JP6793514B2 - Antibodies that bind to novel thyroid cancer-related antigens and thyroid cancer diagnostic agents - Google Patents
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Description
本発明は、甲状腺癌患者の血液から単離される新規甲状腺癌関連抗原に関連し、その新規抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、およびその抗体または抗原結合断片を有効成分とする、血液試料からの甲状腺癌診断剤、および診断用キットに関する。 The present invention relates to a novel thyroid cancer-related antigen isolated from the blood of a thyroid cancer patient, and comprises an antibody or an antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the novel antigen, and an antibody or antigen-binding fragment thereof. , Thyroid cancer diagnostic agents from blood samples, and diagnostic kits.
甲状腺のしこりは甲状腺結節と呼ばれ、女性の１２〜１５人に１人、男性の４０〜５０人に１人の割合で存在するが、８０％以上は良性で癌ではない。甲状腺癌は、甲状腺乳頭癌が８５〜９５％、甲状腺濾胞癌が５〜１５％を占め、その予後は乳頭癌では良好であるものの、それでも約１０〜１５％では肺、骨、リンパ節に転移する。良性か悪性かを検査するための最も信頼できる検査は、穿刺吸引細胞診（ＦＮＡ）であるが、穿刺の必要のない非侵襲性の手法で検査できる甲状腺癌の診断が、その早期検出のために望まれている。 Thyroid lumps, called thyroid nodules, are present in 1 in 12 to 15 women and 1 in 40 to 50 men, but more than 80% are benign and non-cancerous. As for thyroid cancer, papillary thyroid cancer accounts for 85 to 95% and follicular thyroid cancer accounts for 5 to 15%, and although the prognosis is good for papillary cancer, metastasis to lung, bone, and lymph nodes still occurs in about 10 to 15%. To do. The most reliable test for benign or malignant is fine needle aspiration cytology (FNA), but the diagnosis of thyroid cancer, which can be done by a non-invasive method that does not require fine needle, is for early detection. Is desired.
出願人は、甲状腺癌組織由来であって癌細胞膜上に存在する甲状腺癌関連抗原を発見し、その抗原に特異的に結合する抗体を取得した（特許文献１）。さらに出願人は、その抗体を甲状腺癌組織中の癌細胞の検出に用いるため、可視化する方法を検討し（非特許文献１〜３）、その抗体をナノ粒子であるQuantum Dotsと結合させて可視化すると、抗体が甲状腺癌細胞膜上の癌関連抗原に特異的に結合することを観察している。 The applicant discovered a thyroid cancer-related antigen derived from thyroid cancer tissue and present on the cancer cell membrane, and obtained an antibody that specifically binds to the antigen (Patent Document 1). Furthermore, the applicant examined a visualization method for using the antibody for detection of cancer cells in thyroid cancer tissue (Non-Patent Documents 1 to 3), and visualized the antibody by binding it to Quantum Dots, which is a nanoparticle. Then, the antibody is observed to specifically bind to the cancer-related antigen on the thyroid cancer cell membrane.
癌の早期検出と診断は延命効果に影響するため、侵襲性外科手術による切除検体をスクリーニングすることによる癌の診断に代わるものとして、容易に得られる生物学的試料、例えば血液、粘膜分泌物に存在する腫瘍関連抗原を特定する試みが、多くの研究者により行われているところ（特許文献２）、甲状腺癌に関連する抗原マーカーが血流中へ放出され、血液中に存在することは今まで知られていなかった。
そこで、本発明は、甲状腺癌を早期発見するために、血液中に存在する可溶性形態の甲状腺癌関連抗原を特定し、その抗原に特異的に結合する抗体を使用することにより、血液試料で良性の甲状腺結節と悪性のものを区別することができるという、早期診断の向上を目的とする。
Because early detection and diagnosis of cancer affects life-prolonging effects, readily available biological samples such as blood and mucosal secretions can replace the diagnosis of cancer by screening resected specimens from invasive surgery. Attempts to identify existing tumor-related antigens have been made by many researchers (Patent Document 2), and thyroid cancer-related antigen markers are now released into the bloodstream and present in the blood. Was not known until.
Therefore, the present invention identifies a soluble form of a thyroid cancer-related antigen present in blood and uses an antibody that specifically binds to the antigen in order to detect thyroid cancer at an early stage, thereby benign in a blood sample. The purpose is to improve early diagnosis by being able to distinguish between thyroid nodules and malignant ones.
上記特許文献１に記載された甲状腺癌組織の癌細胞膜に存在する癌関連抗原に結合するモノクローナル抗体は、ヒト甲状腺乳頭癌組織をホモジェナイズし、遠心分離により破砕された細胞を除去して、その上清をショ糖連続密度勾配で分画し、1.16〜1.21の密度の分画の膜画分を免疫原としてマウスを免疫して常法により取得したものであり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１で示されるアミノ酸配列であり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で示されるアミノ酸配列であるＩｇＭ抗体である。この抗体は、ＥＬＩＳＡによる492nmの吸光度での結合活性測定によれば、100μg/mlの抗原濃度で最大の結合活性を示し、20μg/mlの抗原濃度で最大の半分の結合活性を示した。この抗体を可視化すると、抗体が甲状腺癌細胞膜上の抗原と特異的に結合し、その他の癌細胞や正常細胞には結合しないことが確認され、甲状腺組織切片を用いた甲状腺癌の診断に使用できることが示された。 The monoclonal antibody that binds to a cancer-related antigen present in the cancer cell membrane of the thyroid cancer tissue described in Patent Document 1 homogenizes human papillary thyroid cancer tissue, removes cells disrupted by centrifugation, and further. Qing was fractionated by a sucrose continuous density gradient, and the membrane fraction of the fraction with a density of 1.16 to 1.21 was used as an immunogen to immunize mice and obtained by a conventional method. The amino acid sequence of the light chain variable region was obtained. It is an IgM antibody which is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 and whose heavy chain variable region amino acid sequence is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2. This antibody showed maximum binding activity at an antigen concentration of 100 μg / ml and half the maximum binding activity at an antigen concentration of 20 μg / ml, as measured by ELISA at 492 nm absorbance. Visualization of this antibody confirms that the antibody specifically binds to the antigen on the thyroid cancer cell membrane and does not bind to other cancer cells or normal cells, and can be used for thyroid cancer diagnosis using thyroid tissue sections. It has been shown.
