JPS63500562A - 蛋白質および同類品の保護 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 およ　ｍ 本発明は蛋白質および他の高分子の乾燥時の変質（ｄｅｎａｔｕｒ　ｉｎｇ）を 保護することに関する。

高分子化合物、とくに蛋白質およびポリペプチド含有化合物（ｐｏ＋ｙｐｅｐｔ ｒｄｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｃ０ＩＯｐＯＩＩｎｄＳ）は、晋通一般に第３ 次構造（ｔｅｒｔｉａｒｙ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）として知られているｗな３次 元折畳み立体配座（ｔｈｒｅｅ−ｄｅｎｅｎｔｉｏｎａｌ　ｆｏｌｄｅｄ　ｃｏ ｎｆｏｒｎａｔｉｏｎｓ）の形状をもった自然に発生した汁ネ靴慎ｉｊｒωする 。しばしば化合物また乾燥されているモノクロナール（ｎｏｎｏｃ　Ｉｏｎａ　 ｌ　）抗体の抗原結合能力の喪失である。

的を達成することができることがわかった。

トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）　、ａ−Ｄ−グルコピラノシル（ｇｌｕｃ ｏｐｙｒａｒｏｓｙｌ）　−の水分を極めて低い水準にと乾燥作用に耐えること ができることが知られている。これらの有機物は、塩水シュリンプ包９（Ａｒｔ ｅｎ＋ｉａ　ｓａｌ　１ｎａ）、ぶつか草（Ｓｅｔａｇｉｎｅｌｌａ　１ｅｐｉ ｄｏｐｈｙｌｌａ）およびパンイースト（Ｓａｃｃｈａｒｃｎｙｃｅｓ　ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅ）を含んでいる。一般的特徴として、それ等はいずれも細胞中に 大量のトレハロースを持っている。

作用の本質は、凍結および脱水の間、Ｈ＠膜の安定化へのトレハロースをふくむ 各種の水和炭化物（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ）の効果にある。二重きはトレ ハロースが他の水和炭化物にくらべて、細胞状の有機物を結合水の喪失という有 害な結果から保護するのに非常にすぐれていることを示している。

（Ｃｒｏｗｅ、Ｊ、Ｈ，、Ｃｒｏｗｅ、Ｌ、Ｍ、ａｎｄＨｏｕｒａｄｉａｎＲ， （１９８３）Ｃｏｂｉｏｌｏｇｙ　２０，３４６，３５６； Ｃｒｏｗｅ　Ｌ、Ｍ、　、Ｈｏｕｒａｄｉａｎ　Ｒ，Ｃｒｏｗｅ　Ｊ、Ｈ，訓ｃ ｋｓｏｎ　Ｓ、Ａ　ａｎｄ　Ｗｏｌｅｒｓｌｅｙ　Ｃ，（１X８４） はないが、一つの仮説は、トレハロースが生きている有機体の膜成分の結合水の 代替となり、結合（構造）水の喪失による変質を妨げることである。効果が生き ている細胞において畑１なく、驚くべきことには、精製された分離された状態の 高分子自身にも示されることを我々は今や見出だした。

ＥＰ１４０４８９＾　（和光純薬工業）は砂糖の溶液中に、時には牛血清アルブ ミン（ｂｏｒｉｎｅ　ｓｅｒｕ１１ａｌｂｕｍｉｒ＋）のような蛋白質と一緒に 、浸せきすることによって周囲の温度での乾燥に対して安定化されたキャリヤー 例えば硝子ビーズの上の免疫活性物質例えば抗体を開示している。かなりの多く の砂糖が使用されると述べられている（リボーズ（ｒｉｂｏｓｅ）、グルコーズ （ｇｌｕｃｏｓｅ）　、フラクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、マンノーズ（１１ ａｎｒｌＯ５ｅ）、ガラクトース（ｑａｌａｃｔｏｓｅ）　、マルトース（ｎａ ｌｔ。

ｓｅ）　＋ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）　、サッカローズ（ｓｕｃｒｏｓｅ） 　、オリゴサツカリド（０１ｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）　、およびポリサツ カリド（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ））　；好ましくはラクトース、サッカ ローズまたはデキシトリン（ｄｅｘｔｒｉｎｅ）溶液、しがしながら、トレハロ ースについては言及されていない。

特オ雀郡ＦＴ＋Ｂ　２００９１９８（Ａ）　（Ｂｅｈｒｉｎｇｉｖｅｒｋ　ＡＧ ）はＭＷ球菌（ｎｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）によって出来たポリサツカリドお よびトレハロースの凍結真空乾燥（ｌｙｏｐｈｉｉｉｓａｔｉｏｎ）を開示して いる：英渾削由号Ｓ求Ｂ　２１２６５８８＾　（旭化成ＫＫＫ）は非イオン界面 活性剤またはトレハロース（または他の砂糖〉のどちらかを含むことによって凍 結真空乾燥および凍結に対する腫よう壊死ファクター（ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏ ｓｉｓｆａｃｔｏｒ）の安定化を開示している：また公表された日本特許出願Ｊ 　５８０７４１３９６＾　（Ｉａｔｒｏｎ　１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）はトレ ハロースの存在下におけるＡＴＰの凍結乾燥（凍結真空乾燥）を開示している。

