JP3445268B2 - 連続式多孔性マトリックスに一体化された共有的に反応性な粒子 - Google Patents

連続式多孔性マトリックスに一体化された共有的に反応性な粒子

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は連続式多孔性マトリックスに一体化された共
有反応性粒子を含んで成る複合物品に関する。共有反応
性粒子は反応性官能基を有しており、そしてこれは中間
活性化工程の必要性抜きでリガンドと共有化学結合を形
成することが可能である。この複合物品は診断用品、ア
フィニティー精製及び酵素の固定化において有用であ
る。
発明の背景 一般に充填材と呼ばれている細く分割された固体又は
粒子を、様々な固形状の、本質的に非孔性な複合材を作
るためにポリマー系によく加える。充填材は典型的に
は、物理的性質を高める又は全体の値段を下げるいづれ
かの目的のためにポリマー材料に加える。これらの充填
材は主に不活性で非反応性な粒子であり、マトリックス
ポリマーとの相溶性及び／又はその値段の安さに大いに
応じて選ばれる。典型的なかかる充填材はミネラル、粘
土、金属粉末、無機酸化物、ガラス、タルク、木粉、及
びカーボンブラックである。
多孔性粒子充填型複合物品も当業界に知られている。
これらの材料は濾過又は分離媒体におけるような用途、
又は気体又は液体の浸透性が必要とされるその他の用途
において有用である。
米国特許第4,957,943号は、微孔性粒子充填型熱可塑
性ポリマー物品を述べ、これはフィルム、ファイバー、
中空ファイバー又はチューブの形状でありうる。この粒
状充填材は超微小又は数マイクロメーターのサイズであ
り、そしてそれは金属、金属酸化物、又は炭素性材料、
例えばカーボンブラックでありうる。これらの複合品は
保護衣料又はＸ−線もしくは電磁気遮断材として有用で
ある。
米国特許第4,550,123号及び第4,342,811号は、蒸気、
液体及び溶質を収着せしめることのできる粒子を含む微
孔性ポリマーファイバー及びフィルムを述べている。典
型的な収着粒子には、活性カーボン、シリカゲル及び分
子フィルター型材料が含まれる。
上記の粒子充填型微孔性材料の他に、大孔性（macrop
orus）繊維ウェブ又はシート材の中に粒子を一体化せし
めることも知られている。例えば、米国特許第3,971,37
3号は、からみ合った溶融吹込有機ポリマーマイクロフ
ァイバーのウェブ、とこのウェブの中に均質に分散、且
つ物理的に保持された三次元配列の固形粒子とを含んで
成る多孔性シート製品を述べている。典型的な粒子は活
性化カーボン又はアルミナである。この複合シートはエ
アー流から有機又は酸性蒸気を収着するのに有用であ
る。米国特許第4,963,431号は浸透性不織ポリマーパッ
ドを開示しており、このパッド全体にはゼオライト粒子
が接着結合されている。このパッドは流体からアンモニ
アを収着するのに有用である。
米国特許第4,153,661号は、相互にからみ合ったフィ
ブリル化ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）より成る
マトリックスにわたって均一に分散された粒子材料を含
んで成る、均一に多孔性な、高気孔率複合シートを述べ
ている。記載の粒子は主として無機粒子である。米国特
許第4,373,519号及び第4,460,642号は、フィブリル化PT
FEマトリックスの中への親水性有機水膨潤性粒子の一体
化を述べている。好ましい複合品は架橋化デキストラン
の粒子を含み、そして創傷包帯として有用である。米国
特許第4,810,381号はPTFEフィブリルマトリックス及び
このマトリックスの中にからんでいる非膨潤性収着粒子
を含んで成る複合クロマトグラフィー用品を開示してい
る。好ましい粒子は無機酸化物、例えばシリカ及びジル
コニアである。
不溶性固形支持体上へのタンパク質又は酵素の固定化
が所望されていることは長い間知られている。固定化は
回収のし易さ及び再利用性を可能にし、そしてしばしば
生物学的に活性な分子の安定性を高める。固定化の方法
は、支持体への生物学的に活性な分子の、物理的収着か
ら物理的捕捉、イオン又は共有結合に至るまでに範囲す
る。
米国特許第4,855,234号は、繊維状支持体に、順に、
表面修飾処理、タンパク質固定化剤及び生物学的に活性
なタンパク質のコーティングを施すことによって供され
る複合物品を開示している。米国特許第4,963,494号は
酵素の固定化された限外濾過膜を述べている。固定化
は、膜に水溶性ポリマーの溶液を含浸せしめ、この膜の
孔内でポリマーを架橋せしめるために架橋剤を利用し、
次いでこの架橋化ポリマーの官能基を介してこの膜に酵
素を共有結合させることによって達成される。
米国特許第4,102,746号は、バインダーにわたって細
く分割された充填粒子が分散されている微孔性バインダ
ー又はマトリックス上に固定化されたタンパク質、例え
ば酵素を開示している。タンパク質は二段手順において
橋渡し剤を利用して、この微孔性材料の中の分散充填粒
子に化学結合を介して共有結合している。
米国特許第5,041,225号はPTFEの親水半透性膜を開示
しており、これは膜構造に付着する親水性ポリマーと錯
生成剤との錯体でコートされた内部及び外部表面を有す
る。この錯体は、PTFE膜を親水性、且つタンパク質親和
性にする。好ましい錯生成剤は硼酸、硼酸ナトリウム又
は塩化ナトリウムである。
発明の概要 何が必要であるかというと、米国特許第4,102,746号
において必要とされているような中間活性化段階抜き
で、連続式多孔性マトリックスを、リガンドと直接共有
反応性な粒子と組合せた、複合物品である。連続式多孔
性マトリックスの中に一体化されたかかる直接共有反応
性な粒子は、簡単な手順におけるかかる粒子のリガンド
誘導化のし易さを、更なる化学的又は生物学的相互作用
のための、多孔性マトリックスに一体化された反応性粒
子上へのリガンドの共有結合の実質的な保証と、組合せ
る。
簡単に述べると、本発明の複合物品は連続式多孔性マ
トリックスの中に一体化された共有反応性粒子含んで成
る。この反応性粒子は、中間活性化工程についての必要
性抜きで、リガンドと共有化学結合を直接形成すること
のできる共有反応性官能基を含んで成る表面を有する。
別の観点において、本発明は、連続式多孔性マトリック
スと、その中に分散された誘導化粒子とを含んで成る付
加複合物品を提供する。この誘導化粒子は、リガンド
と、中間活性化工程抜きで該リガンドと共有化学結合を
直接形成することのできる共有反応性官能基を含んで成
る表面を有する反応性粒子との直接共有反応生成物を含
んで成る。本発明の特に好ましい観点において、このリ
ガンドは生物学的に活性な物質である。従ってこの観点
において、本発明は連続式多孔性マトリックス内に分散
された粒子に共有的に固定化された生物学的に活性な物
質を含んで成る複合物品を提供する。
本発明は少なくとも診断用品、アフィニティー精製、
又は酵素の固定化において有用な複合材料を提供する。
別の観点において、上記の複合物品を提供するための
方法を提供し、この方法は、連続式多孔性マトリックス
の製造のために有用な材料を用意する；この材料から連
続式多孔性マトリックスを形成する；このマトリックス
内に反応性粒子を一体化せしめて複合物品を供する；段
階を含んで成る。マトリックスの中への粒子の一体化
は、マトリックス形成過程中にマトリックス内に粒子を
分散せしめることにより、又はマトリックス形成過程の
前に粒子をマトリックス形成用材料と物質混合すること
のいづれかにより達成されうる。この方法は更に、マト
リックス形成過程の前又はマトリックス形成過程の後の
いづれかにてリガンドを反応性粒子に直接共有化学結合
させることによって共有結合させることを含んで成る。
別の観点において、本発明は流体中の分析物を精製す
るための方法を提供し、この方法は、前記の付加複合物
品を用意する；前記付加複合物品を、リガンドに対して
親和性を有する分析物を含んで成る流体に暴露せしめ、
これによってこの分析物をリガンドに物理的に結合させ
る；この複合物品を洗って全ての非分析物質を除去す
る；次いでこの複合物品から分析物を回収する；段階を
含んで成る。
本発明の特徴は、この複合物品が、連続式多孔性マト
リックスの中に、共有結合によってリガンドにより直接
誘導化されうる、好ましくは実質的に均一に分散されて
いる反応性粒子を有していることにある。
本発明の別の特徴は、この複合物品が、リガンドとし
ての生物学的に活性な物質の反応性粒子への直接共有結
合によって生物学的に活性となりうることにある。この
直接共有結合は、反応性粒子からの生物活性物質の浸出
する又はその上で不活性される率を引き下げる。
本発明の利点は、該複合物品の反応性粒子が、流体中
