CN100378458C - 固相白色氨基反射层样品池制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固相白色氨基反射层样品池制造方法。其方法为：采用吡啶/丙酮预先活化处理聚苯乙烯表面，用乙酸/间甲酚/吡啶溶解、活化尼龙，使两者之间发生疏水性相互作用，可使尼龙-6牢固、均匀的结合于聚苯乙烯样品池的内表面；用三乙基氧鎓四氟硼酸脂直接进行处理使尼龙膜上的氧原子烷基化；尼龙-6膜上的烷基经戊二醛双功能团作用，共价连接一端结合“手臂”上的游离氨基，另一端游离的醛基结合蛋白质的游离氨基形成交牢固的共价结合，得到固相白色氨基反射层样品池。该样品池可以多次重复使用。本发明的方法可以用于固相酶方法，提高酶工程的效果，降低其成本。
Description
技术领域
本发明属于固相白色氨基反射层样品池制造方法。
背景技术
固相免疫分析、亲和层和固相酶等技术都需要将生物活性物质(免疫配基、核酸、酶等)结合于惰性大分子材料，如琼脂糖、纤维素、尼龙及各种塑料表面；其中聚苯乙烯(PS)因原料来源容易，物理、化学性质稳定，易于加工成型等，使其应用最为普遍。结合于固相表面分子的数量及生物活性或亲和力是影响提高免疫分析检测灵敏度的因素之一(半抗原，蛋白质和核酸聚与修饰的苯乙烯固相的共价连接，免疫学方法杂志，Covalent Linking of haptens，protein andnucleic acid to a modified polystyrene support.J Immunol Methods1993.159：177-187)。物理吸附法由于吸附后分子活性降低，且经长期保存及操作中的多次冲洗发生分子脱落，致使其灵敏度、重复性及稳定性明显降低。
自上世纪70年代，人们采用各种化学和物理方法将生物分子共价结合于固相，包括将塑料经过化学修饰成活性基团(氨基，羧基和硫氢基)，活性基团移植和活性分子与聚苯乙烯共聚等方法，但由于聚苯乙烯表面的氢键非常稳定，许多结果不甚理想。有的虽然已形成商品，但由于成本高出常规材料数倍，不适合普遍应用，所以现在常规应用的ELSIA固相仍然采用物理吸附法(用于免疫分析的蛋白质与塑料表面共价连接技术，免疫方法学杂志，1987，98：129-135 Covalent binding of protein to grafted plasticsurfaces suitable suitable suitable suitable for.Immunol.Methods.1987，98：129-135)。因此，研制适于常规应用含活性基团的固相材料成为提高超微量免疫分析灵敏度的关键技术之一。
尼龙(聚己内酰胺)作为可游离出自由氨基的多氨，很早就引起人们的关注。但多数研究都集中于预先将生物分子结合与尼龙膜上之后再覆盖于聚苯乙烯(PS)微孔板(嗜热菌蛋白酶固定在聚酰胺上，生物技术和生物工程2003，82(2)190-199。Immobilization of Thermolysin to polyamideNonwoven Materials.Biotechnol.and Bioeng.2003，82(2)190-199)。不适合做ELSIA固相样品池。关于将尼龙结合于聚苯乙烯为样品池的报道(半抗原结合的尼龙涂布于聚苯乙烯板作为酶联免疫分析固相，免疫方法学杂志1990.127：43-49.Haptenated nylon-coated polystyrene plates as asolid phase for ELSIA.J.Immunol Methods.1990，127：43-49)，由于采用静止状态下的自然结合，被证明结合不均匀，不能耐受尼龙水解释放氨基的强酸处理以及化学偶联中的有机溶剂，导致聚苯乙烯(PS)表面被侵蚀、破坏，不适合于做常规固相材料。
发明内容
为了提高超微量免疫分析灵敏度，研制适于固相时间分辨荧光免疫分析应用的固相材料，解决以反射代替透射、将化学共价结合代替物理吸附等技术问题，本发明提供了一种在聚苯乙烯微孔板的表面固定一层白色不透明的尼龙层，经化学修饰后作为DSLFIA技术中使用的固相白色氨基反射层样品池的制造方法。
