 13: Patient C5, Track 1 4: Normal liver sample. The image is similar to the features described in the description of Figure 1, with the finding that the colon It is shown to be compatible with the carcinoma of. 1500/1650 bp doublet (arrow) shows multiple tumors Easily spotted on tracks (2 and 8-12), tracks 3, 5, 6, 13 The weak signal at the position corresponding to was stronger with longer exposure times. Only However, in tracks 1, 4, 7, and 14 (normal tissue), none was found in this vicinity. It was                               Figure 4   Automata of PCR products obtained from colon tissue samples probed with P2 Geogram (Sample filter exposed to photographic film for 1.5 hours). This is each track Confirmed that they were evenly loaded, and that Other points confirm that they apply to colon carcinoma. Normal liver is CD4 Note that 4 standard forms are expressed.                               FIG.   Normal peripheral blood leukocytes, PBL (obtained from 3 persons) and E4 (panel A; copy). 8 hours exposure on true film) and P2 (panel B; 5 hours exposure on photographic film) Of PCR products obtained from other normal tissues probed by Gram. Track 6 shows the PCR product from breast cancer (patient B) as a positive gene Include as control. With this combination of primer and probe, white blood Spheres are found to express the canonical form of the CD44 molecule, but splice variants are detected Not done. Samples in tracks 4 and 5 were clinically evidenced for tumorigenesis as follows: Obtained from an individual without. That is, track 4 is a woman who died of bacterial endocarditis. Chest tissue obtained by autopsy from the sexual body, track 5 was excised for axial torsion. The colon. References                               Example 7 I. Peptide synthesis   Amino acids 1-1 of the peptide sequence corresponding to CD44 exon 6 shown in FIG. 5 peptides corresponding to 3, 9-23, 19-33, 29-43, 1-43 , Applied Biosystems, Inc.'s Model 431A Peptide Synthesizer Standard scale (0.25 mmol) Fmoc chemistry option available for sale Tyroxycarbonyl (Fmoc) Chemistry Solid Phase Peptide Synthesis (Atherton and Sheppard, 1 989). For this purpose, 403 mg of 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl -Fmoc-aminomethyl) -phenoxy resin (Rink, 1987) was placed with 0.62 mmol / g resin. Replace and use. The amide resin is N, N-dimethyl before the first coupling cycle. Deprotection by treatment with 20% piperidine in formamide (DMF) Protect (Fmoc cleavage). To synthesize the peptide, a 4 mol excess of the following Fmoc-acetate was used. Use mino acid derivatives and other carboxylic acids.     N-Fmoc-L-alanine     N-α-Fmoc-NG-(2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl) -L-ar Guinin     N-α-Fmoc-N-β- (Trityl) -L-Askiparagine     N-α-Fmoc-L-Aspartic acid-β-t-butyl ester     N-Fmoc-S-Trityl-L-Cysteine     N-α-Fmoc-N-γ- (Trityl) -L-glutamine     N-α-Fmoc-L-glutamic acid-γ-t-butyl ester     N-α-Fmoc-N-im-Trityl-L-histidine     N-α-Fmoc-L-leucine     N-α-butyroxycarbonyl-N-ε-Fmoc-L-lysine     N-α-Fmoc-N-ε-butyroxycarbonyl-Fmoc-L-lysine     N-Fmoc-L-norleucine     N-Fmoc-L-proline     N-Fmoc-O-t-butyl-L-serine     N-Fmoc-O-t-butyl-L-threonine     N-α-FMoc-N-ε-Butyloxycarbonyl-L-tryptophan     N-Fmoc-γ-aminobutyric acid     N-Fmoc-ε-aminocaproic acid     (+) -Biotin   Prior to coupling, the amino acid derivative was dissolved in DMF and 1 equivalent of N-hydroxide was used. Add Roxybenzotriazole (HOBt) to N-Methylpyrrolidinone (NMP) Adding 1 equivalent of N, N'-dicyclocarbodiimide (DCC) to NMP Therefore, it is activated. 20 min coupling of HOBt-ester amino acids with DMF Run in Following coupling, deprotection of the N-terminus (Fmoc cleavage) to DMF Achieved by treatment with 20% piperidine for 3 minutes followed by 10 minutes. peptide Strands are stretched by repeating activation / coupling / deprotection cycles It The N-terminal aminocaproic acid spacer and the And cysteine, which attach the peptide to a carrier protein . Regarding peptides used as screening reagents, different N-termini were synthesized. Three γ-aminobutyric acid components, lysine, (attached to the ε-amino group of lysine Contained biotin). Following synthesis, the peptide is trifluoroacetic acid ( It is removed from the resin support by TFA) excision. Peptide-containing resin for 1 hour 20 ml trifluoroacetic acid, 1 ml water, 1 ml thioanisole, 0.5 ml at warm (RT) React with a cleavage cocktail containing ethanedithiol, 1.5 g phenol. Al The removal of acid-labile side chain protecting groups performed under gas was further performed in the cocktail solution described above. After 2.4 hours reaction time is completed at room temperature. Deprotected after cooling for a short time Peptides are precipitated by the addition of diisopropyl ether. Filter the precipitate, It was washed with diisopropyl ether, dissolved with 50% acetic acid and freeze-dried. Pepti The purity of the product was determined by reversed phase HPLC (column-Vydac 218tp54, C18, 300Å, 5μm, 4.6 × 250 mm, mobile phase-A: water containing 0.1% TFA, B: water containing 