CN108508208B - 抗Kaiso蛋白抗体在制备早期强直性脊柱炎诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及诊断试剂盒领域，具体是抗Kaiso蛋白抗体在制备早期强直性脊柱炎诊断试剂或试剂盒中的应用。本发明优点在于：本发明为诊断早期强直性脊柱炎提供了一条全新的途径，对于早期诊断和治疗强直性脊柱炎，评估强直性脊柱炎病情具有重要作用；本发明提供Kaiso自身抗体检测的MSD检测试剂盒和检测方法，提供了MSD检测高信号值、低背景的实验条件，对于早期强直性脊柱炎具有较高的诊断价值。

Description

抗Kaiso蛋白抗体在制备早期强直性脊柱炎诊断试剂盒中的 应用

技术领域

本发明涉及诊断试剂盒领域，具体地说，是抗Kaiso蛋白自身抗体在制备早期强直性脊柱炎诊断试剂盒中的应用。

背景技术

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，以渐进发展的脊柱关节强直、骶髂关节炎、葡萄膜炎和起止点炎为疾病特征。主要症状包括脊柱僵硬、活动受限以及下腰部疼痛等。该病早期侵犯骶髂关节，并逐渐向上累及，最终导致脊柱的骨性强直。强直性脊柱炎好发于 16-40岁青壮年男性，男女发病比例约为2:1。相关研究显示强直性脊柱炎全球的发病率在0.1％到1.4％之间，在我国发病率约为0.2-0.6％。由于缺乏典型的早期症状和明确的早期生物标记物，通常在第一次临床症状出现后的8-10年时间后，才有可能得到明确的诊断。

目前，强直性脊柱炎的诊断标准主要是临床症状结合影像学表现。血清学指标HLA-B27主要作为辅助诊断指标，血沉、C反应蛋白可作为反映疾病活动度的指标。HLA-B27抗原的表达与AS具有较高的相关性，在AS患者中80-95 ％为HLA-B27抗原阳性，但正常人群中也有5-10％的阳性率。并且HLA-B27 在其他几种风湿免疫性疾病(如银屑病关节炎、反应性关节炎、炎性肠病性关节炎、未分化脊柱关节病和幼年发病的脊柱关节炎等)中也有阳性表达。血沉、 C反应蛋白作为炎症活动度指标特异性较差，在炎症性疾病及细菌感染性疾病中均有升高。故强直性脊柱炎无特异性较高的血清学诊断指标。

由于缺乏类风湿因子，一般认为AS是一种血清阴性疾病。然而近年来人们发现B细胞和抗体在AS致病过程中发挥重要作用。微生物、炎症目标和骨骼/结缔组织等抗原都可作为抗体的来源。这些抗原及相应的抗体在AS疾病的发生发展过程中起着重要作用。故对于AS患者血清中自身抗体的筛查有利于寻找新的诊断及治疗标记物。

本发明通过蛋白芯片筛选出抗Kaiso蛋白抗体在强直性脊柱炎病人血清里显著升高。本发明的研究对象Kaiso蛋白是锌指蛋白超家族(POZ/ZF)中BTB/POZ转录因子亚家族的成员。其基因ZBTB33位于Xq23，编码蛋白分子量是97Kd，整个肽链共有672个氨基酸。BTB/POZ蛋白，总体上来说，是一种转录抑制因子，氨基端含有POZ结构域，功能为可形成同二聚体、异二聚体和辅助转录抑制因子。作为转录因子Kaiso可与目的基因启动子上保守的Kaiso结合位点结合并通过募集组蛋白脱乙酰酶来影响染色体重构从而抑制其转录。