この抗体と結合する癌関連抗原は、癌細胞膜に結合しており、細胞質の中には存在していない．癌細胞を溶解してＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけると、見かけ上の分子量が約１３０ｋＤａである糖タンパク質であった。一方、甲状腺癌細胞を培養してその培養上清に分泌される糖タンパク質にも、この抗体が結合することがわかった。培養上清中に存在する抗原は、見かけ上の分子量が約２５０ｋＤａである糖タンパク質であり、細胞膜に結合している抗原とは異なる大きさであった。タンパク質は、アミノ酸配列決定するとフィブロネクチンであった。 The cancer-related antigen that binds to this antibody is bound to the cancer cell membrane and is not present in the cytoplasm. When the cancer cells were lysed and subjected to SDS-PAGE, it was a glycoprotein having an apparent molecular weight of about 130 kDa. On the other hand, it was found that this antibody also binds to glycoprotein secreted from the culture supernatant of thyroid cancer cells. The antigen present in the culture supernatant was a glycoprotein having an apparent molecular weight of about 250 kDa, and had a size different from that of the antigen bound to the cell membrane. The protein was fibronectin when sequenced amino acids.
そして、甲状腺癌患者の血液中に、該抗体で検出可能な量でこの新規癌関連抗原が存在するかどうかを試験したところ、患者のほぼ半数にこの抗体と癌関連抗原の免疫複合体の存在が検出でき、この癌関連抗原に特異的に結合する抗体を、血液試料を用いた甲状腺癌の診断に用いることができることが確認された。 Then, when it was tested whether or not the novel cancer-related antigen was present in the blood of thyroid cancer patients in an amount detectable by the antibody, almost half of the patients had an immune complex of this antibody and the cancer-related antigen. It was confirmed that an antibody that specifically binds to this cancer-related antigen can be used for diagnosing thyroid cancer using a blood sample.
本発明の第１の発明は、甲状腺癌患者の血液から単離されたN-結合型糖鎖と結合したフィブロネクチンであって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけ上の分子量が約２５０ＫＤａの甲状腺癌関連抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。 The first invention of the present invention is a fibronectin bound to an N-linked sugar chain isolated from the blood of a thyroid cancer patient, which is a thyroid cancer-related antigen having an apparent molecular weight of about 250 kDa by SDS-PAGE. An antibody that specifically binds or an antigen-binding fragment thereof.
本発明の第２の発明は、その甲状腺癌関連抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を有効成分とする、血液試料による甲状腺癌診断剤である。 The second invention of the present invention is a thyroid cancer diagnostic agent using a blood sample containing an antibody that specifically binds to the thyroid cancer-related antigen or an antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
本発明の第３の発明は、血液試料による甲状腺癌診断剤を含む診断用キットである。 The third invention of the present invention is a diagnostic kit containing a thyroid cancer diagnostic agent using a blood sample.
本発明は、甲状腺癌患者の血液に存在する甲状腺癌関連抗原に関連し、その抗原に特異的に結合する抗体を用いる、甲状腺癌の早期検出のための診断剤及び診断用キットを提供する。 The present invention provides a diagnostic agent and a diagnostic kit for early detection of thyroid cancer, which is associated with a thyroid cancer-related antigen present in the blood of a thyroid cancer patient and uses an antibody that specifically binds to the antigen.
[定義]
本明細書で使用する場合、「約」は、プラスマイナス１０％を意味する。例えば、約２５０は、２２５〜２７５の任意の数を含む。
用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を含み、キメラ抗体、ヒト化抗体を含む。抗体は、癌関連抗原と、約１０４Ｍ−１以上の、好ましくは約１０５Ｍ−１以上の、さらに好ましくは約１０６Ｍ−１以上の、さらにより好ましくは約１０７Ｍ−１以上のＫａで結合する場合に、「特異的に結合する」と規定される。抗原または抗体の親和性は、慣用的手法（例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６０（１９４９））を用いて、容易に決定され得る。
用語「抗体の抗原結合断片」とは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどの、全長抗体と同じエピトープに結合する抗体の断片を意味する。
用語「血液試料」は、動物（ヒトを含む）から得られる血液、血清、血漿を意味する。
[Definition]
As used herein, "about" means plus or minus 10%. For example, about 250 includes any number of 225 to 275.
The term "antibody" includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and includes chimeric antibodies and humanized antibodies. Antibodies are associated with cancer-related antigens of about 10 4 M -1 or higher, preferably about 10 5 M -1 or higher, even more preferably about 10 6 M -1 or higher, even more preferably about 10 7 M -1. When binding with the above Ka, it is defined as "specifically binding". The affinity of an antigen or antibody can be readily determined using conventional methods (eg, Scatchard et al. Ann. NY Acad. Sci. 51:60 (1949)).
The term "antigen-binding fragment of an antibody" means a fragment of an antibody that binds to the same epitope as a full-length antibody, such as F (ab') 2 , Fab', Fab, Fv, sFv.
The term "blood sample" means blood, serum, plasma obtained from animals (including humans).
甲状腺癌患者の血液中に存在する新規癌関連抗原は、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１で示されるアミノ酸配列であり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で示されるアミノ酸配列であるＩｇＭ抗体を担体に固定化した後、甲状腺癌患者の血清試料と十分接触させた後、抗体に結合したタンパク質を溶出液で溶出させて単離精製することができる。 The novel cancer-related antigen present in the blood of thyroid cancer patients is the amino acid sequence of the light chain variable region shown by SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the heavy chain variable region shown by SEQ ID NO: 2. The IgM antibody is immobilized on a carrier, and after sufficient contact with a serum sample of a thyroid cancer patient, the protein bound to the antibody can be eluted with an eluent for isolation and purification.
甲状腺癌関連抗原に特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗血清として、またはモノクローナル抗体として、例えばＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９）の技法および改良技法を用いて調製される。甲状腺癌関連抗原をアジュバントと混合して免疫原として、マウス等の動物に注射し、数回免疫した後、脾臓を摘出して脾臓細胞と骨髄腫細胞を融合させ、融合細胞の増殖は支持するが骨髄腫細胞の増殖は支持しない選択培地、例えばＨＡＴ培地中で選択される。約１〜２週間後ハイブリドーマのコロニーが観察され、抗原との結合活性が試験され、高い特異性と結合性を有するハイブリドーマが選択され、モノクローナル抗体は、増殖中のハイブリドーマのコロニーの上清から単離され得る。例えば抗体は、固定化プロテインＧまたはプロテインＡ上でのクロマトグラフィーにより精製される。 Antibodies that specifically bind to thyroid cancer-related antigens are prepared as polyclonal antisera or as monoclonal antibodies, eg, using the techniques and improvements of Kohler and Milstein (1976 Eur. J. Immunol. 6: 511-519). Will be done. A thyroid cancer-related antigen is mixed with an adjuvant and injected into an animal such as a mouse as an immunogen, and after immunization several times, the spleen is removed and the spleen cells and myeloma cells are fused to support the proliferation of the fused cells. However, it is selected in a selective medium that does not support the growth of myeloma cells, such as HAT medium. After about 1 to 2 weeks, hybridoma colonies were observed, antigen-binding activity was tested, hybridomas with high specificity and binding were selected, and monoclonal antibodies were simply extracted from the supernatant of growing hybridoma colonies. Can be separated. For example, the antibody is purified by chromatography on immobilized protein G or protein A.