これら三つの刊行物はトレハロースが冷凍乾燥されている間、敏感な材料を安定 化するであろう事を開示していることが記録されよう、冷凍乾燥（冷凍真空乾燥 ）は一つの技術として、ある敏感な材料を方圧できる只−っの方法であるとして 案出された。周囲または上昇温度におりる及び人気（たは減圧下の通常の乾燥は 、杆〆江多くのこのような物質の、敏感な蛋白質等が周囲温度で乾燥出来ないお よび疋燥してはいりないという生物学上の分野における言説外（Ｗｉｔｈｏｕｔ 　ｓａｙｉｎｇ）で行われた物がいつもそうであったように、不妊ｅ９を劣化を 引起こした。冷凍乾燥では、４田固体材料から高真空で取去られる。この方法で 蛋白質の液膜変性、熱不安定等の問題が回避さノゾニ、ト】／ハローズは周囲温 度３７〜４０”Ｃで乾燥量完全な傑獲をあたえるだけでなく、蛍光性ヤ尤伝導性 のような分子１噴子的プロセスも乾燥状態でおこさせるということは、以前には 実現されていなかった。

本発明により、我々は蛋白質または同類品を含有する水からなるシステムをトレ ハロースの存在下で乾燥させることにより、乾燥時に蛋白質および他の高分子を 変性から保護する方法を与えるものである。トレハロースは便利なように水から なるシステムに溶解されている、またいかなる有効量にもすることが出来る。＝ 般にトレハローズ３重星で０．０５□〜２０％の２昌（好ましい、とくに重工で 約０．１〜１０％１例えば約２．５％。

本乾燥工程は、適当な面、例石詣狂・ないしプラスチック板、または皿、プラス チック又はニトロセルローズのフィルム、または紙のような多孔性の支持体の上 にある蛋白質とトレハロースを含む水からなるシステムを争なる空気乾燥するこ とによって成し還デられる。乾燥は好ましくは大気圧で行われる。

乾燥されている製品におけるトレハロースの存在は、間圧が起こるのは明らかに 希な場合（例えばトレハローズ劣化酵素の保護）であるが、高分子物質の物理化 学的ないし生物学上の性質に何等影響を及ぼす事がない、他の酵素、抗体、抗原 および蛍光性マーカーの場合には、なんら問題は起こらないし、化合物はあたか も水和状態に保管されてきたように活性である。

多数の酵素が今や各種試験手順に用いられ、ないしは自身各種検査（ａｓｓａｙ ｓ）で試験される０本発明によれば、酵素または酵素を含む物質は乾燥し保管す る事ができる、また必要な時には水またはバッファー液を添加することにより再 び活性化される０例えば、パーオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）　（例え ば、わさび大根（ｈｏｒｓｅｒａｄ　１ｓｈ）から）およびアルカリホスファタ ーゼ（ａｌｋｃｌｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（は乳動物）はこの方法 で保存することか出来る。血清中に見出だされる酵素の複合“カスケード（ｃａ ｓｃａｄｅ）”、これは抗体−抗原結合により免疫応答において活性化されてい る（Ｐ、Ｊ、Ｌａｃｈｍａｎ　および　Ｍ、Ｊ、Ｈｏｂｅｒｔ、”Ｈａｎｄｂｏ ｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏ１ｏｇ３’″ｅｄ、Ｄ、 Ｍ、Ｗｅｉｒ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　１９７８）が、周知のように化学変化を起 こしやすい、血清０牙は約７０へ一７５■／ｍｌの蛋白質を含み、そのうち約２ ■／ｍｌだけが補体（ＣＯｌｌｐｌｅＩＩｅｎｔ）部分を含んでいる。補体含有 血清（又はそれから取出された精製補体部分）は乾燥することが出来ない、極め て低温条件（−７０〜１９６℃）で保管されねばならない、凍結乾燥することは できるが、この技術は活性度をいくらか破壊する。それゆえ、例えば凍結真空乾 燥された補体はリンパ球（１■ｐｈｏｃｙｔｅ）ｆｆｉ胞毒性検査には使うこと が出来ない、最も驚くべきことには、我々は、補体活性度が本発明にしたがって 室温で大気中で乾燥することにより完全に保存することが出来ることを見出だし た。乾燥された材料は３７℃で数週間も貯蔵することが出来、また活性度を保っ たまま再構成することが出来る。

血清試料中の必要とされるトレハロースの星は普通は蛋白質の含有■に比例する 。例えば、５０重聚％の血清水溶液は少なくとも０．２２Ｍのトレハロース（即 ち約７５ｇ／Ｊ−）を必要とし一方２５％溶液では少なくとも０．１５Ｍのトレ ハロース（即ち約５１ｇ／ｆＬ＞を補体保護用に必要とする。他の血清成分例え ば血清抗体は必要量はかなり少ない。一般に、それゆえ、トレハロースの蛋白質 （または他の高分子）に対するｔｉｔヒは少なくとも１．４：１で、好ましくは 少なくとも２：１で、さらに好ましくは３：１が適当であり、例えば１０：１ま でである。

血清と取消補体、抗体、および抗原の保存は、本発明に従えば多くのタイプのワ クチンをトレハロースの存在のもとに乾燥することにより保存がまた可能である ことを意味している。抗血清（ａｎｔ　１ｓｅｒａ）は色々の毒Ｍ牛を処理する のに用いられる、また殺された微生物をふくむ免疫ワクチンが広く用いられてい る６両方のタイプのワクチンとも低温で水和条件でよたＬ：Ｑ７ｘ’ｖ燵凍条件 での貯蔵を必要とする。乾燥ワクチンは今や本発明の技術により可能になった。