本发明的方法提供的固相白色氨基反射层样品池的结构如图1所示。它是一个有底的圆台型或圆柱型的杯状体；是由基体1、中层2、内表面层3构成；所述的基体1是聚苯乙烯(PS)微孔板，中层2是联结于基体1聚苯乙烯(PS)微孔板的内表面的nylon-6膜层，内表面层3是与中层2的nylon-6膜层以共价结合的多胺基层；
所述的基体1聚苯乙烯(PS)微孔板的内表面和中层2的nylon-6膜层的联结是用吡啶/丙酮预先活化处理基体1的内表面，用乙酸/间甲酚/吡啶溶解、活化nylon-6，使两者之间发生疏水性相互作用，同时吡啶兼有活化PS和温和的“侵蚀”作用，可使nylon-6快速牢固地联结于PS微孔板的内表面而形成内表面层2；对内表面层2的尼龙层进行烷基化处理，可使nylon-6表面生成的烷基-OR很容易地与2，6-二氨基己酸的一个氨基共价结合，形成另一端游离氨基的手臂，该“手臂”的游离氨基能与蛋白质的游离氨基形成较牢固的共价结合的内表面层3是多胺基层，于是得到固相白色不透明反射式样品池。
下面再详细介绍本发明的制造固相白色氨基反射层样品池方法的步骤和条件，以便对本发明作进一步地说明。
本发明所用试剂：
A.基体1活化剂：体积百分比浓度为6.0-8.0％吡啶的丙酮溶液。
B.中层2的尼龙-6活化剂：体积百分比浓度为0.5-0.9％吡啶的乙酸/间甲酚溶液。
C.环氧氯丙烷的乙醚溶液∶环氧氯丙烷与乙醚溶液体积比为1∶9。
D.三乙基氧鎓四氟硼酸脂试剂制备：40ml 5％(v/v)三氟化硼乙醚(v/v)溶液在持续搅拌下，加入12.5ml的环氧氯丙烷的乙醚溶液，在30分钟内加完，之后加热回流一小时，室温再搅拌3小时，滤出三乙基氧鎓四氟硼酸脂，再用无水乙醚冲洗3次，得到的三乙基氧鎓四氟硼酸脂。其产率为90％--95％以上。
E.三乙基氧鎓四氟硼酸脂二氯甲烷溶液：含0.01-0.05g/ml三乙基氧鎓四氟硼酸脂的二氯甲烷溶液。
F.戊二醛液：将0.5M戊二醛溶液以体积百分比浓度为5％溶于pH＝7:6的硼酸盐缓冲溶液。
G.1.6-己二胺溶液：浓度为0.5M的1.6-己二胺溶液溶于0.1M的pH＝9.5的碳酸盐缓冲溶液。
本发明制备方法的步骤和条件：
1).nylon-6与PS基体1的连接
向由PS基体1孔内加入基体1活化剂，室温放置1-3分钟，弃去溶液后立即加入12-18％尼龙-6粉的中层2nylon-6的活化剂，沿中轴线慢速旋转基体1，使尼龙-6快速、坚固、均匀地结合于基体1孔的内表面，形成尼龙-6厚度为0.1-0.2mm的固相白色氨基反射层样品池中层2的膜层；
2).尼龙膜表面烷基化
加入三乙基氧鎓四氟硼酸脂的二氯甲烷溶液上述步骤1)的样品池中；室温放置4-10分钟，弃去，用二氯甲烷冲洗2次，用二氧六环冲洗1次；
3).修饰尼龙膜表面
将戊二醛溶液加入到上述步骤2)的样品池中，37℃温育15分钟，弃去，加入0.2M pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液冲洗三次，再加入1.6-己二胺pH＝9.5的溶液，室温放置3小时，倒掉，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗3次，即得固相白色氨基反射层样品池。
洗3次，即得固相白色氨基反射层样品池。
本发明的制备方法的相关的反应过程如下：
上述的过程说明：为使已结合于PS表面nylon-6聚己内酰氨结构游离出活性基团，采用自合成的三乙基氧鎓四氟硼酸脂烷化处理微孔板内表面的尼龙层，不影响nylon-6结构，且能充分暴露活性基团用戊二醛连接1.6-己二胺，即接长“手臂”，提高了游离氨基反应几率。利用戊二醛双功能团作用，一端结合“手臂”上的游离氨基，另一端游离的醛基结合蛋白质的游离氨基，形成交牢固的共价结合。
1.采用吡啶/丙酮预先活化处理PS表面，用乙酸/间甲酚/吡啶溶解、活化尼龙，使两者之间发生疏水性相互作用。同时吡啶兼有活化PS和温和的“侵蚀”作用，可使nylon-6快速牢固的结合于PS表面。
