RU2754633C1 - Способ иммунологического мониторинга животных - Google Patents

Способ иммунологического мониторинга животных Download PDF

Info

Publication number
RU2754633C1
RU2754633C1 RU2020144360A RU2020144360A RU2754633C1 RU 2754633 C1 RU2754633 C1 RU 2754633C1 RU 2020144360 A RU2020144360 A RU 2020144360A RU 2020144360 A RU2020144360 A RU 2020144360A RU 2754633 C1 RU2754633 C1 RU 2754633C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
sdh
activity
smear
mixture
animals
Prior art date
Application number
RU2020144360A
Other languages
English (en)
Inventor
Анатолий Федорович Дмитриев
Александр Викторович Агарков
Николай Викторович Агарков
Original Assignee
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" filed Critical федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет"
Priority to RU2020144360A priority Critical patent/RU2754633C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2754633C1 publication Critical patent/RU2754633C1/ru

Links

Images

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области ветеринарной иммунологии и предназначено для диагностики снижения иммунологической реактивности животного организма по биологическому тесту. В качестве биологического теста используют энзиматический тест для выявления различия в функциональной активности лимфоцитов и готовят реагирующие смеси. Далее берут кровь из ушной вены опытных и контрольных животных для приготовления мазка и приготовляют мазок на предметном стекле. Мазок фиксируют 30 мин в ацетон-трилоне В и затем промывают проточной водой. Производят учет активности ферментов в течение 4 ч для сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и 24 ч для а-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ) после приготовления мазка. Под световым микроскопом подсчитывают гранулы энзимов в 50 лимфоцитах на двух мазках - для а-ГФДГ и для СДГ. При активности а-ГФДГ и СДГ до 3 гранул в лимфоците животных относят в группу со сниженной иммунологической реактивностью. Изобретение обеспечивает повышение достоверности лабораторного исследования путем проведения биологического теста и позволяет сформировать группу животных с высоким риском снижения иммунологической реактивности. 2 ил., 2 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, которое может быть использовано в клинической практике для диагностики снижения иммунологической реактивности животного организма, в частности к способу иммунологического мониторинга животных и использовать иммунологические методы диагностики для выявления различных заболеваний при помощи иммунологического мониторинга на крупных и мелких животноводческих фермах.
Уровень техники
При изучении патентной и научно-технической информации выявлено несколько способов иммунологического мониторинга животных путем оценки иммунологической реактивности организма.
Известен способ определения иммунологической реактивности организма путем воздействия на организм лекарственным веществом (вводят пирогенал в дозе 0,15-0,18 мкг на 1 кг веса) и при повышении температуры до 37,0-37,5°С определяют иммунологическую реактивность в пределах нормы, при 36,6-36,9°С - определяют недостаточность иммунологической реактивности (См. Авт. св. СССР №1689857, МПК2 G01N 33/53, 1989 г.). Данный способ имеет ряд недостатков, снижающих его информативность. Так, определяемый показатель температуры тела претерпевает существенные изменения, обусловленные не только физиологическими процессами (испарение влаги с поверхности кожи, вентиляция легких и т.д.), но и неконтролируемыми технологическими параметрами (температура и влажность внешнего воздуха, теплопроводность поверхностей). Высокая вариабельность полученных результатов, также снижает информативность таких параметров для суждения о недостаточности иммунологической реактивности.
Известен способ оценки иммунологической реактивности организма, включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы (См. Авт. св. СССР №1686364, МПК2 G01N 33/53, 1991 г.). Однако для реализации способа требуется дорогостоящее оборудование и биопрепараты. Кроме того, способ недостаточно информативен, а также сложен.
Известен способ оценки иммунологической реактивности организма включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы и определение концентрации иммуноглобулинов и специфических антител в плазме, отличающийся тем, что, дополнительно определяют концентрацию иммуноглобулинов A, G, Μ и специфических сывороточных антител, сорбированных на форменных элементах крови и по соотношению концентраций иммуноглобулинов и специфических сывороточных антител в плазме и сорбированных на форменных элементах крови судят о иммунологической реактивности организма (См. Патент РФ №2126154, МПК2 G01N 33/53, 1999 г.).
Недостаток данного способа в том, что он применим только в специальных лабораторных условиях с применением методов иммунохимии, что сужает диапазон его полезного использования в полевых условиях. Кроме того, определение концентраций иммуноглобулинов и специфических сывороточных антител в плазме и сорбированных на форменных элементах крови достаточно сложно технически и требует значительных временных затрат, специального оборудования и реактивов.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному результату, принятый авторами за прототип является способ оценки иммунологической реактивности организма, включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы и определение иммунологических показателей клеток крови, по которым судят о состоянии организма (См. Патент СССР №1813213, МПК2 G01N 33/53, 1993 г.).
Однако недостатком данного способа является повышенная травматичность, т.к. отбор крови производится из локтевой вены, что особенно сложно для тяжелобольных и в педиатрической практике. Из-за невозможности проведения анализа после длительного хранения проб исключается проведение скрининговых исследований. Способ недостаточно информативен, т.к. позволяет определить предрасположенность к небольшому количеству заболеваний, характеризуется низкой пропускной способностью из-за длительности процесса.
В известных способах иммунологического мониторинга животных проводится без выявления и определения значений титра антител и не позволяет достоверно установить наличие и степень тяжести иммунного эффекта. Эффективных методов иммунологического мониторинга животных в настоящее время не существует. Наш способ будет выявлять уже доступные изменения с первых часов жизни у полученного потомства и материнского организма.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа иммунологического мониторинга животных направленного на более релевантный иммунологический мониторинг реактивности материнского организма и полученного потомства, позволяющего в относительно короткие сроки определить уровень иммунологического статуса животных.