ハイブリドーマから、モノクローナル抗体の可変領域をコードするＤＮＡをクローニングする一般的な技術は、Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ８６：３８３３（１９８９）に記載されており、ＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥ法により抗体の可変軽鎖遺伝子と可変重鎖遺伝子をコードするＤＮＡがクローニングされ、上記Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．に記載されるように、キメラ抗体として、細胞培養で発現させることもできる。また、可変軽鎖遺伝子と可変重鎖遺伝子のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列により、それぞれの相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）が決定され、ヒト化抗体を産生するための技術（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ８９：４２８５（１９９２））により、ＣＤＲグラフト化され、ヒト化抗体を作成する。 Common techniques for cloning DNA encoding the variable region of a monoclonal antibody from a hybridoma are described in Orlandi et al. PNAS 86: 3833 (1989), the DNA encoding the variable light chain gene and the variable heavy chain gene of the antibody was cloned by the RT-PCR, 5'-RACE method, and the above Orlandi et al. As described in, it can also be expressed in cell culture as a chimeric antibody. In addition, the complementarity determining regions (CDRs) and framework regions (FRs) are determined by the amino acid sequences deduced from the DNA sequences of the variable light chain gene and the variable heavy chain gene, and for producing humanized antibodies. By techniques (eg, Carter et al. PNAS 89: 4285 (1992)), CDR grafting is performed to produce humanized antibodies.
癌関連抗原に特異的なモノクローナル抗体の、抗原に対する結合能力は、間接的酵素免疫アッセイ、フローサイトメトリー解析、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、またはウエスタンブロット解析を用いて確認することができる。 The ability of a monoclonal antibody specific for a cancer-related antigen to bind to the antigen can be confirmed using an indirect enzyme immunoassay, flow cytometry analysis, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), or Western blot analysis.
抗体またはその抗原結合断片を、血液試料による甲状腺癌の診断剤として用いる態様は、試料中の抗原を検出するための当業者に周知の種々の方法により行うことができる。例えば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット解析、免疫蛍光測定法、免疫沈降法、平衡透析、免疫拡散法等がある。ウエスタンブロット解析では、血液試料からのタンパク質調製物はゲル電気泳動に付され、膜に移されて抗体と反応させて検出され得る。 A mode in which an antibody or an antigen-binding fragment thereof is used as a diagnostic agent for thyroid cancer using a blood sample can be carried out by various methods well known to those skilled in the art for detecting an antigen in a sample. For example, ELISA, radioimmunoassay (RIA), Western blotting, immunofluorescence measurement, immunoprecipitation, equilibrium dialysis, immunodiffusion and the like. In Western blot analysis, protein preparations from blood samples can be detected by subjecting them to gel electrophoresis, transferring them to a membrane and reacting them with antibodies.
また、例えば抗体を固体支持体上に固定して、抗原を含む血液試料と結合させた後、残りの試料を除去する。結合した抗原は次いで、抗原と結合する第二の抗体、例えば検出可能なレポーター部分を含有する試薬を用いて検出され得る。固体支持体は当業者に周知の任意の材料であり、抗体が結合可能であればよく、例えば、マイクロプレートウエル中の試験ウエル、ニトロセルロースフィルター、ビーズまたは円板としてはガラス、ファイバーグラス、ラテックス、プラスチック（ポリスチレン、ポリ塩化ビニル）である。抗体は、当業者の周知の技法を用いて固体支持体に結合され得る。 Also, for example, the antibody is immobilized on a solid support, bound to a blood sample containing an antigen, and then the remaining sample is removed. The bound antigen can then be detected using a second antibody that binds to the antigen, eg, a reagent containing a detectable reporter moiety. The solid support is any material well known to those skilled in the art and may be capable of binding antibodies, such as test wells in microplate wells, nitrocellulose filters, glass as beads or discs, fiberglass, latex. , Plastic (polystyrene, polyvinyl chloride). The antibody can be attached to a solid support using techniques well known to those of skill in the art.
二抗体サンドイッチアッセイでは、血液試料中の抗原は、一般的にはマイクロプレートのウエルに固定された第一の抗体と免疫複合体を形成するように、室温で３０分間インキュベートされ、試料の非結合成分を固定化免疫複合体から除去した後、第二の抗体が付加される。第二の抗体の抗原結合部位は、第一の抗体の抗原との結合を競合的に阻害しない。第二の抗体は、直接検出され得るよう検出可能に標識され得るか、検出可能に標識された第二段階の抗抗体の使用により、または、特異的検出試薬の使用により間接的に検出され得る。第一の抗体または第二の抗体は、抗原に特異的なポリクローナル抗体であってもよい。 In a two-antibody sandwich assay, the antigen in a blood sample is incubated for 30 minutes at room temperature to form an immune complex, typically with the first antibody immobilized in the wells of a microplate, and the sample is unbound. After removing the component from the immobilized immune complex, a second antibody is added. The antigen-binding site of the second antibody does not competitively inhibit the binding of the first antibody to the antigen. The second antibody can be detectably labeled so that it can be detected directly, or can be detected indirectly by the use of a detectably labeled second step anti-antibody, or by the use of a specific detection reagent. .. The first antibody or the second antibody may be an antigen-specific polyclonal antibody.