相关研究显示Kaiso蛋白在调节炎症过程中发挥重要作用(Christina C.Pierre，Kaiso overexpression promotes intestinal inflammation and potentiatesintestinal tumorigenesis in ApcMin/+mice.Biochimica et Biophysica Acta.2015,1846–1855)。并且Kaiso能够调控细胞分化并影响肿瘤的发生(Roop ali Ch audha ry，ThePOZ-ZF Transcript ion Factor Kaiso(ZBTB33)Induces Inflammation and ProgenitorCell Differentiation in the Murin e Intestine.PLOS ONE.8(9):e74160)。另外，Wnt通路与AS发病中的成骨过程密切相关，相关研究表明Kaiso可能通过与转录因子TCF家族成员之间的相互作用，抑制Wnt 靶基因，负向调控Wnt/β-catenin信号通路(Park JI,Kaiso/p120-catenin and TCF/beta-catenin complexes coordinately regulate canonicalWnt gene targets.Dev Cell,2005,8(6):843-854)。综上，Kaiso蛋白可能在AS炎症及骨化进程中起到重要作用。目前，国内外尚无文献报道抗Kaiso蛋白抗体在AS患者中的诊断及鉴别诊断价值，也尚无文献报道抗Kaiso蛋白抗体检测试剂盒以及该类试剂盒在AS血清学诊断中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗Kaiso蛋白自身抗体在早期强直性脊柱炎患者诊断中的应用；本发明的第二个目的是提供Kaiso自身抗体检测的MSD检测试剂盒；本发明的第三个目的是提供Meso Scale Discovery(MSD)技术检测自身抗体的检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面，提供抗Kaiso蛋白抗体在制备早期强直性脊柱炎诊断试剂或试剂盒中的应用。

优选的，所述的诊断试剂或试剂盒是抗Kaiso蛋白抗体Meso Scale Discovery(MSD)技术检测试剂或试剂盒。

优选的，所述的诊断试剂或试剂盒检测血清中抗Kaiso蛋白抗体的浓度。

优选的，所述的诊断试剂或试剂盒的cut-off值为4065.49ng/ml，即当MSD 方法检测血清抗Kaiso蛋白抗体浓度≥4482.33ng/ml，诊断为早期强直性脊柱炎。

本发明所述的早期强直性脊柱炎，是指符合1984年纽约诊断标准的强直性脊柱炎病人，并且影像学显示只有骶髂关节受累而不伴有脊柱关节的累及。 (参考文献1.van derLinden S,Valkenburg H,Cats A.Evaluation of diagnostic criteria for ankylosingspondylitis.A proposal for modification of the New York criteria.ArthritisRheum 1984；27:361-368.2.Braun J,van der Heijde D, Dougados M,Emery P,Khan M,Sieper J,et al.Staging of patients with ankylosing spondylitis:a preliminaryproposal.Ann Rheum Dis 2002；61Suppl 3:iii9-23.)

本发明所涉及的抗Kaiso蛋白抗体，可以是市售的抗体如抗Kaiso一抗 (ab12723，Abcam)、santa cruz的抗体等；最好选用跟人同源的抗原制备得到的抗体。

优选的，所述的诊断试剂或试剂盒包括：封闭液BlockerA(MSD配套)， 4×Readbuffer，Kaiso重组蛋白，抗Kaiso一抗，二抗： SULFO-TAG Anti-Mouse Antibody，SULFO-TAG Anti-Human Antibody，稀释液： 1×PBS，pH:7.35-7.45；抗体稀释液：0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.2％BSA；终止液：2mol/L的硫酸溶液；缓冲液：1×PBS，pH:7.35-7.45；洗涤液：0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20。

本发明的第二方面，提供一种Kaiso蛋白抗体的MSD检测试剂盒，包括以下试剂：封闭液BlockerA(MSD配套)，4×Read buffer，Kaiso重组蛋白，抗Kaiso一抗，二抗：SULFO-TAGAnti-Mouse Antibody， SULFO-TAG Anti-Human Antibody，稀释液：1×PBS，pH:7.35-7.45；抗体稀释液：0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.2％BSA；终止液：2mol/L的硫酸溶液；缓冲液：1×PBS，pH:7.35-7.45；洗涤液：0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20。

本发明的第三方面，提供一种如上所述的Kaiso蛋白抗体的MSD检测试剂盒在制备早期强直性脊柱炎诊断试剂盒中的应用。

本发明的第四方面，提供一种采用如上所述的诊断试剂盒利用MSD技术检测血清中抗Kaiso蛋白抗体浓度的方法，其中，Kaiso重组蛋白包被浓度为 5ug/ml Kaiso，40ul/孔；血清稀释浓度为250倍；二抗浓度为1ug/ml，在以上条件下获得的信号值高且背景低。