の分析物との生物学的又は化学的相互作用を規定でき、
一方、この連続式多孔性マトリックスが流体中のかかる
分析物との物理的相互作用を可能にすることにある。
発明の態様 本発明の複合物品は、直接共有反応性な粒子が中に分
散されている連続式多孔性マトリックスである。これら
の粒子は直接共有反応性であり、その理由はリガンドに
対して共有化学結合を形成することのできる反応性官能
基がその内部及び／又は外部表面上に存在しているから
である。
直接共有反応性粒子 リガンドと直接的に共有反応性である粒子は本発明に
おいては広範囲にわたることができる。かかる粒子は直
接的な相互作用によってリガンドに対して共有化学結合
を形成することのできる少なくとも一反応性官能基を有
する。従って、このリガンドは、従来知られている数多
くの粒子装填複合物品のように物理結合（収着、吸着
等）しているのではなく、粒子（それ故該複合物品）に
化学結合する。本発明において有用な反応性官能基の必
須の特徴は、それがリガンドに直接相互作用することに
より、即ち、中間活性化工程抜きで、共有化学結合を形
成できることにある。この特徴は、例えば米国特許第4,
102,746号に開示されているような橋渡し剤（例えばガ
ンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン又はポリエチ
レンイミン）の利用による粒子装填マトリックスの化学
修飾についての必要性を回避する、及び米国特許第4,10
2,746号に開示されている二価求電子剤（例えばグルタ
ルアルデヒドもしくはビスイミデートエステル）又は当
業界に一般的なその他の活性化性化学品、例えばカルボ
ジイミド及び酸ハライドによる粒子装填マトリックス
（又は橋渡し剤処理マトリックス）の官能基の活性化に
ついての必要性を排除する。従って、直接共有反応性官
能基を有する本発明において有用な反応性粒子は、該複
合品に対してリガンドを共有結合させるのに必要な手順
を簡素化し、そしてより均一、且つコントロールされた
共有結合が達せられることを可能とする。
本発明において有用な反応性粒子は一般に２つの広い
タイプである：化学修飾無機粒子と有機ポリマー粒子。
この無機粒子は例えば金属；金属酸化物、例えばアルミ
ナ、シリカ及びジルコニア；ガラスビーズ、ガラスバブ
ル及びコントロールポアガラス；等でありうる。これら
の粒子は例えば反応性官能基を含むポリマー（通常は有
機系）によるコーティングによって、又は反応性官能基
を含む適当な試薬（例えばアルコキシシランカップリン
グ剤）との反応によって化学装飾される。有機粒子は例
えば適当な反応性官能基を含むモノマーの重合もしくは
共重合により、前述の粒子支持体のコーティングによ
り、又は反応性官能基を導入するための別のポリマーの
化学修飾によって調製された架橋型又は非架橋型ポリマ
ーでありうる。数多くの有用な粒子は市販されている
か、又は当業界に公知の技術によって調製でき、その一
部のリストを下記の表Ａにおいて見い出すことができう
る。
本発明において有用な反応性粒子は球形、規則的な形
態、又は不規な形態を有しうる。反応性粒子のサイズは
本発明においては広範囲にわたることができ、そしてか
かる粒子を一体化せしめる連続式多孔性マトリックスの
タイプにある程度依存するであろう。一般的な反応性粒
子のサイズは平均径において0.1マイクロメーターから
５ミリメーターに範囲する。
本発明の目的にとって有用である直接共有反応性官能
基は一般に求電子性の中に分類されうる。求核基（例え
ばアミン、アルコール又はメルカプタン）との反応は、
付加反応、又は交換もしくは置換型反応（これにおいて
は副産分子が放出される）のいづれかによって共有化学
結合を生成する。付加型反応が好ましい。有用な反応性
官能基及びそれらを含む市販の粒子の例が表Ａに記載さ
れている。
本発明において有用な反応性粒子として特に好ましい
のは、かかる粒子の内部及び／又は外部表面上にアズラ
クトン−官能基を有する粒子である。従って、かかる反
応性粒子は式Ｉのアズラクトン可能基を有する： （式中： R1及びR2は独立して、１〜14個の炭素原子を有するア
ルキル基、３〜14個の炭素原子を有するシクロアルキル
基、５〜12個の環原子を有するアリール基、６〜26個の
炭素原子並びに０〜３個のS,N及び非過酸化Ｏヘテロ原
子を有するアレニル基であるか、又はR1及びR2はそれら
が結合している炭素と一緒になって４〜12個の環原子を
含む炭素環を形成してよく、そして ｎは０又は１の整数である）。
アズラクトン官能反応性粒子が本発明において特に好
ましく、その理由はかかる粒子は表Ａに示されている市
販の反応性官能基よりもより良くリガンドを直接共有結
合させるからである。更に、かかるアズラクトン−官能
基はリガンドとの共有結合の前にかなり安定である。更
に、リガンドとアズラクトン官能基との共有結合は、副
産分子の置換をもたらし、これはリガンドの共有結合さ
せた後の複合物品の所望されない精製を回避する。
また、アズラクトン官能基はプロテインＡのような生
物学的に活性な物質との高い共有結合能力を保有するこ
とで知られている。更に、プロテインＡとのかかる高い
共有結合能力はカップル化リガンドとしてのプロテイン
Ａの特異性の高い結合生物学活性をももたらす。従っ
て、アズラクトン官能反応性粒子は本発明の複合物品の
ために特に好ましい。
アズラクトン−官能ポリマー粒子は例えば、（メタ）
アクリロイルアミノ酸と様々なその他のフリーラジカル
的重合性コモノマーとの共重合、それに続く米国特許第
4,737,560号及び第4,871,824号に記載の通りの環化剤と
の反応により、又は対応ヨーロッパ特許公開0,392,735
号に記載の通りのアルケニルアズラクトンと他のコモノ
マーとの共重合によって作られうる。アズラクトン−官
能粒子は有機又は無機粒子上へのアズラクトン官能ポリ
マーの溶液コーティングによっても調製でき、これも上
記のヨーロッパ特許公開0,392,735号に掲載されてい
る。
アズラクトン官能反応性粒子は、米国特許第5,013,79
5号及びヨーロッパ特許公開0,392,783号に開示されてい
るように、アズラクトングラフトコポリマーからも作ら
れうる。
アズラクトン官能粒子の粒径は約0.1〜1,000マイクロ
メーターであってよく、そして0.5〜100マイクロメータ
ーであることが好ましい。アズラクトン官能粒子は多孔
性でも非孔性でもよい。多孔性であるとき、ドライアズ
ラクトン官能粒子の平均孔径は約１〜約3,000オングス
トロームに範囲してよく、そして10〜約500オングスト
ロームが好ましい。
連続式多孔性マトリックス 連続式多孔性マトリックスは本発明においては広範囲
にわたることができる。有用なマトリックスには、織布
及び不織ウェブ（例えば繊維ウェブ）、微孔性ファイバ
ー及び微孔性膜が含まれる。
織布及び不織ウェブが、本発明の複合物品を形成する
ための、直接共有反応性粒子の一体化のためのマトリッ
クスとして有用である。
繊維ウェブが特に望ましく、その理由はかかるウェブ
は大きな表面積を供するからであり、一方、不織繊維ウ
ェブはその製造のし易さ、低材料費、及びファイバー組
織及びファイバー密度のバリエーションを可能にするこ
とに基づいて好ましい。例えば0.05〜50マイクロメータ
ーの広範囲にわたるファイバー径が、本発明の複合物品
の製造のうえで利用できうる。ウェブの厚みは最終用途
に合うよう幅広く変えてよく、例えば0.2マイクロメー
ターから100cmの厚み又はそれより大きいものであって
よい。
直接共有反応性粒子を一体化せしめた繊維ウェブは当
業界に公知の方法により、又は当業界に公知の方法の改
良方法によって調製できうる。本発明は驚くべきことに
反応性官能基がウェブ製造工程において残存し続けるこ
とを見い出した。不織ウェブを含んで成る本発明の複合
物品は、当業者に公知であり、且つ米国特許第3,971,37
3号に開示されている溶融吹込によって製造できうる。
一般に、溶融ポリマー材料を、溶融ポリマーマイクロフ
ァイバーのストリームが生成されるように押出する。反
応性粒子をこのマイクロファイバーストリームに導入
し、そしてこれらのファイバーとまぜ合わせる。ファイ
バーと粒子との混合物をコレクションスクリーンの上
に、ウェブを形成するマイクロファイバーと粒子とがこ
のウェブの中に好ましくは実質的に均質に分散するよう
にして集める。
このウェブを任意的に同時提出国際特許出願
（公開WO ）（代理人事件番号47748PCT3
A）に記載の通りに620,460N/m2（90psi）までの圧力に
て成形又はプレスして、少なくとも２秒のガーリー指数
を有する物品を供してよい。
この不織複合ウェブは任意的に、米国特許第4,433,02
4号に記載の通り、ウェブの片面もしくは両面に積載さ
