JPH10132817A - 標識抗体粒子及びそれを用いた測定装置 - Google Patents

標識抗体粒子及びそれを用いた測定装置

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JPH10132817A JP29143596A JP29143596A JPH10132817A JP H10132817 A JPH10132817 A JP H10132817A JP 29143596 A JP29143596 A JP 29143596A JP 29143596 A JP29143596 A JP 29143596A JP H10132817 A JPH10132817 A JP H10132817A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 粒子に結合した抗体のアビィディティを失う
ことなく、任意の色を持った標識抗体粒子を用いて高い
判定能力を有する測定装置を提供する。また、2種類以
上の上記標識抗体粒子を用いて2種類以上の測定対象物
を同時に測定可能な測定装置を提供する。 【解決手段】 抗体に粒子状でない標識物を標識した
後、粒子に結合することを特徴とする標識抗体粒子作製
方法、あるいは抗体に粒子を結合した後、粒子状でない
標識物を粒子結合抗体んい標識することを特徴とする標
識抗体粒子作製方法を利用して粒子状でない標識物を標
識した抗体を粒子に結合させたことを特徴とする標識抗
体粒子を作製する。また、このようにして作製した標識
抗体粒子を利用して単独あるいは多種の測定対象物を測
定できる装置を作製した。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、溶液中の測定対象
物を測定あるいは検出する手段として利用することがで
き、特に環境、食品及び医療の分野に有用な標識抗体粒
子およびそれを用いた測定装置に関するものである。
【0002】
【従来の技術】従来の抗体を利用した測定方法あるいは
測定装置において、抗体を標識する方法として、色素あ
るいは酵素を用いるか金属コロイド粒子、ラッテクス粒
子、染料ゾル粒子あるいは金属酸化物コロイド粒子を用
いることが知られていた。
【0003】また、近年盛んに利用されている測定原理
として免疫クロマトグラフィ法がある。この免疫クロマ
トグラフィ法では、標識物として金属コロイドである金
コロイドあるいは、ブルーラッテクス粒子がよく使用さ
れている。金コロイドは、赤味がかった色をしており、
ブルーラッテクスは青色をしている。これら測定装置
は、簡便性を重視して作製されており、それぞれの標識
粒子の色により一般の人でも容易に可視的に検出できる
ようになっている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】上記のように従来のも
のは可視的に検出することが重要視されており、その
点、色の配色も判定度を向上させるためには重要であ
る。
【0005】従来の方法では、上記以外の粒子を使用し
てもより鮮やかな色の持った粒子を作製することは困難
であり、また多色を揃えることも困難なことであった。
【0006】さらに酸化物あるいはラッテクスに含しん
させる染料の種類を変えることにより色の異なった粒子
を作製することは理論的に可能であるが、粒子をコロイ
ド状にし、さらには抗体を容易にその表面に結合させる
ことは困難であった。
【0007】その結果として、種々の測定対象物を同時
に測定することもできなかった。
【0008】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決する手段
として、粒子材料を変更することなく、抗体に結合させ
る色素の種類を任意に変えて抗体に結合させ、その結合
物をさらに粒子に結合する方法または、あらかじめ抗体
を粒子に結合させたものに任意の色素を結合する方法を
用いることにより、判定度の向上に貢献できる色を持っ
た標識抗体粒子を容易に作製することができる。
【0009】この標識抗体粒子を使用した測定方法及び
測定装置は、判定度の向上が期待できる。
【0010】さらには、任意の2種類以上の色素を使用
することにより2種類以上の標識抗体粒子を容易に作製
することができ、それらを利用することにより種々の測
定対象物を同時に測定することもできる。
【0011】
【発明の実施の形態】抗体のアミノ基と結合できる官能