Цель изобретения - повышение точности и упрощения процедуры определения нарушения иммунологического статуса у животных.
Техническим результатом изобретения является повышение, достоверности лабораторного исследования путем проведения биологического теста, в качестве которого используют энзиматический тест для выявления различия в функциональной активности лимфоцитов определяя среднюю активность гликолитических ферментов а-ГФДГ (а-глицерофосфатдегидрогеназы) и СДГ (сукцинатдегидрогеназы). Предлагаемый способ позволяет сформировать группу животных с высоким риском снижения иммунологической реактивности.
Технический результат достигается при помощи способ аиммунологического мониторинга животных путем определения иммунологической реактивности по биологическому тесту, при этом, с целью повышения точности и упрощения способа, в качестве биологического теста используют энзиматический тест для выявления различия в функциональной активности лимфоцитов определяя среднюю активность гликолитических ферментов а-ГФДГ (а-глицерофосфатдегидрогеназы) и СДГ (сукцинатдегидрогеназы) по следующей формуле:
A=S/N
где А - активность фермента, S - число гранул, а N - число просмотренных лимфоцитов,
при активности а-ГФДГ (а-глицерофосфатдегидрогеназы) и СДГ (сукцинатдегидрогеназы) до 3 гранул в лимфоците животных относят в группу со сниженной иммунологической реактивностью.
Краткое описание чертежей и иных материалов
На фиг. 1, приведена средняя активность гликолитических ферментов лимфоцитов а-ГФДГ (а-глицерофосфатдегидрогеназы) и СДГ (сукцинатдегидрогеназы) в лимфоцитах.
На фиг. 2, указана корреляционная зависимость между активацией а-ГФДГ (СДГ) и периодом беременности.
Осуществление изобретения
Выбирая энзиматический тест в иммунологическом мониторинге, мы исходили из предположения, что изменение функциональной активности лимфоцитов периферической крови, индуцированной главным образом различием между донором и реципиентом в HLA-совместимости и имеющей следствием манифестацию криза отторжения, должно сопровождаться изменением внутриклеточного метаболизма, а значит, опосредоваться через системы внутриклеточных ферментов.
Определение активности ферментов производили микроскопически на мазке перефереической крови после осуществления энзиматической проводки. Тест состоит из четырех этапов, хронометраж которых для одного исполнителя приведен ниже:
- приготовление реагирующих смесей - 10 мин на каждую;
- постановка реакции - 1 ч 15 мин;
- микроскопический анализ - 20-30 мин;
- вычисление активности для одного фермента - 3 мин.
Пример 1
Приготовление реагирующих смесей
Смесь №1. В 300 мл 1/1,5 Μ фосфатного буфера (рН 7,2-7,4) добавляют 78 мг трилона-В (ЕДТА Na2, «Reaml») и 78 мг нитротетразолия фиолетового («Reanal»); смесь фильтруют и хранят при 4°С; перед употреблением нагревают до 37°С.
Смесь №2а (готовят ex tempore): 40 мл смеси №1 + 630 мг «глицерофосфата (глицерин-1-фосфатдинатриевая соль).
Смесь №2б (готовят ex tempore): 40 мл смеси №1 + 540 мг динатрий сукцината.
В опыте для определения иммунологической реактивности использовали 15 свиноматок крупной белой породы и полученное потомство (новорожденные поросята 165 гол.). Кровь у опытных и контрольных животных для приготовления мазка берут ушной вены и приготовляют мазок на предметном стекле. Мазок фиксируют 30 мин в ацетон-трилоне В (60% раствор ацетона + 250 мг ЕДТА Na2) и затем промывают проточной водой. У
Затем для оценки энзимной активности ферментов лимфоцитов подготовленные мазки помещают в смесь 2а (для а-ГФДГ) на 4 часа и 2б (для СДГ) на 24 ч при 37°С, после чего промывают в проточной воде. Затем окрашивают 0,25% раствором Janus grun (Merck) в течение 10-15 с; промывают и высушивают при 22°С, после чего он готов для подсчета.
Учет активности ферментов. Производится в течение 4 ч для СДГ и 24 ч для а-ГФДГ после приготовления мазка. Под световым микроскопом (10×90) подсчитывают гранулы энзимов, образовавшиеся в результате цитохимических реакций и видные как фиолетовые включения, расположенные по всей поверхности клетки. Подсчитывают число гранул в 50 лимфоцитах (на двух разных мазках, для а-ГФДГ и для СДГ).
Активность фермента А в числе гранул рассчитывается по формуле
A=S/N,
где S - число гранул, a N - число просмотренных лимфоцитов.
Нами обнаружены различия в функциональной активности лимфоцитов (внутриклеточный метаболизм лимфоцитов). Установили, что активность внутриклеточного фермента отражает напряженность клеточного метаболизма, этот фермент служит маркером иммунологической реактивности.
У животных с признаками пониженной иммунологической реактивности имелись различия по данным показателям. Так у опытных животных составило 2 гранулы, а у контрольных 10 гранул на лимфоцит. Уровень активности ферментов показан в таблице 1.
Пример 2
По второму примеру во вторую половину беременности определяют активность ферментов, которая соответствует в среднем 6,83±0,50 (а-ГФДГ) и 10,55±0,63 (СДГ). Нарушение условий плацентации в первую половину снижало уровень а-ГФДГ и активность СДГ.
Начиная с 1-го месяца после беременности, т.е. в период стабильной функции фетоплацентарного комплекса, активность обоих ферментов близка к активности у интактных животных. Из полученных данных следует, что при снижении иммунологической реактивности активность фермента а-ГФДГ была высокой в подавляющем большинстве случаев, а при отсутствии данного эффекта, наоборот, около 60% определений активности фермента давали низкие результаты. Высокий коэффициент корреляции и однозначная направленность процесса свидетельствуют о том, что активация а-ГФДГ связана с последующей манифестацией иммуносупрессивного состояния у данных особей.
Из проведенного исследования можно сделать вывод о том, что предлагаемое изобретение обладает в отношении известных разработок следующими преимуществами.
1. Предлагаемый способ предназначен для проведения более достоверного иммунологического мониторинга животных.
2. Обладает меньшей трудоемкостью в применении, делая его простым и доступным по техническому выполнению на любом сельскохозяйственном предприятии.