貯蔵と保存についてのもう一つ問題がアガローズゲルの分野で生じた。多くの生 化学技術でアガローズゲルは基質として、例えば、電気泳動（ｅｌｅｃｔｒｏｐ ｈｏｒｅｓｉｓ）　、オケテルロニー拡散（ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ　ｄｉｆｆ ｕｓｉｏｎ）　、免疫電気泳動（ｉｍｍｕｎｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉ ｓ）などに用いられる。１〜３％のゲルは広くこれらの技術で分離媒質として用 いられている。現在、固体アガロースをバッファー中で溶解するまで加熱するこ とにより各実験用に研究室で新鮮にしなければならない、もし乾燥されるとゲル はゲル構造の不可逆的な崩壊をうけて水またはバッファー中での簡単な再水和に より再構成する事は出来ない。

本発明によれば２〜２０％のトレハロースを含有する２および３％アガローズゲ ルは乾燥し、引続いて再水和することができる。我々は、トレハロースなしに乾 燥されたゲルと再水和特性を比較したところ本発明の乾燥されたゲルは初期の深 さと水分量を持ったゲルを与えるよう完全に再水和されることを見出だした。こ れは乾燥されたアガローズゲル板は何等特別な容器を必要とせずにｅｌｆｓ）を 乾燥することによって保存することが又可能であり、特に例えば赤血球凝縮検査 （ｈａｅｌｌａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ）として知られたｆｉ端 に鋭敏な免疫検査で使用されるような抗体、および抗原のような結びついている 化学的に変化しやすい分子に固定された全赤血球を乾燥保存することが可能であ る。ここで、抗原にせよ抗体にせよどちらも化学的に赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃ ｙｔｅｓ）の表面膜に結合しており、又適当な配位子（Ｉ　１９ａｎｄ）は目に みえる集合パターンに赤血球が一緒に固めるような能力により検出されることが 出来る。抗扉力（赤血球に結合している場合には、抗体の効力は抗体を希釈ＩＭ ｍにて滴定し赤血球のもはや凝集反応／集合をおこさない点を観察することによ って評価することが出来る。抗体力レッドセルに結合している場合には、未知の 溶沼ＥｍＪえば血液中の正確な抗原の！４支り述のように滴定終点を検出するこ とにより決定される。このなめに、抗原はレッドセル上で抗体によりみられるこ との出来る分子について一つ以上の抗原の用地を占領せねばならない。

この検査はたくさんの準備を必要とする。レッドセルは普通新鮮なものが使われ 、洗浄を必要とし、化学的に抗原又は抗体のいずれかと結合され、次に配位子の 滴定稀薄液に加えられる。

我々は抗原および抗体をグルタルアルデヒド（ｇ　Ｉｕｔａｒａ　Ｉｄｅｈｙｄ ｅ）のような組織の固定液で固定されているレッドセルに抗原と抗体を組合わせ ることが出来、次に組合わされたレッドセルをトレハロースの存在下で乾燥する ことが出来ることが分った。再水和の際組合わされ固定されたレッドセルは、レ ッドセル凝集検査にて新鮮なレッド七ノり返濁液として振舞う完全な単−絽腫懸 濁液をつくるように再懸濁することが出来る。この利用ではトレハロースは二つ 加能を提仔８−る。： １、固定レッドセル膜に結合された抗体または抗原の機能を完全に保存する。

２、単一細胞ａＦＳ液となるように完全にバッファー中で再懸濁するように固定 されたレッドセル自身を完全に保存する。固定レッドセルはトレハロースなしく コ吃燥されると不可逆の自然ａ反応がおこり、使用することは出来ない。

かくて本赤血球凝集検査キットは、測定されるべき抗原ないし抗体が単にバッフ ァー中の乾燥レッドセルに加えられる時にごく普通のやり方で行われる乾稼゛組 立てられる。

Ｒ型フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｔ＋ｒ　ｉｎ）は海洋のロードファ イト（ｒｉｏｄｅｐｈｙｔｅｓ）を係長づ−る。

分子の応用に大変興味のもてるものである。例としては、プロトンおよびニレ（ コンピューターを含む）の棺成をもって（（る。

次の実施例は発明の詳細な説明するものである。

寒柿広−１ フィコビリ蛋白質、Ｒ−フィコエリトリン？讃瞬１のロードフィトから精製され る。輝かしい赤色の蛍光蛋白質は、１０％ｗ／ｖのトレハローズ江彷口または無 添加の燐酸塩バッファー中に置方）れなニトロセルローズ膜またはガラスファイ バーフィルター紙上に吸取られ、室温で乾燥される。トレハロースのない場合に は赤色蛋白質は紫色に変化し、青色光て・照らされた時にオレンヂ／赤の蛍光を 発する能力を失った。１０％のトレハロースがある場合には蛋白質はその色を保 持し、完全に乾いた時でさえも馬鍬中の蛋白質と同じように輝かしく蛍光を発し た。

我々は同じくリンパ球の表面に結合された抗体と組合わされたフィコエリトリン の蛍光性をトレハロースの存在下で乾燥することにより完全に保持した。

大腫例−λ・ 我々は同じく乾燥された時に抗体の抗原結合容量を保持するトレハロースに対す る能力を研究した。これは、１級移植抗原（ｃｌａｓｓ　Ｉ　ｔｒａｎｓｐｌａ ｔａｔｉｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎｓ）用の非常に敏感な二位置酵素リンク免疫検査 （ｔｙｏ　５ｉｔｅ　ＥｎｚｙＩ＋ｌｅ　Ｌｉｎｋｅｄ■ｌＩｌ叫ｎｏａｓｓａ ｙ）　（Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ　）への応用によって最も良く説明される。

