WO2011145809A2 - 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체, 그 제조방법 및 그 용도 - Google Patents

효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체, 그 제조방법 및 그 용도 Download PDF

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fibers
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    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
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    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds

Definitions

  • Fiber matrix complex of enzyme three-dimensional network structure preparation method thereof and use thereof
  • the present invention relates to a fiber matrix complex of an enzyme -3D network structure, a method for producing the same, and a use thereof. More specifically, a much larger amount of an enzyme is three-dimensionally compared to a fiber matrix complex of a conventional enzyme -3D network structure.
  • Fiber matrix complex of enzyme-three-dimensional network structure which can be fixed to fiber of network structure and maintain it for a long time, its manufacturing method and bio sensor, bio fuel cell, enzyme column, ELISA device, bio purification device, antifouling It is to provide uses such as a paint (antifouling agent) production device and a crystalline ibuprofen production device.
  • the enzyme immobilization method using porous silica there are enzymatic adsorption method and cross-linking method after the enzyme adsorption.
  • the method of simple adsorption and the crosslinking between enzymes after adsorption in pore silica having pores shows better results than the simple adsorption in terms of stability. Since the quantities are similar, there is little difference in activity.
  • the enzyme coating used in the conventional nanofibers was a method of enzymatic coating using a crosslinking agent after covalent bonding with the enzyme using a functional group present on the surface.
  • the method not only has a fixed amount of enzyme but also a problem that the enzyme is denatured.
  • the present invention has been made to solve the above-described problems, the first problem of the present invention is to provide a method capable of stably immobilizing a large number of enzymes in a porous matrix containing three-dimensional network fibers will be.
  • the second problem to be solved of the present invention is that of the enzyme-three-dimensional network structure capable of stably immobilizing a large number of enzymes even though there are almost no functional groups covalently bonded to the enzyme on the surface of the three-dimensional network fibers. To provide a sugar matrix complex.
  • the three-dimensional network fibers may be microfibers or nanofibers.
  • the three-dimensional network fibers, the polyvinyl alcohol, polyacrylonitrile, nylon, polyester, polyurethane, polyvinyl chloride, polystyrene, cellulose, chitosan, Polylactic acid, polylactic-co-glycolic acid, polyglycolic acid polycaprolactone, collagen, polypy, may be any one or more selected from the group consisting of polyaniline and poly (styrene-co—maleic anhydride).
  • the diameter of the enzyme aggregate is It may be larger than the inlet size of the voids.
  • a shell containing an enzyme is formed on the surface of the three-dimensional network fibers, covalent bonds between the enzyme and the fiber may not be substantially formed.
  • the surface of the three-dimensional network fibers may not be modified
  • the precipitation agent is methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, butyl alcohol, acetone, PEG, ammonium sulfate, sodium chloride, sodium sulfate, sodium phosphate, Potassium chloride, potassium sulfate, potassium phosphate and aqueous solutions thereof may be used alone or in combination.
  • the crosslinking agent is diiso cyanate, dianhydride, diepoxide, dialdehyde, diimide, 1-ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodi And may include any one or more compounds selected from the group consisting of mead, glutaraldehyde, bis (imido ester), bis (succinimidyl ester) and diacid chloride.
  • step (3) may further comprise the step of removing the precipitation agent and crosslinking agent.
  • a porous matrix comprising a three-dimensional network fiber;
  • a crosslinked enzyme aggregate carried in the pores of the matrix and having a diameter larger than the inlet size of the pores; And it provides a fiber matrix complex of enzyme-three-dimensional network structure comprising a shell comprising an enzyme surrounding the surface of the three-dimensional network fibers,
  • the three-dimensional network fiber is a microphone
  • Furnace fibers or nanofibers are Furnace fibers or nanofibers.
  • the three-dimensional network fibers are the polyvinyl alcohol, polyacrylonitrile, naalone, polyester, polyurethane, polyvinyl chloride, polystyrene, cellulose and chitosan ,
  • Polylactic acid, polylactic-co-glycolic acid, polyglycolic acid polycaprolactone, collagen, polypy may be any one or more selected from the group consisting of polyaniline and poly (styrene-CO-maleic anhydride).
  • the shell may be formed by crosslinking of enzymes.
  • the surface and the shell of the fiber Covalent bonds may not actually form
  • a biosensor, a biofuel cell, an enzyme column, an ELISA device, and a bio purification comprising the fiber matrix complex of the enzyme-tertiary network structure of the present invention described above.
  • substantially free of covalent bonds between fibers and enzymes' refers to functional groups capable of covalently bonding with enzymes naturally formed on the surface of the island (eg fibers that do not react during the polymerization and spinning process of the fibers). Except for the formation of covalent bonds between amino groups, etc., remaining on the surface and enzymes, it does not form a small container on the surface of the fiber through modification of the fiber surface, except for covalent bonds with the naturally formed functional groups on the surface of the fiber. Means that no covalent bond is formed between the fiber and the enzyme.
  • the enzyme-three-dimensional network fiber matrix complex of the present invention not only can a large amount of enzyme be supported and immobilized in the matrix, but also the immobilized enzyme is not easily released from the outer layer.
  • the stability is maintained even after a long time
  • the enzyme-three-dimensional network fiber matrix complex of the present invention can be used for biofuel cell, biosensor, electrochemical transistor bioconversion, biopurification, enzyme column, proteolysis, pharmaceutical synthesis, antifouling and quantitative analysis (ELISA).
  • the performance can be remarkably improved compared to the conventional matrix composite.
  • 1 is a schematic view showing a step of producing a polyaniline nanofibers.
  • Figure 2 is a schematic view showing the step of fixing the enzyme to the fiber matrix ⁇
  • FIG. 3 is a SEM photograph of polyaniline nanofibers (PANFs) prepared in Preparation Example 1.
  • PANFs polyaniline nanofibers
  • Comparative Example 1 Enzyme SEM picture of polyaniline nanofiber matrix composite of enzyme -3D network structure according to adsorpt ion (EA).
  • FIG. 6 is a polyaniline nanofiber matrix composite having an enzyme-three-dimensional network structure according to the enzyme adsorption, precipitation and crosslinking methods of Example 1 (Enzyme adsorpt ion, precipi tat ion, and cross l inking, EAPC). SEM photo of.
  • FIG. 7 is a graph measuring the activity of EA, EAC, and EAPC using a UV spectrophotometer.
  • Figure 8a is a graph measuring the activity while stirring at 200 rpm in 100 mM PB at room temperature
  • Figure 8b is stirred at 200 rpm in 100 mM PB at 50 ° C to examine the thermal stability It is a graph measuring the activity while giving
  • FIG. 9A is a schematic view of a conventional fuel cell using the carbon paper of Example 4 as a cathode
  • FIG. 9B is a perspective view showing this in detail.
  • FIG. 10 is a polarization curve graph of the biofuel cell of the present invention.
  • FIG. 11 is a graph showing the initial maximum power density of the biofuel cell of the present invention.
  • FIG. 13 is a perspective view and a cross-sectional view of a polyaniline nanofiber matrix composite having an enzyme-three-dimensional network structure according to a preferred embodiment of the present invention.
  • an enzyme is adsorbed to a porous matrix including three-dimensional network fibers.
  • a three-dimensional network is formed during spinning to form voids between the fibers and the fibers.
  • It can be used without limitation of type and can be used as polyvinyl alcohol, polyacrylonitrile, nylon, polyester, polyurethane, polyvinyl chloride, polystyrene, cellulose, chitosan, polylactic acid, polylactic-co-glycol of fiber.
  • Acid, polyglycolic acid polycaprolactone, collagen, polypy may be any one or more selected from the group consisting of polyaniline and poly (styrene-co-maleic anhydride), more preferably in consideration of cost and efficiency It is advantageous to use polyaniline fibers, but not limited thereto.
  • the type of spinning for producing the fiber also has a three-dimensional network structure between the fiber and the fiber can be used in the usual thickening and / or spinning process, it can be used both electrospinning, melt spinning and the like.
  • the diameter of the fiber may also be applied to both nanofibers and microfibers, but it may be more advantageous to use nanofibers in consideration of the size of the enzyme assembly described below and the size of the pores formed between the fiber and the fiber. In the case of nano-lube, even if weaved with three oils, the three-dimensional network cannot be formed, and thus it is not within the scope of the present invention.
  • the porous matrix according to an embodiment of the present invention may be configured to include some or all of the three-dimensional network fibers, wherein the porosity is a space (pore) between the fibers and the fibers forming the three-dimensional network it means.
  • the fiber of the present invention forms a three-dimensional network, which can have a fiber matrix structure, and the matrix structure may be an amorphous structure in which fibers are complicatedly intertwined.
  • Enzymes that can be used in the present invention can be used without limitation so long as it can be adsorbed on the surface of the fiber matrix according to the purpose of use, preferably chymotrypsin, trypsin, subtilisin, papain , Lipase, holceradish ferroc Oxidase, soybean peroxidase, chloro peroxidase, manganese peroxidase, tyrosinase, laccase, celase, silanase, lactase, sucrase, organo. Nophosphohydrolases, chlorine terases, glucose oxidases, alcohol dehydrogenases, glucose dehydrogenases, hydrogenases, glucose isomerases and combinations thereof may be used, but not limited thereto .
  • the fiber matrix of the present invention contains substantially no functional group (eg amino group) that can be covalently bonded to the enzyme on its surface, and can be applied to fibers, so that it is covalently bonded between the surface of the fiber and the enzyme. Instead of being bound together, they adsorb between the surfaces of the fibers or the voids (spaces) formed between them. Therefore, when the outer layer is applied to the matrix surface simply by washing with water, most of the adsorbed enzymes are separated from the matrix, and as a result, the fixation rate of the enzyme is significantly reduced.
  • a functional group eg amino group
  • a precipitant is added to the matrix to prevent the outflow of enzymes adsorbed in the pores of the matrix.
  • Adsorbed enzymes are so small that they are rarely observed with the naked eye.
  • a precipitation agent is added to the matrix to precipitate the adsorbed enzyme, the adsorbed enzymes agglomerate with each other and become larger in size, and thus between the pores (spaces) formed between the surface of the fiber or between the fiber and the fiber. Will be precipitated.
  • Precipitation agents which may be used at this time can be used with almost no impact as long as the enzyme can ⁇ 'be precipitated on the kind of restriction enzyme, but preferably methanol, ethanol,
  • 1-propane, 2-propanol, butyl alcohol, acetone, PEG, ammonium sulfate, sodium chloride, sodium sulfate, sodium phosphate, potassium chloride, potassium sulfate, potassium phosphate and aqueous solutions thereof may be used alone or in combination. However, it is not limited thereto.