0.1% TFA / acetate Trinitrile (35/65, volume / volume); gradient-0-100% B in 90 minutes, flow rate-1 ml / minute, Detection-226 nm). The above peptides with a purity of less than 60% were subjected to reverse phase HPLC (column-Wat ers DeltaPak C18, 100Å, 15μm, 50 × 300mm, Mobile phase-A: 0.1% TFA included Water, B: 0.1% TFA Containing water / acetonitrile (35/65, v / v); gradient-0.50% B over 130 min, Flow rate-15 ml / min, detection-226 nm). The peptide identity was determined by plasma desorption mass spectrometry. Is verified. Characteristic HPLC assay for peptides used in immunogen synthesis The retention time characteristics and the mass spectrometry data are shown in Table 2. II. Activation of carrier protein   For immunogen analysis, keyhole limpet hemocyanin (KLH) or corpus Heterobifunctional cross-linking test using any carrier protein of sera serum albumin (BSA) Using the drug N-succinimidyl 3-maleimidopropionate (MPS) Modification via the ε-amine of the amino acid. This is because the sulfhydryl peptide It provides a carrier protein with a "handle" that serves. 10 μM for KLH KLH solution is prepared with 0.1M sodium bicarbonate solution, pH 8.35. Suspension The pH of the liquor is adjusted to 8.3 and centrifuged briefly. bicinchoninic acid (BCA) After measuring protein concentration by protein assay (Smith, et al., 1985) Agitated 3000 equivalents of a 0.3 molar MPS solution in dimethyl sulfoxide. Was added dropwise to the KLH solution and reacted at room temperature for 1 hour. The pH of the solution is 0.1 molar HCL. Therefore, the activated carrier protein, adjusted to 7.0, was Separated from excess MPS by Ruffy (Column-AcA202, IBF Biotechn ics, 5 × 12 cm) room temperature; buffer-0.1 M KH2POFour/ K2HPOFour, PH 7.0, 0.1 M NaCl; flow rate -6 ml / min, detection -226 nm). The protein concentration was determined by BCA protein assay Degree, the degree of maleimide propioamide (MP) substitution of activated KLH (KLH-M P) was measured using Ellman's reagent DTNB (Ellman, 1959). Regarding BSA For example, add 190 μM BSA solution to 0.1 mol KH.2POFour/ K2HPOFour, PH 7.0, prepare 1 It was added dropwise to 00 equivalents of MPS (40 mM in 1,4-dioxane). Reaction mixture at room temperature for 2 hours After stirring vigorously, it was loaded on a size exclusion column. Activated BSA (BSA-MP) was purified and analyzed in a manner similar to KLH-MP. 20-35: Substitution values of 1 and 200-600: 1 indicate that the activated carrier protein BSA-MP And KLH-MP were each achieved mechanically. III. Peptides and active carrier proteins Conjugate   Due to the formation of thioether bonds, the thio-containing peptide is covalently linked to the MP-activated carrier. Be used. In the case of BSA-MP, 0.1M KH of pH 7.02POFour/ K2POFour74 μM BS included in A-MP solution was included in 1 equivalent (with respect to MP) 4 mM peptide solution in the same phosphate buffer To react. The solution was stirred slowly and allowed to react overnight at room temperature. Centrifuge The soluble BSA-MP peptide conjugate was then subjected to size exclusion chromatography (II. Unbound peptides were separated by the same chromatographic conditions as in section). Tan For analysis of protein conjugates, in addition to protein concentration determination by BCA, Ellman's reagent To determine the number of unreacted MP-groups remaining. KLH-MP Pepti Conjugates have active carrier protein and peptide concentrations of 3 μM and 18 μM, respectively. Except for analysis.References Abbreviation   BCA-bicinchoninic acid   BSA-Bovine Serum Albumin   BSA-MP N-succinimidyl 3-maleimidopropionate activated Bovine serum albumin   DCC-N, N'-dicyclocarbodiimide   DMF-N, N'-dimethylformamide   DTNB-dithio-bis- (2-nitrobenzoic acid), Ellman's reagent   Fmoc-9-fluorenylmethyloxycarbonyl   HOBt-N-hydroxybenzotriazole   KLH-Keyhole Limpet Hemocyanin   Activated with KLH-MP-N-succinimidyl 3-maleimidopropionate Keyhole limpet hemocyanin   MP-maleimidopropionamide   MPS-N-succinimidyl 3-maleimidopropionate   NMP-N-methylpyrrolidinone   RT-room temperature   TFA-trifluoroacetic acid                               Example 8 Recombinant HIV2 (gp32) -CD44 exon 6 antigen / immunogen Manufacture   Exon 6 of the CD44 gene is a peptide consisting of 43 amino acids as shown in FIG. Code Petit.   Peptides and small proteins of less than 100 amino acids are generally It cannot recombine due to cytoplasmic expression. For this reason,E. coliEasily at Expressable gene (part of HIV2 retrovirus envelope protein gp32) And a fusion gene containing CD44 exon 6-DNA was prepared.   To increase the CD44 exon 6 epitope of the fusion protein, (CD Encoding the 3 C-terminal amino acids of 44 exons 5) with an appropriate linker Replicated CD44 exon 6 at the DNA level.   