この検査ではモノクロナール抗原ＹＲ５／３１０が、９６個のウェル（ｗｅｌｌ ）を持ったミクロ滴定プレート（ｎ＋１ｃｒｏ　ｔｉｔｒｅ　ｐｌａｔｅ）　（ Ｎｕｃ　免疫板）にあるポリスチレン表面に一晩培養して結び付けられた０次に トレハロースのないプレートの２４個のウェルを乾燥し、１０％添加トレハロー ズの２４個のウェルを乾燥、残り４８個のウェルは燐酸塩バッファーで湿した。

乾燥は３７℃で−２を１時間加えた。そのプレートを再び洗浄し、基体３．Ｉ、 ５．１−テトラメチル　ベンヂヂン（ｔｅｔｒａｍｅｔｔ＋ｙｌｂｅｎｚｉｄｉ ｎｅ）と２０分間培培養た９反応生成物は自動ＥＬＩＳＡプレートリーダーで測 定された。結果（第一図）はトレ乾燥抗体によるものと同じであるように完全に 抗体活性度を保持している。

因總例一旦 ドライプレート血液タイピング検査 ４個のウェルを持つ組へ培養皿（Ｎｕｎｃｌｏｎ　３／１Ｂ２　マルチ皿４、Ｎ ｕｎｃ　Ｄｅｎｍａｒｋ）が用いられた。他の安い代替品、例えば薄いＰＶＣシ ートから作られた“ブリスターパック（ｂｌ　１ｓｔｅｒ　ｐａｃｋ）”が用い られる。

また標準のミクロ滴定グレート、９４．４８．ないし２４個のウェルも用いられ る。

艶遣 ３個のウェルは抗体を含み、１個は（ウェル４）Ａ血液ブルーフ１質にモノクロ ナール　マウス　ＩｇＭ　抗体の５０μ炎のみを含む（６４ｉ、ｕ、ｐｅｒ　ｍ ｌ−Ｂｌｏｏｄ　Ｇｒｏｕｐ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｙ、Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ　Ｉｎｆｉｒｍａｒｙ、０ｘｆｏｒｄ、）ウェル２は ＢｌｆｌＬ液グルーク°物質に対しモノクロナール　マウスＩｇＭ抗体を５０μ ｌ含む（６４ｉ、ｕ、ｐｅｒ　ｍｌ−出所上に同じ）。

ウェル３はＲｈ　Ｄ抗原に対しモノクロナール　人　ＩｇＭ抗体を５０μｌ（１ ｍｇ、／ｍ！、我々の研究所製品）。

全てのウェルが５単位のヘパリン（ｉｅｐａｒｉｎ）および０．０１％のナトリ クムアジド（ｓｏｃ！１ｕｎｌａｚｉｄｅ）を加えた蒸溜水の０．１〜１０％Ｗ ／■トレハローズ溶液を５０μ夏含む。プレートは暖かい部屋の中で３７℃で一 晩乾燥される。

各々のウェルに水（蕉溜水または水を幻を２滴（約１００ｕｌ）加え２〜５秒揺 動プレートで広げる。全血液の１滴を加え、血液とウェルの中身が混合するよう に、静かに揺らす。５分間それぞれ数秒静かに揺する。

結果 Ａ、ＢまたはＲｈ抗原に対して陽性であるレッドセルを含んでいる血液は特定の ウェル（ｓ）の中で３０秒功勺に明白な、粗大な肉眼で見えるａ模様を与えるで あらう、０．Ｒｈ−ｖｅ血液はどのウェルにも血液凝集を起こさない。

Ｕは １、プレートは無期限に室温で安定である。活性度の損失なしに３７℃で２ケ月 貯蔵された。

２、検査は非常に便利で速い、何等の装置も必要としない、全ての血液が用いら れる。レッドセルは分離したり洗ったりする必要がない、指を刺ずことはＡＢＯ およびＲｈ検査用に十分な血液を与える。

３、トレハロースは１００％抗体活性度を保持する０滴定血液凝集検査において ５％の最終濃度ですべて用いられた５つの砂糖の検査結果は次の通りである。

活性度保有串　％・・・ＨＡ滴定における湿った抗体（人　ＩｇＭ　アンチ−Ｄ ）　１００乾燥　Ａｂ十添加物なし　３．７ 乾燥　Ａｂ十トレハローズ　１００ 乾燥　Ａｂ＋マルトーズ　１１．１ 乾燥　Ａｂ＋サッカローズ　１１，１ 乾燥　Ａｂ＋ラフィノーズ　３，７ 乾燥　Ａｂ＋グルコーズ　１．２ 追加の滴定が保存用の最適のトレハローズ凛度があるがどうか確立するため行わ れた。検査された抗体はマウス　モノクロナール　ＩｇＭ　アンチＡ抗体、マウ ス　モノクロナール　ＩｇＭ　アンチＢ抗体および上述の検査で用いられた人　 モノクロナール　ＩｇＭ　アンチＲｈ抗体であった。これらは適当な出発濃度に 下記のように希釈されたニーマウスアンチＡは１：１０．マウスアンチＢは１： １．Ｏ，人アンチＲｈは最終濃度２０ｔｈ　ｇ／ｍ、　１に。これらは最終容積 ５０μｍとなるデュルベ＝ｒ（ｄｕｌｂａｃｃｏ）の供酸塩バッファー塩水（Ｄ ｈｏｓｐｈａｔｅわｕｌＴｅｒｅｄ　５ａｌｉｕｅ）　（ＰＢＳ）中で９６個の ウェルのあるミクロ滴定板を横１析して１：３７ｉ定された。各々の水平８個の ウェルの列に５０μｌのトレハロースが１０％ｗ／ｖから０．１％ｗ／ｖの範囲 のｒＦＪ！ｔｃｉｏえられた。ウェルはつぎに３７°Ｃで一晩乾燥された。翌日 ウェルは等張性を回復するのに１分なバッファーをふくむ１００μ夏の蒸溜水て 再水和された０次に５０μｍの部分が）！底のミクロ滴定プレートに移され、適 当な血液クループ抗原を運ぶ１％の洗浄された人レッドセルを２５μｍ添加さｉ 督昆合された。レッドセルに反応滴定が室温で２〜３時間後に読取らノ〜ぴご。