2.为使nylon-6聚己内酰氨结构游离出活性基团，以往用盐酸部分水解法，由于过度水解会使nylon结构断裂，控制水解时间又导致游离氨基暴露不充分，故采用自己合成的三乙基氧鎓四氟硼酸脂烷化处理微孔板内表面的尼龙层，不影响nylon-6结构，且能充分暴露活性基团后者用戊二醛很容易联结1.6-己二胺，即接长“手臂”。
3.利用戊二醛双功能团作用，一端结合“手臂”上的游离氨基，另一端游离的醛基结合蛋白质的游离氨基，形成牢固的共价结合。
本发明的技术特点和效果：
1.利用nylon-6结合于PS的内表面的固相白色氨基反射层样品池，采用新的溶解多氨技术和特定的PS活化剂、多氨凝固剂，使多胺均匀、牢固移植于nylon-6的表面，形成白色反射光的多胺基内层。
2.该多胺内表面固相在室温暴露空气中能长期保存并能耐受强酸、碱、有机溶剂不变形、不脱落。为使nylon-6聚己内酰氨结构游离出活性基团，以往用盐酸部分水解法，由于过度水解会使尼龙结构断裂，控制水解时间又导致游离氨基暴露不充分，故采用三乙基氧鎓四氟硼酸脂烷化处理尼龙层。该法不会影响nylon-6结构，且能充分暴露活性基团
利用戊二醛双功能团作用，一端结合“手臂”上的游离氨基，另一端游离的醛基结合蛋白质的游离氨基，提高结合免疫配基的活性。
3.采用吡啶代替二氯甲烷。因为吡啶不但挥发慢而且能促进溶解状态的nylon聚集及与PS的结合，在PS表面形成均匀、坚韧、不能透过有机溶剂的薄膜；并在其与PS结合时，对活性氨基含量、机械强度及对有机溶剂耐受性等方面收到理想的效果。
4.用三乙基氧鎓四氟硼酸脂处理nylon表面，文献中已有报道，但都是用nylon膜反应，洗脱需经过大量液体浸泡，而本发明采用池内冲洗三次，非特异结合为3.41％，实验/非特异＝12.9，显著高于ELISA 2.1倍诊断标准。
5.将本发明的方法制造的固相白色氨基反射层样品池用于放射性标记免疫分析，配基结合率达43.98％，为已有的PS微孔板的2.5-13.1倍。证明本发明的方法制造的固相白色氨基反射层样品池具有较高活性及灵敏度。
6.本发明方法制造的固相白色氨基反射层样品池的批内误差统计实验及对照组平均CV＝5.0％，各组8个平行样本CV＜10％，显著高于已有的PS微孔板。
7.本发明方法制造的固相白色氨基反射层样品池的破坏性实验结果证明：蛋白质完全变性的温度为65℃，实验采用50℃保持加温48小时，样品池偶联抗体的结合率仍保持41％，比实验前降低了4.6％。而已有的方法制造的PS样品池结合率5％，已完全失效。
8.本发明的固相白色氨基反射层样品池的性能可与与丹麦生产的NuncCovalink-NH微孔板相比，实用性则比其优越。例如Nunc板的活性基团为-NH，本发明为-NH2，该基团联结蛋白质的氨基更容易，更稳定；Nunc板售价比PS微孔板贵2倍。本发明因操作简便，取材容易，成本只比PS微孔板贵20％左右。
用本发明的方法制造的固相白色氨基反射层样品池既可用于应用于固相免疫分析(放射免疫分析、荧光免疫分析、酶联免疫分析、时间分辨荧光免疫分析)DNA芯片等生物技术分析领域，还可以用做亲和层析固相结合剂，即将直径为5-8μm PS微珠按本方法移植活性氨基，可作为高效能亲和层析材料，且可以反复使用，其功能及成本均比常用的聚丙烯酰胺凝胶为优，具有广泛的应用价值。
附图说明
图1是固相白色氨基反射层样品池结构示意图。
具体实施方式
本发明的实施例所使用的试剂及其制备：
A.基体1活化剂：体积百分比浓度为6.0-8.0％吡啶的丙酮溶液。
B.中层2的nylon-6的活化剂：体积百分比浓度为0.5-0.9％吡啶的乙酸/间甲酚溶液。
C.环氧氯丙烷乙醚溶液∶环氧氯丙烷与乙醚溶液体积比为1∶9。
D.三乙基氧鎓四氟硼酸脂及制备：40ml 5％(v/v)三氟化硼乙醚(v/v)溶液在持续搅拌下，加入12.5ml的环氧氯丙烷的乙醚溶液，在30分钟内加完，之后加热回流一小时，室温再搅拌3小时，滤出沉淀，再用无水乙醚冲洗3次，得到的三乙基氧鎓四氟硼酸脂。其产率为90％--95％以上。得到的三乙基氧鎓四氟硼酸脂必须在48小时内用完，否则失效。