Easier antigen / immunity with metal chelate affinity chromatography Six histidine residues (codons) were isolated at the DNA level for HIV2 ( It was inserted into the N-terminal region of the gp32) -CD44 exon 6 fusion protein. Recombinant DNA technology   Molecular Cloning: A laboratory manual Cold Spring using standard methods Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) Sambrook, J. et al.e t al. The DNA was manipulated as described by Manufacturing of molecular biological reagents Used according to the manufacturer's manual. HIV2 (gp32) -partial gene (plasmid pUC18 HIV2-gp32) creation   The coding region of amino acids 48-162 of the HIV2-gp32 gene overlaps the chemical gene Plasmid pUC18 after synthesis by overlap chemical gene synthesis Was used for subcloning. Described the generation and classification of plasmid pUC18HIV2-gp32. This is disclosed in European Patent Application No. 0 440 207.E. coli Expression vector pDS56-6HIS-HIV2-gp32 Create   In the following plasmid construction, the N-terminal of the amino acid sequence MRGSHHHHHHTDPEF (poly-Hi s tail) and a selected HIV2-gp32 antigen.   For this purpose, the vector pQE-10 was modified with the restriction endonucleases BamHI and HindI. BamHI / HindIII-pQE-10 vector fragment digested with II and approximately 3.4 kbp long. Were isolated by agarose gel electrophoresis. pQE-10 vector [synonyms: pDS56 / RBSIII , 6 × His (-1)] are supplied by Diagen, Germany, and are available from Stuber, D .;et al． (1 990) Immunol. Methods IV: 121-152. In another preparation , Plasmid pUC18 HIV2-gp32 into restriction endonucleases BamHI and HindIII Therefore digested and isolated the BamHI / HindIII-HIV2-gp32 fragment of approximately 400-bp in length And ligated to a BamHI / HindIII-PQE-10 vector fragment approximately 3.4 bp in length. The desired plasmid was identified by pDS56-6HIS-HIV2-gp by identification using restriction mapping. Turned out to be 32.E. coli Expression vector pDS56-HIV2-CD44 exon 6 Create Encodes the N-terminus (poly-Histil) for the amino acid sequence MRGSHHHHHHTDPEF Fusion gene, selected HIV2-gp32 antigen, and CD44 exon 6 antigen Made a copy.   Two copies of the CD44 exon 6 gene are available in the polymerase chain reaction (PCR [Mullis, K.B. and Faloona, F.A. (1987) Methods Enzym ol. 155: 355-350].   In the first PCR reaction, the CD44 exon from base pair positions 397-538 was obtained. The DNA sequence of 5-6 was amplified (FIG. 9: HIV2 (gp32) -CD44 exon 6 fusion gene). DNA sequence), restriction endonuclease cleavage (BamHI and Hae III) was formed. Amplification was performed using subcloned CD44 cDNA (ex Song 5- 11) and the following primer pairs.                       BamHI primer (1): 5'-aaaaaaCGATTCccgctgccacttttgatgagcactagtgctac-3 '                            ProAlaThrThrLeuMetSerThrSerAla ..                              Exon 5 exon 6                    HaeIII primer (2): 5'-aaaaaaCGCCGGagccatttgtgttgtgttgtgtgg-3 '   A PCR product about 160-bp in length was digested with BamHI and HaeIII to give about 150-b Agar gel electrophoresis of p-long BamHI / HaeIII-CD44 exon 6 fragment Therefore isolated.   In the second PCR reaction, the position of the base pair was 539-672th CD44 exon 5 -6 DNA sequence (see FIG. 9: D of HIV2 (gp32) -CD44 exon 6 fusion gene) CD4 which was obtained by amplifying (NA sequence) and subcloned as template DNA. Using 4 cDNA exons 5-11 and the following primer pairs: Appropriate single restriction nuclease cleavage site for amplified DNA sequences .                    HaeIII primer (3): 5'-aaaaaaCCGGCCACCACTttgatgagcactagtgctac-3 '                     ProAlaThrThrLeuMetSerThrSerAla ..                       Exon 5 exon 6                     HindIII primer (4): 5'-aaaaaaAAGCTTTTATCAgccatttgtgttgttgtgtg-3 '   A PCR product about 150-bp in length was digested with HaeIII and HindIII to give about 140 -bp long BamHI / HaeIII-CD44 (exon 6) fragment was subjected to agar gel electrophoresis. Isolated by electrophoresis.   Then, the BamHI / HaeII-CD44 exon 6 fragment obtained from the first PCR reaction Fragment and HaeIII / HindIII-CD44 exon obtained from the second PCR reaction By ligation with 3 fragments of BgIII / HundIII-p of about 3.8 bp in length. This was designated as DS56-6HIS-HIV2-gp32 vector fragment. The desired plasmid is restricted Identified by mapping, the PCR-synthesized DNA region has a DNA sequence (structure: pD S56-HIV2-CD44 exon 6).E. coli (Gp32) -CD44 exon 6 antigen in humans Expression of   E. coliTo express the HIV2 (gp32) -CD44 exon 6 antigen inBig Enterobacter K12 strain RM82 (methionine revertant EX8654, Murry, N.E.et a l ． (1977) Mol. Gen. Genet. 150: 53-61), HIV (gp32) -CD44 exon 6 expression plasmids pDS56-HIV2-CD44 exon 6 (resistant ampicillin) and I Transformation was performed with the acI repressor plasmid pUHA1 (resistant kanamycin). The generation and classification of plasmid pUHA1 is described in Stuber, D. et al.et al． (1990) 45 Immunol. Methods IV: 121-152.   RM82 / pUHA1 / pDS56-HIV2-CD44 exon 6 cells were transferred to DYT medium (1% (w / v) yeast antibody). 50 mg / in a kiss, 1% (w / v) Bacto Tryptone, Difco, 0.5% sodium chloride) Using 1 ampicillin and 50 mg / l kanamycin, the optical density at 550 nm The cells were cultured to 0.6-0.9 and induced with IPTG (final concentration 1-5 mmol / l). 