結果は人抗体については活性度のＬ高保存は１００％て支煙段階でトレハローズ の蟲裂ξ渡２．５％で起こったことを示している。５％最終トレハロー内Ｅ度で 滴定に任かな滅多功（あった。アンチＡ抗体では１％以上のどんなトレハローズ 譜度でも最高活性度を保存し、アンチＢ抗体では０．５％以上のどんな）鈑でも 践高活性度を保存した。

Ｚ二と 多くの他の抗体、ＩｇＭまたは１ｇ０級のモノクロナールおよび血清抗体ともに トレハロースとのこの方法で保存された。活性度の保存辛は常に１００％または それに近かった。抗体は疎水性で電荷相互作用により滴定プレートのウェルのプ ラスチック表面に結付けられる事もできるし、同様な力でニトロセルローズやナ イロン膜に結付けられることも出来るし又は溶液中でフリーであることも出来る 。抗体が溶液中でフリーである場合には、その機能は十分に保なれる、即ち抗血 液グループＷ抗体（ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇａｎｔｉ　ｂｌｏｏｄ　ｇｒｏ ｕｐ　５ｕｂｓｔａｒＩＣｅ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）をＭすることは乾燥して いるレッドセルの激しい凝集を引起こし、溶液中での多価結合と再水和への能力 を保持していることを示している。

実施例　４ 全ての血清におり杢掠イ輻舌性度を１−に公Ｐ二々π在■３欠ｇ豪することによ ゑ保護 ねずみＩｇＧ免疫免疫グロビンリンｍｍｕｎｏｇｌｕｂｉｎ）　（Ｋ２３７＞へ 羊抗血清は９６ウエルの平底ミクロ滴定プ１／−トで１：３跳で滴定された（５ ０〕ｄ、ＰＢＳ中２５□夏血清）。Ｄ、Ｗ中５％Ｗ／Ｖ）レバローズ５０ｕｌが 次に加えられ、プレー・トを温室で３７℃で４８時間乾燥した。

ウェルは１００７１１の蒸溜水で再棺成される。各々のウェルの内容の内５０μ ｌがＶ底ミクロ滴定プレー■・へ移され、ＤＡねずみレッドセル（ＤＡ　ｒａｔ 　ｅＩ−ｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）は塩水で３回洗われ、ＤＡレッドセル上へのＡ ａクラス１移植抗原として１）殊であるモノクロナ・−ル抗体Ｒ３／１３ＨＬＫ の表面にうかぶｍｌへ培養でもって室温で２時間の項五により敏感にされる。レ ッドセルはつぎに塩水で３回洗われＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中に１％ｖ／ｖて再懸湧 された。教官に１．たねずみレッドセルがくわえられる。同時に新しいに２３７ 血清が湯性１１Ｒ’ａ例と同じように滴定される。

ねずみ抗体Ｒ３／１３により敏感にさせられたレッドセルの族１２Ｎ買ない凝集 を引起こす乾燥されたまた新しい血清への能力は次のようである。

桔里 列　処理　滴定（カップ数）　滴定（希釈度）Ａ　乾燥＋トレハロース　７　１ ：８．７４８Ｅ　新鮮　滴定　７ Ａ　乾燥（トレハロースなし）　２　１：３６ＢツノＨ１１：１２ Ｃノｒｎ１１：１２ Ｄノｔｎ２１：３６ 結論 トレハロースは全血清の抗体活性度を１００％保存する。トレハロースのない乾 関ゴＭ１度を９９％以上破壊する。

大風己一旦 多数の異なった基質がトレハロース支持体として検査された。そこには純粋なセ ルローズ紙（ワットマン（ＷｈａｔｌＤａｎ）　Ｎｏ、　ｌろ紙）、ガラスファ イバー紙（ワットマン　ＧＦ／ＡおよびＧＦ／Ｃ紙）、ポリウレタンスポンヂフ ォーム及び多孔質ポリエチレンシートがある。これらの基質は１０％から１％ま での色々の濃度で蒸溜水に溶解したトレハロースに浸し、３７℃で乾燥した。乾 燥した紙のトレハロースの含有Ｈｌ：Ｊ：ｔＴ！中の約２倍であった。それゆえ １０％溶液は重量でトレハロース２０％を含む乾燥紙を、また５％溶液は１０％ 重量のトレハロースを含む紙を与えた０色々の血清が紙に適用され３７℃で乾燥 された。３７℃で一定期間貯蔵後、蒸溜水または普通の塩水で洗われる；普通は 同じ血清の新しい非乾燥サンプルとその効力カ宝ロ妾１ヒ較されるように元の血 清サンプルの２〜４倍策で用いられる。