基を有しており任意の吸光色を有している色素(蛍光色
素)を利用する。一般的な吸光色として橙色(490nm付
近)、赤色(550nm付近)、青色(600nm付近)を利用
し、それぞれに対応する色素も多く存在している。タン
パク質との結合効率の面から官能基としては、サクシミ
ドあるいはイソチオシアネート基が望ましい。
【0012】抗体1分子に対する色素の結合数は、任意
に変えることが可能であり、なるべく多く結合させるこ
とができる。しかし、多く結合させると抗体の性能(親
和性、溶解性等)を低下させる恐れがあるため、結合数
は1〜20までが望ましい。色素を抗体に結合する際、
上記官能基を有する場合には室温で数時間で結合するこ
とができる。その後、未反応色素をゲル濾過あるいは透
析により容易に取り除くことができる。
【0013】色素標識抗体を結合することのできる粒子
(金属コロイド、ラッテクス粒子、染料ゾル粒子、金属
酸化物コロイド等)は多く存在している。測定装置の構
成によりどの粒子が最適を選定しなければならない。色
素の色調を損なわない粒子が最も適している。その点か
ら、粒子は無色透明あるいはそれに限りなく近いもの、
あるいは白色のものを利用する。特に望ましいのは、無
色透明な粒子である。通常の方法と同様に粒子と上記色
素標識抗体を非特異吸着により結合する。ブロキング剤
としては常法通り牛血清アルブミンを使用する。未反応
の色素標識抗体を遠心分離あるいは透析により除去・精
製する。
【0014】一つの方法として、最初に抗体を上記方法
により選定した粒子に結合させた後、上記色素標識法に
より色素を標識する。その後、未反応色素を透析あるい
は遠心分離により除去・精製する。
【0015】いずれの方法により作製した標識抗体粒子
は、その後、安定を保つために凍結乾燥して固体状態で
保存するかあるいは測定装置構築のため濾紙に含浸した
後に凍結乾燥して保存する。
【0016】色素標識抗体粒子を利用して多くの測定原
理と多くの測定対象物の組み合わせが存在する。
【0017】その中でも今回発明した標識抗体粒子を最
大限活用できる測定原理は、免疫クロマトグラフィであ
る。この方法は、可視的に(目視で)簡便に測定対象物
を検出することができため、色素標識物である標識抗体
粒子を利用する方法としては最適である。
【0018】今回発明した標識抗体粒子を免疫クロマト
法に導入することにより多くの測定対象物を測定するこ
とができる。特に、免疫測定項目の大多数を占めている
タンパク質を半定量的に測定するには、免疫クロマト法
とサンドイッチ法を利用することが最も容易な方法であ
ると考えられる。
【0019】サンドイッチ法を導入した免疫クロマト
は、測定対象物に対して同時に結合することのできる2
種類の抗体が必要であり、一方を標識し移動相として使
用し、他方を担体に固定化し固相として使用する。この
標識抗体として今回発明した標識抗体粒子を使用する。
【0020】図1に示すように標識抗体粒子含浸濾紙を
抗体固定化部の上流側に装着する。さらに上流側から測
定対象物を含む試料液を添加し、クロマトにより標識抗
体粒子と測定対象物が反応しながら流れる。固定化部ま
で到達すること測定対象物を介してサンドイッチ状態で
標識抗体粒子は停止する。そのため、抗体固定化部が呈
色する。
【0021】さらに、この原理を応用して同時に2種類
以上の測定対象物を測定することができる。
【0022】この場合、上記の免疫クロマトとの相違点
は、標識抗体粒子含浸濾紙中には、2種類以上の色素標
識粒子が混在していること、および抗体固定化部は、2
カ所以上存在していることである(図1)。
【0023】さらに、具体的に上記発明の一例として、
2種類の蛍光色素及び白金コロイドを利用してhCG、
LHを同時に測定できる測定装置を用いた測定方法につ
いて記述する。
【0024】(TRITC標識抗hCGβ抗体の作製)
ETRAMETHYLRHODAMINE-5-(and-6-)-ISOTHIOCYANATE(TRI
TC、Mw=444、吸収極大:約550nm)1.48mgを100μlのDM
Fに溶解した(3.33*10-6モル、抗体比50倍当量)。この液
を10mg/ml抗hCGβモノクローナル抗体液(6.67*10-8モ
ル)に添加し、室温で一晩撹拌しながら反応した。
【0025】反応後、SephadexG-25カラム(サイズ:40
0*20mm、平衡バッファ:PBS、流速:2ml/分)をか
け、タンパク質分画のみを集めた。