4-8 After the lag phase of time, cells were harvested by centrifugation and washed with pH 6.8, 10 mmol / l phosphate buffer. It was washed with an electrolyte and stored at -20 ° C until further treatment.   Cell pellet obtained from 1 ml of medium (RM82 / pUHA2 / pDS56-HIV-CD44 exo (6 cells) in 0.25 ml, 10 mmol / l, pH 6.8 phosphate buffer and 1 mmol / l EDTA. Suspension and cells were lysed mechanically by French press. 1/5 volume after centrifugation Volume of 5x SDS sample buffer: pH 6.8, 50 mmol / l Tris-HCl, 1% SDS, 1% mercap Ethanol, 10% glycerol and 0.001% bromophenol blue) Added to the clear. The insoluble cell debris fraction was treated with 6-8 M urea in 0.3 ml 1 × SDS sample buffer. Using Resuspended. The samples were then incubated for 5 minutes at 95 ° C and centrifuged. Then, the proteins were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Away (Laemmli, U.K. (1070) Nature227: 680-685), Coomassie Brilliant Stained with Toblue R dye.   E. coliThe HIV (gp32) -CD44 exon 6 antigen (Fig. 10) synthesized in , Observed only in the insoluble cell fraction. HIV2 (gp32) -CD44 exon 6 antigen The expression level ofE. coli30-50% of the total protein.E. coli Derived from HIV2 (gp32) -CD44 exon 6 antigen Preparation   Inclusion body (IB) cell lysis and preparation.   20g (fresh weight) of RM82 / pUHA1 / pDS56-HIV2-CD44 exon 6 cells was added to pH 7.0, 10 The suspension was resuspended in 0 ml 10.1 mol / l Tris-hydrochloric acid at 0 ° C. Add 30 mg lysozyme and mix The mixture was incubated for 20 minutes at 0 ° C. Then the cells are mechanically and high pressure dispersed Completely lysed the DNA and digested the DNA with 2 mmol / l magnesium chloride and 1 mg deoxyribonu Digested for 30 minutes at 25 ° C by adding Crease (Boehringer Mannheim , Germany, Cat. No. 154709). Next, 50m, 160mmol EDTA, 6% Triton X100 , 1.5 mmol / l sodium chloride was added to the digestion solution at pH 7.0 and the mixture was further Incubated for 30 minutes at 0 ° C. Insoluble components (cell debris and IB) are Sorvall It was centrifuged and centrifuged. Pellet the pellet in 100 ml 0.1 mol phosphate buffer to pH 8 Resuspend at 0.5 and incubate at 25 ° C for 30 minutes and isolate IB product by centrifugation did. HIV (gp32) -CD44 exon 6 antigen using metal chelate chromatography Purification of   By stirring 2.5 g of IB pellets (fresh weight) at 25 ° C. for 2 hours, 25 m Suspended in 16 mol / l guanidine-hydrochloric acid, 0.1 mol / l phosphate buffer, pH 8.5. Insoluble The components were separated by centrifugation and the clear supernatant was 6 mol / l guanidine-HCl, Applied to an NTA column equilibrated with 0.1 mmol / l phosphate buffer, pH 8.5. Ram capacity: 50 ml, NTA gel from Diagen Company of Germany; Hochuli, E .; et al. ( 1988). Bio / Technology 6: 1321-1325).   The column consisted of approximately 5 column volumes of 8 mol / l urine, 10 mmol / l Tris-HCl, 0.01 mmo / l phosphorus. Washed with acid buffer, pH 8.5. Then HIV2 (gp32) -CD44 exon 6 antigen Was eluted with 8 mol / l urine and 0.01 mol / l phosphate buffer, pH 4.0, to give HIV2 (gp32) -CD44 Fractions containing the xon 6 antigen were pooled. HIV2 (gp32) -carrier antigen in E. coli Expression and isolation   Similar to the HIV2 (gp32) -CD44 exon 6 antigen, the HIV (gp) 32 antigen is plasmided. PDS56-6HIS-HIV2-gp32. Biotinylation of HIV2 (gp32) -CD34 exon 6 antigen   Biotinylated biotinyl-*-aminocarnic acid-N-hydroxy-succinimide (Bi-X-NHS) (Boehringer Mannheim, Germany Cat. No. 1003933) 1: 3 , 1: 6, 1:10. 8M urine, 0.1M sodium phosphate buffer, 10mM Tri Fusion protein HIV2 (gp32) present at a concentration of 7.1 mg / ml at about pH 6 in -CD44 exon 6 was added to dialysis buffer (0.1 M sodium phosphate buffer, 0.5% SDS, 10mMDTT, pH8.5), dialyzed against the above buffer at room temperature and further 1mg / ml Diluted to. Add the appropriate amount of Bi-X-NHS to the fusion protein and incubate at room temperature for about 2 hours. Incubate and stop the reaction by adding 1 M lysine / HCL, pH 6.5 to 2 mM Let After dialysis against 0.1 M sodium phosphate buffer, 0.5% SDS, pH 6.0, The reagent HIV2 (gp32) -CD44 exon 6-Bi was stored at -20 ° C.   Peptide HIV2 (gP32) was similarly biotinylated. References                               Example 9 Immunization of mice   Immunization of mice was performed according to Cianfriglia et al. (1983). Hybridoma, Vol.2, No.4:  Followed by 451-457. Bound to a carrier protein (see Example 7) as an immunogen Synthetic amino acids 1-13, 9-23, 19-33, 29-43 and 1-43 Tide and HIV2 (gp32) -CD44 exon 6 antigen were used.   12-week-old Balb / c mice in complete Freund's adjuvant with 50 μg immunogen Were immunized by intraperitoneal injection 15 days, 8 days before fusion. 