Ｋ２３７、ねずみＩｇＧに対して羊抗血消（ｓｈｅｅｐ　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ） 　、は１０％０％トレハロース含浸セルローズガラスファイバー紙および多孔質 ポリエチレンシート上で乾燥され３７°Ｃで７日間貯蔵される。

紙またはシートは通常の塩水の４倍量で洗われ、レッドセル膜の上にしぼられた クラス１抗原に対してモノクロナール抗体（ＪＮ２／８５）で覆われたＤＡスト レインねずみレッドセルをａする能力について間接レッドセル凝集検査で滴定さ れた。結果はセルローズ紙でまた多孔質ポリエチレンシート上で１００％の活性 度が保たれ、ガラスファイバー紙では５０％であった。

抵　滴定 シュライファー及ジュール　ＧＢＯＯ３１：６４０シユライフアー＆ジユール　 ＧＢＯＯ２ＳＢ　１：６４０ワツトマン　ＧＦ／Ｃ（ガラスファイバー＞　１８ １２８０ワツ１〜マン　Ｎｏ、１　（セルローズ）　１：２５６０多孔質ポリエ チレンシー）　１　：　２５６０（非乾燥抗血Ｗ４　１＋２５６０） 同じ血清がワラ１へマンＮｏ、ｔセルロース紙上で各種砂糖のある場合とない場 合とを乾燥することにより試験された。

砂楯　滴定 サッカローズ　１：６４０ ラフイノーズ　１：６４０ トレハローズ　１：１２８０ なし　１：６４０ 湿った抗血清　１：１２８０ 滴定が１：１２８０から１　：　６４０に低下したのは少なくとも５０％の抗体 活性度か失われたことを意味する。サッカローズとラフイノーズ紙および未処理 紙の間には重要な差はない。

因總倒一旦 紙または膜上のフィコエリトリンの乾燥Ｒ型フィコエリトリン５ｍｇ、／ｍｌは ３７°Ｃでガラスファイバーろ紙（ワットマンＧＦ／Ｃ）、セルローズろ紙（ワ ットマンＮｏ、１）又はニトロセルローズ膜〈シュライヒアー＆ジュール０．４ ５μ孔径〉の上で５％トレハローズ溶液のある場合とない場合と乾燥した。トレ ハロースのない場合には乾燥したＲ型フィコエリトリンのスポットは色が紫がか った赤に変わりその蛍光強度の９０％より以上を失った。トレハローズ乞励口し た％合には色と蛍光性の両方とも保ち続けている。トレハロース含有サンプル（ 叱柊九性をうしなう事なく１０か月間暗所に貯蔵された。

フィコエリトリンの蛍光性は哀えることなしに、牲Ｉ−で彰゛燥状態でｔｌｒｘ 起されるので、非常に強い完全な蛍光信号がこの分子から写真の丁−マルジョン 上に記録される。

この方法の敏感さの一例として、ＤＮＡの１００ｐｉｃｏｇｒａｌｌｌからｃ） 、ｉｐｇへの１０回３！、続の希釈はスＯン）−プＵＵ　ット１ｉ（ｓｌｏｔ− ｂｌｏｔ　ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて二１−ロセルローズ上に乾燥さノｔな 、このＤＮＡは尤ビオチンを用いているビオチンと分類されていた。これらの股 はＲ型フィコエリトリン（ＱＢ−ＡＲ４セロテンク社〉に、３００ｍ１Ｑ、のブ ロンキングパンファー（ｉ％ＢＳＡｉｎＰＢｓ）中に一晩中過乗塔賢争を続けら れた１ｍｇ、　、、／ｍ　ｆ！溶液に７温て１時間項五することによって等価に 結合されているスト１．プＩ・アビディンて以て検査された。つづいて膜は蒸溜 水１０％Ｉ・レバローズ溶液て洗浄され室温て憬９９される。膜は次に修正した ボロライドＶＤＵカメラで１時間露出を用いて写真を写され、一方４９０ｎｍの 干渉フィルター（イーリング　ベック（ｅａｔ　ｉｎｇ　ｂｅｃｋ））を通した キセノン光源からの強烈な青色光で照・ちされた。カメラレンズはオレンデー赤 蛍光だ番力低巳録されるＪ：うに５６０ｎｍ切請しのロングパス干渉フィルター で覆われた。レッデルを張られたＤＮＡのしみは容易に１０ｐｇＤＮＡより以上 の感度゛で′検出され、バックグランドは無視出来た。ニド１７セル１７−ズの 同じ乾燥膜はこのシステムで３日の期間に亙−）で２０回以上蛍光イ言−りか哀 えることなしに写真が写された。対（イ）仇こ湿また状態でよたｌ・レバローズ がない場合に照らされると、蛍光信号は３０秒内に哀える。トド・へローズなし ７に乾燥すると蛍光信号は失われることになる。