れた浸透性支持布帛を含むか、又は米国特許第4,681,80
1及び4,868,032号に記載のように補強ファイバーを更に
含んでもよい。反応性粒子は、予備成形ウェブに液状ス
ラリー含有粒子を、任意的に接着剤又はバインダーの存
在下で含浸させ、次いでこの複合物品から液体を除去す
るために乾燥することによって、織布又は不織ウェブの
中に一体化せしめることもできる。かかる方法の一つが
米国特許第4,963,431号に記載されている。
本発明の複合物品のための不織繊維ウェブを作るため
に有用な好適な材料には、繊維ウェブを形成するモノマ
ーのポリマー及びコポリマーが含まれる。適切なポリマ
ーには、ポリアルキレン、例えばポリエチレン及びポリ
プロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、例えば様々
なナイロン、ポリスチレン、ポリアリールスルホン、ポ
リビニルアルコール、ポリブチレン、エチルビニルアセ
テート、ポリアクリレート、例えばポリメチルメタクリ
レート、ポリカーボネート、セルロース系類、例えばセ
ルロースアセテートブチレート、ポリエステル、例えば
ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリイミド、及びポ
リウレタン、例えばポリエーテルポリウレタン、並びに
それらの組合せが含まれる。
不織ウェブはポリエステルとポリアルキレンとのよう
な同時押出ポリマーの組合せにより作られもできる。上
記のポリマーを供するモノマーのコポリマーも本発明の
範囲に含まれる。
不織ウェブは微細ファイバーとけん縮ステープルファ
イバーとの均質ブレンドであってもよい。
本発明の複合物品は、例えば米国特許第4,153,661,
4,565,663, 4,810,381及び4,971,736号に開示されてい
る方法によって反応性粒子が中に一体化又はからまれて
いる多孔性フィブリル化ポリマーマトリックス、例えば
フィブリル化PTFEから作ることもできうる。一般に、こ
れらの方法は、反応性粒子をポリテトラフルオロエチレ
ン分散体と配合してパテ様塊を獲得し、このパテ様塊を
５℃〜100℃の温度において強力混合に付してこのPTFE
のフィブリル化を起こし、このパテ様塊を二軸圧延に付
し、次いで得られるシートを乾燥することを包括してい
る。好適なアズラクトン官能反応性粒子にとっての溶媒
としてイソプロパノール又はtert−ブタノールを使用す
ることを条件として、例えば米国特許第4,565,663号に
開示されている方法が有用である。下記の比較例１に記
載の通り、エタノールの使用はアズラクトン官能基を加
水分解してしまうことがある。
反応性粒子を多孔性フィルム、ファイバー、中空ファ
イバー又はチューブの中に、当業界に公知の方法によっ
て一体化させることもできうる。本発明の微孔性熱可塑
性ポリマー複合物品の調製にとって有用な好適な技術
は、反応性粒子を液体の中に分散せしめてコロイド状懸
濁物を作り、熱可塑性ポリマーをこのコロイド状懸濁物
と、分散反応性粒子を含む均質溶液を形成するのに十分
な温度において溶融配合し、この溶液から物品を所望の
形状へと成形し、この成形物品を冷やして液とポリマー
との相分離を誘発せしめ、最終的にこのポリマーを固形
化させ、そして得られる微孔性ポリマーマトリックスの
中に粒子が分散されているままにしてほとんどの液体を
除去することを包括している。この方法は米国特許第4,
957,943号に詳しく述べられている。
他方、本発明の複合物品は米国特許第4,539,256号に
開示されているような熱誘発相分離技術によっても製造
できうる。かかる技術においては、反応性粒子をポリオ
レフィンの分散物の中に含ませ、これを熱し、次いで攪
拌して均質な混合物とし、この溶融混合物を加熱プレー
トの上に流延し、加圧及び氷冷水プランジに付してい
る。
マトリックスの中への反応性粒子の一体化 連続式多孔性マトリックスの中に一体化せしめる反応
性粒子の量は本発明においては広範囲にわたることがで
きうる。一般に、反応性粒子の量はこの複合物品を構成
する材料の約１〜99容量％に範囲してよい。好ましく
は、この量は20容量％以上、そしてより好ましくは50容
量％以上である。従って、本発明の複合物品は95重量％
以上の反応性粒子を含んでよく、これによりリガンド共
有結合のための潜在的な高能力が供される。
上記した通り、反応性粒子のサイズは平均径において
約0.1マイクロメーターから５ミリメーターにわたって
変えることができる。しかしながら好ましいサイズ範囲
は反応性粒子を一体化すべきマトリックスのタイプに依
存する。例えば、不織繊維ウェブ及びフィブリル化ポリ
マーマトリックスにはこの全域サイズの粒子が配合され
うる。好ましくは、不織物にとっては約40〜200マイク
ロメーターのサイズの粒子が好ましく、一方、フィブリ
ル化PTFEマトリックスにとっては１〜100マイクロメー
ターのサイズの粒子が好ましい。米国特許第4,957,943
号の開示に従って作られたような微孔性複合物品にとっ
ては0.1〜20マイクロメーター、好ましくは0.5〜３マイ
クロメーター、そして最も好ましくは0.5〜１マイクロ
メーターの範囲にあるもっと小さな粒子が有用である。
時折り、上記の方法に従う様々な分散体の形成の際に所
望の粒径へと小さくなってしまうなら、より大きめの粒
子が利用できうる。最後に、有用な粒径における相違
は、連続式多孔性マトリックスを形成するのに用いた方
法及び装置、並びにこのようにして作られたマトリック
スの気孔率により決定される。
更に、非反応性粒子及び充填材、加工助剤、界面活性
剤、スリップ剤等を含ませるために、本発明の複合物品
に一定の補助剤を加えてよい。連続式多孔性マトリック
スの中にかかる補助剤を一体化せしめる望ましさ及び方
法は、本発明にとって有用なマトリックスの形成を述べ
ている上記の参照特許の中に詳しく述べられている。
リガンド及び付加複合物品 本発明の別の観点において、複合物品は付加複合物品
となりうる。付加複合物品は、生物学的又は化学的活性
粒子を形成するようかかる粒子に共有結合しているリガ
ンドの誘導化粒子を有する。かかる誘導化粒子は上記の
方法に従ってマトリックスを形成するときにマトリック
スの中に一体化せしめることができる。他方、かかる反
応性粒子をマトリックスの中に一体化せしめた後に反応
性粒子を誘導化してよい。
前述した通り、本発明において有用な反応性官能基は
吸電子基である。従って、直接的な共有結合のため、本
発明において有用なリガンドは求核基である。限定でな
い例には、第一及び第二アミン、アルコール及びメルカ
プタンが含まれる。これらのうちで、アミン官能リガン
ドが特に好ましい。
付加複合物品の製造にとって有用なリガンドは本発明
においては広範囲にわたることができる。好ましくは、
リガンドは付加複合物品の考えられている最終用途に基
づいて選定される。
リガンドを反応性粒子に共有結合させ、次いで連続式
多孔性マトリックスの中に一体化せしめて付加複合物品
を形成せしめたら、かかるリガンドは生物学的又は化学
的相互作用、例えば収着、複合、触媒又は反応的最終用
途にとって有用となっている。
付加複合物品は収着剤、複合剤、触媒、反応体とし
て、酵素として、及びその他のタンパク質保有支持体と
して、並びにクロマトグラフィー用品として有用であ
る。
本発明の好ましい観点において、共有結合にとって所
望されるリガンドは求核官能基を有する生物学的に活性
な物質である。生物学的に活性な物質の限定でない例
は、生物学的、免疫学的、生理学的又は薬理学的に活性
な物質である。生物学的に活性な物質の例にはタンパク
質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗原性物質、酵
素、補因子、阻害剤、レクチン、ホルモン、レセプタ
ー、凝固因子、アミノ酸、ヒストン、ビタミン、薬剤、
細胞表層マーカー、及びそれらに相互作用する物質が含
まれる。
これらの生物学的に活性な物質のうちで、タンパク
質、酵素及び抗原性物質が反応性粒子への共有結合のた
めに所望される。タンパク質、酵素及び抗原性物質の限
定でない例には、天然及び組換プロテインＡ（Prot
A）、イムノグロブリン、例えばラット（rIgG）、ヒト
（hIgG）、ウシ（bIgG）、ウサギ（rbIgG）及びマウス
（mIgG）、コンカナバリンＡ（Con A）、ウシ血清アル
ブミン（BSA）、サイログロブリン（TG）、アポフェリ
チン（Af）、リゾチーム（Ly）、カルボニックアンヒド
ラーゼ（CA）及び細菌性抗原（BA）が含まれる。固定化
タンパク質、酵素及び抗原性物質についての用途はヨー
ロッパ特許公開0,392,735号に開示されている。
現状好ましい生物学的に活性な物質はPro Aであり、