3 days before the fusion , Immunize mice by intraperitoneal injection with 200 μg in PBS buffer, Two days before the fusion and the last day before the fusion, mice were given 100 μl by intraperitoneal injection and intravenous injection. The quarantine was included in PBS for immunization. Fusion and cloning Production of spleen cell suspension   The mice were killed by cervical dislocation and their spleens were removed under sterile conditions. Spleen Vesicles were removed from connective tissue in RPMI 1640 basal medium. Pass cell suspension through sieve And centrifuged with 200 g of RPMI basal medium (centrifuge tube). fusion   Spleen cells derived from immunized mice were added to P3 × 63Ag8-653 myeloma cells (ATCC CRL 8 375) and centrifuged (10 min, 300 g, 4 ° C). Cells in RPMI basal medium again Washed and centrifuged at 400g. Decant the supernatant and 1 ml PEG (Mr4000, Merck) Was added and mixed by pipetting. 1 minute after water bath, add 5 ml RPMI1640 basal medium Add dropwise over 5-6 minutes at room temperature, and mix the mixture and medium (RPMI1640 + 10% FCS) to 50 ml. I chose After this, it was centrifuged for 10 minutes at 400 g at 4 ° C. Settled cells in RPMI 1640 2.5% 10 / well in 96 well culture plate by adding 10% FCSFourSplenocytes 200 μl selective medium (100 μM hypoxanthine, 1 μg / ml azaserine in RPMI1640 + 10% FC (Contained in S) and inoculated. [FCS = fetal calf serum]   After 10 days, these primary cultures were tested for specific antibody synthesis. Appropriate The specific culture is cultivated in a 96 culture plate using FACS (cell sorter). I learned. As a growth factor, interleukin 6 (Boehringer Mannheim Ca t. No.1271172, 100 U / ml) was added to the medium.   In this way, the following hybridoma cell lines were isolated. Brauns It was deposited at the DMS facility in chweig.       MAK <CD44> M-1.1.12       MAK <CD44> -2.42.3       MAK <CD44> -4.3.16   Among CD44 exon 6 having the amino acid sequence shown in FIG. 7, MAK <CD44> M-1.1.1 For 2, a synthetic peptide corresponding to amino acids 9-23, for MAK <CD44> -2.42.3 Amino acids 29-43 are used, and for MAK <CD44> -4.3.16 amino acids 1-13 are used. It was Antibody production Antibody acquisition from ascites   5 x 106Peritoneum in 2 mice pretreated with 0.5 ml of Pristan It was injected internally. After 1-3 weeks, ascites with an IgG concentration of 5-20 mg was obtained. Antibody from this ascites Was isolated by conventional methods. Obtaining antibody from cell culture supernatant   The cybridoma cells were transferred to Techne biological agitator (THERMO-DUX, Wertheim / Mai n, Model MCS-104XL, Cat. No.144-050) by RPMI1640 + 10% FCS included 1 × TenFiveOperating at an inoculum concentration of cells / ml for 7 days. Average concentration of culture supernatant is 100 μg MA It was B / ml. Purification was performed using standard protein chemistry.                               Example 10 Antibody specificity generated Evaluation Antibodies to synthetic CD44 peptide   In order to demonstrate the antibody specificity of the hybridoma cell culture supernatant, a partial peptide And complete exon 6 reactivity measured in parallel by inhibition test did. 96-well titer plate (Nunc) at 200 μl / well streptavidin Coating with [10 μg, coating buffer = 0.2 mol / l carbonic acid / sodium bicarbonate] I'm sorry 1-13 biotin, 9-23 biotin after streptavidin coating , 29-43 biotin, etc., biotinylated peptide, c = 2.5 μg / ml Buffer [sodium phosphate buffer, 40 mM, 0.5% Crotein C, 100 μl / well, 1 Time incubation, room temperature]. Blocking buffer for free binding site [ 0.9% sodium chloride, 1% Crotein C, 200 μl, 30 minutes, room temperature].   Free peptide exon 6 (1-43) NH2, C = 5 μg / ml test and no test The antibody solution to be tested was added and incubated for 1 hour. Wash once more [0. 9% sodium chloride, 0.05% Tween], and then from a polyclonal antibody derived from sheep 100 μl for mouse κ and mouse λ [BM, mouse Ig measurement kit, bottle 2 and bottle 6] Fab fragment labeled with POD was added. Ink this for 1 hour at room temperature Was added. After further washing, 100 μl of colored substance [ABTS, BM: # 811769, # 68735 9] was incubated for 30 minutes at room temperature. Absorbance at 450/490 nm is measured by Dynatech M Measured with an R 700 microplate reader.   Later, all adherent cell line-positive antibodies were dot blotted and immunohistologically Screened by. Antibody to recombinant CD44 (fusion protein)   To measure antigen-body specificity derived from a fusion having recombinant CD44 as an antigen , Perform another screening test. For antibody samples, fusion protein To determine its reactivity with and cross-linking with HIV-gp32 in a parallel ELISA assay. I went to strike. Microtiter plates coated with streptavidin (Sec (See section 1) for biotinylated fusion protein HIV2 (gp32) -CD4 exon 6-Bi (XOSU) or HIV2 (gp32) -Bi (XOSU) [C = 5μg / ml, 100μl / well, 1 hour Room temperature]. Blocking buffer for free binding sites [0.9% sodium chloride Block with 200 ml of 1% Crotine C, room temperature for 30 minutes]. Washing step [0.9% salt Sodium bromide, 0.05% Tween], then 100μ per well, antibody sample c = 5-10μg / ml Dilute with incubation buffer (40 mM sodium phosphate buffer) for 1 hour Room temperature incubation I did. The following steps were performed as in the example above for peptide synthesis.   