第二の抗体は、検出可能なレポーター部分または標識、例えば酵素、染料、放射性核種、発光基、蛍光基、またはビオチン等を含有し得る。固体支持体に結合している第二の抗体の量は、特異的な検出可能なレポーター部分または標識について適切な方法を用いて決定される。放射性基については、シンチレーション計数またはオートラジオグラフ法が一般的であり、抗体−酵素接合体は、種々のカップリング技術を用いて調製され得る。分光法を使用して、色素（例えば、酵素反応の比色生成物を含む）、発光基、蛍光基を検出し得る。ビオチンは、異なるレポーター基（通常は、放射性基、蛍光基、酵素）に連結されたアビジンまたはストレプトアビジンを用いて検出され得る。酵素レポーター基は、基質の付加（一般に特定時間の）と、その後の分光分析、分光光度分析、または反応産物のその他の分析により検出され得る。 The second antibody may contain a detectable reporter moiety or label, such as an enzyme, dye, radionuclide, luminescent group, fluorescent group, biotin, or the like. The amount of second antibody bound to the solid support is determined using appropriate methods for specific detectable reporter moieties or labels. For radioactive groups, scintillation counting or autoradiographing is common, and antibody-enzyme conjugates can be prepared using a variety of coupling techniques. Spectroscopy can be used to detect dyes (eg, including colorimetric products of enzymatic reactions), luminescent groups, fluorescent groups. Biotin can be detected using avidin or streptavidin linked to different reporter groups (usually radioactive groups, fluorescent groups, enzymes). Enzyme reporter groups can be detected by substrate addition (generally at a specific time) followed by spectroscopic analysis, spectrophotometric analysis, or other analysis of the reaction product.
本発明の診断用キットには、抗体またはその抗原結合断片の他に、上記のような抗原と抗体との免疫複合体を検出する種々の態様に使用するための診断用材料が包含され得る。
また、本発明の診断用キットには、抗体またはその抗原結合断片は、抗体の滅菌液体処方物または凍結乾燥製剤として含むことができ、試薬やキットを使用するための取扱説明書を含むことができる。キット構成要素は、１つにまとめて包装してもよいし、２つ以上の容器に分けてもよい。容器は、再構成に好適な診断用組成物の滅菌凍結乾燥処方物を含むバイアルであってもよい。キットはまた、他の試薬の再構成や希釈に好適な１つまたは複数の緩衝液を含んでいてもよい。使用するその他の容器としては、袋、箱、トレイ、チューブなどが挙げられ、キット構成要素はこれらの容器内に包装し、滅菌状態で維持してもよい。
In addition to the antibody or the antigen-binding fragment thereof, the diagnostic kit of the present invention may include a diagnostic material for use in various embodiments for detecting an immune complex of an antigen and an antibody as described above.
In addition, the diagnostic kit of the present invention may include the antibody or an antigen-binding fragment thereof as a sterile liquid formulation or lyophilized formulation of the antibody, and may include reagents and instruction manuals for using the kit. it can. The kit components may be packaged together or divided into two or more containers. The container may be a vial containing a sterile lyophilized formulation of a diagnostic composition suitable for reconstruction. The kit may also contain one or more buffers suitable for reconstitution or dilution of other reagents. Other containers used may include bags, boxes, trays, tubes, etc., and kit components may be packaged in these containers and maintained sterile.
以下の実施例は、本発明の実施の態様を例示するものであって、本発明を限定するものではない。実施例では、例示的なモノクローナル抗体（ＪＴ）を利用した試験が行われているが、本発明の抗体はこの抗体に限定されるものではない。抗体を用いた臨床研究では、甲状腺癌患者の約半数の血液試料中で、抗原との免疫複合体が検出されており、新規甲状腺癌関連抗原に特異的に結合する抗体が、血液試料による甲状腺癌の診断に有用であることを示している。 The following examples exemplify embodiments of the present invention and do not limit the present invention. In the examples, a test using an exemplary monoclonal antibody (JT) is carried out, but the antibody of the present invention is not limited to this antibody. In clinical studies using antibodies, immune complexes with antigens were detected in blood samples of about half of thyroid cancer patients, and antibodies that specifically bind to novel thyroid cancer-related antigens are found in the blood samples of the thyroid gland. It has been shown to be useful in diagnosing cancer.
[イムノブロット解析]
イムノブロット分析用サンプルを、以下のようにして調製した。
癌培養上清は対数増殖期の甲状腺がん細胞株（SW1736）の培養液を用い、細胞可溶化物は、培養細胞を培養ディッシュからEDTAを添加したトリプシンで単離し1500回転/分で遠心後、ペレットから細胞を回収し、Chaps 細胞抽出バッファー（セルシグナリング社）を用いて細胞抽出液として用いた。この後、ゼラチン結合ビーズにそれぞれの試料の一部を吸着させ、吸着処理を行わなかった試料（試料、SupまたはLysate）、ゼラチン結合ビーズに吸着したタンパク（ゼラチンビース吸着、ppt）、ビーズ処理を行った残りのタンパク（ビーズ処理後、Sup または Lysate-ppt）を電気泳動法で分離した。泳動前に等量の2倍濃縮SDSサンプルバッファー（0.5Mトリス塩酸バッファーpH=6.8 最終濃度0.125M、2-メルカプトエタノール最終濃度10%(v/v)、SDS 最終濃度4%,シュークロース最終濃度10%、ブロモフェノールブルー 最終濃度0.01%）を等量加えて、100℃、3分間、可溶化処理したものを最終的な試料とした。電気泳動には3-10%の濃度勾配のついたグラジエントポリアクリルアミドゲルを用いて行い、泳動後、ナイロン膜にタンパクを転写させ、ブロックエース（DSバイオファーマ社）でタンパクブロックを行った後、４℃で一晩ＪＴ抗体と反応させ、リン酸緩衝液で洗浄後、ペルオキシダーゼ結合抗マウスIgM抗体（ヤギ）と室温2時間反応、さらにリン酸緩衝液で洗浄を行い、反応のシグナルを、ピアス社（カタログ番号NCI 3106）ウエスタンブロッティングサブストレイトキットを用いて化学発光法で検出した。
[Immunoblot analysis]
Samples for immunoblot analysis were prepared as follows.