Ｒ−フィコエリトリンを用いる蛍光順徽鏡使用法、フッ化クロムは以前水性マウ ンタント（ｍｏｕｎｔａｎｔｓ）における蛍光性の衰えの為に非常に効率力兇幼 ）っな。

これはｔｌＢｊ？＋を乾燥することにより、またガル（Ｑｕｒｒ）のフルオロマ ウン）−（ｆｌｕｏｒｏｌ′Ｉｏｕｎｔ）のようなＩＦＸａマウンタントに乗せ ることにより避けることができる、しかしながら乾燥はＲ−フィコエリトリンの 蛍光性の９０％以上を破壊する。これは最終バッファーにトレハロースを加えて 乾燥することにより避けられる。これは有Ｖマ復［水マウンタンに乗ぜられるス 蛍光信５の損失無しに長期間繰返して試験出来るレッデルのはった細胞ないし組 帥轟度の全てを事実上保存する。

アンチＣＤ４モノクロナール抗体Ｗ３／２５はビオチン（ｂｉｏｔｉ口）−リン カ−（ｌｉｋｅｒ）−ア・−仏（ａｒｎ）　Ｎ−ヒドロキシサクシーニイミドエ スデル（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｔ＋１ｎｉｄｅ　ｅｓｔｅｒ）と結合され、 ねずみリンパ球のＴ・＼ルバ一部分集合としてレッグルを貼るよう飽和さノ）、 たドーズて・もらいらｈｆ；、こ：れらレッテルの貼られた細胞は次にストレブ Ｉ・アビディン−Ｒ−フィコエリトリン結合品を用いて第二の着色過程で検出さ ｉｄ＝。最終洗汁後細胞は４分割され一つはこれらの試薬と正確な１ノツテルを 示すよ３ＦＡＣＳで試験された。二つの他の分割扁はスピンダウンされｌ−レバ ローズ］、Ｏ’６添加のまたは入っていない血清に再懸濁された。

標本が作られ、店罫され、次にフルオ■７マウントに乗せろノ′また。四番目の 分割品はＰＢＳにしめった湿ったまｔ備え付１すらｔ試：、全てのヨ、つのよ叩 へ胃まブレーム光字のツアイス光学題ｉ故鏡て′試験さｉた。

湿っノごマウントは約２０”−３０秒１ユ内に最も明るい細胞だけが丘かに見分 けることが出来るほど急激に衰えた約７５％輝度の蛍光Ｅｉ胞を示した。■・レ バローズをふくまない乾燥マウン１−は辛うじてバックグランドの上に見ること のできる極めて弱い蛍光細胞のみを示した。

トレハロース添加のＱ２Ｊ、’ｉＣ歴品は哀えることのない７５％輝度の蛍光細 胞を示した。この河筋腸朋開力ヌし試験したが、何等検出しうるその細胞の哀え は見られなかった。

このように１−レバローズは完全に乾燥された時て゛も蛋白質のいくつかの広く ことなれる又非常に変化しヤシ１屯竹を完全に保持する。これらの羽嘲三（蛍光 性と抗原結合）Ｆ完全に分子の千のついていない第三の構造の保持によるもので ある。

この現象は蛋白質の償能と構造力埠μＨＱ杏で完全に保たれていることを意味す る。かくして科学的ないし医−作’１にきつ蛋白質は凍結または凍結乾燥に対す る必要条件なし、に保存される。免疫−検査用キットは水分損失を阻止するため 密閉するとか脂肪体−形成とかの必要性なしに調製され貯蔵される。化学ルミネ ッサンス、電気伝導および窒素固定とか光合成のようなあるいは複合した特性の ような新しい又ありふれていない蛋白質や他の分子力徨ｄ電伏味で保存すること が出来る。

因延例−２ ッファー塩水（ＰＢＳ）で遇靜実こ薄められ、ＮＩＪＮＣ免疫プレートのウェル に加えられた。プラスチック表面に酵素を結び付けるよう・−％′Ｊ、１培養の 後、ウェルは洗浄され、液をとるよう揺り動かされ、３７℃で５％トレハローズ 蒸溜昶容液の存在下でまたはなしに乾燥された。プレートは次に室温で４週間培 養された。この時のＬ後にウェルは蒸溜水で再水和さノ埴本が加えられた。陽性 コントロールは酵素の新鮮な希釈からなっていた。一つの酵素の活性度がｐ”） ０７ｘニルフオスフｘ　ｌ’（ｎ！Ｌｒ０ｐｈｅｎＶｌｐ１１０Ｓｐｈａｊｅ） を還元する標準テストにより測定されまた４０５ｎｍにおける光密度を監視した 。

活性度の十分な保有は酵素がトレハロースとともに乾燥されたときに得られ、ト レハロースがなしに乾燥されたときには９０％川活用度が失われた。同一の結果 がわさび大根からのパーオキシダーゼについて同一の実験に使われた時に得られ た。

ギニア豚血清（ｇｕｉｎｉａ　ｐｉｇ　ｓｅｒｕｍ）が使用まで一１９６°Ｃで 分割して新鮮力つ凍結されて準備された。目標細胞として、２週間（こいなるま て・アルスパー（Ａｌｓｅｖｅｒ　）の溶液に貯蔵した洗浄された羊しツドセル カ【１ニモノクロナ一ルアンチーホルスマン抗体（ｂｏｖｉｎ　１１ｏｎｏｃ　 １ｏｎａ　ｌ　ａｎｔｉ−ｆｏｒｒｓｎａｎｎ　ａｎｔ　１ｂｏｄｙ）　９４　 Ａ　１−ＡＺＡと一緒に４℃で１時間ｊ音畏された、次に補体固定希釈液（ＣＦ Ｄ）で洗浄された。