It has a strong reaction to recombinant CD44 and a weak response to HIV2 (gp32) protein. A primary culture with a bridge reaction was obtained. Such cultures include dot blots and immunizations. Further evaluation by histological methods. Measurement of antibody specificity for cells and tissues (Immunostaining)   Method A: Remove tumor cell line (ZR-75 1 or MDA 4A4) from flask by scraping The cell suspension was dropped on a glass slide, dried, and fixed with methanol.   Method B: Lyophilized sections of tumor and normal tissue were fixed with acetone.   Block with 5% skim milk-TBS at 37 ° C for 60 min, wash with TBS for 2 min, and sample ( Incubate undiluted cell culture supernatant for 120 minutes at 37 ° C with antibody did. After careful washing with TBS X3, further incubation was performed with biotinylated anti-antibody. It was carried out using Us Ig (Dakopatts) for 60 minutes at 37 ° C. After further washing (TBS), Add HRPO avidin-biotin complex (Dakopatts) and use sample for 60 minutes at room temperature Incubated. After washing with TBS X1, 1% glutaraldehyde solution for 1 minute Added at room temperature. After further washing step, add base (DAB) and use the sample Incubated (15-20 minutes). After washing with tap water, the nucleus is washed with hematoxylin for 30 minutes. Stained. Samples were dried and embedded in Cristal Mount (Kaiser jelly).   Using monoclonal antibodies from the cell lines MAB <CD44> M-1.1.12 and 4.3.16 The obtained results are shown in Table 4. In method B, MAB <CD44> 1.1.12 MAB <4.3.16> is colon-derived. Showed specificity for the tumor tissue of. Method A is for MAB1.1.12 and MAB4.3.16 Compared to cell line MDA4A4 (exon 6 low product), cell line ZR-75-1 (exon 6 high product) Product), and the response to the human breast cancer cell line (ATCC CRL 1500) was high. This thin Cell line is a subclone of the cell line MDA-MB-435S (ductal carcinoma, bladder, human; ATCCH TB 129; subclone is Baoet al, Differentiaion 52 (1993), 239-246; M DA4A4 is the reference of the text MDA-MB-435-C2).   In primary cultures obtained with the recombinantly produced CD44 fusion protein as the immunogen (see above) ), Cultured PK 9.00.22 has a high specificity for colon tumor tissue using Method B. Indicated. Using Method A, this cultured cell line was also marked against the cell line ZR75-1. Showed sex. Antibody generated by dot blot Specificity measurement Preparation of cell extract   Cell lines HT29 (ATCCHTB 38-Colon adenocarcinoma) and MDA4A4 according to ATCC catalog The medium was cultivated by adding the protease adduct, and the protease adduct was collected selectively.   Centrifuge cells harvested without the use of protease adducts to double volume of lysis Add to buffer (50 mM potassium phosphate buffer, 150 mM sodium chloride, pH 8.0) It was included in an unce homogenizer and homogenized to measure the amount of protein. this Detergent [1% Triton X-100 (Boehringer Mann heim, Germany Cat. No. 743119), 0.6% CHAPS (Boehringer Mannheim, G erm any Cat. No. 810681), 1% HECAMEG (Boehringer Mannheim, Germany Cat. No. 1382225), 0.9% octyl glucoside (Boehringer Mannheim, Germany Cat. No. ． 411469) or 0.05% dodecyl maltoside (Boehringer Mannheim, Germany Ca t. No. 808342)] is used to selectively increase the protein concentration to 1 using the cell suspension. -Adjusted to 2 mg / ml and stirred for 2 hours. CD44 or CD44v after centrifugation Were stored at 4 ° C or -20 ° C and the usage was unchanged. Obtained after centrifugation of the membrane The supernatant was collected from CD44 (standard type) and CD44v (CD44 containing another exon). ) Was sufficiently included for antibody evaluation. Due to cellular mRNA concentration, MDA4A4 Is an exon CD44vHT29 cell containing a large amount of CD44 standard type and containing exon 6 Is assumed to contain almost none of the It is desirable to include 44v.   Another simple method by which CD44 or CD44v can be obtained is the following. Instead of collecting cells with trypsin instead of collecting cells as described above, is there. Also the supernatant obtained after adding trypsin inhibitor and centrifuging from the cells , CD44 and CD44v are included for antibody evaluation. Antibody evaluation by dot blot   Various solutions (according to Example 7 amino acid sequence 1-43 shown in Figure 7 synthetic CD 44 exon 6 peptide, HT29 cell extract, MDA4A4 cell extract) Used for nitrocellulose. After blocking with Crotein C, use antibody (AB) Incubation of nitrocellulose was performed. Similar to antibodies, various MABs The <CD44> -M cell line supernatant was used. The detection of bound Ab is based on alkaline phosphate. Was carried out using a polyclonal anti-Ig antibody conjugated to the genotype. NBT / X for colonic reactions Phosphate was used.   Reaction specificity depends on the free peptide prior to nitrocellulose incubation. Shown by adding to Ab. Reaction specific to exon 6 or CD44v If not, AB will not bind to nitrocellulose after addition of free peptide. Squid, very little binds. The best results with the following clones It was.     