For the cancer culture supernatant, use the culture solution of the logarithmic growth phase thyroid cancer cell line (SW1736), and for the cell solubilized product, isolate the cultured cells from the culture dish with trypsin containing EDTA and centrifuge at 1500 rpm. , Cells were harvested from pellets and used as cell extracts using Chaps cell extraction buffer (Cell Signaling). After that, a part of each sample is adsorbed on the gelatin-bound beads, and the sample not subjected to the adsorption treatment (sample, Sup or Lysate), the protein adsorbed on the gelatin-bound beads (gelatin bead adsorption, ppt), and the bead treatment are performed. The remaining protein (Sup or Lysate-ppt after bead treatment) was separated by electrophoresis. Equal volume of double-concentrated SDS sample buffer (0.5M Tris-hydrochloric acid buffer pH = 6.8 final concentration 0.125M, 2-mercaptoethanol final concentration 10% (v / v), SDS final concentration 4%, shoe cloth final concentration before migration 10%, bromophenol blue final concentration 0.01%) was added in equal amounts, and the final sample was solubilized at 100 ° C. for 3 minutes. Electrophoresis is performed using a gradient polyacrylamide gel with a concentration gradient of 3-10%, and after electrophoresis, the protein is transferred to a nylon membrane, and the protein is blocked with Block Ace (DS Biopharmaceutical Co., Ltd.). After reacting with JT antibody overnight at 4 ° C. and washing with phosphate buffer, react with peroxidase-binding anti-mouse IgM antibody (goat) at room temperature for 2 hours, and then wash with phosphate buffer to signal the reaction. (Cat. No. NCI 3106) Detected by chemical luminescence using a Western blotting substrait kit.
図２は、イムノブロット解析の結果を示す。抗体として、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１で示されるアミノ酸配列であり、かつ、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で示されるアミノ酸配列であるマウスモノクローナル抗体（以下、「ＪＴ抗体」という。）を結合することによって検出されたバンドを示す。
ビーズ処理にはゼラチン結合ビーズを用い、このビーズと作用させるとゼラチン結合作用があるファイブロネクチンなど試料中のタンパクはビーズに吸着される。従って、癌培養上清と細胞可溶化物をそのまま試料として電気泳動を行なった結果（レーン（３）と（６））とそれぞれゼラチン結合ビーズに吸着されたタンパク（（レーン（２）と（５）））を比較すると癌培養上清にはファイブロネクチンが含有されていることが分かる。一方、細胞可溶化物にはファイブロネクチンは含まれていない。これはビーズ処理を行った後の試料（（レーン（１）と（４）））の結果（癌培養上清のレーンではファイブロネクチンのバンドの強さが低下、一方、細胞可溶化物ではビーズ処理後もバンドの強さが処理前の試料と変化していない）からも推察できる。
細胞可溶化物からの抗原は、癌細胞表面に結合しているものであり、約１３０ＫＤａの見かけ上の分子量を有するのに対して、癌培養上清からの抗原は、培養液上清に放出された、血液に存在する抗原と同じものと思われ、約２５０ＫＤａのみかけ上の分子量を有する。
FIG. 2 shows the results of immunoblot analysis. As the antibody, a mouse monoclonal antibody in which the amino acid sequence of the light chain variable region is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of the heavy chain variable region is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 (hereinafter, "JT"). The band detected by binding (referred to as "antibody") is shown.
Gelatin-bound beads are used for bead treatment, and when they act on these beads, proteins in the sample such as fibronectin, which has a gelatin-binding action, are adsorbed on the beads. Therefore, the results of electrophoresis using the cancer culture supernatant and the cell solubilized product as samples (lanes (3) and (6)) and the proteins adsorbed on the gelatin-bound beads ((lanes (2) and (5)), respectively. ))) It can be seen that the cancer culture supernatant contains fibronectin. On the other hand, the cell solubilized product does not contain fibronectin. This is the result of the samples ((lanes (1) and (4))) after bead treatment (the strength of the fibronectin band is reduced in the lane of the cancer culture supernatant, while the beads in the cell solubilized product. It can be inferred from the fact that the band strength does not change from that of the sample before treatment even after the treatment).
The antigen from the cell solubilized product is bound to the surface of the cancer cell and has an apparent molecular weight of about 130 kDa, whereas the antigen from the cancer culture supernatant is released into the culture medium supernatant. It appears to be the same as the antigen present in the blood, and has an apparent molecular weight of about 250 kDa.
[約２５０ＫＤａの癌関連抗原の特徴付け]
甲状腺癌患者の血液に存在する約２５０ＫＤａの抗原を単離精製した。500μgのＪＴ抗体をＰＢＳで希釈してニトロセルロースフィルターに吸着させた。甲状腺癌患者の血清をトリスバッファーで10倍希釈後100mlとした試料と、ニトロセルロースフィルターとをインキュベートして、室温で３時間以上置いてから洗った後、2mlの溶出液で２回洗い、抗原を溶出させ単離精製した。
[Characterization of cancer-related antigens of about 250 kDa]
Approximately 250 kDa of antigen present in the blood of thyroid cancer patients was isolated and purified. 500 μg of JT antibody was diluted with PBS and adsorbed on a nitrocellulose filter. A sample of thyroid cancer patient's serum diluted 10-fold with Tris buffer to make 100 ml is incubated with a nitrocellulose filter, left at room temperature for 3 hours or more, washed, and then washed twice with 2 ml of eluate to obtain an antigen. Was eluted and isolated and purified.
精製した抗原は、アミノ酸配列の決定のためにＶ８プロテアーゼで処理後、自動ペプチドシークエンサーで配列決定すると、ヒトフィブロネクチンと一致した。フィブロネクチンであるか確認するために、ヒトノーマル血漿型フィブロネクチンと精製した癌関連抗原のそれぞれに対して、ウサギ抗ヒトフィブロネクチン抗血清とＪＴ抗体とをそれぞれ反応させた。抗ヒトフィブロネクチン抗血清は、ヒトノーマル血漿型フィブロネクチンと精製した癌関連抗原の両方に結合したが、ＪＴ抗体は、精製した癌関連抗原にしか結合しなかった。精製した癌関連抗原のタンパク質がヒトフィブロネクチンであることが確認されたが、ＪＴ抗体が、ヒトノーマル血漿型フィブロネクチンと結合せず、精製した癌関連抗原のみに結合したことは、精製した癌関連抗原がヒトノーマル血漿型フィブロネクチンとは異なる糖鎖で修飾されており、ＪＴ抗体はその修飾された糖鎖に関連する部位に結合することが示唆された。 The purified antigen was treated with V8 protease for amino acid sequencing and then sequenced with an automated peptide sequencer to match human fibronectin. In order to confirm whether it is fibronectin, rabbit anti-human fibronectin antiserum and JT antibody were reacted with each of human normal plasma type fibronectin and purified cancer-related antigen. Anti-human fibronectin Antisera bound to both human normal plasma fibronectin and purified cancer-related antigens, whereas JT antibody bound only to purified cancer-related antigens. It was confirmed that the protein of the purified cancer-related antigen was human fibronectin, but the fact that the JT antibody did not bind to human normal plasma-type fibronectin but only to the purified cancer-related antigen means that the purified cancer-related antigen. Is modified with a sugar chain different from that of human normal plasma fibronectin, suggesting that the JT antibody binds to the site associated with the modified sugar chain.