新たにとかしたギニア豚血清はＣＦＤで希釈され、その際平底ミクロ滴定プレー ト（ＮＵＮＣ，デンマーク）が使われ、またトレハロースは各種の法度でＵＤさ れる。プレートは室温で一時辺上失劣と’ＥＬＫを流して乾燥された。

ＣＨ３０検査（Ｐ、Ｊ、　Ｌａｃｔ＋ｍａｎｎ　及び’Ｈ，ｊ、１Ｉｏｂａｒｔ 、　”Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｎｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ ｇｙ”刊行、　Ｄ、Ｈ，Ｗｅｉｒ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　１９７８）にライては 、乾燥したまたは新鮮な補体がＵ底のミクロ滴定プレートの中で滴定が行わｕｎ ン鈑２％まで添加し５ＲＢＣをじにした。プレートは次に３７°Ｃ１時間培養さ れ、遠心分離された。終点はレッドセルの５０％がその中でボタンとして残って いるのがカンツブとして澄１定された。

結果 トレハロースの保訳効果は砂糖の蛋白質に対するモル比に依存した。補体活性度 １００％は５０％規定の血清中にトレハロースを０．２２Ｍまたはそれ以上によ り保たれ、２５％血清では０．１５Ｍと同等口上を必要とした。トレハロースの 高い濃度（０，５Ｍまで）はいかなる濃度の血清おいても抑制ルなかった。

トレハロースのない場合での牛頷血消（＋＋ｅａｔ）の転用よ補体活性度の７５ ％の損失を引起こした。トレハロースのない２５２６血清の乾燥は９３％の補体 活性度損失を起こした。これらの損失は完全にトレハロースにより阻止された、 乾燥され再構成された補体の活性度は新鮮な補体のものと全く同じであった。

因胚坏しユ１ アガローズ　ゲル 我々は２〜２０％トレハロースを含む２および３％のアガロースゲルを乾燥し、 それらの再水和特性をトレハロースなしに乾燥したゲルと比較した。再水和の程 度は再び獲得した水の工を確立するようゲルの重量を計ることにより測定された ６分離媒質として適合性が、再水和されたトレハロース保存の、乾燥ゲルにおけ るオケテル口二−（ｏｕｃｈｔｅｒ　１ｏｎｙ）−二重拡散検査および免疫電気 泳動性を準備することによって確立された。

結果（表）は５％または１０％ｌ−レバローズから乾燥された２％および３％ゲ ルは１００％の水の再取得を示している。これらのゲルは外観１新たに注がれて 固まったゲルと同一である。

アウチターロー二−拡散と免疫電気泳動の両方とも新たなゲルで行われる検査と 同一となる結果をもってこのようなゲルにおいて実行されうる。ゲルがその中で 再組立てされるバッファーを変えることによって、蒸溜水中のアガローズ／トレ ハローズから乾燥された同じゲルが各種の目的用に使用される。このようにして オケテルロニーーバンファーはこの検査に適当なゲルを作る、一方電気泳動バツ ファー（でし孔永動ないし免疫電気泳動３実施するのを可能にする。

宍 重量（ｇ） ％トレハロース　新鮮なゲル　乾燥フィルム　再水和ゲル　回復　％２％アガロ ーズ５　１．７２１　０．１７０　１．７３３　１００１０　２．３９０　０． ３４５　２．３７１　９９０　２．０８　０．０６７　０．７２７　３５３％ア ガローズ５　２．１２６　０．２２０　２．１７０　１０２１０　２．２８０　 ０．３４３　２．３５２　１０３０　１．９８４　０．０７９　０．７１７　３ ６とができ、そして直ちに使用することができる。

ｎｇ抗ｉ（鳩１ｇ艷）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．乾燥中の変質に対して蛋白質および他の高分子を保護する方法で、蛋白質ま たは他の高分子を含有する水を含んだシステムをトレハローズ（ｔｒｅｈａｌｏ ｓｅ）の存在のもとで氷点以上て乾燥することによって行われることからなる蛋 白質および他の高分子の保護方法。 ２．水を含んだシステムが０．０５〜２０重量％のトレハローズを含んでいる特 許請求の範囲第１項記載の方法。 ３．トレハローズの蛋白質または他の高分子に対する割合いが重量で少なくとも １．４：１である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４．蛋白質または他の高分子が、酵素、血清、血清補体、抗体または抗原（フリ ーなものと支持体に結合しているもの両方）、蛍光性蛋白質、ワクチン構成成分 またはポリサッカリドである特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５．システムが周囲温度またはそれ以上で大気圧で乾燥されることからなる特許 請求の範囲第１項記載の方法。 ６．少なくともそれぞれ１．４：１の重量比にあるトレハローズと蛋白質または 他の高分子を含んでいる乾燥生成物。 ７．乾燥生成物が、酵素、血清補体、抗体または抗原（フリーでも支持体に結合 していてもどちらでも）、蛍光性蛋白質、ワクチン構成成分またはポリサッカリ ドを合んでいる特許請求の範囲第６項記載の乾燥生成物。 ８．トレハローズの存在下て乾燥された少なくとも１個以上の接着している抗体 を持つているプレート。 ９．クレーム１による方法において用いるように、トレハローズで含浸されてい る多孔質基質。 １０．５〜２５％重量のトレハローズを含んでいる特許請求の範囲第９項記載の 多孔質基質。 １１．セルローズまたはガラスーベース紙、多孔質プラスチックフィルム、また は織物からなる特許請求の範囲第９項記載の多孔質基質。