具体包括以下步骤：

(A)包被蛋白浓度：5ug/ml Kaiso，40ul/孔，室温孵育半小时后，转移至 4℃过夜；

(B)第二天从冰箱取出，室温继续孵育半小时后，用5％(v/v) BlockerA-PBS，室温封闭2小时；

(C)用0.05％(v/v)PBS-Tween20，150ul/孔，洗涤三次；

(D)加入用PBS稀释好的样品和标准品，50ul/孔，室温摇床孵育2小时；

(E)用0.05％(v/v)PBS-Tween20，150ul/孔，洗涤三次；

(F)加入用1％(v/v)BlockerA-PBS稀释后的相应种属的检测抗体，室温摇床孵育2小时；

(G)用0.05％(v/v)PBS-Tween20，150ul/孔，洗涤三次，加入2×read buffer，150ul/孔；

(H)上机检测。

本发明优点在于：

1、本发明为诊断早期强直性脊柱炎提供了一条全新的途径，对于早期诊断和治疗强直性脊柱炎，评估强直性脊柱炎病情具有重要作用；

2、本发明提供Kaiso自身抗体检测的MSD检测试剂盒和检测方法，提供了MSD检测高信号值、低背景的实验条件，对于早期强直性脊柱炎具有较高的诊断价值。

附图说明

图1为血清样本经蛋白芯片筛选后，芯片中结合Kaiso蛋白位点处信号放大图。

图2为MSD技术检测血清自身抗体原理示意图。

图3为检测抗Kaiso自身抗体的标准曲线。

图4为MSD检测试剂盒检测出的正常组，早期AS组，晚期AS组以及 RA组的抗Kaiso自身抗体表达量。**P<0.05。

图5为血清抗Kaiso自身抗体ROC曲线(早期AS组vs正常组)。

图6为血清抗Kaiso自身抗体ROC曲线(早期AS组vs晚期AS组)。

图7为血清抗Kaiso自身抗体ROC曲线(早期AS组vs RA组)。

图8为晚期强直性脊柱炎和晚期骨关节炎患者(a)滑膜组织和(b)韧带组织Kaiso蛋白免疫组化染色图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：蛋白芯片筛选自身抗体

利用美国CDI实验室提供的人类蛋白芯片(human proteome microarray， HuPro)对早期强直性脊柱炎患者以及正常人血清进行自身抗体的筛选。强直性脊柱炎患者符合1984年纽约诊断标准，早期AS诊断标准为：影像学显示仅有Ⅰ度骶髂关节炎不伴有脊柱关节的累及。

1.样品：7例早期强直性脊柱炎患者血清样本，7例正常人血清样本。

2.试剂：封闭液：含5％BSA的TBST(0.1％Tween 20)缓冲液；洗液： TBST(0.1％Tween 20)；二抗：Biotin-Donkey Anti-Human IgG(H+L)(cat： SA00004-10，Proteintech，China)，参照说明书按照1:10,000将二抗稀释到TBST 中，混匀；检测荧光：1‰Cy5-Streptavidn Solution。

3.实验过程：

(1)芯片封闭

A.在100mm培养皿中加入预冷的30mL封闭液，使用平头镊子将HuProt 芯片从-80℃取出，立即浸入封闭液中，确保有条形码的一面向上；

B.将培养皿置于摇床上，室温，50rpm，孵育5min；

C.换新的封闭液，室温，50rpm，孵育1.5hr；

(2)芯片杂交

A.在杂交盒中加入稀释后的血浆样品；将芯片放入，盖上盖子，50rpm，室温孵育1hr；

B.在100mm培养皿中加入30mL TBST洗液，将芯片转移其中，简单清洗3次；再使用TBST清洗，50rpm，室温洗涤三次，每次10min；

C.双蒸水清洗芯片两次，每次5min；

(3)芯片检测

A.在杂交盒中加入稀释后的二抗；将芯片放入，避光，50rpm，室温反应 1.5hr；

B.在100mm培养皿中加入30mL TBST洗液，将芯片转移其中，简单清洗3次；再使用TBST清洗，50rpm，室温洗涤三次，每次10min；

C.双蒸水清洗芯片两次，每次5min；

D.在100mm培养皿中加入30mL 1‰Cy5-Streptavidn Solution；将芯片放入，避光，50rpm，室温反应20min；

E.重复步骤B、C清洗芯片。

F.将芯片置于芯片小型离心机中，离心2min甩干；

G.避光，GenePix 4000B扫描仪于635nm处扫描芯片。

4.蛋白芯片结果

蛋白芯片筛选后，7例AS患者血清中，抗Kaiso抗体在5例患者血清中阳性表达，正常患者中则为弱阳性或无表达。结果如图1。

实施例2：抗Kaiso自身抗体MSD检测试剂盒的开发及优化

为了进一步验证蛋白芯片筛选的结果，采用Meso Scale Discovery(MSD) 技术开发相应的自身抗体检测试剂盒。MSD技术是基于电化学发光技术的一种免疫检测方法，较传统的酶联免疫吸附实验即ELISA实验具有更高的灵敏度和更宽的线性范围，同时均一性好、信号稳定。用于检测血清内自身抗体的含量时，实验原理是利用夹心法，将重组蛋白包被在板底，然后加入含有待测抗体的血清样本，或阳性对照抗体，进行孵育，再加入带有sulfo-tag标记的，抗待测抗体的二抗，最终利用电化学发光原理检测，图2为技术原理图。