【0026】この分画を紫外線・可視光線スペクル分析
を行った結果、抗体1個あたりに10.5個のTRITCが結合
していた(抗hCGβ-TRITC)。
【0027】(TRITC標識抗hCGβ抗体白金コロ
イド粒子の作製) .2M K2CO3で白金コロイド溶液のpHを7.0に調節した。25
0μg抗 hCGβ-TRITCを含む抗体液を100ml白金コロイド
溶液に添加した。その後、室温で10分間放置した後、10
g/l Carbowax-20M(Union Cabide)と5mM NaClを含む2.0m
l溶液(pH 7.0)を添加した。室温で1時間放置した後、遠
心分離した(12,000rpm、10分間)。
【0028】沈澱物を10g/l Carbowax-20M(Union Cabid
e)と5mM NaClと0.1g/l thiomersalを含む2.0ml溶液(pH
7.0)で懸濁した。この操作を2回繰り返した後、最終的
に遠心分離後1%BSAを含むPBS2.0MLで懸濁して保存し
た。
【0029】(FITC標識抗LHβ抗体の作製)LUOR
ESCENCEIN-5-ISOTHIOCYANATE(FITC、Mw=389、吸収極
大:約500nm)1.30mgを100μlのDMFに溶解した(3.33*
10-6モル、抗体比50倍当量)。
【0030】この液を10mg/ml抗LHβモノクローナル抗
体液(6.67*10-8モル)に添加し、室温で一晩撹拌しなが
ら反応した。
【0031】反応後、SephadexG-25カラム(サイズ:40
0*20mm、平衡バッファ:PBS、流速:2ml/分)をか
け、タンパク質分画のみを集めた。
【0032】この分画を紫外線・可視光線スペクル分析
を行った結果、抗体1個あたりに12個のFITCが結合して
いた(抗LHβ-FITC)。
【0033】(FITC標識抗LHβ抗体白金コロイド
粒子の作製) .2M K2CO3で白金コロイド溶液のpHを7.0に調節した。25
0μg抗 LHβ-FITCを含む抗体液を100ml白金コロイド溶
液に添加した。その後、室温で10分間放置した後、10g/
l Carbowax-20M(Union Cabide)と5mM NaClを含む2.0ml
溶液(pH 7.0)を添加した。室温で1時間放置した後、遠
心分離した(12,000rpm、10分間)。
【0034】沈澱物を10g/l Carbowax-20M(Union Cabid
e)と5mM NaClと0.1g/l thiomersalを含む2.0ml溶液(pH
7.0)で懸濁した。この操作を2回繰り返した後、最終的
に遠心分離後1%BSAを含むPBS2.0MLで懸濁して保存し
た。
【0035】(hCG・LH同時測定)ここで作製した
抗hCGβ-TRITC白金コロイド溶液及び抗LHβ-FITC白金コ
ロイド溶液を100μlずつ混合した。この混合液をガラス
繊維濾紙(ワットマン社製、F075-14、サイズ:50*10m
m)に含浸させ、凍結乾燥した。この含浸濾紙を5mm使用
して移動相として使用した。
【0036】固定相としては、ニトロセルロース(ミリ
ポア社製、孔径5μm、サイズ:16*9mm)に抗hCGポリ
クローナル抗体及び抗LHポリクローナル抗体それぞれ
5mg/mlを1μlずつ別の場所に固定化した(図1)。
【0037】一例として、それぞれの濃度のhCG及び
LHを使用した(100IU/L〜100000IU/L)。
【0038】その後、呈色ラインをデンシトメータ(島
津製、CS-9000、500・550nmにおける反射吸収度測
定)で測定した(図2)。
【0039】
【発明の効果】以上のように本発明は、任意の色を持つ
標識抗体粒子及びそれを利用した測定装置及び同時測定
装置を得ることができた。
【0040】また、本発明の標識抗体粒子を利用するこ
とにより高性能な環境測定装置、食品管理測定装置及び
医療診断装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の標識抗体粒子を用いたhCG、LH同
時測定装置の概略図
【図2】本発明の標識抗体粒子を用いたhCG、LH同
時測定装置を用いて、hCG、LHを同時に測定した結
果を示すグラフ図

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 粒子状でない標識物を標識した抗体を粒
    子に結合させたことを特徴とする標識抗体粒子。
  2. 【請求項2】 抗体に粒子状でない標識物を標識した