E.三乙基氧鎓四氟硼酸脂二氯甲烷溶液：含0.01-0.05g/ml三乙基氧鎓四氟硼酸脂二氯甲烷溶液。
F.戊二醛硼酸盐缓冲溶液：将0.5M戊二醛溶液以体积比5％相溶于pH＝7.6硼酸盐缓冲溶液。
G.1.6-己二胺溶液：浓度为0.5M 1.6-己二胺的溶液溶于0.1M pH＝9.5碳酸盐缓冲溶液。
实施例1：
(1).向由PS构成的基体1内加入400μl基体1活化剂，室温放置1分钟，弃去溶液后立即加入200μl由中层2nylon-6活化剂溶解的12％nylon-6溶液，沿中轴线慢速旋转(40次/分)基体1，使nylon-6快速、坚固、均匀地结合于基体1的内表面，形成nylon-6膜层厚度为0.1-0.2mm的固相白色氨基反射层样品池中层2nylon-6膜层；
(2).加入400μl 5％三乙基氧鎓四氟硼酸脂的二氯甲烷溶液到上述步骤(1)的样品池中，室温放置4-10分钟，弃去，用二氯甲烷冲洗2次，二氧六环冲洗1次；
3.将200μl 0.5M戊二醛加入上述(2)的样品池中，37℃温育15分钟，弃去。加入0.2M pH＝7.2磷酸盐缓冲溶液冲洗三次；再加入200μl0.058g/ml的1，6己二胺溶液，室温放置3小时，倒掉。然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗3次，即得本发明的固相白色氨基反射层样品池。
实施例2
(1).向由PS构成的基体1内加入400μl基体1活化剂，室温放置1分钟，弃去溶液后立即加入200μl用中层2 nylon-6活化剂溶解的13％nylon-6溶液。沿中轴线慢速旋转(40次/分)基体1，使nylon-6快速、坚固、均匀地结合于基体1的内表面，形成nylon-6厚度为0.1-0.2mm的固相白色氨基反射层样品池中层2nylon-6膜层；
(2).加入400l 4％三乙基氧鎓四氟硼酸脂的二氯甲烷溶液到上述步骤(1)的样品池中，室温放置4-10分钟，弃去.用二氯甲烷冲洗2次，二氧六环冲洗1次；
3.加入200μl 0.5M戊二醛硼酸盐缓冲溶液到上述步骤(2)的样品池中，37℃温育15分钟，弃去。加入0.2M pH＝7.2磷酸盐缓冲溶液冲洗三次；再加入200μl 0.5M的1.6-己二胺溶液，室温放置3小时，倒掉，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗3次，即得到本发明的固相白色氨基反射层样品池。
实施例3
(1).向由PS构成的基体1内加入400μl基体1活化剂。室温放置1分钟，弃去溶液后立即加入200μl由中层2nylon-6活化剂溶解的14％nylon-6溶液。沿中轴线慢速旋转(40次/分)基体1，使nylon-6快速、坚固、均匀地结合于基体1的内表面，形成nylon-6膜层厚度为0.1-0.2mm的固相白色氨基反射层样品池中层2nylon-6膜层；
(2).加入400μl 3％三乙基氧鎓四氟硼酸脂的二氯甲烷溶液到上述步骤(1)的样品池中，室温放置4-10分钟，弃去。用二氯甲烷冲洗2次，二氧六环冲洗1次；所述的三乙基氧鎓四氟硼酸脂合成方法是按文献：(酶固定于尼龙的化学，生物化学.J.1975，147：593-603 A chemistry for theImmobilization of Enzymes on nylon.Biochem.J.1975，147：593-603)合成方法合成；
3.将200μl 0.5M戊二醛硼酸盐溶液加入到上述(2)的样品池中，37℃温育15分钟，加入0.2M pH＝7.2磷酸盐缓冲溶液冲洗三次；再加入200μl 0.5M的1.6己二胺溶液，室温放置3小时，倒掉，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗3次，即得本发明的固相白色氨基反射层样品池。
实施例4