  • a crosslinking agent is added to form crosslinks between the enzymes to form an enzyme aggregate.
  • the precipitated enzyme may leak out of the pores due to the external layer lattice such as water washing.
  • a binder is added to form a crosslink between the precipitated enzyme and the enzyme, the crosslinked enzymes form an aggregate, and the formed enzyme aggregate almost fills the interior of the pores.
  • the size of the enzyme aggregate formed becomes larger than the inlet of the pores, so that the crosslinked enzyme aggregate is easily discharged into the pores of the pores even by an external layer lattice such as water washing. Will not be.
  • enzyme aggregates are located in the pores over time, so even if a direct binding relationship such as covalent bonds between fibers and enzymes is not formed, enzyme aggregates can be provided in the fiber matrix for a long time.
  • the complex formed between the three-dimensional network fiber matrix has a much higher amount of fixed enzyme than the conventional complex, and thus the performance of the complex formed by the biosensor or biofuel cell is significantly higher than that of the conventional complex. Can be improved
  • a crosslinking agent after treating the precipitation agent significantly enhances the effect as compared with the case where only the crosslinking agent is added.
  • the concentration of the enzymes becomes equal to the ambient concentration even if the inside of the pores formed between the fibers and the fibers cannot be substantially filled or the housework is filled. Enzymes of the same concentration crosslink and do not form larger masses in the pores in the nanofibers than inlet pores, so the crosslinked enzymes are likely to leak out during washing.
  • the enzymes are forced to fill the pores in the nanofibers more densely by precipitation after the adsorption of the enzymes. It is expected that losses will be less than EAC during the flushing process.
  • the crosslinking agent that can be used in the present invention can be used without limitation as long as it can form crosslinking between the enzymes without inhibiting the activity of the enzyme, but preferably diisocyanate, dianhydride, diepoxide , Selected from the group consisting of dialdehydes, diimides, 1-ethyl-3-dimethyl aminopropylcarbodiimide, glutaraldehyde, bis (imido ester), bis (succinimidyl ester) and diacid chloride Any one or more compounds may be used, and more preferably, glutaraldehyde may be used, but is not limited thereto. It will be apparent to those skilled in the art that any crosslinking agent known in the art may be used without limitation.
  • the step of removing the added cross-linking agent and precipitation agent by washing the enzyme-three-dimensional network fiber matrix complex may be further performed.
  • the enzyme fixed between the pores is substantially leaked out of the pores, but the enzyme -3D network fiber matrix complex prepared by the present invention is formed in the pores. Since the size of the formed enzyme aggregate is larger than the inlet of the pores, the enzyme aggregate can be fixed inside the pores without flowing out despite the washing process.
  • a porous matrix comprising three-dimensional network fibers;
  • a crosslinked enzyme aggregate carried in the pores of the matrix and having a diameter larger than the inlet size of the pores; And it provides a fiber matrix complex of enzyme-three-dimensional network structure comprising a shell comprising an enzyme surrounding the surface of the three-dimensional network fibers.
  • FIG. 13 is a perspective view and a cross-sectional view of a polyaniline nanofiber matrix composite having an enzyme-three-dimensional network structure according to a preferred embodiment of the present invention.
  • a crosslinked enzyme aggregate having a diameter larger than the inlet size of the pores is carried in the pores of the fibrous matrix of the tertiary network structure.
  • the surface of the three-dimensional network fibers are wrapped in a shell containing an enzyme aggregate.
  • FIG. 13 is a cross-sectional view of an area where the shell containing the enzyme aggregate encloses the surface of the three-dimensional network fibers.
  • a shell containing the enzyme aggregate surrounds the surface of the three-dimensional network fiber without substantially forming a covalent bond between the fiber and the enzyme aggregate forming the shell.
  • the enzyme-three-dimensional network fiber matrix complex of the present invention has a large size of the enzyme complex formed in the interior of the pores such that the pores formed between the fiber and the fiber do not flow out to the outside.
  • a significantly larger amount of enzyme is immobilized on the matrix to form a complex.
  • the size of the enzyme complex formed inside the pore is larger than the size of the inlet of the pore, which is a passage that flows out from the pores formed between the fibers and the outside, so that even if there is an external stimulus such as water washing, The complex can be maintained for a long time without forming a direct binding relationship between the enzyme and the matrix.
  • the poly-polyfunctional group having almost no functional group capable of covalently binding to an enzyme on the surface of the fiber In the case of aniline nanofibers, it is very difficult for the enzyme to be immobilized on the surface of the fiber.
  • the enzymes precipitated on the surface of the fiber are crosslinked to form a shell surrounding the surface of the fiber, even if a covalent bond is not substantially formed between the fiber and the enzyme like a hot dog, Positive enzymes can be immobilized by forming shells.
  • the amount of fixed enzyme can be expressed as the amount of fixed enzyme relative to the amount of fiber used in the finally prepared enzyme-three-dimensional network fiber matrix complex, where the conventional enzyme -three-dimensional network fiber matrix complex is used per fiber lg used. While the enzyme is fixed at 5000 to 6000 units, the enzyme-three-dimensional network fiber matrix complex of the present invention can fix 50000 to 60000 units of enzyme per lg of fiber, thereby increasing the amount of immobilized enzyme.
  • the enzyme-three-dimensional network fiber matrix complex of the present invention can not only support and immobilize a significantly larger amount of enzyme in the matrix than the conventional complex, but also does not easily release the immobilized enzyme from the outer layer. The stability is maintained even after a long time
  • the enzyme-three-dimensional network fiber matrix complex of the present invention can be used for the biosensor, Bao fuel cell, enzyme column, ELISA device, bio purification device, antifouling paint (antifouling agent) manufacturing device and crystalline ibuprofen production device.
  • the performance can be remarkably improved as compared with the case of using a conventional matrix composite.
  • the electrically conductive nanofibers polyaniline nanofibers for enzyme immobilization were prepared by oxidative polymerization with ammonium persulfate as an initiator.
  • Acid polymerization prevents the polyaniline overgrowth by controlling the amount of ammonium persulfate.
  • Ammonium persulfate was prepared by dissolving 0.1 M in 1 M HC1 solution. Add 1.5 ml of aniline to 8.5 ml of 1 M HC1 Mix 10 ml of the prepared ammonium persulfate solution was added to a 10 ml solution containing aniline and HC1 and mixed well. The mixed solution was stirred at 200 rpm at room temperature for 24 hours.
  • the prepared polyaniline nanofibers were synthesized by controlling the amount of ammonium persulfate to prevent overgrowth.
  • the nanofibers were intricately connected to each other like corals to form a three-dimensional network structure. It has many pores from the inside as well as the pores of the part.
  • the pores of the nanofibers (the spaces formed between the fibers) play a big role in the immobilization of enzymes.
  • the BET surface area of the polyaniline nanofibers was 58 mm 4 mVg and the average pore diameter was 12,26 nm.
  • the polyaniline nanofiber matrix composite of the enzyme -three-dimensional network structure was prepared according to the enzyme fixation method (Enzyme adsorption, EA) of FIG. 2. Specifically, 5 mg of the polyaniline nanofiber matrix prepared in the above example was dissolved in 100 mM PB buffer (pH 7.0), and 10 ml / ml of glucose oxidase (GOx) solution was added at 150 rpm for 2 hours. Stirred. Then, the solution containing the matrix complex to which GOx was adsorbed was stirred at 200 rpm for 30 minutes using 100 mM Tris buffer pH 7.4 and washed again using 100 mM PB. All treated enzyme-fixed materials were stored at 4 ° C to produce polyaniline nanofiber matrix complexes (EA) with enzyme -3D network structure.
  • EA enzyme fixation method
  • Polyaniline nanofiber matrix complex of enzyme -3D network structure was prepared according to EAC). Specifically, the polyaniline nanofiber matrix prepared in the preparation was washed with water and then mixed with lOmg / ml GOx 1ml solution and stirred at 150 rpm for 2 hours to adsorb well. Then, 25% glutaraldehyde 20'4 / was added as a crosslinking agent so that the concentration of glutaraldehyde in the solution was 5% v / v. The reaction was conducted for 17 hours at 4 ° C. for a sufficient reaction of the binder.
  • the solution containing the matrix complex was then stirred at 200 rpm for 30 minutes using lOOraM Tris buffer pH 7.4 and 100 mM PB was added again. All treated enzyme-fixed materials were stored at 4 ° C to prepare polyaniline nanofiber matrix complex (EAC) with enzyme -3D network structure.
  • EAC polyaniline nanofiber matrix complex
  • Polyaniline nanofiber matrix composite having an enzyme -3D network structure was prepared according to enzyme adsorption, precipitation, and cross linking (EAPC).
  • Polyaniline nanofiber matrix complexes of the enzyme-three-dimensional network structure were prepared according to EAPC of FIG. 2. Specifically, the polyaniline nanofiber matrix prepared in the above preparation was washed with water, mixed with a 10 mg / ml G0x solution, and stirred at 150 rpm for 2 hours to allow adsorption. Then, 60% w / v 1.4ml ammonium sulfate solution was added as a precipitation agent so that the ammonium sulfate solution concentration was 35% v / v in the solution. In order to facilitate the precipitation of the enzyme, the mixture was stirred for 30 minutes at 150 rpm at room temperature.
  • FIG. 3 is a SEM photograph of polyaniline nanofibers (PANFs) prepared in Preparation Example 1.
  • FIG. Figure 4 is a SEM photograph of the polyaniline nanofiber matrix composite of the enzyme -three-dimensional network structure according to the enzyme fixation method (Enzyme adsorption, EA) using the enzyme adsorption prepared in Comparative Example 1.
  • Fig. 5 is Comparative Example 2 3D enzyme according to enzyme adsorption and crossl inking (EAC) SEM image of polyaniline nanofiber matrix composite of network structure.
  • FIG. 3 is a SEM photograph of polyaniline nanofibers (PANFs) prepared in Preparation Example 1.
  • FIG. Figure 4 is a SEM photograph of the polyaniline nanofiber matrix composite of the enzyme -three-dimensional network structure according to the enzyme fixation method (Enzyme adsorption, EA) using the enzyme adsorption prepared in Comparative Example 1.