1.试剂：MSD专用96孔板(L15XA-3，MSD)；MSD检测仪(SQ120， MSD)；BlockerA(R92TC-3，MSD)；4×Read buffer(R93BA-4，MSD)；Kaiso 重组蛋白(ab160762，Abcam)；抗Kaiso一抗(ab12723，Abcam)；二抗： SULFO-TAG Anti-Mouse Antibody(Goat，R32AC-5，MSD)； SULFO-TAG Anti-Human Antibody(Goat，R32AJ-5，MSD)。

2.实验过程：开发该自身抗体检测试剂盒需摸索条件包括重组蛋白包被浓度及包被量；血清样本稀释浓度；阳性对照抗体浓度点设置；带有sulfo-tag标记的，抗待测抗体的二抗浓度点设置等。摸索条件见表1。最后摸索出高信号值，低背景的实验条件。

表1

(1)包被相应浓度的重组蛋白，室温孵育半小时后，转移至4℃过夜；

(2)第二天从冰箱取出，室温继续孵育半小时后，用5％BlockerA-PBS，室温封闭2小时；

(3)用0.05％PBS-Tween20，150ul/孔，洗涤三次；

(4)加入用PBS稀释好的样品和标准品，50ul/孔，室温摇床孵育2小时；

(5)用0.05％PBS-Tween20，150ul/孔，洗涤三次；

(6)加入用1％BlockerA-PBS稀释后的相应种属的检测抗体，室温摇床孵育2小时；

(7)用0.05％PBS-Tween20，150ul/孔，洗涤三次，加入2×read buffer， 150ul/孔；

(8)上机检测。

3.结果：Kaiso重组蛋白包被浓度为5ug/ml Kaiso，40ul/孔；血清稀释浓度为250倍；二抗浓度为1ug/ml；在以上条件下获得的信号值高且背景低。阳性对照抗体浓度点设置为2,500,625,156.25,39.06,9.77,2.44,0.61,0ng/ml。根据以上阳性对照抗体浓度梯度获得标准曲线如图3。

实施例3：抗Kaiso自身抗体对早期强直性脊柱炎病人的诊断价值

为了进一步验证蛋白芯片筛选的结果，采用抗Kaiso自身抗体MSD检测试剂盒对早期AS患者、晚期AS患者、类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis， RA)患者以及正常人血清进行抗Kaiso自身抗体的检测(标本的获取均已签署知情同意并且通过伦理审批)。晚期AS病人诊断标准是广泛的脊柱或髋关节钙化、强直。RA诊断标准是符合2010年美国风湿病学会诊断标准。

1.样品：收集早期AS患者血清50例，晚期AS患者血清40例，类风湿关节炎患者血清40例，正常人血清45例。

2.试剂：MSD专用96孔板(L15XA-3，MSD)；MSD检测仪(SQ120， MSD)；BlockerA(R92TC-3，MSD)；4×Read buffer(R93BA-4，MSD)；Kaiso 重组蛋白(ab160762，Abcam)；抗Kaiso一抗(ab12723，Abcam)；二抗： SULFO-TAG Anti-Mouse Antibody(Goat，R32AC-5，MSD)； SULFO-TAG Anti-Human Antibody(Goat，R32AJ-5，MSD)。

3.实验过程：

(1)包被蛋白浓度:5ug/ml Kaiso，40ul/孔，室温孵育半小时后，转移至4 ℃过夜；

(2)第二天从冰箱取出，室温继续孵育半小时后，用5％BlockerA-PBS，室温封闭2小时；

(3)用0.05％PBS-Tween20，150ul/孔，洗涤三次；

(4)加入用PBS稀释好的样品和标准品，50ul/孔，室温摇床孵育2小时；

(5)用0.05％PBS-Tween20，150ul/孔，洗涤三次；

(6)加入用1％BlockerA-PBS稀释后的相应种属的检测抗体，室温摇床孵育2小时；

(7)用0.05％PBS-Tween20，150ul/孔，洗涤三次，加入2×read buffer， 150ul/孔；

(8)上机检测。

4.结果：

如图4所示，抗Kaiso自身抗体在早期AS病人血清中的表达量显著高于正常人组(p<0.05)。应用ROC曲线分析血清抗Kaiso自身抗体对早期AS患者的诊断价值。如图5所示，曲线下面积为0.88，其cut-off值为4065.49ng/ml，敏感性、特异性则分别为82％、85％，表明其对早期AS病人具有较高的诊断价值。