さらに、レクチンを用いた解析から、この糖鎖はα2-6／α2-3シアル酸N-結合型糖鎖であることが判明した。フィブロネクチンのN-結合型糖鎖付加可能性部位は８か所であることから、部分的にフィブロネクチンを消化してＪＴ抗体との反応性により、結合部位である可能性のある場所は２か所（１９０３位と２１１９位のアスパラギン酸）であることがわかった。その２つの部位をそれぞれ欠失させたフィブロネクチン遺伝子を導入した細胞では、ＪＴ抗体が反応しない部位が１９０３位欠失のものであったことから、ＪＴ抗体は１９０３位のＡｓｐに結合した糖鎖に関連する部位に結合すると予測される。癌細胞膜上の約１３０ＫＤａの抗原もＪＴ抗体と結合することから、Ａｓｐに結合した糖鎖修飾に関しては、約２５０ＫＤａの抗原と同じ修飾を有すると考えらえる。 Furthermore, analysis using lectins revealed that this sugar chain was an α2-6 / α2-3 sialic acid N-linked sugar chain. Since there are eight potential sites for N-linked sugar chain addition in fibronectin, there are two potential sites for binding due to the reactivity of fibronectin with JT antibody by partially digesting fibronectin. It was found to be (aspartic acid at positions 1903 and 2119). In the cells into which the fibronectin gene lacking each of the two sites was introduced, the site where the JT antibody did not react was the one with the deletion at position 1903, so that the JT antibody became a sugar chain bound to Asp at position 1903. Expected to bind to relevant sites. Since the antigen of about 130 KDa on the cancer cell membrane also binds to the JT antibody, it is considered that the sugar chain modification bound to Asp has the same modification as the antigen of about 250 KDa.
[フィブロネクチン遺伝子（5783番目から5951番目までの遺伝子配列）を欠失させた甲状腺癌細胞のイムノブロット分析]
イムノブロット分析用サンプルは、実施例１と同様にして調製した。フィブロネクチン遺伝子の5783番目から5951番目までの塩基配列を欠失させた甲状腺癌細胞株（SW1736）を用いた。陽性対照は遺伝子を欠失させていない野生型のSW1736を用いた。癌培養上清は対数増殖期の培養液を用い、細胞可溶化物は、培養細胞を培養ディッシュから単離して細胞抽出液を得た。それぞれ４つの試料を電気泳動法で分離した。電気泳動は、実施例１と同様に行った。
そのイムノブロット分析の結果を図３に示す。
左の陽性対照（ポジコンSW1736細胞）では細胞培養の上清中とライセート中の2レーンに、それぞれ約２５０Ｋｄと約１３０Ｋｄの抗原が存在するが、この細胞のフィブロネクチン遺伝子（5783番目から5951番目までの塩基配列）を欠失すると(右側のレーン(1)-2の細胞)このバンドは現れなくなる。このことから約２５０Ｋｄバンドがフィブロネクチン由来であり、ライセート中の約１３０Ｋｄのバンドはフィブロネクチン由来ではないことがわかる。
[Immunoblot analysis of thyroid cancer cells lacking the fibronectin gene (gene sequence from 5783 to 5951)]
Samples for immunoblot analysis were prepared in the same manner as in Example 1. A thyroid cancer cell line (SW1736) lacking the nucleotide sequence from the 578th to the 5951th gene of the fibronectin gene was used. As a positive control, a wild-type SW1736 in which the gene was not deleted was used. For the cancer culture supernatant, a culture solution in the logarithmic growth phase was used, and for the cell solubilized product, the cultured cells were isolated from the culture dish to obtain a cell extract. Each of the four samples was separated by electrophoresis. Electrophoresis was carried out in the same manner as in Example 1.
The result of the immunoblot analysis is shown in FIG.
In the positive control on the left (Posicon SW1736 cells), antigens of about 250 Kd and about 130 Kd are present in the supernatant of the cell culture and in the two lanes of the lysate, respectively, and the fibronectin genes (5783 to 5951) of this cell are present. If the base sequence) is deleted (cells in lane (1) -2 on the right side), this band disappears. From this, it can be seen that the approximately 250 Kd band is derived from fibronectin, and the approximately 130 Kd band in lysate is not derived from fibronectin.
以前行った甲状腺患者の甲状腺組織切片のＪＴ抗体による免疫組織検査の結果は、以下のとおりであった。対照となる良性の甲状腺関連疾患の陽性率は低いか０であった。
組織型 患者数 陽性数 陽性率（％）
悪性
乳頭癌 １００ ９５ ９５
濾胞癌 ４ ３ ７５
良性
線腫 ３９ ０ ０
線腫様甲状腺腫 ２１ ３ １４
甲状腺機能亢進症 ８ ０ ０
慢性甲状腺炎（橋本病） ８ ３ ３８
The results of a previous immunohistochemical examination of thyroid tissue sections of thyroid patients with JT antibody were as follows. The positive rate for control benign thyroid-related disease was low or zero.
Histological type Number of patients Positive number Positive rate (%)
Malignant papillary cancer 100 95 95
Follicular cancer 4 3 75
Benign adenoma 3900
Adenomatous goiter 21 3 14
Hyperthyroidism 800
Chronic thyroiditis (Hashimoto's disease) 8 3 38
[患者の血液からの新規癌関連抗原の検出]
血漿試料は、甲状腺穿刺吸引細胞診により甲状腺癌と新しく診断された、以前治療を受けていない５８人の患者と、甲状腺癌が再発した１２人の患者から選択した。血液を診断の時に患者から採取した。対照として、甲状腺の超音波検査および手術の病理所見により甲状腺癌でないと診断された４１人の患者からの血漿試料を用いた。
[Detection of new cancer-related antigens in patient blood]
Plasma samples were selected from 58 previously untreated patients who were newly diagnosed with thyroid cancer by fine needle aspiration cytology and 12 patients who had recurrent thyroid cancer. Blood was taken from the patient at the time of diagnosis. As a control, plasma samples from 41 patients diagnosed as not having thyroid cancer by ultrasonography of the thyroid gland and pathological findings of surgery were used.