  • Fig. 5 is Comparative Example 2 3D enzyme according to enzyme adsorption and crossl in
  • Example 6 is an SEM image of the polyaniline nanofiber matrix complex of the enzyme -3D network structure according to enzyme adsorption, precipitation, and crosslinking method (EPC) of Example 1 (Enzyme adsorpt ion, precipitat ion, and crossl inking).
  • EPC enzyme adsorption, precipitation, and crosslinking method
  • the polyaniline nanofibers, EA, and EAC do not show a significant difference in the SEM image.
  • EAPC unlike the others can be seen that the diameter of the polyaniline nanofibers increased significantly (Fig. 6).
  • GOx does not form an enzyme coating and is immobilized by entering the pores of polyaniline nanofibers, but EAPC exists in the surface of polyaniline nanofibers by enzymatic precipitation and encapsulates the surface by crosslinking. this can be done jyeotdago m which is interpreted to show that the EAPC is playing an important role in the degree of enzyme immobilization.
  • Enzymatic activity of the polyaniline nanofiber matrix complex of each enzyme -3D network structure prepared in Comparative Examples 1, 2 and Example 1 was determined by U ⁇ L800 UV.
  • the polyaniline nanofiber matrix complex of the enzyme-three-dimensional network structure was prepared by diluting O. lmg / ml in 100 mM PB buffer. After dissolving lOmg o-dianisidine (ODS) in 1.52ml of DI, the solution was littered with lOOmM PB buffer so that the 0DS solution was 21mM. D-glucose was added to the prepared 0DS solution to make 1.724% w / v solution with D-glucose concentration. Peroxidase (POD) was prepared in 3Om 79 mg / ml in 100 mM PB buffer, and the enzyme activity was measured using three solutions. 980ul ODS solution, lOul POD solution and The absorbance was measured on a UV spectrophotometer at 500 nm by mixing Oul's GOx-immobilized polyaniline nanofiber matrix composite solution.
  • ODS o-dianisidine
  • FIG. 7 is a graph measuring the activity of EA, EAC, and EAPC using UV spectrophotometer.
  • the activity of EA, EAC, and EAPC is 0.040, 0.091, and 0 382 A500 / min, respectively. It was 9.6 times larger than EA and 4 owned2 times larger than EAC. This increase in activity can be explained by an increase in the amount of GOx supported by the SEM images of FIGS. 3 to 6.
  • Enzyme precipitation results in the presence of a large amount of enzyme on the surface of the polyaniline nanofibers and enzymatic coating through a crosslinking agent. The enzyme can be immobilized.
  • Figure 8a is a graph measuring the activity by stirring at 200 rpm in 100 mM PB at room temperature, EA and EAC activity after 22 days and 22% and 19%, respectively, EAPC was the initial activity after 56 days It can be seen that almost 90% of the time is maintained.
  • Figure 8b is a graph measuring the activity while stirring at 200 rpm in 100 mM PB at 50 ° C to examine the thermal stability ⁇ After 4 hours the activity of EA and EAC drops to 50%, EAPC Maintains nearly 100 percent.
  • nafion solution was added to 3 mg / ml of the polyaniline nanofiber matrix complex solution of each enzyme-three-dimensional network structure prepared according to Comparative Examples 1, 2 and Example 1 to increase the concentration of na fi on in the solution. 3%. Then, the mixture was stirred for 4 to 1 hour while stirring to mix the nafion solution and the polyaniline nanofiber matrix composite solution.
  • Carbon paper thickness: 370 ⁇ , area: 0.332 cm 2 ) was added to the reacted solution so that the solution was well adsorbed onto the carbon paper. The solution containing the carbon paper was left at room temperature for 10 minutes for stable adsorption. The thickness of the carbon paper was 370 and the width was 0,332 cm 2.
  • FIG. 9A is a schematic view of a conventional fuel cell using the carbon paper of Example 4 as a cathode
  • FIG. 9B is a perspective view showing this in detail. Specifically, it consists of an enzyme cathode including carbon paper, a cathode space, a current acceptor and a membrane electrode (MEA).
  • the proton exchange membrane, air pump and Pt anode electrode are the fuel cell store (San Diego, CA, USA).
  • a 200 mM glucose solution was supplied as a fuel by a pump at a rate of 20 ml / min and air plunged at the anode.
  • As a mediator for electron transfer rate l, 4-benzoquinone (BQ) was added to glucose solution to 10 mM.
  • BQ 4-benzoquinone
  • the polarization curve can be obtained and the maximum power density can be obtained.
  • the CLD mode applies external resistance from the resistance box to the biofuel cell, with each resistor stabilized current and voltage. Walk every 3 minutes to get. The power obtained was divided by the surface area of the enzyme electrode (0.33 cm 2 ) to calculate the maximum power density.
  • Electrochemical impedence spectroscopy (EIS) experiments were performed.
  • the imperdence spectra measures resistance by applying 25 mV and changing the frequency in 10 steps every 10 seconds from 20 Hz to 10 mHz.
  • Nyquist plots were used to display the results of the EIS experiments.
  • the semicircle diameter from the Nyquist plot is the electron transfer resistance (R ct ) at the cathode and the electrolyte resistance (R s ) on the x-axis.
  • the model to obtain these values is based on the reaction kinetic of the faradaic impedance.
  • the EIS measurement uses the same reaction conditions as the polarization curve.
  • hydrogen gas should be supplied instead of air to eliminate the effect of anode resistance. Therefore, the experiment was conducted by supplying air instead of hydrogen.
  • the performance of the biofuel cell is based on the polarization curve of 200 mM glucose solution.
  • Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) experiments were performed to measure resistance affecting electron transfer rates through biofuel cell experiments and the results are shown in FIG. 12.
  • the Nyqui st plot obtained from the EIS measurement provides the electrolyte resi stance (R s ) and the charge transfer resistance (Ret). According to the Nyquist plot, the electrolyte resi stance for all samples is about the same. However, charge transfer resi stance shows EA, EAC, and EAPC 20.8, 18.3, and 43.4, respectively. EAPC, which shows the largest charge transfer resi stance, can be explained by the high enzyme loading.
  • Enzyme is a protein that has a high resistance, so the higher the amount of enzyme immobilized on the electrode, the higher the charge transfer resistance.
  • the charge transfer resistance of EAPC is about 2 times higher than EA and about 5 times higher at maximum power density. This is the result of EAPC being 9.6 times higher than EA in enzymatic activity.
  • EAPC's large charge transfer resistance hinders the transfer of rapidly producing electrons, but because it produces a greater amount of electrons than disturbing electron transfer, its maximum power density is the largest of the three enzyme immobilization methods. Is showing the value.
  • Table 1 shows measurement results of initial maximum power density and maximum power density after 2 months at room temperature. When measured after 2 months at room temperature, all the enzyme electrodes maintained the maximum and initial maximum power densities. This prevented the enzyme from being denatured as the enzyme immobilized samples were adsorbed onto carbon paper like nafion.
  • Table 2 shows the measurement results of the initial maximum power density at 50 ° C and the maximum power density after 4 hours for thermal stability. As a result, the enzyme electrode maintained the initial maximum power density in all samples.
  • Table 2 shows the maximum power density and initial initial power density at 6C C for thermal stability.
  • An enzyme-three-dimensional network fiber matrix complex is used in biosensors, biofuels cells, enzyme columns, ELISA devices, bio purifiers, anti-fouling paint (antifouling agent) manufacturing equipment, and crystalline ibuprofen production equipment. Its performance can be remarkably improved compared to conventional matrix composites.

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Abstract

본 발명의 효소-3차원 네트워크 섬유 매트릭스 복합체는 종래의 복합체에 비하여 현저하게 많은 양의 효소가 매트릭스에 담지 및 고정될 수 있을 뿐 아나라 외부충격으로부터 고정된 효소가 쉽게 유출되지 않으므로 장기간 경과한 경우에도 그 안정성이 유지된다, 또한, 섬유의 표면에 효소와 공유결합을 수행하는 작용기가 거의 존재하지 않는 섬유의 경우에도 많은 양의 효소를 안정적으로 고정화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 효소-3차원 네트워크 파이버 매트릭스 복합체를 바이오 센서，바이오 연료전지 등에 사용하는 경우 종래의 매트릭스 복합체에 비하여 그 성능을 현저하게 개선시킬 수 있다.

Description

[명세서】
【발명의 명칭】
효소 3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체， 그 제조방법 및 그 용도
【기술분야】 、
본 발명은 효소 -3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체, 그 제조방법 및 그 용도에 관한 것으로， 보다 상세하게는 종래의 효소 -3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체에 비하여 훨씬 많은 양의 효소를 3차원 네트워크 구조의 파 이버에 고정시키고 이를 장기간 안정적으로 유지할 수 있는 효소 -3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체, 그 제조방법 및 이를 이용한 바이오 센서， 바이오 연료전지， 효소컬럼, ELISA 장치, 바이오 정화기기, Antifouling용 도료 (방오제) 제조 장치 및 결정성 이부프로펜 제조장치 등의 용도를 제공하는 것이다ᅳ
【배경기술】
종래에 3차원 네트워크 구조를 갖는 섬유에 효과적으로 효소를 고정하기 위 한 여러 가자 방법들이 제안되어 왔으며 그 방법들에는 운반물 결합， 가교결합그 리고 흡착 등이 제안되어 왔다. 그러나 1990년대 후반부터 나노테크놀로지의 발전 과 나노바이오테크 전자기기 요구의 증가로 인하여 새로운 효소고정화방법이 필요 하게 되었고 그들의 여러 결과들이 발표되었다。 그리고 이를 통하여 나노구조 물질 의 발전에 따른 효소고정화는 바이오 센서， 바아오 연료전지, 효소컬럼, ELISA장 치, 바이오 정화기기， Antifouling용 도료 (방오제)제조 장치 및 결정성 이부프로 펜 제조장치 등와 활용에서 층분한관심을 받고 있다.