MAB 〈CD44〉 M-1.1.12     MAB <CD44> M-2.42.3   The following compounds are capillary nitrocellulose (Schleriher & Schuell 401180) Spotted using. A: Synthetic product CD exon 6, 1-43-NH2, (0.1mg / ml) B: HT29 extract (1.2 mg / ml) C: MDA4A4 extract (1.35mg / ml)   Incubation buffer (20 mM Tris / HCL, 150 mM NaCl, 1% Crotein C, pH 7. After blocking the nitrocellulose with 4), in each case 2 or 3 drops of 1 block of (For each case: 1: 4 diluted or undiluted in incubation buffer) , 1:16, 1:64, 1: 256 and 1: 1024) incubation with cell culture supernatant Was done. The binding antibodies were PAB <M-Ig> S-Fab-Ap and 5-bromo-4-chloro-3-indo Ryl-phosphate / 4-nitroblue-tetrazolium chloride (NBT / X phosphate Was detected as a dye base.   To test AB specificity, one of 10 fg / ml of free exon 6,1-43 peptide was tested. One was pre-incubated with the antibody and the test was performed in parallel. Desirably, inhibition is observed for exon 6 specific reactions.   Anti-cells produced by the cell lines MAK 〈CD44〉 M-1.1.12 and MAK 〈CD44〉 M-2.42.3 Body binds to doted CD44 exon 6 peptide and extract of HT29 cells But it cannot bind to MDA4A4 cells. Monoclonal anti Extracting the body with dotted CD44 exon 6 peptide and HT29 cells Pre-incubating both antibodies with synthetic CD44 exon 6 Inhibits the binding of antigen to nitrocellulose, so CD44v It is specific to the tumor-specific variant of. (Table 5)

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/705 19/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/02 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/574 Ａ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ (31)優先権主張番号 ＰＣＴ／ＧＢ９３／０１５２０ (32)優先日 1993年７月20日 (33)優先権主張国 世界知的所有権機構（ＷＯ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI C07K 14/705 19/00 C12N 5/10 15/02 15/09 ZNA C12P 21/08 9358-4B G01N 33 / 53 D 8310-2J 33/574 A 8310-2J 33/577 B 8310-2J // (C12P 21/08 C12R 1:91) 9162-4B C12N 15/00 ZNA A (31) Priority claim number PCT / GB93 / 01520 (32) Priority date July 20, 1993 (33) Priority claiming countries World Intellectual Property Organization (WO) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), CA, JP, US

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． 図７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソン６に対応するペプ チド、その対立変異型、リン酸化生成物、グリコシル化生成物およびその標徴フ ラグメントに特異的な抗体。 ２． モノクローナルまたはポリクローナルであることを特徴とする請求の範囲 第１項記載の抗体。 ３． ハイブリドーマ細胞系MAK〈CD44〉M-1.1.12、MAK〈CD44〉M-2.42.3または MAK〈CD44〉M-4.3.16によって得られる図７に示されるアミノ酸配列を有するＣ Ｄ４４エキソン６に対応するペプチドに特異的なモノクローナル抗体。 ４． ハイブリドーマ細胞系MAK〈CD44〉M-1.1.12、MAK〈CD44〉M-2.42.3または MAK〈CD44〉-4.3.16によって生成されるモノクローナル抗体と同一のエピトープ を認識する請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 ５． 請求の範囲第１項記載の抗体を生成する方法において、適切な実験動物に 図７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソンに対応するペプチド、そ の対立変異型またはそのフラグメントを含む効果的な量の抗原化合物を注入し、 該実験動物から血清を収集し、免疫吸着技術によって特異的抗体を単離すること を含む方法。 ６． 請求の範囲第１項記載の抗体を生成する方法において、適切な実験動物に 、図７に示すアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソン６に対応するペプチド、そ の対立変異型またはその標徴フラグメントを含む効果的な量の抗原化合物を注入 し、抗体産生細胞を単離し、該細胞を不死化させ、請求の範囲第１項記載の抗体 を産生する不死細胞系をスクリーニングし、前記不死細胞系をクローニングし、 腹水症から得られた抗体または培養された不死細胞系の上澄みを得ることを含む ことを特徴とする方法。 ７． 請求の範囲第５項または第６項記載の抗体を生成する方法において、免疫 原として適切な免疫原担体に結合された請求の範囲第１７項記載の融合タンパク 質または請求の範囲第１３項記載のペプチドを使用することを特徴とする方法。 ８． ＣＤ４４エキソン６に対応するペプチドを含むＣＤ４４タンパク質を検出 する免疫検定法であって、図７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソ ン６ペプチド、その対立変異型またはその標徴フラグメントを使用することを特 徴とする免疫検定法。 ９． ＣＤ４４タンパク質の検出に請求の範囲第１項から第４項のいずれか記載 の抗体を使用する方法。 １０．癌診断に請求の範囲第１項から第４項のいずれか記載の抗体を使用する方 法。 １１．抗原特異的免疫錯体の検出に請求の範囲第１項から第４項のいずれか記載 の抗体を使用する方法。 １２．図７に示すアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソン６に応じたペプチド配 列、その対立変異型またはその標徴フラグメントを含む免疫検定において使用す る標準化合物。 １３．図７に示すアミノ酸配列に対応するアミノ酸の長さの少なくとも６個分の ペプチド、その対立変異型またはその標徴フラグメント。 １４．標識または固相に直接もしくは間接に２つの特異的結合相手によって結合 される請求の範囲第１３項記載の方法。 １５．免疫検定において請求の範囲第１３項記載のペプチドを使用する方法。 １６．請求の範囲第１項から第４項記載の抗体を少なくとも１つ含むことを特徴 とするテストキット。 １７．図７に示すアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソン６に対応するペプチド 、その対立変異型またはその標徴フラグメントを含む融合タンパク質。 １８．図７に示すエキソン６、その対立変異型またはその標徴フラグメントを含 む融合遺伝子。 １９．図７に示すアミノ酸配列を有するＣＤ４４エキソン６に対応するペプチド 、その対立変異型、燐酸化生成物、グリコシル化生成物およびその標徴フラグメ ントに特異的な抗体を、腫瘍療法用の治療剤または腫瘍のin vivo撮像用の薬剤 を製造するために使用する方法。 ２０．前記抗体がモノクローナルであることを特徴とする請求の範囲第１９項記 載の抗体を使用する方法。 ２１．前記抗体がハイブリドーマ細胞系MAK〈CD44〉M-1.1.12、MAK〈CD44〉M-2. 42.3またはMAK〈CD44〉M-4.3.16によって得られる図７に示されるアミノ酸配列 を有するＣＤ４４エキソン６に対応するペプチドに対するモノクローナル抗体で あることを特徴とする請求の範囲第１９項または第２０項記載の抗体を使用する 方法。 ２２．ハイブリドーマ細胞系MAK〈CD44〉M-1.1.12、MAK〈CD44〉M-2.42.3または MAK〈CD44〉M-4.3.16によって産生されるモノクローナル抗体と同一のエピトー プを認識することを特徴とする請求の範囲第１９項または第２０項記載の抗体を 使用する方法。 ２３．前記抗体が標徴フラグメント、キメラ抗体、ヒューマナイズド抗体または ヒト型抗体であることを特徴とする請求の範囲第１９項から第２２項までに記載 の抗体を使用する方法。 ２４．前記抗体がヒトIgG1抗体であることを特徴とする請求の範囲第１９項から 第２３項記載のモノクローナル抗体を使用する方法。 ２５．前記抗体がフラグメント、キメラ抗体、ヒューマナイズド抗体またはキメ ラヒト型抗体であることを特徴とする請求の範囲第１項から第４項記載のモノク ローナル抗体。 ２６．前記抗体がヒトIgG1抗体であることを特徴とする請求の範囲第１項から第 ４項または第２５項記載のモノクローナル抗体。[Claims] 1. Antibodies specific for the peptide corresponding to CD44 exon 6 having the amino acid sequence shown in Figure 7, its allelic forms, phosphorylation products, glycosylation products and characteristic fragments thereof. 2. The antibody according to claim 1, which is monoclonal or polyclonal. 