その理由は生検分離におけるその様々な用途にある。
他方、本発明の付加複合物品は酵素により認識される
物質の化学変換を触媒する共有結合化酵素を含んで成り
うる。また、共有結合抗原性物質を含んで成る複合物質
は、この付加複合物質の多孔性マトリックス伝いに流れ
る複雑な生物流体からの対応の抗体のアフィニティー精
製のために利用できうる。別の例において、この付加複
合物品の多孔性マトリックスの内部及び外部表面にプロ
テインＡが共有結合している多孔性粒子は、アフィニテ
ィー分離工程のためにイムノグロブリンＧのような生物
学的に活性な物質を収着させることができる。別の例に
おいて、複合物品は抗体の固定化のために、又はウェス
タンブロッティングのための免疫診断用品のために利用
できうる。
現状好ましいアズラクトン官能基はアミン、チオール
及びアルコールによる求核攻撃を受けるであろう。従っ
て、少なくとも１個のアミン、チオール又はアルコール
基をその上に有しているリガンドはアズラクトン官能複
合物品における共有結合のための候補である。
好適なアズラクトン官能粒子へのリガンドの共有結合
は、結合リガンドに対する高結合特異性生物活性を達成
するような濃度において無機又は有機ポリアニミック塩
を利用する方法、例えばPCT国際出願WO92/07879に開示
の方法を利用できうる。
本発明に従う好適なアズラクトン官能粒子へのリガン
ドの共有結合は次式を有する付加複合物品をもたらす： （式中： R1,R2及びｎは前述した通りであり、 Ｘは−Ｏ−，−Ｓ−，−NH−又は−NR4（ここでR4は
アルキル又はアリールでありうる）であってよく、そし
て Ｇは、この付加複合物品の収着、複合、触媒、分離又
は試薬機能を担うHXGの残基である）。
HXGは生物活性物質でありうる。
リガンドは、適当な触媒の存在下又は非存在下で、ア
ズラクトン官能基と、下記の式（２）に示す通りの求核
付加によって反応するアミン、アルコール又はメルカプ
ト求核官能基を有する。
（式中、R1,R2,R3,n,X及びＸは前述した通りである）。
リガンドの中に存在している官能基に依存して、有効
な付加反応速度を達しめるのに触媒が必要とされうる。
第一アミン官能基は触媒を必要としない。酸触媒、例え
ばトリフルオロ酢酸、エタンスルホン酸、トルエンスル
ホン酸等がヒドロキシ及び第二アミン官能基に有効であ
る。
本発明の別の観点において、リガンドは生物学的に活
性ではないが、その最終用途へと導く別の特性を有す。
例えば、このリガンドはイオン官能基を含むイオン官能
物質でありうる。この場合、得られる付加複合物品はイ
オン変換型用途に利用されうる。適切なイオン基にはカ
ルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸、第三アミン、及び
第四アミン基を含む。有用なイオン基含有リガンドの例
には、アミノカルボン酸、スルホン酸もしくはホスホン
酸、例えばグリシン、アラミン、ロイシン、バリン、β
−アラミン、８−アミノ酪酸、１−及び３−アミノプロ
ピル−ホスホン酸、タウリン、８−アミノオクタノン
酸、アミノメチルホスホン酸、アミノ−メタンスルホン
酸等；ヒドロキシ酸、例えばイセチオニン酸、３−ヒド
ロキシ−プロパンスルホン酸、乳酸、グリコール酸、ヒ
ドロキシメチルホスホン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸
等；並びにアミノ−及びヒドロキシ−官能第三及び第四
アミン、例えば２−ジエチルアミノエチルアミン、３−
ジメチルアミノプロピルアミン、N,N−ジエチルエタノ
ールアミン等、及びそれらの四級化バージョンが含まれ
る。アミン−、アルコール−、又はメルカプタン−官能
リガンドが簡単な脂肪族及び／又は芳香族炭化水素のと
き、得られる付加物品は逆相又は疎水性相互作用型クロ
マトグラフィー処理において有用となりうる。本発明の
複合物品と非常に親水性又は疎水性なリガンドとの反応
は、水性又は油性流体それぞれに対して高い吸収特性を
示す付加物品を作るのに利用されうる。その他のタイプ
のリガンド及び用途は当業者に自明であり、従って本発
明の範囲に属すると考えられる。
本発明の目的及び長所を下記の実施例により更に例示
するが、これらの実施例に記載の特定の材料及び量、並
びにその他の条件及び詳細は本発明を限定するものと考
えるべきではない。
実施例 実施例1:アズラクトン−アクリルアミド親水性ビーズの
包埋されたポリテトラフルオロエチレン（PTFE）多孔性
マトリックスの製造。
本実施例は、アズラクトン官能親水性ビーズの大集団
をPTFEマトリックスの中に一体化せしめることができる
ことを示し、ここでこの集団はその個々の構成ビーズへ
と分断される。米国特許第4,871,824号のExample 18の
教示に従い、末誘導化ビーズを、58重量部のメチレン−
ビス−アクリルアミド（MBA）及び42重量部のビニルジ
メチルアズラクトン（VDM）のモノマー混合物より調製
した。それは小型（５〜30μｍ）の球形ビーズの100〜5
00μｍの不規則な集団より成る。
これらのビーズ（1g）を米国特許第4,565,663号に記
載の通りに、90:10のビーズ、対、PTFEの比及び溶媒と
してのアルコールを利用して、40℃でPTFE複合品へと加
工した。全体で50平方インチ（323cm2）の得られた複合
品は無傷であり、滑らかであり、そして取扱い易かっ
た。
これらの複合品のSEM写真は、これらの集団がその個
々の構成単独ビーズへと分断していることを示した。各
ビーズはPTFEウェブの中に一体化して結合しており、そ
してそれらは実質的にこの複合品にわたって均等に分散
されていた。ほとんどのビーズが小さなへこみの印を有
しており、これは大集団からの個々のビーズへの分断の
後に残った傷を示唆している。1Rスペクトルは、アズラ
クトン基がこの膜製造過程中に実質的に加水分解したこ
とを示した。しかしながら、中間活性工程の利用が所望
されるなら、アズラクトン基は無水酢酸の中でこの複合
品を温めることによって容易に再利用される。
実施例2:予備誘導化ビーズからの複合品の製造 本実施例においては、抗体と結合する活性を保持した
プロテインＡ−結合ビーズを利用して複合材料を調製し
た。実施例１の1.0gのアズラクトンビーズを周囲温度
（22℃）で1h,25mMのリン酸ナトリウム/150mMのNaClバ
ッファー、pH7.5中の20mlの2.5mg/mlのプロテインＡと
反応させた。遠心及び上清液の除去後、未反応のアズラ
クトン環を0.5Mのエタノールアミン、pH7.5との30分間
の反応によって開環させた。この工程を繰り返し、続い
てリン酸/NaClバッファーにより４回すすぎ、次いで水
により４回すすいだ。最後の遠心の後、これらのビーズ
を20％のエタノールの中に再懸濁させ、そして４℃で一
夜保存した。翌朝、それらを50％のエタノール、次いで
100％のエタノールの中に再懸濁させ、それよりPTFE複
合品を実施例１に記載の通りに調製したが、ただしビー
ズ、対、PTFEの比は80/20（重量／重量）とした。調製
の直後、この複合品を真空のもとで保存して過剰のアル
コールを除去した。
Iodo−Beads（商標）（Pierce）を用いてヨウ素化し
たラジオラベル化（Ｉ−125）ウシイムノグロブリン
Ｇ、IgG（Calbiochem）の結合性を、この複合品のそれ
ぞれ8.0から9.5mgに至るまでの９レプリケートの0.64cm
（1/4インチ）円形パンチを利用して試験した。利用し
た手順はColemanらJ.Chrom.,512,345−363,1990に記載
してある。各サンプルを1h,500μｌのIgG（250μg/ml,1
700cpm/μｇ、リン酸/NaClバッファー中）とインキュベ
ートし、そしてこのバッファーで２回すすいだ。この複
合品をぬぐい、そして新しいチューブに移し、そしてPa
ckard Model 5230ガンマーシンチレーションカウンター
上で放射性活性を決定した。ウシ血清アルブミンで誘導
化したビーズから調製したコントロール複合品の約２倍
となる、2.25MgのIgGがマトリックス包埋ビーズのｇ当
りに結合した。
実施例３ アズラクトン官能ビーズ（EP 0,392,735号のExample
25Aの教示に従い、42重量部のビニルジメチルアズラク
トン（VDM）及び58重量部のMBAより調製）を実施例１に
記載の通りにPTFEマトリックスの中に一体化せしめた
が、ただしエタノールではなくtert−ブタノールを使用
した。得られる複合品を真空デシケーターの中で乾燥し
て液体を除去した。
プロテインＡの直接共有結合は実施例２におけるIgG
実験と類似して、ラジオラベル化（Ｉ−125）プロテイ
ンＡを用いて決定した。複合品ディスクを500μｌのプ