그런데， 3차원 네트워크 구조의 파이버에 대한 효소 고정화가상업화되기 위 하여 달성하여야 할 목표로는 얼마나 효소의 안정성을 유지할 수 있는지와높은 전 기적 수행을 나타낼 수 있는지가중요한 열쇠 중에 하나이다ᅳ 그 결과 다양한 나노 구조 물질이 고려되었는데 구체적으로 높은 표면적을 가진 나노세공성 물질， 전기 방사 나노섬유 그리고 나노입자와 같은 나노구조 물질의 사용으로 효소가고정화 되었을 때 새어나오거나 떨어져 나오는 것을 방지하여 효소 담지량을 극대화시키는 방법이 모색되었다,
한편 , 다공성 실리카를 이용한 효소 고정화 방법은 효소 흡착방법과효소 흡 착후 가교결합 방법이 있다. 공극을 가지고 있는 세공성 실리카안에 효소를 단순 흡착시키는 방법과 흡착후 효소 간에 가교결합하는 방법은 흡착후 효소간의 가교 결합하는 방법이 안정성 측면에서는 단순흡착에 비해 좋은 결과를 보여주지만 흡 착되는 효소의 양이 비슷하기 때문에 활성에 있어서 그 차이는 거의 없다。 고정되 는 효소의 양을 늘리기 위하여 종래 나노섬유에 사용했던 효소코팅은 표면에 존재 하는 작용기를 이용하여 효소와공유결합시킨 후 가교결합제를 이용하여 효소코팅 을 하는 방법이었다. 그러나상기 방법은 효소의 고정량에 한계가 있을 뿐 아니라， 효소가 변성되는 문제가 발생하였다. 또한섬유표면에 효소와공유결합을수행할 수 있는 작용기가 없는 나노섬유에는 적용되기 어려운 문제가 있었다。
<5> 결국， 종래의 3차원 네트워크 구조의 파이버에 효과적으로 효소를 고정하는 방법은 모두 수율이 너무 낮을 뿐 아니라 장기간 사용할 경우 안정성이 크게 떨어 지게 되어 이를 상업화하기는 지극히 곤란한문제가 있었다ᅳ
【발명의 상세한설명】
[기술적 과제】
<6> 본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로， 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 3차원 네트워크 섬유를 포함하는 다공성 매트릭스에 현저하게 많은 효소를 안정적으로 고정화시킬 수 있는 방법을 제공하는 것이다。
<7> 본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 3차원 네트워크 섬유의 표면에 효소와 공유결합할 수 있는 작용기가 거의 존재하지 않더라도 현저하게 많은 효소를 안정 적으로 고정화시킬 수 있는 효소 -3차원 네트워크 구조의 설유 매트릭스 복합체를 제공하는 것이다ᅳ
【가술적 해결방법】
<8> 본 발명의 첫번째 과제를 해결하기 위하여, (1) 3차원 네트워크 섬유를 포함 하는 다공성 매트릭스에 효소를 흡착시키는 단계; (2) 상기 매트릭스의 공극내부에 흡착된 효소들의 유출을 방지하기 위하여 상기 매트릭스에 석출화제를 첨가하는 단 계; 및 (3) 상기 효소들간의 가교결합을 형성하기 위하여 가교결합제를 첨가하여 효소집적체를 형성하는 단계를 포함하는 효소 -3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭 스 복합체의 제조방법을 제공한다ᅳ
<9> 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 3차원 네트워크 섬유는 마이크 로 섬유 또는 나노섬유일 수 있다。
<ιο> 본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면， 상기 3차원 네트워크 섬유는 상기 폴리비닐알콜， 폴리아크릴로니트릴， 나일론, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리 염화비닐, 폴리스티렌, 셀를로우즈, 키토산, 폴리락틱산, 폴리락틱 -co-글리콜산, 폴리글리콜산폴리카프로락톤, 콜라겐, 폴리피를, 폴리아닐린 및 폴리 (스티렌 -co— 무수말레산)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다。
<ιι> 본 발명의 바람직한또 다른 일실시예에 따르면, 상기 효소집적체의 직경이 공극의 입구 크기보다 클 수 있다.
<12> 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 3차원 네트워크 섬유 의 표면에 효소를 포함하는 쉘이 형성되며， 상기 효소와섬유간에 공유결합이 실질 적으로 형성되지 않을 수 있다ᅳ
<13> 본 발명의 바람직한또 다른 일실시예에 따르면, 상기 3차원 네트워크 섬유 의 표면이 개질되지 않을 수 있다,
<14> 본 발명의 바람직한또 다른 일실시예에 따르면 , 상기 석출화제는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 부틸알콜, 아세톤, PEG, 암모늄 설페이트， 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트， 소듐 포스페이트, 포타슘클로라이드, 포타슘 설페이 트, 포타슘 포스페이트 및 이들의 수용액을 단독 또는 흔합한 것일 수 있다.
<15> 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 가교결합제는 디이소 시아네이트， 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 1-에틸 -3-디 메틸 아미노프로필카보디이미드， 글루타르알데하이드, 비스 (이미도 에스테르)， 비 스 (석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을포함하는 것 일 수 있다。
<16> 본 발명의 바람직한또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (3) 단계 이후 상기 석출화제 및 가교결합제를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다。
<17> 본 발명의 두번째 과제를 해결하기 위하여, 3차원 네트워크 섬유를 포함하는 다공성 매트릭스; 상기 매트릭스의 공극내부에 담지되며 직경이 공극의 입구 크기 보다큰 가교결합된 효소집적체; 및 상기 3차원 네트워크 섬유의 표면을 둘러싼 효 소를 포함하는 쉘을 포함하는 효소 -3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체 를 제공한다,
<18> 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 3차원 네트워크 섬유는 마이크
로 섬유 또는 나노섬유일 수 있다.
<19> 본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 3차원 네트워크 섬유는 상기 폴리비닐알콜， 폴리아크릴로니트릴, 나알론, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리 염화비닐, 폴리스티렌， 셀를로우즈, 키토산， 폴리락틱산, 폴리락틱 -co-글리콜산, 폴리글리콜산폴리카프로락톤, 콜라겐, 폴리피를, 폴리아닐린 및 폴리 (스티렌 -CO- 무수말레산)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다。
<20> 본 발명의 바람직한또 다른 일실시예에 따르면 , 상기 쉘은 효소들의 가교결 합으로 형성될 수 있다.
<21> 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면， 상기 섬유의 표면과 쉘은 공유결합이 실질적으로 형성되지 않을수 있다ᅳ
<22> 본 발명의 바람직한또 다른 일실시예에 따르면, 상술한 본 발명의 효소 -3차 원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체를 포함하는 바이오 센서 , 바이오 연료전 지, 효소컬럼, ELISA장치, 바이오 정화기기, Antifouling용 도료 (방오제)제조 장치 및 결정성 이부프로펜 제조장치로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 장치를 제공한다ᅳ
<23>
<24> 본 발명에 사용된 용어를 설명한다.
<25> 용어 '섬유와 효소간의 공유결합이 실질적으로 형성되지 않은'이라 함은 섬 유의 표면에 자연적으로 형성된 효소와 공유결합이 가능한 작용기 (예 ： 섬유의 중 합 및 방사과정에서 반응하지 않고 섬유표면에 남아있는 아미노기 등)와 효소간의 공유결합이 형성되는 것을 제외하고는 섬유표면의 개질 등을 통해 섬유 표면에 작 용기를 형성하지 않으며， 섬유 표면의 자연적으로 형성된 작용기와와 공유결합을 제외하고는 섬유와 효소간의 공유결합이 형성되지 않은 것을 의미한다.
【유리한 효과】
<26> 본 발명의 효소 -3차원 네트워크섬유 매트릭스 복합체는 종래의 복합체에 비 하여 현저하게 많은 양의 효소가 매트릭스에 담지 및 고정될 수 있을 뿐 아니라 외 부층격으로부터 고정된 효소가 쉽게 유출되지 않으므로 장기간 경과한 경우에도 그 안정성이 유지된다ᅳ
<27> 또한, 섬유의 표면에 효소와공유결합을 수행하는 작용기가 거의 존재하지 않는 섬유의 경우에도 많은 양의 효소를 안정적으로 고정화할 수 있다.
<28> 따라서, 본 발명의 효소 -3차원 네트워크 파이버 매트릭스 복합체를 바이오 연료전지, 바이오 센서, 전기화학적 트랜지스터 바이오 전환， 바이오정화, 효소컬 럼， 단백질가수분해, 제약합성, Antifouling그리고 정량분석법 (ELISA) 등에 사용 하는 경우 종래의 매트릭스 복합체에 비하여 그 성능을 현저하게 개선시킬 수 있 다.
【도면의 간단한 설명】
<29> 도 1은 폴리아닐린나노섬유의 제조하는 공정을 나타내는 모식도이다.
<30> 도 2는 섬유 매트릭스에 효소를 고정화시키는 공정을 나타내는모식도이다ᄋ
<3i> 도 3은 제조예 1을 통해 제조한 폴리아닐린 나노섬유 (PANFs)를 촬영한 SEM .
사진이다,
<32> 도 4는 비교예 1을 통해 제조한 효소 흡착을 이용한 효소고정방법 (Enzyme adsorpt ion, EA)에 따라 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭 스 복합체의 SEM 사진이다.
<33> 도 5는 비교예 2를 통해 제조된 효소 흡착 및 가교결합방법 (Enzyme
adsorpt ion and cross l inking, EAC)에 따라 효소— 3차원 네트워크 구조의 폴리아날 린 나노섬유 매트릭스 복합체의 SEM 사진이다ᅳ
<34> 도 6은 실시 예 1의 효소흡착， 석출화 및 가교결합방법 (Enzyme adsorpt ion, precipi tat ion, and cross l inking, EAPC)에 따라 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리 아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 SEM 사진이다.
<35> 도 7은 UV spectrophotometer을 이용한 EA, EAC, 그리고 EAPC의 활성을 측정 한 그래프이다 .
<36> 도 8a는 실온에서 100 mM PB 안에서 200 rpm으로 교반시 켜주면서 그 활성을 측정 한 그래프이고， 도 8b는 열적 안정성을 알아보기 위한 50 °C에서 100 mM PB 안 에서 200 rpm으로 교반시켜주면서 그 활성을 측정 한 그래프이다,
<37> 도 9a는 실시 예 4의 카본종이를 음극으로 사용한 통상의 연료전지의 개략도 이고 , 도 9b는 이를 구체적으로 나타낸 사시도이다ᅳ
<38> 도 10은 본 발명의 바이오 연료전지의 분극곡선 그래프이다。
<39> 도 11은 본 발명의 바이오 연료전지의 초기 최 대 전력밀도를 나타내는 그래 프이다.
<40> 도 12는 본 발명의 바이오 연료전지의 electrochemical impedance
spectroscopy (EIS)실험을 수행한 결과를 나타내는 그래프이 다。
<4i> 도 13은 본 발명의 바람직 한 일실시 예에 따른 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 사시도 및 단면도이다。
【발명의 실시를 위 한 최선의 형 태】
<42> 이하 본 발명을 보다 상세하게 설명 한다 .