    後、粒子に結合することを特徴とする標識抗体粒子作製
    方法。
  3. 【請求項3】 抗体に粒子を結合した後、粒子状でない
    標識物を粒子結合抗体で標識することを特徴とする標識
    抗体粒子作製方法。
  4. 【請求項4】 粒子が、金属、酸化物、半導体、有機物
    あるいはそれらの混合物であることを特徴とする請求項
    1記載の標識抗体粒子。
  5. 【請求項5】 粒子が、無色透明あるいはそれに著しく
    近い状態あるいは白色であることを特徴とする請求項1
    記載の標識抗体粒子。
  6. 【請求項6】 粒子状でない標識物が色素、蛍光色素、
    発光色素、電気化学的ラベル化剤であることを特徴とす
    る請求項1記載の標識抗体粒子。
  7. 【請求項7】 抗体が、生体内物質、細菌、ウイルス、
    医薬品あるいは乱用薬物に対して結合することができる
    モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体あるいは抗血
    清であることを特徴とする標識抗体粒子。
  8. 【請求項8】 請求項7記載の生体内物質が、タンパク
    質、脂質、糖類あるいは核酸類であることを特徴とする
    請求項1記載の標識抗体粒子。
  9. 【請求項9】 タンパク質が、ホルモンであることを特
    徴とする請求項8記載の標識抗体粒子。
  10. 【請求項10】 ホルモンが、絨毛性性腺刺激ホルモ
    ン、甲状腺刺激ホルモン、黄体ホルモン、濾胞形成ホル
    モン、副甲状腺刺激ホルモン、副腎脂質刺激ホルモンで
    あることを特徴とする請求項9記載の標識抗体粒子。
  11. 【請求項11】 請求項1、3〜10のいずれかに記載
    の標識抗体粒子を使用することを特徴とする定性・定量
    的測定装置。
  12. 【請求項12】 定性的あるいは定量的測定装置が、免
    疫クロマトグラフィ法、凝集法、電気化学的手法あるい
    は分光学的手法であることを特徴とする請求項11記載
    の定性・定量的測定装置。
  13. 【請求項13】 定性的あるいは定量的測定装置の測定
    対象物が、内分泌系ホルモンであることを特徴とする請
    求項11記載の定性・定量的測定装置。
  14. 【請求項14】 内分泌系ホルモンが、絨毛性性腺刺激
    ホルモン(hCG)、黄体ホルモン(LH)、甲状腺刺
    激ホルモンあるいは濾胞形成ホルモンであることを特徴
    とする請求項13記載の定性・定量的測定装置。
  15. 【請求項15】 請求項1、3〜10のいずれかに記載
    の標識抗体粒子を使用することを特徴とする定性的ある
    いは定量的測定方法。
  16. 【請求項16】 定性的あるいは定量的測定方法が、免
    疫クロマトグラフィ法、凝集法、電気化学的手法あるい
    は分光学的手法であることを特徴とする請求項15記載
    の定性・定量的測定方法。
  17. 【請求項17】 hCGあるいはLH測定において、そ
    のhCGあるいはLHに特異的に結合する2種類の抗体
    を用いて免疫クロマトグラフィ及びサンドイッチ法を利
    用し、移動相として請求項1記載の標識抗体粒子を用
    い、固定相としてもう一方の抗体を白色の担体に固定化
    し、hCGあるいはLHを含む試料を展開することによ
    り固定化部で標識抗体粒子がhCGあるいはLHを介し
    て結合することによりhCGあるいはLHを測定するこ
    とを特徴とする測定装置。
  18. 【請求項18】 2種類以上のタンパク質測定におい
    て、それぞれのタンパク質に特異的に結合するそれぞれ
    タンパク質に対して2種類の抗体を用いて免疫クロマト
    グラフィ及びサンドイッチ法を利用し、移動相として色
    の異なった2種類以上の色素を用いて作製した請求項1
    記載の標識抗体粒子2種類以上を用い、固定相としてそ
    れぞれもう一方の抗体を白色の担体に固定化し、2種類
    以上のタンパク質を含む試料を展開することにより固定
    化部でそれぞれの標識抗体粒子がそれぞれのタンパク質
    を介して結合することにより2種類以上のタンパク質を
    測定することを特徴とする同時測定装置。
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