3. Corresponds to CD44 exon 6 having the amino acid sequence shown in FIG. 7 obtained by the hybridoma cell line MAK <CD44> M-1.1.12, MAK <CD44> M-2.42.3 or MAK <CD44> M-4.3.16 Antibody specific for the peptide. 4. Claim 1 which recognizes the same epitope as the monoclonal antibody produced by the hybridoma cell line MAK <CD44> M-1.1.12, MAK <CD44> M-2.42.3 or MAK <CD44> -4.3.16. The described monoclonal antibody. 5. A method for producing an antibody according to claim 1, wherein a suitable experimental animal is provided with an effective amount of a peptide corresponding to the CD44 exon having the amino acid sequence shown in FIG. 7, an allelic variant thereof or a fragment thereof. A method comprising injecting an antigenic compound, collecting serum from the experimental animal, and isolating specific antibodies by immunoadsorption techniques. 6. A method for producing the antibody according to claim 1, which is effective in containing a peptide corresponding to CD44 exon 6 having the amino acid sequence shown in FIG. 7, an allelic variant thereof, or a characteristic fragment thereof, in the method for producing the antibody according to claim 1. Injecting a sufficient amount of the antigenic compound, isolating the antibody-producing cells, immortalizing the cells, screening the immortal cell line that produces the antibody of claim 1, cloning the immortal cell line, A method comprising obtaining an antibody obtained from ascites or a supernatant of a cultured immortal cell line. 7. A method for producing an antibody according to claim 5 or 6, wherein the fusion protein according to claim 17 or a fusion protein according to claim 13 bound to an immunogen carrier suitable as an immunogen. A method characterized by using a peptide. 8. An immunoassay method for detecting a CD44 protein containing a peptide corresponding to CD44 exon 6, characterized by using a CD44 exon 6 peptide having an amino acid sequence shown in FIG. 7, an allelic variant thereof or a signature fragment thereof. Immunoassay. 9. A method of using the antibody according to any one of claims 1 to 4 for detecting CD44 protein. 10. A method of using the antibody according to any one of claims 1 to 4 for cancer diagnosis. 11. A method of using the antibody according to any one of claims 1 to 4 for detecting an antigen-specific immunocomplex. 12. A standard compound for use in an immunoassay comprising a peptide sequence corresponding to CD44 exon 6 having the amino acid sequence shown in FIG. 7, an allelic variant thereof or a signature fragment thereof. 13. A peptide of at least 6 amino acids in length corresponding to the amino acid sequence shown in FIG. 7, an allelic variant thereof or a signature fragment thereof. 14. 14. The method according to claim 13, wherein the label or the solid phase is bound directly or indirectly by two specific binding partners. 15. A method of using the peptide according to claim 13 in an immunoassay. 16. A test kit comprising at least one of the antibodies according to claims 1 to 4. 17． A fusion protein comprising a peptide corresponding to CD44 exon 6 having the amino acid sequence shown in FIG. 7, an allelic variant thereof or a signature fragment thereof. 18. A fusion gene comprising exon 6 shown in FIG. 7, an allelic variant thereof, or a signature fragment thereof. 19. Antibodies specific for a peptide corresponding to CD44 exon 6 having the amino acid sequence shown in FIG. 7, allelic variants, phosphorylation products, glycosylation products and characteristic fragments thereof are used as therapeutic agents for tumor therapy or tumors. The method used to manufacture a drug for in vivo imaging of. 20. 20. A method of using the antibody of claim 19, wherein the antibody is monoclonal. 21. The antibody is obtained by the hybridoma cell lines MAK <CD44> M-1.1.12, MAK <CD44> M-2.42.3 or MAK <CD44> M-4.3.16, the CD44 exon 6 having the amino acid sequence shown in FIG. 21. A method of using the antibody according to claim 19 or 20, which is a monoclonal antibody against the peptide corresponding to. 22. Characterized by recognizing the same epitope as the monoclonal antibody produced by the hybridoma cell lines MAK <CD44> M-1.1.12, MAK <CD44> M-2.42.3 or MAK <CD44> M-4.3.16 A method of using the antibody according to claim 19 or 20. 23. 23. The method of using an antibody according to claims 19 to 22, wherein the antibody is a characteristic fragment, a chimeric antibody, a humanized antibody or a humanized antibody. 24. 24. A method of using the monoclonal antibody according to claims 19 to 23, wherein the antibody is a human IgG1 antibody. 25. The monoclonal antibody according to any one of claims 1 to 4, wherein the antibody is a fragment, a chimeric antibody, a humanized antibody, or a chimeric human antibody. 26. 26. The monoclonal antibody according to any one of claims 1 to 4 or 25, wherein the antibody is a human IgG1 antibody.
JP6512889A 1992-11-20 1993-11-22 Peptides corresponding to CD44 exon 6, antibodies specific to the peptides, and methods of using these antibodies for tumor diagnosis Pending JPH08506801A (en)

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