<43> 상술한 바와 같이 , 종래의 3차원 네트워크 구조의 파이버에 효과적으로 효소 를 고정하는 방법은 모두 수율이 너무 낮을 뿐 아니라 장기간 사용할 경우 안정성 이 크게 떨어지게 되어 이를 상업화하기는 지극히 곤란한 문제가 있었다ᅳ 또한 섬 유의 표면에 효소와 공유결합을 수행하는 작용기가 거의 존재하지 않는 폴리아닐린 나노섬유의 등의 경우에는 효소의 고정화가 거의 이루어지지 않는 문제가 있었다。
<44> 이에 본 발명에서는 ( 1) 3차원 네트워크 섬유를 포함하는 다공성 매트릭스 에 효소를 흡착시키는 단계 ; (2) 상기 매트릭스의 공극내부에 흡착된 효소들의 유 출을 방지하기 위하여 상기 매트릭스에 석출화제를 첨가하는 단계 ; 및 (3) 상기 효 소들간의 가교결합을 형성하기 위하여 가교결합제를 첨가하여 효소집적체를 형성하 는 단계를 포함하는 효소 -3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체의 제조방법 을 제공하여 상술한문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 종래의 복합체에 비하여 현저하게 많은 양의 효소가 매트릭스에 담지 및 고정될 수 있을뿐 아니라 외부층 격으로부터 고정된 효소가 쉽게 유출되지 않으므로 장기간 경과한 경우에도 그 안 정성이 유지된다. 또한, 섬유의 표면에 효소와공유결합을 수행하는 작용기가 거의 존재하지 않는 섬유의 경우에도 많은 양의 효소를 안정적으로 고정화할 수 있다ᅳ
<45> 먼저 (1) 단계로서 3차원 네트워크 섬유를 포함하는 다공성 매트릭스에 효소 를 흡착시킨다。 본 발명에 사용되는 파이버는 방사 시 3차원 네트워크가 형성되어 섬유와섬유사이에 공극이 형성할 수 있는 것이면 종류의 제한없이 사용될 수 있으 며 섬유의 폴리비닐알콜, 폴리아크릴로니트릴, 나일론, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 셀를로우즈, 키토산, 폴리락틱산, 폴리락틱 -co-글리콜 산, 폴리글리콜산 폴리카프로락톤, 콜라겐, 폴리피를, 폴리아닐린 및 폴리 ( 스티렌 -co-무수말레산)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있 으며， 보다 바람직하게는 비용 및 효율을 고려하여 폴리아닐린 섬유를사용하는 것 이 유리하나 이에 제한되지 않는다,
<46> 섬유를 제조하기 위한방사의 종류 역시 섬유와섬유간에 3차원 네트워크 구 조를 갖는 것이면 통상의 증합 및 /또는 방사공정을 활용할 수 있고, 전기방사, 용 융방사 등을 모두사용할 수 있다。 섬유의 직경 역시 나노섬유, 마이크로 섬유에 모두 적용될 수 있으나, 후술하는 효소집합체의 크기와섬유와섬유사이에 형성되 는 공극의 크기를 고려할 때 나노섬유를사용하는 것이 보다유리할수 있다。 하지 만, 탄소나노류브의 경우 이를 삼유로 제직한다 하더라도 3차원 네트워크를 형성할 수 없으므로 본 발명의 범위에 속하지 않는다.
<47> 본 발명의 일구현예에 따른 다공성 매트릭스는 3차원 네트워크 섬유를 일부 또는 전부를 포함하여 구성될 수 있으며, 이 때 다공성은 3차원 네트워크를 형성하 는 섬유와섬유간의 공간 (공극)을 의미한다。
<48> 본 발명의 섬유는 3차원상의 네트워크를 형성하며 이를 통해 파이버 매트릭 스 구조를 가질 수 있게 되며， 상기 매트릭스 구조는 섬유가복잡하게 얽힌 무정형 의 구조일 수 였다。
<49> 본 발명에 사용될 수 있는 효소는사용하려는 목적에 따라상기 파이버 매트 릭스의 표면에 흡착될 수 있는 것이면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 목적에 따라 키모트립신, 트립신， 서브틸리신, 파파인, 리파아제, 홀세라디쉬 페록 시다아제 , 소이빈 페록시다아제 , 클로로 페록시다아제， 망가네이제 페록시다아제 , 티로시나아제 , 락카아제 , 셀를라아제 , 사일라네이즈， 락타아제， 수크라아제 , 오가 . 노포스포히드로라아제 , 클로리네스테라아제 , 글루코스 옥시다아제， 알코올 데히드 로제나아제 , 글루코스 데히드로제나아제 , 히드로제나아제， 글루코스 이소머 라아제 및 이들의 흔합물을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다 .
<50> 한편， 본 발명의 파이버 매트릭스는 그 표면에 상기 효소와 공유결합될 수 있는 어떠 한 작용기 (예 ： 아미노기 )를 실질적으로 포함하고 있지 섬유에도 적용될 수 있으므로 , 파이버의 표면과 효소간에 공유결합으로 결합된 것이 아니라 섬유의 표면 또는 섬유와 섬유간에 형성되는 공극 (공간) 사이에 흡착하게 된다 . 따라서， 단순히 효소가 매트릭스의 표면에 흡착된 상태에서 수세 등의 외부층격 이 가해지는 경우 흡착된 효소 중 대부분이 매트릭스에서 떨어져나가게 되므로 결과적으로 효소 의 고정률이 현저하게 감소하게 되는 것이다 .
<51> 다음 (2) 단계로서 상기 매트릭스의 공극내부에 흡착된 효소들의 유출을 방 지하기 위하여 상기 매트릭스에 석출화제를 첨가 (enzyme precipiatat ion)한다。
<52> 흡착된 효소는 그 크기가 매우 작으므로 육안으로 거의 관찰되지 않는다 . 이 에 상기 흡착된 효소를 석출시키기 위하여 상기 매트릭스에 석출화제를 첨가하는 경우 흡착된 효소들이 서로 뭉치게 되어 그 크기가 커지게 되어 결국 섬유의 표면 또는 섬유와 섬유간에 형성되는 공극 (공간) 사이에서 석출하게 된다 . 이 때 사용될 수 있는 석출화제는 효소의 활성에 거의 영향을 미치지 않으면 ^ 효소를 석출시킬' 수 있는 것이면 종류의 제한없이 사용될 수 있지만 바람직하게는 메탄올 , 에탄올，
1-프로판을 , 2-프로판올 , 부틸알콜 , 아세톤， PEG, 암모늄 설페이트 , 소듐 클로라이 드， 소듐 설페이트 , 소듐 포스페이트 , 포타슘 클로라이드 , 포타슘 설페이트， 포타 슘 포스페이트 및 이들의 수용액을 단독 또는 흔합한 것일 수 있으나 이에 제한되 는 것은 아니다.
<53> 다음 , (3) 단계로서 상기 효소들간의 가교결합을 형성하기 위하여 가교결합 제를 첨가하여 효소집적 체를 형성한다. 구체적으로 섬유와 섬유사이에 형성 된 공극 (공간)의 크기에 비하여 석출된 효소의 크기가 상대적으로 작으므로 수세 등의 외부층격에 의하여 석출된 효소가 공극의 외부로 유출될 수 있다。 그러나, 가교결 합제를 첨가하여 석출된 효소와 효소간에 가교결합을 형성하는 경우 가교결합된 효 소들이 집합체를 형성하게 되고 상기 형성된 효소 집합체는 공극 내부를 거의 채우 게 된다. 그 결과 공극의 입구보다 형성된 효소 집합체의 크기가 더 커지게 되므로 가교결합된 효소집합체는 수세 등의 외부층격에 의해서도 쉽 게 공극의 와부로 유출 되지 않게 된다. 그 결과 시간이 경과하여도 상기 공극 내부에 효소 집합체가 위치 하게 되므로 섬유과 효소간의 공유결합과 같은 직접적인 결합관계가 형성되지 않는 다 하더라도 효소집합체가섬유 매트릭스 내부에 장기간 구비될 수 있는 것이다。 또한 효소 -3차원 네트워크 파이버 매트릭스간에 형성된 복합체는 종래의 복합체에 비하여 고정된 효소의 양이 월등하게 많기 때문에 이를 바이오 센서 또는 바이오 연료전지 등에 활용하는 경우에도 그 성능이 종래의 복합체를 사용하는경우에 비 하여 현저하게 개선될 수 있는 것이다ᄋ
<54> 한편, 석출화제를 처리한후 가교결합제를 첨가하는 것이, 가교결합제만 첨 가하는 경우에 비하여 그 효과가 현저하게 증진된다. 이는 효소의 흡착후 가교결 합제를 첨가하는 경우 섬유와섬유간에 형성된 공극의 내부를 상당부분 채우지 못 하게 되거나 가사 이를 채웠다 하더라도 효소들의 농도는 주위 농도와 같아지게 된 다. 주위와 같은 농도의 효소가 가교결합을 하여 나노섬유안의 공극에서 공극의 입 구보다 더 큰 덩어리를 이루지 못하여 수세과정에서 가교결합된 효소가 외부로 유 출되는 경우가 발생할 확률이 높다. 하지만본 발명의 경우 효소의 흡착후 석출을 통해 효소들이 강제적으로 나노섬유 안의 공극을 더욱 조밀하게 메우게 되며 공국 에 채워진 효소들은 가교결합을 통해 큰 덩어리를 이루기 때문에 병목현상 혹은 ship in a bottle 현상으로 수세과정에서 손실이 EAC보다 덜하게 되는 것으로 예 상된다.
<55> 나아가， 섬유의 표면에 효소와공유결합할수 있는 작용기가 거의 없는 폴리 아닐린나노섬유 등의 경우 섬유의 표면에 효소가고정화되기 매우 어렵다, 하지만， 본 발명에서는 섬유의 표면에서 석출된 효소들이 가교결합되어 섬유의 표면을 감싸 는 쉘을 형성하게 되므로 마치 핫도그와 같이 섬유와 효소간에 공유결합이 실질적 으로 형성되지 않는 경우에도 섬유의 표면에 많은 양의 효소가 쉘을 형성하여 고정 화될 수 있다.