如图5所示，抗Kaiso自身抗体在早期AS病人血清中的表达量也显著高于晚期AS病人(p<0.05)。应用ROC曲线分析发现抗Kaiso自身抗体表达量能够较准确区分早晚期AS患者，曲线下面积为0.86，其cut-off值为4482.33ng/ml，敏感性、特异性则分别为78％、80％，如图6。

另外，血清抗Kaiso自身抗体表达量有助于对早期AS患者和RA患者的鉴别诊断(图4)。应用ROC曲线分析发现曲线下面积为0.87，其cut-off值为 4464.79ng/ml，敏感性、特异性则分别为78％、80％，如图7。

实施例4：Kaiso蛋白在晚期AS及晚期RA患者滑膜及韧带中的表达

自身免疫性疾病中抗某蛋白自身抗体的升高可能来源于组织内高表达的该蛋白。相关文献表明Kaiso蛋白可能与骨破坏和新骨形成有关，故抗Kaiso 自身抗体在早期AS中表达升高可能源于AS患者受累关节组织中高表达的Kaiso蛋白。由于早期患者相关组织标本无法获取，本研究通过分析AS晚期病人组织中Kaiso蛋白的表达情况来进一步证实Kaiso蛋白的表达对于AS早期病人的诊断价值。

1.样本：20例AS患者韧带组织和滑膜组织，20例RA患者韧带组织和滑膜组织(标本的获取均已签署知情同意并且通过伦理审批)。

2.实验过程：对石蜡包埋的组织样本经过切片脱蜡，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，BSA封闭，加一抗，加二抗，DAB显色，复染细胞核，脱水封片等步骤处理，最后对石蜡切片免疫组化结果进行判读。

3.结果：如图8所示晚期AS患者和晚期RA患者韧带以及滑膜组织中Kaiso 蛋白的表达无明显差异，结果与血清学检查结果一致。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (5)

1.抗Kaiso蛋白抗体在制备早期强直性脊柱炎诊断试剂或试剂盒中的应用，血清抗Kaiso蛋白抗体浓度≥4482.33ng/ml，诊断为早期强直性脊柱炎。

2.根据权利要求1所述的抗Kaiso蛋白抗体在制备早期强直性脊柱炎诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的诊断试剂或试剂盒是抗Kaiso蛋白抗体MSD技术检测试剂或试剂盒。

3.根据权利要求1所述的抗Kaiso蛋白抗体在制备早期强直性脊柱炎诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的诊断试剂或试剂盒包括：封闭液BlockerA，4×Readbuffer，Kaiso重组蛋白，抗Kaiso一抗，二抗：SULFO-TAG Anti-Mouse Antibody，SULFO-TAGAnti-Human Antibody，稀释液：1×PBS，pH:7.35-7.45；抗体稀释液：0.02mol/L pH7.4的PBS+0.2％BSA；终止液：2mol/L的硫酸溶液；缓冲液：1×PBS，pH:7.35-7.45；洗涤液：0.02mol/L pH7.4的PBS+0.05％Tween-20。

4.一种Kaiso蛋白抗体的MSD检测试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：封闭液BlockerA，4×Read buffer，Kaiso重组蛋白，抗Kaiso一抗，二抗：SULFO-TAG Anti-MouseAntibody，SULFO-TAG Anti-Human Antibody，稀释液：1×PBS，pH:7.35-7.45；抗体稀释液：0.02mol/L pH7.4的PBS+0.2％BSA；终止液：2mol/L的硫酸溶液；缓冲液：1×PBS，pH:7.35-7.45；洗涤液：0.02mol/L pH7.4的PBS+0.05％Tween-20。

5.一种如权利要求4所述的Kaiso蛋白抗体的MSD检测试剂盒在制备早期强直性脊柱炎诊断试剂盒中的应用，血清抗Kaiso蛋白抗体浓度≥4482.33ng/ml，诊断为早期强直性脊柱炎。

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