ロテインＡ溶液（250μg/ml,2000cpm/μｇ、リン酸/NaC
lバッファー中１）と1hインキュベートし、3.0Mのエタ
ノールアミンの中でpH9.0において30min、クエンチし、
次いでバッファーで４回すすいだ。すすいだディスクを
ぬぐい、次いで新たなテストチューブに移した後に放射
性活性を決定した。一夜放置後、これらのディスクを50
0μｌの１％の水性ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）溶液
と4h,37℃でインキュベートし、次いで残留放射性活性
の決定の前に１％のSDSで３回すすいだ。
アズラクトンビーズ複合品のコントロールセットを同
じように処理したが、ただしそれらをまずエタノールア
ミンクエンチ用試薬（3.0M,pH9.0,30min）と反応させ、
次いでラジオラベル化タンパク質とのインキュベーショ
ンの前に３回すすいだ。別のセットのコントロールは、
複合品の中に包埋されていないラジオラベル化タンパク
質と反応させた同一のビーズより成り、そのうちの一セ
ットはタンパク質との反応の前にtert−ブタノールと予
備インキュベートさせておいた。全ての実験はトリプリ
ケートで行い、そしてその結果を平均した。
これらの結果は、該複合品の混練加工の後もビーズが
非常に反応性であり続けていることを示している。予備
クエンチ型（複合品−アミン）コントロールより15倍の
上昇が、上記の複合品ビーズに対するプロテインＡの共
有結合において認められた。更に、その収率は未妨害ビ
ーズ（アルコール予備処理コントロールビーズ）の60％
であり、そしてタンパク質の80％以上がSDS実験により
評価された通り共有結合していた。
実施例４ 未誘導化アズラクトンコポリマービーズを、ヨーロッ
パ特許公開0,392,735号のExample 5の一般手順を利用し
て、20％（重量／重量）のVDM及び80％のトリメチロー
ルプロパントリメタクリレート（TMPTMA）のモノマー混
合物からの分散重合によって調製した。これらのビーズ
を90:10（重量／重量）のビーズ、対、PTFE比を利用し
て40℃でPTFE複合品へと加工した。全体で220平方cmの
得られた複合品は滑らかであり、且つ取扱い易かった。
この材料をデシケーターで室温にて保存した。
アズラクトンビーズの一体化された複合品に対するプ
ロテインＡの結合を定量するため、0.46cm（1/4イン
チ）のディスクを予め調製した材料からパンチし、そし
て秤量した。トリプリケートのディスクを、リン酸バッ
ファー食塩水（PBS:25mMのリン酸ナトリウム、pH7.5
中、0.15MのNaCl）又は25mMのリン酸ナトリウム、pH7.5
中の1.5Mの硫酸ナトリウム中の、125μｇ又は2.5mgのタ
ンパク質を含む0.5mlの125−Ｉ−ラベル化組換プロテイ
ンＡ（Repligen由来のrProt A）に暴露させた。これら
のディスクを室温で60分インキュベートし、その最初の
15分は捕捉エアーを排除するために真空のもとで行っ
た。反応は、タンパク質溶液の除去及び30分にわたる1.
0mlのエタノールアミン、pH9.0の添加、それに続く新た
な試薬による二次処理によって停止させた。PBSで数回
すすいだ後、これらのディスクをぬぐい、次いでPackar
d Model 5230ガンマーシンチレーション光度計の中での
計測のために清浄なチューブに移し入れた。これらのデ
ィスクを次に１％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で4
h,37℃で処理して非共有結合タンパク質を除去した。こ
の結合実験の結果を表２に示す。比較のため、同じ重合
化のビーズを、0.1％のトリトン（商標）Ｘ−100界面活
性剤を含む同一のバッファーの中で、同一の結合時間、
クエンチング条件及びすすぎを伴って暴露した。
上記の結果は、PTFE複合品内のアズラクトンビーズ
は、PBSバッファー中で、そのビーズ単独より高いプロ
テインＡ密度へと容易に誘導化されることを示唆してい
る。従って、複合品の形成はビーズの化学的反応性を損
なわない。硫酸ナトリウムの存在下では、このマトリッ
クス結合型ビーズのプロテインＡ容量はある程度下がる
が、しかしビーズの機能は示され続けた。耐SDS性（共
有結合したタンパク質の尺度）はそれらが複合品の中に
あるときに約10％低下したが、これはタンパク質収着に
とって非常に大きな表面積を供するPTFEの存在に基づく
ものでありうる。本実施例は、PTFE複合品へと混練され
たアズラクトンビーズが、タンパク質結合に関するその
能力を保持し、且つ複合品のマトリックス内で容易に誘
導化されることを例証した。
実施例5:IgGのアズラクトン/PTFE複合品上の固定化rPro
t Aへの収着及びそれからの溶離 実施例４の複合品の25mmのディスクをはさみで切り、
そしてMillipore Swinnex（商標）−25フィルターユニ
ットハウジングの中に挿入した。入口及び出口ポートに
5.0mlのシリンジを取付け、0.5Mの炭酸バッファー、pH
9.3中の5.0mg/mlのrProt A溶液3.0mlを膜の上に導入
し、次いでこの複合品にわたって前方及び後方に、全部
で20回走行させ、そして室温で30分間のインキュベーシ
ョンに付した。この反応は、タンパク質溶液の除去及び
5.0mlの3.0Mのエタノールアミン、pH9.0の導入（20回の
走行）により停止させた。次にこの試薬を除き、そして
この複合品の中で新たな試薬を30分インキュベートし
た。クエンチング反応を終了させた後、下記のすすぎ工
程を実施した:a）PBS,5ml（３回の走行）、３アリコー
トづつ;b）1.0MのNaCl,5ml（３回の走行）、３アリコー
トづつ;c）0.1Mのグリシン＋２％の酢酸、pH2.2,5ml
（３回の走行）、３アリコートづつ；及びPBS,5ml（３
回の走行）、３アリコートづつ。
該複合品へのリガンドの共有結合の後、固定化プロテ
インＡの活性を、この複合品伝いのPBS中の1.0mg/mlの
ヒトIgG（Sigma Chem.Co.）5.0mlの走行により評価し
た。この膜伝いの10回の往復走行及び追加の５分間のイ
ンキュベーション後、タンパク質溶液を除去した。この
複合品に1mlづつのPBSを導入することにより未結合IgG
をすすぎ落し、1mlの画分を分析のために集めた。10ml
のPBSの添加後、５×1.0mlの0.1Mのグリシン＋２％の酢
酸、pH2.2を同じようにして導入したが、ただし1.0ml/m
inの流速となるように間隔をおいた。溶離画分（1.0m
l）を集めた。pH7.5での再平衡化のために更に10mlのPB
Sを導入した。
画分を280nmでの吸収測定によりIgG濃度について評価
した。得られる溶離図は、1.08mgのIgGが特異的に収着
し、そしてPTFE−アズラクトンビーズディスクから溶離
されることを示し、それに対し、Nalge（商標）ディス
ク（Nalgeni Co.,Rochester,NY）（その製造者の仕様書
に従って調製）からは0.13mgのIgGであった。バッファ
ーのみで誘導化（エタノールアミン処理の前）したコン
トロールPTFE−アズラクトンディスクは非特異的なIgG
収着を示さなかった。
実施例6:ヒト血液からのIgGの分離。
実施例５に記載のタイプの器具の実際の有用性は、血
液、培養培地又は腹水中のタンパク質の周囲におけるそ
の他の成分からのIgGの分離にある。rProt Aで誘導化さ
れたアズラクトン官能反応性粒子を有する実施例５にお
いて利用した複合品を、フィルターハウジングユニット
の中のPBS中で４℃で７日間、使用の間に保存した。更
なる評価のため、ヒト血清を希釈し（2mlの血清＋8mlの
PBS）、そして分類のために0.2μｍのフィルター（Nalg
ene Co.,Rochester,NY）で濾過した。このサンプル5.0m
lをPTFEアズラクトンディスク上に導入し、前記の実施
例５に記載の通りに導入及びインキュベーションを行っ
た。更に、25mMのリン酸塩、pH7.5中の1.0MのNaCl 5.0m
l及び5.0mlのPBSを、非特異的に収着した血清タンパク
質の除去のための最初のPBSすすぎの後に続けた。溶離
は前記のようにグリシン酢酸バッファーで行った。血清
から全部で1.21mgのヒトIgGがPTFE−アズラクトンディ
スクより溶離し、それに対して同一の径及び形状のNalg
e（商標）膜からは0.17mgのIgGが溶離した。従って実施
例６は、生物流体からの分析物のアフィニティー分離及
び精製を例証した。
実施例7:熱誘発型相分離技術を利用する微孔性ポリエチ
レン／アズラクトン官能ビーズ複合膜の製造。
20:80（W/W）のVDM/TMPTMAビーズを含む高密度ポリエ
チレン（HDPE）膜を、まずビーズ（ビーズのｇ当り約0.