<56> 본 발명에 사용될 수 있는 가교결합제는 효소의 활성을 저해하지 않고서 효 소간에 가교결합을 형성할수 있는 것이면 종류의 제한없이 사용될 수 있지만 바람 직하게는 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드， 디알데하이드, 디이미 드, 1-에틸 -3—디메틸 아미노프로필카보디이미드, 글루타르알데하이드, 비스 (이미도 에스테르)， 비스 (석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로 구성되는 군으로 부터 선택되는어느 하나 이상의 화합물을 포함하여 사용할수 있으며 , 보다바람 직하게는 글루타르알데하이드를 사용할 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니며 당업 계에 공지된 가교결합제를 제한없이 사용하는 것은 당업자에게 자명한 것이다, <57> 한편， 상기 (3) 단계 이후 바람직하게는 상기 효소 -3차원 네트워크 파이 버 매트릭스 복합체를 수세하여 첨가된 가교결합제 및 석출화제를 제거하는 공정을 더 수행할 수 있다. 상기 수세단계를 거치면서 통상의 제조방법으로 제조된 매트릭스 복합체의 경우 공극사이에 고정된 효소가 상당부분 공극 밖으로 유출되지만, 본 발 명에 의해 제조된 효소 -3차원 네트워크 파이버 매트릭스 복합체는 공극 내부에 형 성된 효소 집합체의 크기가 공극의 입구보다 크게 되므로 상기 효소 집합체는 수세 공정에도 불구하고 외부로 유출되지 않고 공극의 내부에 고정될 수 있게 되는 것 이 다.
<58> 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면 , 3차원 네트워크 섬유를 포함하는 다 공성 매트릭스 ; 상기 매트릭스의 공극내부에 담지되며 직 경 이 공극의 입구 크기보 다 큰 가교결합된 효소집 적 체 ; 및 상기 3차원 네트워크 섬유의 표면을 둘러싼 효소 를 포함하는 쉘을 포함하는 효소 -3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체를 제공한다 .
<59> 도 13은 본 발명의 바람직한 일실시 예에 따른 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리 아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 사시도 및 단면도이다. 이를 살펴보면 3차 원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스의 공극 내부에 직경 이 공극의 입구 크기보다 큰 가교결합된 효소집 적체가 담지되어 있다. 또한 , 3차원 네트워크 섬유의 표면을 효 소 집적 체를 포함하는 쉘이 감싸고 있다ᅳ 도 13의 우하단의 EPCs 는 3차원 네트워 크 섬유의 표면을 효소 집 적체를 포함하는 쉘이 감싸는 부분에 대한 단면도로서 섬 유와 쉘을 형성하는 효소집 적 체 사이에는 공유결합이 실질적으로 형성되지 않으면 서 마치 핫도그처 럼 효소집 적체를 포함하는 쉘이 3차원 네트워크 섬유의 표면을 둘 러싸고 있다,
<60> 결국， 본 발명의 효소 -3차원 네트워크 파이 버 매트릭스 복합체는 섬유와 섬 유간에 형성된 공극에서 외부로 유출되지 않을 정도로 상기 공극의 내부에 형성된 효소 복합체의 크기가 층분히 크게 되므로 종래의 효소 복합체에 비하여 현저하게 많은 양의 효소가 매트릭스에 고정되 어 복합체를 형성할 수 있게 된다 . 다시 말해 섬유와 섬유간에 형성된 공극에서 외부로 유출되는 통로인 공극의 입구의 크기보다 공극 내부에 형성된 효소 복합체의 크기가 더 크게 되어 결국 수세 등의 외부 자극 이 있는 경우에도 효소 복합체가 상기 공극의 내부에 구비될 수 있게 되며， 이는 효소와 매트릭스간에 직 접 적 인 결합관계가 형성되지 않고서도 상기 복합체가 장기 간 유지될 수 있게 되는 것 이다.
<61> 나아가, 섬유의 표면에 효소와 공유결합할 수 있는 작용기가 거의 없는 폴리 아닐린나노섬유 등의 경우 섬유의 표면에 효소가 고정화되기 매우 어렵다. 하지만， 본 발명에서는 섬유의 표면에서 석출된 효소들이 가교결합되어 섬유의 표면을 감싸 는 쉘을 형성하게 되므로 마치 핫도그와 같이 섬유와 효소간에 공유결합이 실질적 으로 형성되지 않는 경우에도 섬유의 표면에 많은 양의 효소가 쉘을 형성하여 고정 화될 수 있다。
<62> 최종적으로 제조된 효소 -3차원 네트워크 파이버 매트릭스 복합체에서 사용된 섬유의 양에 대한 고정된 효소의 양으로 표현할 수 있는데, 종래의 효소 -3차원 네 트워크 파이버 매트릭스 복합체가사용된 파이버 lg 당효소 5000 ~ 6000unit가고 정되는데 반하여, 본원발명의 효소 -3차원 네트워크 파이버 매트릭스복합체는 파이 버 lg 당 효소 50000 ~ 60000unit가고정될 수 있으므로 고정된 효소의 양이 비약 적으로 증가하게 되는 것이다.
<63> 그러므로， 본 발명의 효소 -3차원 네트워크 섬유 매트릭스 복합체는 종래의 복합체에 비하여 현저하게 많은 양의 효소가 매트릭스에 담지 및 고정될 수 있을 뿐 아니라 외부층격으로부터 고정된 효소가 쉽게 유출되지 않으므로 장기간 경과한 경우에도 그 안정성이 유지된다ᅳ
<64> 또한， 섬유의 표면에 효소와공유결합을 수행하는 작용기가 거의 존재하지 않는 섬유의 경우에도 많은 양의 효소를 안정적으로 고정화할 수 있다.
<65> 따라서 , 본 발명의 효소 -3차원 네트워크 파이버 매트릭스 복합체를 바이오 센서， 바아오 연료전지， 효소컬럼, ELISA 장치, 바이오 정화기기, Antifouling 용 도료 (방오제)제조 장치 및 결정성 이부프로펜 제조장치 등에 사용하는 경우 종래 의 매트릭스 복합체를 사용하는 경우에 비하여 그 성능을 현저하게 개선시킬 수 있 다.
<66>
【발명의 실시를 위한 형태】
<67> <제조예 > 3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스의 제조
<68> 도 1과 같은 방법으로 3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 를 제조하였다,
<69> 구체적으로효소고정화를위한 전기전도성 나노섬유 폴리아닐린 나노섬유는 산화제민 ammonium persulfate를 개시제로 하여 산화 중합을 통해 제조하였다ᅳ 산 화중합은 ammonium persulfate의 양을 조절하여 폴리아닐린의 과성장을 막아주는 rapidly mixing reaction 방법을사용하였다。 Ammonium persulfate를 1 M HC1 용액 에 0.1 M이 되도록 녹여 준비하였다. 아닐린 1.5 ml를 1 M HC1 8.5 ml에 넣고 잘 섞어 준다. 준비한 ammonium persulfate 용액 10 ml을 아닐린과 HC1이 섞인 10 ml 용액에 넣고 잘섞어주었다. 잘 섞인 용액을 24시간동안 실온에서 200 rpm으로 교 반시켜주었다。 이렇게 중합과정이 끝난 후 용액을 centrifuge down하여 상등액을 버린 후 DI용액을 넣어준 후 잘교반하여 씻어주는 과정을 여러 번 거친 후 4°C 에 서 보관하였다. 제조된 폴리 아닐린 나노섬유는 과성장을 막기 위해 ammonium persulfate의 양을 조절하여 합성되었다ᅳ 나노섬유는 서로서로 산호처럼 복잡하게 연결되어 3차원 네트워크 구조를 형성하고 아닐린의 농도에 따라 나노섬유의 바깥 가지 부분의 공극뿐만 아니라 안쪽에서 많은 공극을 가지고 있다。 나노섬유의 공극 (섬유와 섬유간에 형성된 공간)은 효소 고정화에서 큰 역할을 한다. 폴리아닐 린 나노섬유의 BET표면적은 58ᅳ 4 mVg이고 평균 공극지름은 12,26 nm이었다ᅳ 전체 공극부피는 0.179cm3 /g(p/p0=0, 990)이었다.
<70>
<71> <비교예 1>효소 흡착을 이용한 효소고정방법 (Enzyme adsorption, EA)에 따라
효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체를 제조
<72> 도 2의 효소 흡착을 이용한 효소고정방법 (Enzyme adsorption, EA)에 따라 효 소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체를 제조하였다. 구 체적으로 상기 제조예에서 제조된 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 5 mg을 100 mM PB buffer (pH 7.0)에 녹인 글루코스 옥시다제 (glucose oxidase, GOx) 용액 10 mg/ml 1 ml를 넣어 2시간동안 150 rpm으로 교반시켰다. 그 뒤 GOx를 흡착시킨 매트릭스 복합체를 포함하는 용액을 lOOmM Tris buffer pH 7.4를 이용해 30분 동안 200 rpm 에서 교반시켜준 후 다시 100 mM PB를 이용하여 씻어주었다. 모든 처리가끝난 효 소고정화 물질들은 4 °C에서 보관하여 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나 노섬유 매트릭스 복합체 (EA)를 제조하였다。
<73>
<74> 〈비교예 2> 효소 흡착 및 가교결합방법 (Enzyme adsorption and cross 1 inking, EAC) 에 따라 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체를 제조
<75> 도 2의 효소 흡착 및 가교결합방법 (Enzyme adsorption and crossl inking,
EAC)에 따라 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체를 제조하였다. 구체적으로 상기 제조예에서 제조된 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스를 수세한후 lOmg/ml GOx 1ml 용액과 흔합한후 흡착이 잘되도톡 2시간동안 150rpm에 서 교반하였다. 그 뒤 가교결합제로서 25%의 글루타르알데하이드 20„4/ 를 첨가하 여 용액속의 글루타르알데하이드의 농도가으 5% v/v가 되도록 하였다。 그 뒤 가교 결합제의 충분한 반응을 위하여 4°C의 넁장고에서 17시간동안 반응시켰다。 그 뒤 매트릭스 복합체를 포함하는 용액을 lOOraM Tris buffer pH 7.4를 이용해 30분 동안 200 rpm에서 교반시켜준 후 다시 100 mM PB를 이용하여 씻어주었다ᅳ 모든 처리가 끝난 효소고정화 물질들은 4 °C에서 보관하여 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아 닐린 나노섬유 매트릭스 복합체 (EAC)를 제조하였다.