(1).向由PS构成的基体1内加入400μl基体1活化剂，室温放置1分钟，弃去溶液后立即加入200μl用中层2 nylon-6活化剂溶解的15％ nylon-6溶液。沿中轴线慢速旋转(40次/分)基体1，使nylon-6快速、坚固、均匀地结合于基体1的内表面，形成nylon-6厚度为0.1-0.2mm的固相白色氨基反射层样品池中层2nylon-6膜层；
(2).加入400μl 2％三乙基氧鎓四氟硼酸脂的二氯甲烷溶液到上述(1)的样品池中，室温放置4-10分钟，弃去，用二氯甲烷冲洗2次，二氧六环冲洗1次；
3.将200μl pH＝7.6戊二醛硼酸盐缓冲溶液的加入到上述步骤(2)的样品池中，37℃温育15分钟后加入0.2M pH＝7.2磷酸盐缓冲溶液冲洗三次；再加入200μ溶于pH＝9.5碳酸盐缓冲溶液的0.5M的1.6己二胺溶液，室温放置3小时，倒掉，然后用PBS溶液冲洗3次，即得本发明的固相白色氨基反射层样品池。
实施例5
(1).向由PS构成的基体1内加入400μl基体1活化剂。室温放置1分钟，弃去溶液后立即加入200μl由中层2 nylon-6活化剂溶解的16％nylon-6溶液，沿中轴线慢速旋转(40次/分)基体1，使nylon-6快速、坚固、均匀地结合于基体1的内表面，形成nylon-6膜层厚度为0.1-0.2mm的固相白色氨基反射层样品池中层2nylon-6膜层；
(2).加入400μl 1％三乙基氧鎓四氟硼酸脂的二氯甲烷溶液到上述(1)的样品池中，室温放置4-10分钟，弃去。用二氯甲烷冲洗2次，二氧六环冲洗1次；
3.加入200μl 0.5M戊二醛硼酸盐缓冲溶液到上述步骤(2)的样品池中，37℃温育15分钟，加入0.2M pH＝7.2磷酸盐缓冲溶液冲洗三次；再加入200μl0.5M1.6己二胺碳酸盐缓冲溶液，室温放置3小时，倒掉。然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗3次，即得本发明的固相白色氨基反射层样品池。
Claims (2)
1.一种固相白色氨基反射层样品池制造方法，其特征在于制备方法的步骤和条件如下：
1).尼龙-6与聚苯乙烯基体1的联结
向固相白色氨基反射层样品池的聚苯乙烯基体(1)内加入基体(1)的活化剂吡啶/丙酮溶液，室温放置1-3分钟，弃去溶液后立即加入12-18％尼龙-6粉的中层(2)尼龙-6的活化剂，沿中轴线慢速旋转基体(1)，使尼龙-6快速、坚固、均匀地结合于基体(1)池的内表面，形成尼龙-6厚度为0.1-0.2mm的固相白色氨基反射层样品池中层(2)的膜层；
2).尼龙膜表面烷基化
加入三乙基氧鎓四氟硼酸脂二氯甲烷溶液上述的步骤1)样品池中，室温放置4-10分钟，弃去，用二氯甲烷冲洗2次，用二氧六环冲洗1次；
3).修饰尼龙膜表面
将戊二醛溶液加入到上述步骤2)的样品池中，37℃温育15分钟，弃去，加入0.2M pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液冲洗三次，再加入1.6-己二胺的pH＝7.2溶液，室温放置3小时，倒掉，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗3次，得固相白色氨基反射层样品池。
2.一种如权利要求1所述的固相白色氨基反射层样品池制造方法，其特征在于所述的：
基体(1)活化剂为：体积百分比浓度为6.0-8.0％吡啶的丙酮溶液；中层(2)的尼龙-6的活化剂为：体积百分比浓度为0.5-0.9％吡啶的乙酸/间甲酚溶液；
三乙基氧鎓四氟硼酸脂的二氯甲烷溶液为：含0.01-0.05g/ml三乙基氧鎓四氟硼酸脂的二氯甲烷溶液；
戊二醛液为：将0.5M戊二醛液以体积比5％相溶于0.2M pH＝7.6硼酸盐缓冲溶液；
1，6-己二胺溶液为：将的0.5M的1.6-己二胺溶液溶于0.1M的pH＝9.5的碳酸盐缓冲溶液。
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| PB01 | Publication | ||
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