Claims (11)

  1. Способ диагностики снижения иммунологической реактивности животного организма по биологическому тесту, отличающийся тем, что в качестве биологического теста используют энзиматический тест для выявления различия в функциональной активности лимфоцитов и готовят реагирующие смеси:
  2. cмесь 1 включает 300 мл 1/1,5 Μ фосфатного буфера с рН 7,2-7,4, в который добавляют 78 мг трилона-В и 78 мг нитротетразолия фиолетового; смесь фильтруют и хранят при 4°С; перед употреблением нагревают до 37°С;
  3. смесь 2а готовят ex tempore: 40 мл смеси 1 + 630 мг глицерин-1-фосфатдинатриевой соли;
  4. смесь 2б готовят ex tempore: 40 мл смеси 1 + 540 мг динатрий сукцината;
  5. далее кровь берут из ушной вены опытных и контрольных животных для приготовления мазка и приготовляют мазок на предметном стекле; мазок фиксируют 30 мин в ацетон-трилоне В и затем промывают проточной водой;
  6. для оценки энзимной активности ферментов лимфоцитов подготовленные мазки помещают в смесь 2а для а-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ) на 4 часа и 2б для сукцинатдегидрогеназы (СДГ) на 24 ч при 37°С, после чего промывают в проточной воде, затем окрашивают в течение 10-15 с; промывают и высушивают при 22°С, после чего производят учет активности ферментов в течение 4 ч для СДГ и 24 ч для а-ГФДГ после приготовления мазка;
  7. под световым микроскопом подсчитывают гранулы энзимов, образовавшиеся в результате цитохимических реакций и видные как фиолетовые включения, расположенные по всей поверхности клетки; подсчитывают число гранул в 50 лимфоцитах на двух мазках - для а-ГФДГ и для СДГ;
  8. определяют среднюю активность гликолитических ферментов а-ГФДГ и СДГ по следующей формуле:
  9. A=S/N
  10. где А - активность фермента, S - число гранул, а N - число просмотренных лимфоцитов,
  11. при активности а-ГФДГ и СДГ до 3 гранул в лимфоците животных относят в группу со сниженной иммунологической реактивностью.
RU2020144360A 2020-12-30 2020-12-30 Способ иммунологического мониторинга животных RU2754633C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020144360A RU2754633C1 (ru) 2020-12-30 2020-12-30 Способ иммунологического мониторинга животных