<76>
<77> <실시예 1>효소흡착， 석출화 및 가교결합방법 (Enzyme adsorption, precipitation, and cross linking, EAPC)에 따라 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체를 제조
<78> 도 2의 EAPC에 따라 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트 릭스 복합체를 제조하였다. 구체적으로 상기 제조예에서 제조된 폴리아닐린 나노섬 유 매트릭스를수세한후 10mg/ml G0x 용액과흔합한후 흡착이 잘되도록 2시간 동 안 150rpm에서 교반하였다. 그 뒤 석출화제로서 60% w/v 1.4ml 암모늄 설페이트용 액을 첨가하여 용액속에 암모늄설페이트용액 농도가 35%v/v가 되도록 하였다. 효소 의 석출이 용이하도록 하기 위해 실온에서 150 rpm으로 30 분동안교반시켰다。 그 뒤 가교결합제로서 25%v/v의 글루타르알데하이드를 첨가하여 용액속의 글루타르알 데하이드의 농도가 0.5%가 되도록 한다ᅳ 그 뒤 가교결합제의 층분한 반응을 위하여 4°C의 냉장고에서 17시간동안 반응시켰다。 그 뒤 매트릭스 복합체를 포함하는 용액 을 lOOmM Tris buffer 7.4를 이용해 30분 동안 200 rpm에서 교반시켜준 후 다시 100 mM PB를 이용하여 씻어주었다。 모든 처리가끝난 효소고정화 물질들은 4 °C에 서 보관하여 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스
복합체 (EAPC)를 제조하였다.
<79>
<80> <실시예 2>효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 효소 고정화 정도 확인
<81> 상기 실시예 1 및 비교예 1, 2에서 제조된 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복 합체의 효소고정화 정도를 확인하기 위하여 SEM사진을 촬영하였다.
<82> 구체적으로 도 3은 제조예 1을 통해 제조한폴리아닐린 나노섬유 (PANFs)를 촬영한 SEM사진이다. 도 4는 비교예 1을 통해 제조한 효소 흡착을 이용한 효소고 정방법 (Enzyme adsorption, EA)에 따라 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나 노섬유 매트릭스 복합체의 SEM사진이다。 도 5는 비교예 2를 통해 제조된 효소 흡 착 및 가교결합방법 (Enzyme adsorption and crossl inking, EAC)에 따라 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 SEM 사진이다. 도 6은 실 시 예 1의 효소흡착, 석출화 및 가교결합방법 (Enzyme adsorpt ion, precipitat ion, and crossl inking, EAPC)에 따라 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 SEM 사진이다.
<83> 상기 도 3〜도 6을 살펴보면 , 폴리 아닐린 나노섬유， EA, 그리고 EAC는 SEM 사진상 큰 차이를 보이지 않는다. 하지만 EAPC는 다른 것들과는 다르게 폴리 아닐 린 나노섬유의 지름이 크게 증가한 것을 볼 수 있다 (도 6) . 이는 EA와 EAC에서는 GOx가 효소코팅을 이루지 못하고 폴리 아닐린 나노섬유의 공극에 들어가 고정화 되 지만 EAPC의 경우 효소 침 전에 의해 폴리 아닐린 나노섬유의 표면에 많이 존재하다 가 가교결합에 의해 표면을 감싸는 효소코팅 이 이루어졌다고 해석할 수 있다ᄆ 이는 EAPC가 효소 고정화 정도에 중요한 역할을 수행하는 것을 보여주는 것 이다。
<84>
<85>： <실시 예 3> 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 효소활성 및 안정성 측정
<86> 상기 비교예 1 , 2 및 실시 예 1을 통해 제조된 각각의 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 효소활성을 U\ L800 UV
spectrophotometer를 이용하여 측정하였다 . 구체적으로 우선 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체를 lOOmM PB buffer에 O. lmg/ml로 회 석시켜 준비하였다 . 그리고 lOmg o-dianisidine (ODS)를 1.52ml의 DI에 녹인 후 lOOmM PB buffer를 이용하여 0DS용액이 으 21mM이 되도록 회석시 켰다. 준비된 0DS 용액에 D-glucose를 넣어 용액 안의 D-glucose의 농도가 1.724% w/v 용액을 만들었 다. Peroxidase (POD)는 lOOmM PB buffer에 녹여 3ᅳ 79mg/ml이 되도록 제조하였다 , 이 렇게 만들어진 세가지 용액을 가지고 효소의 활성을 측정하였다。 효소의 활성을 측정하기 위 해 980ul ODS 용액， lOul POD 용액 그리고 lOul의 GOx가 고정화된 폴리 아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체용액을 섞어 500nm에서 UV spectrophotometer에서 흡광도를 측정하였다ᅳ
<87> 도 7은 UV spectrophotometer을 이용한 EA, EAC, 그리고 EAPC의 활성을 측정 한 그래프로서 , EA, EAC, 그리고 EAPC의 활성은 각각 0.040, 0.091 , 그리고 0 382 A500/min이다ᅳ EAPC의 활성 이 EA보다 9.6 배 크고 EAC보다 4„2 배 더 크게 나왔다。 이와 같은 활성의 증가는 상기 도 3 ~6의 SEM 사진을 통해 알 수 있듯이 GOx의 담 지량 증가로 설명할 수 있다 . 효소 침 전에 의해 폴리 아닐린 나노섬유 표면에 많은 양의 효소를 존재하고 하고 가교결합제를 통해 효소코팅을 이루어 더 많은 양의 효소를 고정화 할수 있는 것이다.
<88>
<89> 각각의 샘플의 활성면에서도 EAPC는 다른 것들에 비해 확연히 좋은 결과를 보여준다. 도 8a는 실온에서 100 mM PB 안에서 200 rpm으로 교반시켜주면서 그 활 성을 측정한 그래프로서 56일후에 EA와 EAC의 활성이 각각초기 활성 대비 22 % 그 리고 19 %인 반면, EAPC는 그 초기 활성의 거의 90 %대를 유지하는 것을 볼 수 있 다. 또한 도 8b는 열적 안정성을할아보기 위한 50 °C에서 100 mM PB 안에서 200 rpm으로 교반시켜주면서 그 활성을 측정한 그래프이다ᄋ 4시간후에 EA와 EAC의 활 성이 50 %대로 떨어지는 반면， EAPC는 거의 100 %대를 유지하고 있다.
<90> 이러한 결과들은 폴리 아닐린 나노섬유에 GOx의 다른 고정화 전략에 의해 설 명될 수 있다,단순 흡착 (EA)나 흡착후 결합 (EAC)은 폴라아닐린 나노섬유에 높은 담지량을 이루어 낼 수 없을 뿐만 아니라고정화된 효소들이 안정선 실험을 하는 동안폴리아닐린 나노섬유표면에서 쉽게 떨어진다。 반면에 (EAPC)의 경우 폴리아닐 린 나노섬유 안의 공극에 효소 집합체가 꽉 차있기 때문에 높은 담지량을 보여주고 또한 꽉 들어찬 효소 집합체들은 폴리아닐린 나노섬유 밖으로 쉽게 유출되지 않는 다, 이를 통해 본 발명의 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭 스 복합체를사용한 바이오 연료전지 등은 그 성능이 크게 개선될 것이 예상된다ᅳ
<91>
<92> <실시예 4>효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체를 이용한 바이오 연료전지용 전극의 제조
<93> 상기 비교예 1, 2 및 실시예 1을 통해 제조된 각각의 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체 용액 3mg/ml 안에 5% nafion용액을 넣어 용액 속에 nafion의 농도가으 3%가 되도록 하였다. 그 뒤 nafion용액과 폴리 아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체 용액이 잘섞이도록 교반시켜주면서 4에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응시킨 용액 안에 carbon paper두께 ： 370 βη, 면적 ： 0.332 cm2)를 한 개씩 넣어 carbon paper에 용액이 흡착이 잘 되도록 하였다. carbon paper가들어간 용액을 안정된 흡착을 위해 10분 동안실온에 놓아두었다。 carbon paper의 두께는 370 이고 넓이는 0,332 cm2이다ᄋ carbon paper는 사용하기 전에 황산과 질산의 3:1 비율의 용액에 의해 산처리를 하였다。 상기 용액에 효소 -3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체가 흡착된 carbon paper를 꺼낸 후실온에서 1시간동안 말려주었다, 잘 말린 후 lOOmM PB buffer를이용하여 여러번 잘씻어준 후 4°C에 보관하였다ᅳ <94>
<95> <실시예 5> 바이오 연료전지의 제작 및 분극 곡선과 전기화학적 임피던스 측정
<96> 상기 실시예 4를 통해 제조된 각각의 carbon paper를 음극으로 한 것을 제 외하고는 통상의 바이오 연료전지의 구성을 가지는 연료전지를 제작하였다. 구체적 으로 도 9a, 9b의 구성을 갖는 바이오 연료전지를 제작하였다ᅳ 도 9a는 실시예 4의 카본종이를 음극으로사용한 통상의 연료전지의 개략도이고, 도 9b는 이를 구체적 으로 나타낸 사시도이다. 구체적으로 carbon paper를 포함하는 효소음극, 음극 공 간， 전류 수용체와 그리고 맴브레인 전극 (MEA)로 이루어져 있다。 양성자 교환 맴 브레인， 에어펌프 그리고 Pt 양극 전극은 Fuel Cell Store (San Diego, CA, USA)로 부터 구입하였다。 바이오연료전지 성능을 측정하기 위해 200 mM glucose 용액이 연료로서 20 ml/min의 속도로 펌프에 의해 공급되고 양극에서 층분한 공기가 공급 된다. 전자전달속도를 위한 mediator로서 l,4-benzoquinone(BQ)이 10 mM이 되도록 glucose 용액에 넣어주었다. constant load discharge(CLD)모드를 이용하여 polarization curve를 얻을 수 있고 이를 통해 최대 전력밀도를구할 수 있다, CLD 모드는 저항박스로부터 바이오연료전지 셀로 외부저항을 걸어주며 각각의 저항은 안정화된 껀류와 전압을 얻기 위해 3분 간격으로 걸어준다。 얻어진 파워는 효소 전 극의 표면적 (0.33 cm2)으로 나누어 최대 전력밀도를 계산하였다。
<97> 고정화된 샘플의 시스템을 분석하기 위해 Bio-Logic SP-150를 이용하여
Electrochemical impedence spectroscopy (EIS)실험을 하였다, Imperdence spectra 는 25mV를 걸어준 후주파수를 20 Hz에서 10 mHz까지 10초마다 10단계로 변화시키 면서 저항을 측정한다. EIS실험의 결과를 표시하기 위해 Nyquist plot이 사용되았 다. Nyquist plot에서 나오는 반원의 지름은 음극에서의 electron transfer resistance(Rct)이고 x축의 절편은 electrolyte resistance(Rs)이다, 이러한 값을 얻기 위한 모델은 Faradaic impedance의 reaction kinetic을 이용하였다. EIS측정 은 polarization curve를 구할 때와 같은 반응조건을사용하였다。 EIS측정을 위해 서는 양극 저항의 효과를 제거 하기 위해 공기대신에 수소가스가 공급되어야 하지 만 전제저항 대시 양극저항은 무시할 수 있는 정도이기 때문에 수소 대신에 공기를 공급하여 실험하였다