25meqのアズラクトン官能基を有し、５〜15マイクロメ
ーターの粘径である）をSPAN（商標）85界面活性剤（IC
I）を用いて0.87g/ccの密度を有する鉱物油の中に分散
させることにより作った。この分散体は、少量のVDMビ
ーズを1.00gのSPAN85と100.0gの油との混合物の中に、2
000〜2500rpmで作動させたDispersater（商標）ミルを
用いてゆっくり加えることによって作った。この装置は
ディスクブレード羽根車を有する高速剪断ミルであり、
そしてPremier Mill Corporation,Temple,Pennsylvania
より入手できる。そのスピードは集団を分断するために
2500から3000rpmへと瞬時に強めた。
10.0gの上記の分散体及び42.5gのHDPE（Himont由来の
GM9225）を含む密閉金属缶をホットプレート上で300℃
に熱した。時折りこの缶を開けてこの混合物を攪拌し
た。10.0gのHDPE及び40.0gの油を有する類似の缶を同一
条件で同時に熱して、HDPEを溶かして均質な混合物を得
るのにかかる時間を決定した。この溶融混合物の一部を
ホットプレートを用いて180℃に熱したプレスプレート
に移し、次いで180℃に熱した段プレスの中に入れた。
0.5mm（20mil）の厚さに2min圧搾した後、そのプレート
を取外し、そして室温の水の容器中に突っ込んだ。
得られたフィルムを1,1,1−トリクロロエタンを含む
パンの中に浸すことによって油を洗い出した。各時、新
しい溶媒を用いてこの手順を繰り返した。示差走査熱量
計は、得られる微孔性フィルムが23.4重量％のVDMビー
ズを含むことを示唆した。ビーズのサイズは0.1〜0.3マ
イクロメーターであることがSEMにより決定され、そし
てそれらは通常20〜25マイクロメーターの凝集体にあっ
た。それを明確にするために180℃にプレスしたフィル
ム片に基づいて得られたフーリエ変換赤外（FTIR）スペ
クトル（HDPEのバックグランドFTIRスペクトルは差し引
いた）は、VDBビーズについての対照スペクトルとほぼ
一致した。
この複合体に結合したタンパク質は実施例４に利用し
たのと類似の手順により示されうる。
実施例8:アズラクトン官能ビーズの装填された不織ウェ
ブの調製。
アズラクトン官能ポリマービーズをVDMとMBAとの20:8
0重量／重量のモノマー混合物から、EP 0,392,735 A2の
Examlle 4Eに記載と類似の手順によって調製した。これ
らのビーズをボールミルの中で粉砕し、そして37マイク
ロメーター以下の粒径を有する画分をスクリーンを用い
て分離した。これらの直接共有反応性粒子のうちの37マ
イクロメーター以上の画分をポリプロピレン吹込マイク
ロファイバーウェルの中に装填させた。このポリプロピ
レンファイバーは径３マイクロメーターであり、そして
粒子、対、ウェブの比は重量で1:1とした。この複合品
を米国特許第 （代理人事件番号47748USA 5
A）のExample 1に記載の通りに加熱ロールの間で直ちに
圧延し、気孔率を約50％にまで下げた。
実施例9:粒子装填不織複合品へのタンパク質の結合。
ウシ血清アルブミン（BSA）、ヒトイムノグロブリン
Ｇ（IgG;共にSigma Chemical Co.,St.Louis,MOの製品）
及び組換プロテインＡ（rProt A;Repligen,Cambridge,M
A）を、ナトリウムＩ−125（New England Nuclear,Bill
erica,MA）及びIodo−Beads（商標）（Pierce Chemical
Co.,Rockford,IL）を用いて、HolmesらProc.Natl.Aca
d.Sci.1985,82,7706の手順を利用してヨウ素化させた。
実施例８に記載の粒子装填させたウェブ及び粒子フリー
コントロールウェブの0.64cmのディスク（標準の事務用
紙パンチを用いて用意）を、25mMのリン酸ナトリウム、
150mMのNaCl,pH7.5（PBS）中の放射性ヨウ素化タンパク
質250μｌと室温で、1h連続攪拌しながらインキュベー
トした。タンパク質濃度は0.1,1及び5mg/mlとし、比放
射性活性はそれぞれ約10000,3000及び1000cpm/μｇであ
った。非ラジオラベル化タンパク質を比放射性活性及び
濃度を調節するために用いた。
反応の後、このテストチューブから溶液を除去し、次
いで500μｌの1.0Mのエタノールアミン、pH9.0を加え、
そして混合しながら30min反応させて残留アズラクトン
官能基を不活性化させた。この工程を新鮮なエタノール
アミンで繰り返して反応を完全なものとした。全てのデ
ィスクをPBSで３回すすぎ（計90分）、吸収紙でぬぐ
い、次いでPackard Model 5230 AutoGamma光度計（Down
ers Grove,IL）の中に入れ、一体化放射性活性を決定し
た。
共有タンパク質結合の度合いの評価は、ドデシル硫酸
ナトリウム（SDS）変性による非共有結合タンパク質の
除去により決定した。各ディスクを500μｌの１％（W/
V）のSDS溶液（25mMのリン酸ナトリウム、pH7.5）の中
に37℃で4hインキュベートし、続いて500μｌのすすぎ
を新鮮なSDS溶液で行い、そして放射性活性の決定を繰
り返した。高保持率の放射性活性はタンパク質と固相と
間での大量の共有結合の形成を示唆する。
ある実験において、タンパク質共有結合へのアズラク
トンの寄与を決定する別の手段として、ディスクをラジ
オラベル化タンパク質溶液と反応させる前にエタノール
アミン溶液と反応（16h）させた。粒子含有ウェブにつ
いての全ての実験はトリプリケートで行った。粒子フリ
ーコントロールについての全てのそれはデュプリケート
で行った。得られるデーターを平均した。
各タンパク質についての濃度−依存性実験の結果を表
３に示す。BSA及びrProt Aについて認められた最大値は
13〜15μg/cm2であり、そしてIgGについての最大値は35
0μg/cm2以上であった。全ての濃度依存性は直線状であ
り、飽和は認められず、かなりより多くの各タンパク質
が結合可能となるであろうことが示唆された。
表４には5mg/mlで実施した実験より決定されたいくつ
かの追加の重要な結合パラメーターをまとめている。特
に有意義なのはコントロールウェブに対する複合品への
初期結合の比である。rProt A,BSA及びIgGそれぞれにつ
いてのその比は94,32及び1416であり、事実上全てのタ
ンパク質の結合が複合品のビーズ部分に起因することが
示唆される。約２μg/cm2の、予備クエンチ化複合品へ
の結合についての低く、且つ不変な値が認められた。各
タンパク質に関して、結合タンパク質のうちの少なくと
も70％が共有結合していた。
このディスクはでこぼこであり、それが付される4hの
実験の際の厳しい取扱い及び連続混合によく持ちこたえ
た。
実施例10:アズラクトンビーズ含有複合品上に固定化さ
れたプロテインＡの生物活性。
実施例８の複合品の１枚の径25mmのディスクをSwinne
x−25フィルターユニット（Millipore Corp.,Bedford,M
A）の中に入れ、そしてこのフィルターユニットの両出
口ポートにシリンジを付けることによって濾過器具を組
立てた。このシリンジは、この複合品伝いに溶液を往復
運動で前後に走行させるために用いた。
rProt Aをこの複合品に、20走行の3mlの溶液（0.5Mの
Na2SO4,0.2％のトリトンＸ−100界面活性剤、25mMのリ
ン酸ナトリウム、pH7.5中5mg/ml）と更に30minの静置イ
ンキュベーションにより結合させた；全ての工程は周囲
温度で行った。
結合反応はタンパク質の除去、及び1.0Mのエタノール
アミンクエンチャー、pH9.0（20走行）の導入により停
止させた。次に新鮮なクエンチ用溶液を加え、そして30
分インキュベートした。クエンチング後、このフィルタ
ーを順に:1）PBS;2）1.0MのNaCl,25mMのリン酸ナトリウ
ム、pH7.5;3）0.1Mのグリシン、0.2％の酢酸、pH2.2;
4）PBS;で洗った。全ての洗浄は5mlのサンプルでの３回
の反復、１反復当り３走行による。
結合rProt Aの活性を、この膜ユニットを通じる5mlの
ヒトIgG（PBS中1mg/ml）の透過によって評価した。総滞
留時間は15分とした。このフィルターをPBS、続いてリ
ン酸バッファー中の1.0MのNaClにより、すすいだ。IgG
をグリシン−酢酸溶液を用いて溶離させ、次いでIgGの
濃度を、励起係数として1.3ml−cm/mgを利用して280nm