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020144360A RU2754633C1 (ru) 2020-12-30 2020-12-30 Способ иммунологического мониторинга животных

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2754633C1 true RU2754633C1 (ru) 2021-09-06

Family

ID=77669939

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020144360A RU2754633C1 (ru) 2020-12-30 2020-12-30 Способ иммунологического мониторинга животных

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2754633C1 (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1752344A1 (ru) * 1990-02-27 1992-08-07 Омский сельскохозяйственный институт им.С.М.Кирова Способ оценки иммунного ответа животных
EP0542301A1 (en) * 1991-11-15 1993-05-19 Olympus Optical Co., Ltd. A method of fixing coated biological substances by drying them
RU2126154C1 (ru) * 1996-06-13 1999-02-10 Емельянов Борис Алексеевич Способ оценки иммунологической реактивности организма
RU2605381C2 (ru) * 2009-12-23 2016-12-20 Селлестис Лимитед Способ измерения клеточно-опосредованной иммунологической реактивности

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1752344A1 (ru) * 1990-02-27 1992-08-07 Омский сельскохозяйственный институт им.С.М.Кирова Способ оценки иммунного ответа животных
EP0542301A1 (en) * 1991-11-15 1993-05-19 Olympus Optical Co., Ltd. A method of fixing coated biological substances by drying them
RU2126154C1 (ru) * 1996-06-13 1999-02-10 Емельянов Борис Алексеевич Способ оценки иммунологической реактивности организма
RU2605381C2 (ru) * 2009-12-23 2016-12-20 Селлестис Лимитед Способ измерения клеточно-опосредованной иммунологической реактивности

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
КАВЦЕВИЧ Н.Н. Морфологические и цитохимические особенности клеток крови морских млекопитающих в связи с адаптацией к среде обитания. Автореф. дисс. доктора биол. наук. Петрозаводск, 2011, 38 c. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Archetti et al. Serum chemistry and hematology values in commercial rabbits: preliminary data from industrial farms in northern Italy
Piccione et al. Reference values for some haematological, haematochemical, and electrophoretic parameters in the Girgentana goat
Sardharwalla et al. Detection of heterozygotes for homocystinuria: study of sulphur-containing amino acids in plasma and urine after L-methionine loading
Gomez et al. Normal reference-intervals for 20 biochemical variables in healthy infants, children, and adolescents.
Hussein et al. 24-h variations of blood serum metabolites in high yielding dairy cows and calves
US20010018220A1 (en) IgG antibody testing method
JP2005526513A (ja) 白血球数の測定方法および装置
Siegel et al. Hematology and Biochemistry of small mammals
Winecker et al. Detection of cocaine and its metabolites in amniotic fluid and umbilical cord tissue
PT88615B (pt) Equipamento e metodo de dosagem imunometrica aplicavel a celulas completas
Barton et al. Serum bile acids concentrations in healthy and clinically III neonatal foals
Martins et al. Prolonged, low-grade inflammation in the first week of lactation: Associations with mineral, protein, and energy balance markers, and milk yield, in a clinically healthy Jersey cow cohort
RU2754633C1 (ru) Способ иммунологического мониторинга животных
CN101118237A (zh) 一种奶牛亚临床酮病诊断试纸
RU2737336C1 (ru) Способ определения иммунологической реактивности организма животных
Fraser et al. Studies with a simplified nitroprusside test for ketone bodies in urine, serum, plasma, and milk
US6333160B1 (en) Method and specific diagnostic system for objectively assessing and monitoring the relative homeostasis and health of animals
RU2752766C1 (ru) Способ определения иммунологической толерантности у животных
RU2750787C1 (ru) Способ определения изоантигенной нагрузки в функциональной системе "мать-плод-новорожденный"
Reynolds et al. Determination of reference intervals for plasma biochemical values in clinically normal adult domestic shorthair cats by use of a dry-slide biochemical analyzer
RU2766780C1 (ru) Способ определения антигенной нагрузки животных
WO2012163361A1 (en) Method and system for identification of physiological imbalance in an animal
CN109097434B (zh) 一种唾液酸检测试剂盒
RU2743363C1 (ru) Способ тестирования иммунологической толерантности у животных
RU2749026C1 (ru) Способ диагностики изоиммунизации животных