<98>
<99> 바이오연료전지의 성능은 200 mM glucose 용액을 연료로 하여 분극곡선
(polarization curve)를 구함으로써 최대전력밀도를 측정하였다 (도 10). 각각의 샘 플 EA, EAC, 그리고 EAPC의 초기 최 대 전력밀도는 57， 206, 292 ii W/cm 로 측정 되 었다 (도 ll EAPC의 최 대 전력밀도는 EA보다 5 배 높고 EAC에 비해 1ᅳ 5 배가 높 게 나왔다 . 각각의 활성 값과 최 대 전력밀도를 비교해볼 때 어느 정도 상관관계는 있지만 EAPC가 활성 측정에서 보여주었던 만큼 최 대 전력밀도는 증가하지 않았다。 최 대 전력 밀도가 효소의 양에 따른 전자 생성 량과 전자 전달속도에 의해 결정되는 데 반해 효소 활성은 효소의 양과 상관이 있다。
바이오연료전지 실험을 통해 전자 전달속도에 영향을 미치는 저항을 측정하기 위해 electrochemical impedance spectroscopy (EIS)실험을 수행하고 그 결과를 도 12에 나타내었다. EIS 측정을 통해 얻게 되는 Nyqui st plot통해 electrolyte resi stance (Rs)와 charge transfer resistance (Ret)를 구할 수 있ᅵ다 . Nyquist plot에 따르면 모든 샘플에서의 electrolyte resi stance는 거의 비슷하다. 하지만 charge transfer resi stance는 EA와 EAC, 그리고 EAPC는 각각 20.8， 18.3， 그리고 43.4를 보여주고 있다 . 가장 큰 charge transfer resi stance를 보여주고 있는 EAPC 는 높은 효소의 담지량으로 설명할 수 있다. 효소는 단백질의 일종으로 저항이 크 기 때문에 전극에 많은 양의 효소가 고정화 되 어 있을수록 charge transfer resistance는 증가하게 되는 것이다. EAPC의 charge transfer resi stance는 EA보다 약 2 배 더 높은 값을 나타내고 최 대전력 밀도에서는 약 5 배 더 높은 값올 보여주 고 있다 . 이 것은 효소 활성에 있어서 EAPC가 EA보다 9。6 배 더 높은 것과 맞아 떨 어지는 결과이다. 다시 말해 EAPC의 큰 charge transfer resistance는 빠르게 생산 하는 전자의 전달을 방해하는 역할을 하지만 전자 전달의 방해보다 더 큰 양의 전 자를 생산해 내기 때문에 그 최 대전력밀도는 세 가지의 효소 고정화 방법 중에서 가장 큰 값을 보여주고 있다 .
Polar izat ion curve와 EIS 실험을 통해 고정화한 샘플들의 바이오연료전지의 성능을 알아보았고 효소 고정화된 샘플들과 마찬가지로 각각 효소 전극들의 안정성 도 실험을 하였다ᅳ Naf ion과 고정화된 샘플을 섞 어 carbon paper에 흡착시켜 만든 각각의 효소 전극을 100 mM PB에서 보관하면서 안정성 실험을 하였다.
[표 1】
Figure imgf000019_0001
<104> 표 1은 상온에서 초기최대 전력밀도 및 2개월 경과후 최대 전력밀도의 측정 결과이다. 상온에서 2 개월 후 측정하였을 때 모든 효소 전극은 거와 초기 최대 전 력밀도를 유지하였다. 이는 효소 고정화된 샘플들이 nafion과 같이 carbon paper에 흡착되면서 효소가 변성이 되는 것을어느 정도 막아주었다고 할 수 있다,
<105>
<106> 【표 2]
Figure imgf000019_0002
<107>
<i08> 표 2는 열적 안정성을 알아보기 위해 50°C에서 초기최대 전력밀도 및 4시간 경과후 최대 전력밀도의 측정결과이다. 그 결과 효소 전극은 모든 샘플에서 초기 최대 전력밀도를 유지하였다。
<109>
<πο> 【표 3】
Figure imgf000020_0001
<111>
<ii2> 표 3은표 2는 열적 안정성을 알아보기 위해 6C C에서 초기최대 전력밀도 및
4시간 경과 후 최대 전력밀도의 측정결과이다. EAPC는 초기 최대 전력밀도를 거의 유자한 반면 EA는 최대 전력밀도가 50 %로 떨어졌고 EAC는 25 %로 떨어졌다。 이 실 험에서도 역시 EAPC를 이용해 만든 효소전극아 더 좋은 안정성을 보여주고 있는 것 을 확인할 수 있다.
【산업상 이용가능성】
<113> 효소 -3차원 네트워크 파이버 매트릭스 복합체를 바이오 센서, 바이오 연료전 지， 효소컬럼, ELISA 장치, 바이오 정화기가, Ant i fouling 용 도료 (방오제)제조 장치 및 결정성 이부프로펜 제조장치 등에 사용하는 경우 종래의 매트릭스 복합체 에 비하여 그 성능을 현저하게 개선시킬 수있다ᅳ

Claims

【청구의 범위】 【청구항 1】
(1) 3차원 네트워크 섬유를 포함하는 다공성 매트릭스에 효소를 흡착시키는 단계;
(2) 상기 매트릭스의 공극내부에 흡착된 효소들의 유출을 방지하기 위하여 상기 매트릭스에 석출화제를 첨가하는 단계; 및
(3) 상기 효소들간의 가교결합을 형성하기 위하여 가교결합제를 첨가하여 효 소집적체를 형성하는 단계를 포함하는 효소 -3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체의 쩨조방법.
【청구항 2】
제 1항에 있어서,
상기 3차원 네트워크 섬유는 마이크로 섬유 또는 나노섬유인 것을 특징으로 하는 효소_3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체의 제조방법 .
【청구항 3】
제 2항에 있어서,
3차원 네트워크 섬유는 상기 폴리비닐알콜, 폴리아크릴로니트릴, 나일론， 폴 리에스테르, 폴리우레탄, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 셀를로우즈, 키토산, 폴라락 틱산, 폴리락틱 -co-글리콜산， 폴리글리콜산 폴리카프로락톤, 콜라겐， 폴리피롤， 폴리아닐린 및 폴리 (스티렌 -co-무수말레산)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아 느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 효소 -3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복 합체의 제조방법'
【청구항 4】
계 1항에 있어서,
상기 효소집적체의 직경이 공극의 입구 크기보다 큰 것을 특징으로 하는 효 소 -3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체와 제조방법。
【청구항 5】
제 1항에 있어서,
상기 3차원 네트워크 섬유의 표면에 효소를 포함하는 쉘이 형성되며, 상기 효소와 섬유간에 공유결합이 실질적으로 형성되지 않은 것을 특징으로 하는 효소 -3 차원 네트워크 구조꾀 섬유 매트릭스 복합체의 제조방법ᅳ
【청구항 6】
제 1항에 있어서' 상기 3차원 네트워크 섬유의 표면이 개질되지 않은 것을 특징으로 하는 효소 -3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체의 제조방법.
【청구항 7】
제 1항에 있어서,
상기 석출화제는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 부틸알콜, 아세 톤， PEG, 암모늄 설페이트， 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 포스페이트, 포 타슴 클로라이드, 포타슘 설페이트, 포타슘 포스페이트 및 이들의 수용액을 단독 또는 흔합한 것을 특징으로 하는 효소 -3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합 체의 제조방법 .
【청구항 8】
제 1항에 있어서，
상기 가교결합제는 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드， 디알 데하이드, 디이미드， 1-에틸 -3-디메틸 아미노프로필카보디이미드, 글루타르알데하 이드, 비스 (이미도 에스테르)， 비스 (석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드 로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징 으로하는 효소 -3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체의 제조방법 .
【청구항 9】
제 1항에 있어서，
상기 (3) 단계 이후 상기 석출화제 및 가교결합제를 제거하는 단계를 더 포 함하는 것을 특징으로 하는 효소 -3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체의 제조방법.
【청구항 10】
3차원 네트워크 섬유를 포함하는 다공성 매트릭스;
상기 매트릭스의 공극내부에 담지되며 직경이 공극의 입구 크기보다큰 가교 결합돤효소집적체; 및
상기 3차원 네트워크 섬유의 표면을 둘러싼 효소를 포함하는 쉘을 포함하는 효소 -3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체 .
【청구항 11】
제 10항에 있어서,
상기 3차원 네트워크 섬유는 마이크로 섬유 또는 나노섬유인 것을 특징으로 하는 효소 -3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체。
【청구항 12】 제 11항에 있어서,
3차원 네트워크 섬유는 상기 폴리비닐알콜, 폴리아크릴로니트릴, 나일론， 플 리에스테르, 폴리우레탄, 폴리염화비닐, 폴리스티렌， 샐를로우즈， 키토산， 폴리락 틱산， 폴리락틱 -co-글리콜산, 폴리글리콜산 폴리카프로락톤, 콜라겐, 폴리피를, 폴 리아닐린 및 폴리 (스티렌 -co-무수말레산)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 효소— 3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합 체,
【청구항 13】
제 10항에 있어서,
상기 쉘은 효소들의 가교결합으로 형성되는 것을 특징으로 하는 효소ᅳ 3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체.
【청구항 14】
제 10항에 있어서，
상기 섬유의 표면과 쉘은 공유결합이 실질적으로 형성되지 않는 것을 특징으 로 하는 효소 -3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체ᅳ
【청구항 15】
제 10항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 효소 -3차원 네트워크 구조의 섬유 매트 릭스 복합체를 포함하는 바이오 센서， 바이오 연료전지, 효소컬럼， ELISA 장치, 바 이오 정화기기， Antifouiing 용 도료 (방오제)제조 장치 및 결정성 이부프로펜 제 조장치로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 장치 .
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