患者の血漿におけるＪＴ抗体と癌関連抗原との免疫複合体の検出は、以下の方法により行った。
９６穴のマイクロプレートウエルに、精製されたＪＴ抗体4μg/ml を100μl、４℃で一晩結合させた。その後、ウエルをツイーン20含有リン酸緩衝液で３回洗浄。洗浄後、ブロックエース（DSファーマバイオメディカル株式会社）でウエルを２時間室温でブロックしさらに洗浄を行い、血漿試料をウエルに加えて室温で２時間反応させた。その後、ツイーン20含有リン酸緩衝液でウエルを３回洗浄、洗浄後ブロックエースで希釈したビオチン化ＪＴ抗体20μg/ml を100μlウエルに加えて１時間室温で反応させ、さらにツイーン20含有リン酸緩衝液で３回洗浄後にストレプトアビジンを結合させたペルオキシダーゼ(HRP,ホースラディッシュペルオキシダーゼ)を100μl加え、３０分間室温で反応させツイーン20含有リン酸緩衝液でウエルを３回洗浄、洗浄後、3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン(TMB)液体基質を100μl加え酵素反応を確認した。反応後、1規程硫酸水溶液100μlを加えて反応を停止させ波長450nmで吸光度を測定した（サンドイッチELISA法）。サンドイッチELISA法で得られた吸光度値を陽性対照試料と比較して最終的に判断された患者血液中の抗原の検出結果を表１に示す。
The detection of the immune complex between the JT antibody and the cancer-related antigen in the patient's plasma was performed by the following method.
Purified JT antibody 4 μg / ml was bound to a 96-well microplate well at 100 μl at 4 ° C. overnight. Then, the wells were washed 3 times with Tween 20-containing phosphate buffer. After washing, the wells were blocked with Block Ace (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) at room temperature for 2 hours, further washed, and plasma samples were added to the wells and reacted at room temperature for 2 hours. Then, the wells were washed 3 times with Tween 20-containing phosphate buffer, and after washing, 20 μg / ml of biotinylated JT antibody diluted with Block Ace was added to 100 μl wells and reacted at room temperature for 1 hour, and further, Tween 20-containing phosphate buffer was added. After washing 3 times with the solution, 100 μl of peroxidase (HRP, horseradish peroxidase) bound with streptavidin was added, reacted at room temperature for 30 minutes, and the wells were washed 3 times with a phosphate buffer containing Tween 20. After washing, 3,3 An enzymatic reaction was confirmed by adding 100 μl of ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate. After the reaction, 100 μl of 1-regulated sulfuric acid aqueous solution was added to stop the reaction, and the absorbance was measured at a wavelength of 450 nm (sandwich ELISA method). Table 1 shows the results of detection of the antigen in the patient's blood, which was finally determined by comparing the absorbance value obtained by the sandwich ELISA method with the positive control sample.
ＪＴ抗体により、甲状腺癌患者の血液中の癌関連抗原を検出することができた。甲状腺乳頭癌では７０人の患者のうち３２人の血液中から検出され、４５．７％の陽性率であり、甲状腺癌でない患者では、４１人のうち陽性が４人で、陽性率が９．８％であり、甲状腺結節を有する患者に対する良性か悪性の早期診断として、臨床的に十分機能する結果が示された。
［参考例１］
The JT antibody was able to detect cancer-related antigens in the blood of thyroid cancer patients. Papillary thyroid cancer was detected in the blood of 32 of 70 patients with a positive rate of 45.7%, and non-thyroid cancer patients were positive in 4 of 41 patients with a positive rate of 9. It was 8%, showing that it functions clinically well as an early diagnosis of benign or malignant for patients with thyroid nodules.
[Reference example 1]
[免疫組織化学染色]
甲状腺癌の細胞膜上で、約１３０ＫＤａ抗原が局在化する様子を、ＪＴ抗体の結合により示す。
培養中のSW1736細胞を2％パラフォルムアルデヒド/0.1Mリン酸緩衝液で固定、固定後リン酸緩衝液で洗浄した後、ヤギ血清を用いて非特異反応をブロッキングした後、プレエンベディング法で免疫染色を行った。ＪＴ抗体を5μg/ml、４℃で3日間反応させ洗浄、洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgM抗体で反応後に3,3'-diaminobenzidine（DAB）反応を行った。その後、四酸化オスミウム処理をして、通常のエポン包埋超薄切片を作製して、透過型電子顕微鏡で観察を行った。
図４の写真では、ＪＴ抗体は、細胞の膜表面のみを認識し、甲状腺癌細胞中では、約１３０ＫＤａの甲状腺癌関連抗原が局在化していることが明確に観察された。
[Immunohistochemical staining]
The localization of about 130 KDa antigen on the cell membrane of thyroid cancer is shown by the binding of JT antibody.
SW1736 cells in culture are fixed with 2% paraformaldehyde / 0.1M phosphate buffer, fixed, washed with phosphate buffer, blocked with goat serum for non-specific reactions, and then immunostained by pre-embedding method. Staining was performed. The JT antibody was reacted at 5 μg / ml at 4 ° C. for 3 days, washed, washed, and then reacted with a peroxidase-labeled anti-mouse IgM antibody, followed by a 3,3'-diaminobenzidine (DAB) reaction. Then, it was treated with osmium tetroxide to prepare a normal Epon-embedded ultrathin section, which was observed with a transmission electron microscope.
In the photograph of FIG. 4, the JT antibody recognized only the membrane surface of the cell, and it was clearly observed that about 130 kDa of thyroid cancer-related antigen was localized in the thyroid cancer cell.
［まとめ］
以上の通り、本発明は、（１）ないし（７）の態様を包含する
（１）甲状腺癌患者の血液由来のN-結合型糖鎖と結合したフィブロネクチンであって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見かけ上の分子量が約２５０ＫＤａの甲状腺癌関連抗原に、特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（ただし、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１で示されるアミノ酸配列であり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で示されるアミノ酸配列である抗体またはその抗原結合断片は除く）。
（２）（ａ）軽鎖可変領域のＣＤＲがそれぞれ以下のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ１：ＲＳＳＫＳＬＬＹＫＤＧＫＴＹＬＮ
ＣＤＲ２：ＬＭＳＴＲＡＳ
ＣＤＲ３：ＱＱＬＶＥＹＰＷＴ
（ｂ）重鎖可変領域のＣＤＲが、それぞれ以下のアミノ酸配列を有する、
ＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨ
ＣＤＲ２：ＶＩＷＳＧＧＳＴＤＹＮＡＡＦＩＳ
ＣＤＲ３：ＳＳＧＴＤＹＷＹＦＤＶ
上記（１）に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（３）抗体がＩｇＭである、上記（１）または（２）に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（４）上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を有効成分とする、血液試料による甲状腺癌診断剤。
（５）軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１で示されるアミノ酸配列であり、かつ、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で示されるアミノ酸配列である抗体、またはその抗原結合断片を有効成分とする、血液試料による甲状腺癌診断剤。
（６）抗体がＩｇＭである、上記（４）または（５）に記載の血液試料による甲状腺癌診断剤。
（７）上記（４）ないし（６）のいずれかに記載の甲状腺癌診断剤を含む、血液試料による甲状腺癌の診断用キット。
[Summary]
As described above, the present invention includes (1) fibronectin bound to an N-linked sugar chain derived from the blood of a thyroid cancer patient, which includes aspects (1) to (7), and apparently by SDS-PAGE. An antibody that specifically binds to a thyroid cancer-related antigen having a molecular weight of about 250 kDa or an antigen-binding fragment thereof (however, the amino acid sequence of the light chain variable region is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1, and the heavy chain variable region Antibodies or antigen-binding fragments thereof whose amino acid sequence is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are excluded).