での吸収により決定した。
コントロールとして、上記の手順全てを粒子フリーウ
ェブに基づいて平行に実施した。コントロールより約10
倍多い量のIgGがビーズ含有フィルターから回収された
（312μｇ、対34μｇ）。IgGの総回収率は、複合品及び
コントロールそれぞれについて101％及び96％であっ
た。実施例９において決定されたIgG密度を利用し、Ig
G、対、rProt Aの見かけ上のモル比は1.26であり、粒子
のみに固定化されたプロテインＡのほとんどの実施例に
関する約1.0の平均値より高かった。
フィルターを通じる全ての流体の手動通過にかかわる
背圧は全くなかった。実験後の観察において、このフィ
ルターは完全であり、摩耗又はすり切れの徴候はなかっ
た。
実施例11:ビレットの製造 直接共有反応性粒子装填不織ビレットを、5gのポリプ
ロピレン吹込マイクロファイバーを０〜5gの実施例８の
37マイクロメーター以下の反応性粒子と混合し、ウォー
タリングブレンダーの中で５〜15秒混合し、径約8cmの
金属モルドにこの混合物を慎重に充填し、次いで室温で
（約22℃）10〜18,000psi（68.9〜124×106N/m2）のも
とでの段プレスにおいてプレスすることによって作っ
た。得られたビレットは厚さ約1.25〜3.80mmであり、そ
して20〜50％の気孔率を有していた。径１〜20マイクロ
メーターのマイクロファイバー及び平均１〜150マイク
ロメーターの反応性粒子が有用であった。コントロール
ビレットを、粒子を添加せずにマイクロファイバーから
作った。
実施例12:二層及び三層「サンドイッチ」複合品の製
造。
サンドイッチ複合品を、まず典型的なポリプロピレン
吹込マイクロファイバーウェブを作り、このウェブの上
面に反応性粒子を散布し、別のポリプロピレンウェブを
この粒子の上に載せ、次いでこのサンドイッチを225℃
及び620,460N/m2（90psi）で圧延して２層複合品を作る
ことによって製造した。３層複合品は、圧延の前に第２
粒子層及び第３不織ウェブを追加することによって同様
に製造した。利用した反応性粒子は実施例８の37マイク
ロメーター以上の画分とし、そして複合品全体の50重量
％において装填させた。二層サンドイッチは0.10mmの厚
み及び30秒の10ccガーリー値を有していた。三層複合品
は0.14mmの厚み及び108秒の10ccガーリー値を有してい
た。粒子抜きのコントロールの二及び三層サンドイッチ
も作った。
実施例13:粒子装填ビレット及びサンドイッチ複合品へ
のタンパク質の直接共有結合。
タンパク質を実施例11及び12の複合品に結合させ、次
いで残留アズラクトンを実施例９に記載と同じ方法でエ
タノールアミンにより不活性化させた。rProt Aは25mM
のリン酸ナトリウム、25mMのピロリン酸ナトリウム、1.
5MのNa2SO4,pH7.5中で1mg/mlとした。実施例９と同じ手
順で放射性ヨウ素化したラットモノクローナル抗体（MA
b）、抗マウスIgG2（アメリカンタイプカルチャーコレ
クション、Cot No.HB−90,Rockville,MP）をリン酸−ピ
ロリン酸バッファーの中で1mg/mlにてインキュベートし
たが、ただし硫酸塩は0.75Mとし、そしてpHは9.0とし
た。
このサンドイッチ複合品の0.64cmのディスクを利用
し、そして5mmのディスクのビレットをNo.2コークボー
ラーを用いて作った。サンドイッチディスク実験は200
μｌのタンパク質溶液を使用した；ビレットは500μｌ
を使用した。材料の予備クエンチングは、連続混合しな
がらの1.0Mのエタノールアミン、pH9.0 500μｌ（サン
ドイッチ）又は1000μｌ（ビレット）との16hのインキ
ュベーションにより行った。比タンパク質放射性活性は
1890cpm/μｇであった。コントロール（粒子フリー）材
料も平行して調べた。全ての実験はトリプリケートで行
った。結果を表５に示す。ビレットNo.6は50重量％のア
ズラクトン粒子装填を含み、そして3.8mmの厚み及び189
秒の10cm3ガーリー値を有していた。ビレットNo.14は1
6.7重量％の装填、2.54mmの厚み及び13秒の10cm3ガーリ
ー値を有していた。
従来の複合品と同様に、これらはアズラクトン官能反
応性粒子に起因して高い直接共有結合性を示した。更
に、上昇率（粒子装填ウェブ、対、コントロールウェ
ブ、に対する結合性）はビレット及び二層サンドイッチ
については６−から７−倍、そして三層については35−
倍であった。これらの結果はそれぞれ、アズラクトン官
能反応性粒子が製造過程にて機能の有意義な損失を伴う
ことなく残ることを示している。
実施例14:ポリエステル−ポリエチレン−ポリブチレン
の三成分吹込マイクロファイバーによるアズラクトンビ
ーズの複合品の製造。
不織複合品を実施例８の方法により、ウェブ形成用材
料としての65重量％のポリエステル／ポリエチレン二成
分ファイバーと35重量％のポリブチレンとの混合物、及
び実施例４の反応性アズラクトン官能粒子を用いて作っ
た。この複合品は11重量％の反応性粒子とした。ビーズ
フリーコントロールも作った。
実施例15:アズラクトンビーズと二成分吹込マイクロフ
ァイバーウェブとの複合品へのタンパク質結合。
全ての溶液及び手順は実施例13におけるサンドイッチ
複合品について記載したものと同一とした。
各タンパク質について、エタノールアミンクエンチン
グ工程はSDS処理後に残っているタンパク質の量を大い
に低め、アズラクトン官能基がこの複合品製造過程で残
ったことを示唆している。各ケースにおいて、コントロ
ールウェブ（反応性ビーズ粒子なし）への装填タンパク
質量は、先の実施例において記載したその他の複合品全
てについて示したものと同様に、予備クエンチ化複合品
のそれより低かった。上昇比（ビーズ複合品結合、対、
ビーズフリーコントロール）は３〜10倍であった。
実施例16:不織ウェブマトリックスに一体化したアズラ
クトン官能反応性粒子の複合物品を用いた診断用品にお
けるヒトIgGアッセイの有効な用途の完証。
本実施例においては、分析物及びコントロール試薬を
支持体に固定化させた。機能的な分析のための支持体を
探り当てるために抗体を用いた。コントロール材料への
結合は非特異的活性、劣った洗浄、等の指標である。実
験とコントロールとのシグナルにおける差が大きいほ
ど、開発した複合品イムノアッセイの有効な感度が高
い。
本ケースにおいては、分析物はヒトIgGとした；分析
コントロールはBSAとした。プローブ用抗体はヒトIgGに
対して発生させたヒツジ抗体とした。この抗体は西洋ワ
サビペルオキシダーゼに結合されており、これはその活
性により、抗体の存在を、先の実施例における放射活性
シグナル化結合タンパク質と同様にシグナル化させてい
る。ペルオキシダーゼ活性はｏ−フェニレンジアミンの
着色生成物への酸化によって決定される。
使用した支持材料は実施例12の層状複合品及び実施例
14の三成分材料とした。複合品及びコントロール（反応
性粒子なし）の0.64cmのディスク３枚づつを500μｌの
ヒトIgG（1.0mg/ml,25mMのピロリン酸ナトリウム、0.75
MのNa2SO4,pH9.0）と、周囲温度で2h混合しながらイン
キュベートした。IgGフリーコントロールについては、
同一のバッファー中のBSA溶液をこの複合品及びコント
ロール材料とインキュベートした。インキュベーション
後、溶液を除去し、そして1000μｌのPBSで５分すすい
だ；その除去後、500μｌのクエンチング剤（1.0Mのエ
タノールアミン及び1.0mg/mlのBSA;pH9.0のピロリン酸
バッファー中）を加え、次いでそれらのチューブを周囲
温度で一夜混合した。クエンチング用溶液の除去後、こ
れらのディスクを1000μｌのPBSで３回すすいだ（すす
ぎの間、混合を行い、全部で2hのすすぎ時間とした）。
各ディスクを免疫反応の前に吸収紙の上でぬぐった。
各ディスクを1000μｌのペルオキシダーゼコンジュゲ
ートIgG（西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲー
トされたヒツジ抗−ヒトIgG,Cappel Co.,Malvern,PAよ
り）とインキュベートした。1h後、その上清液を除去
し、そしてそらのディスクを1000μｌのPBS−ツイーン
（商標）界面活性剤（PBS中の0.6％のツイーン−２）の
中で４℃で一夜保存した。保存後、それらのディスクを
PBS−ツイーンですすぎ、ぬぐい、そして清浄な12×75m
mのチューブに移した。
結合HRP活性をｏ−フェニレンジアミン（OPD）を発色
基質として用いてアッセイした。1000μｌの調製したば
かりの基質（30mgのOPD,0.1Mのクエン酸ナトリウム、pH
5.0,30μｌの30％のH2O2;全容量50ml）を各チューブに
加え、直ちに混合し、そして１又は3min反応させた。発
色を100μｌの1.0MのH2SO4の添加によりクエンチし、そ
して溶液の吸収を490nmで決定した。その結果を表７に
示す。
ビーズフリーコントロールサンプルにおいては小さな
吸光度変化があったが、レートは複合品において認めら
れたものよりもかなり低かった。
実施例17:反応性粒子を作るためのアズラクトン−官能
コポリマーによる無機粒子のコーティング クロマトグラフィー級シリカビーズ/Silicar CC−4F
（商標）、Mallinkrodt Chemical,St.Louis,MO）を、ヨ
ーロッパ特許公開0,392,735のExample 10に記載の手順
（前記ExampleのVDM−60）により１重量％のアズラクト
ン含有コポリマーでコートした。これらの直接共有反応
性粒子を次に、90:10（重量／重量）のビーズ、対、PTF
Eの比を利用してPTFE多孔性マトリックスへと加工し
た。この複合品を上記の実施例３に用いた手順によりプ
ロテインＡ結合能力について分析した。共有結合性は、
エタノールアミンで予備クエンチしたコントロールのそ
れの10倍であることが認められた。
本発明の様々な改良及び変更は本発明の範囲を逸脱す
ることなく当業者になされることが明らかであり、例え
ば、上記の表Ａに記載の各反応性粒子は、アズラクトン
官能反応性粒子についての先の実施例に記載の方法と同
じようにして連続式多孔性マトリックス（特に不織ウェ
ブ）の中に一体化させることができる。本発明は本明細
書に記載の実施態様に限定されないことが明らかであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヘイルマン，スティーブン エム. アメリカ合衆国，ミネソタ 55133，セ ント ポール，ポスト オフィス ボッ クス 33427（番地なし) (72)発明者 クレプスキー，ラリー アール. アメリカ合衆国，ミネソタ 55133− 3427，セント ポール，ポスト オフィ ス ボックス 33427（番地なし) (72)発明者 コールマン パトリック エル. アメリカ合衆国，ミネソタ 55133− 3427，セント ポール，ポスト オフィ ス ボックス 33427（番地なし) (72)発明者 ミルブラス，ディーン エス. アメリカ合衆国，ミネソタ 55133− 3427，セント ポール，ポスト オフィ ス ボックス 33427（番地なし) (72)発明者 ウォルカー，マーガレット エム. アメリカ合衆国，ミネソタ 55133− 3427，セント ポール，ポスト オフィ ス ボックス 33427（番地なし) (72)発明者 ヘイガン，ドナルド エフ. アメリカ合衆国，ミネソタ 55133− 3427，セント ポール，ポスト オフィ ス ボックス 33427（番地なし) (72)発明者 ハンセン，ジョン シー. アメリカ合衆国，ミネソタ 55133− 3427，セント ポール，ポスト オフィ ス ボックス 33427（番地なし) (72)発明者 キャンベル ジョン シー. アメリカ合衆国，ミネソタ 55133− 3427，セント ポール，ポスト オフィ ス ボックス 33427（番地なし) (56)参考文献 特開 昭63−122700（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C08J 9/36 G01N 30/48,33/544,33/554

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】複合物品であって： 連続式多孔性マトリックスの中に一体化されたアガロー
    ス、シリカ、酢酸ビニルのコポリマー、アクリルアミド
    のコポリマー、メタクリルアミドのコポリマー及びメタ
    クリレートのコポリマーから成る群から選ばれる共有結
    合反応性粒子を含んで成り、前記反応性粒子が、粒子の
    装填された当該マトリックスの共有結合反応性を高める
    試薬との事前反応による当該粒子の装填されたマトリッ
    クスの化学修飾を必要とすることなく、求核性リガンド
    と共有化学結合を形成することができるエポキシド基、
    Ｎ−ヒトロキシスクシニミドエステル基、スルホニルエ
    ステル基、ヨードアセチル基、アルデヒド基、イミダゾ
    リルカルバメート基及びアズラクトン基から成る群から
    選ばれる共有反応性官能基を含んで成る表面を有する、
    複合物品。
  2. 【請求項２】前記反応性官能基が次式を有するアズラク
    トン官能基： （式中、R1及びR2は 独立して、１〜14個の炭素原子を有するアルキル基、３
    〜14個の炭素原子を有するシクロアルキル基、５〜12個
    の環原子を有するアリール基、６〜26個の炭素原子、及
    び０〜３個のS,N及び非過酸化Ｏ異項原子を有するアレ
    ーニル基でありうるか、又はR1及びR2はそれらが結合し
    ている炭素と一緒になって４〜12個の環原子を含む炭素
    環を形成していることができ、そしてｎは０又は１の整
    数である）である、請求項１に記載の物品。
  3. 【請求項３】前記アズラクトン官能基が、無機粒子上の
    コーティングの中に含まれているか、又は前記アズラク
    トン官能基を含むコポリマーを含んで成る粒子の表面上
    に存在している、請求項２に記載の物品。
  4. 【請求項４】前記連続式多孔性マトリックスが、ウェ
    ブ、繊維ウェブ、微孔性膜、微孔性ファイバー、不織ウ
    ェブの片面もしくは両面に積載された透過性支持布帛を
    有する不織ウェブであるか、又はフィブリル化ポリテト
    ラフルオロエチレンである、請求項２に記載の物品。
  5. 【請求項５】前記反応性粒子が0.1〜1000マイクロメー
    ターに範囲するサイズを有し；ここで前記粒子が多孔性
    であり；そしてここで前記反応性官能基がリガンドに共
    有結合する、請求項２に記載の物品。
  6. 【請求項６】前記リガンドが生物学的に活性な物質及び
    イオン的に官能性な物質から成る群から選ばれる、請求
    項５に記載の物品。
  7. 【請求項７】前記生物学的に活性な物質が、生物学的
    に、免疫化学的に、生理学的に又は薬理学的に活性な物
    質を含んで成り、そしてここで前記生物学的に活性な物
    質が、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗
    原性物質、酵素、補因子、阻害剤、レクチン、ホルモ
    ン、レセプター、凝固因子、アミノ酸、ヒストン、ビタ
    ミン、薬剤、細胞表層マーカー、又はそれらと相互作用
    する物質を含んで成る、請求項６に記載の物質。
  8. 【請求項８】診断用品、アフィニティー精製用品、又は
    酵素固定化用品として使用される、請求項７に記載の物
    品。
  9. 【請求項９】（ａ）連続式多孔性マトリックスの製造に
    とって有用な材料を用意し； （ｂ）この材料から連続式多孔性マトリックスを形成
    し； （ｃ）このマトリックス内に共有結合反応性粒子を一体
    化させて複合物品を供し、ここで前記粒子は粒子の装填
    された当該マトリックスの共有結合反応性を高める試薬
    との事前反応による当該粒子の装填されたマトリックス
    の化学修飾を必要とすることなく求核性リガンドと共有
    化学結合を形成することができる能力を保持している： 段階を含んで成る、請求項１に記載の複合物品を形成す
    る方法。
  10. 【請求項１０】前記の一体化段階が、前記形成段階中に
    前記反応性粒子を分散せしめることを含んで成る、請求
    項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記の一体化段階が、前記形成段階の前
    に前記反応性粒子を分散せしめることを含んで成る、請
    求項９に記載の方法。
  12. 【請求項１２】前記反応性粒子を、前記一体化段階の後
    にリガンドと反応させて付加複合物品を形成する段階
    （ｄ）を更に含んで成る、請求項９に記載の方法。
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