(2) (a) The CDRs of the light chain variable region each have the following amino acid sequences.
CDR1: RSSKSLLYKDGKTYLN
CDR2: LMSTRAS
CDR3: QQLVEYPWT
(B) The CDRs of the heavy chain variable region each have the following amino acid sequences.
CDR1: GFSLTSYGVH
CDR2: VIWSGGSTDYNAAFIS
CDR3: SSGTDYWYFDV
The antibody or antigen-binding fragment thereof according to (1) above.
(3) The antibody or antigen-binding fragment thereof according to (1) or (2) above, wherein the antibody is IgM.
(4) A thyroid cancer diagnostic agent using a blood sample containing the antibody according to any one of (1) to (3) above or an antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
(5) An antibody or an antigen-binding fragment thereof in which the amino acid sequence of the light chain variable region is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of the heavy chain variable region is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. A thyroid cancer diagnostic agent using a blood sample as an active ingredient.
(6) The thyroid cancer diagnostic agent based on the blood sample according to (4) or (5) above, wherein the antibody is IgM.
(7) A kit for diagnosing thyroid cancer using a blood sample, which comprises the thyroid cancer diagnostic agent according to any one of (4) to (6) above.
甲状腺癌患者の血液中に、約２５０ＫＤａのみかけ上の分子量を有するN-結合型糖鎖有するフィブロネクチンが存在することを発見し、この新規甲状腺癌関連抗原は、他の癌患者の血液中には存在せず、また、健常者の血液にも存在しないことが判明した。そして、この新規甲状腺癌関連抗に特異的に結合する抗体を用いると、甲状腺癌患者のほぼ半数の血液中にこの抗体と癌関連抗原との免疫複合体の存在が検出できたことから、この抗原に特異的に結合する抗体を、血液試料を用いた甲状腺癌の診断に用いることができることが確認された。 We discovered that fibronectin with an N-linked sugar chain with an apparent molecular weight of about 250 kDa is present in the blood of thyroid cancer patients, and this novel thyroid cancer-related antigen is found in the blood of other cancer patients. It was found to be absent and not present in the blood of healthy individuals. Then, using an antibody that specifically binds to this novel thyroid cancer-related anti, the presence of an immune complex between this antibody and a cancer-related antigen could be detected in the blood of almost half of thyroid cancer patients. It was confirmed that an antibody that specifically binds to an antigen can be used for diagnosing thyroid cancer using a blood sample.
Claims (5)
（１）軽鎖可変領域のＣＤＲがそれぞれ以下のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ１：ＲＳＳＫＳＬＬＹＫＤＧＫＴＹＬＮ
ＣＤＲ２：ＬＭＳＴＲＡＳ
ＣＤＲ３：ＱＱＬＶＥＹＰＷＴ
（２）重鎖可変領域のＣＤＲが、それぞれ以下のアミノ酸配列を有する、
ＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨ
ＣＤＲ２：ＶＩＷＳＧＧＳＴＤＹＮＡＡＦＩＳ
ＣＤＲ３：ＳＳＧＴＤＹＷＹＦＤＶ、
抗体またはその抗原結合断片（ただし、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１で示されるアミノ酸配列であり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で示されるアミノ酸配列である抗体またはその抗原結合断片は除く）。 Fibronectin bound to N-linked sugar chains derived from the blood of thyroid cancer patients, which specifically binds to a thyroid cancer-related antigen having an apparent molecular weight of about 250 kDa by SDS-PAGE.
(1) The CDRs of the light chain variable region each have the following amino acid sequences .
CDR1: RSSKSLLYKDGKTYLN
CDR2: LMSTRAS
CDR3: QQLVEYPWT
(2) The CDRs of the heavy chain variable region each have the following amino acid sequences .
CDR1: GFSLTSYGVH
CDR2: VIWSGGSTDYNAAFIS
CDR3: SSGTDYWYFDV ,
An antibody or an antigen-binding fragment thereof (however, the amino acid sequence of the light chain variable region is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of the heavy chain variable region is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2). (Excluding binding fragments).
（１）軽鎖可変領域のＣＤＲがそれぞれ以下のアミノ酸配列を有し、
ＣＤＲ１：ＲＳＳＫＳＬＬＹＫＤＧＫＴＹＬＮ
ＣＤＲ２：ＬＭＳＴＲＡＳ
ＣＤＲ３：ＱＱＬＶＥＹＰＷＴ
（２）重鎖可変領域のＣＤＲが、それぞれ以下のアミノ酸配列を有する、
ＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨ
ＣＤＲ２：ＶＩＷＳＧＧＳＴＤＹＮＡＡＦＩＳ
ＣＤＲ３：ＳＳＧＴＤＹＷＹＦＤＶ、
抗体またはその抗原結合断片を有効成分とする、血液試料による甲状腺癌診断剤。 For detecting fibronectin bound to an N-linked sugar chain present in the blood of a thyroid cancer patient and having an apparent molecular weight of about 250 kDa by SDS-PAGE .
(1) The CDRs of the light chain variable region each have the following amino acid sequences .
CDR1: RSSKSLLYKDGKTYLN
CDR2: LMSTRAS
CDR3: QQLVEYPWT
(2) The CDRs of the heavy chain variable region each have the following amino acid sequences .
CDR1: GFSLTSYGVH
CDR2: VIWSGGSTDYNAAFIS
CDR3: SSGTDYWYFDV ,
A diagnostic agent for thyroid cancer using a blood sample containing an antibody or an antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
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