KR102095365B1 - 폴리디아세틸렌 분자를 포함하는 리포좀 및 이의 용도 - Google Patents

폴리디아세틸렌 분자를 포함하는 리포좀 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폴리디아세틸렌 분자를 포함하는 지질 이중층을 포함하는 리포좀에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 리포좀을 포함하는 칼슘 이온 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 칼슘 이온 검출용 센서, 상기 조성물을 이용한 칼슘 이온 검출 방법 및 상기 센서를 포함하는 칼슘 관련 질환 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 칼슘 이온 검출용 조성물은 칼슘 이온에 대한 선택성이 높고 검출 한계가 낮아 우수한 감도를 가지므로, 다른 양이온의 간섭 없이 칼슘 이온을 효과적으로 검출할 수 있는 우수한 성능을 나타낼 수 있다.

Description

폴리디아세틸렌 분자를 포함하는 리포좀 및 이의 용도{Liposomes comprising polydiacetylene molecules and uses thereof}
본 발명은 폴리디아세틸렌(polydiacetylene: PDA) 분자를 포함하는 지질 이중층을 포함하는 리포좀에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 리포좀을 포함하는 칼슘 이온 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 칼슘 이온 검출용 센서, 상기 조성물을 이용한 칼슘 이온 검출 방법 및 상기 센서를 포함하는 칼슘 관련 질환 진단용 키트에 관한 것이다.
환경 모니터링을 위한 비색 센서 활용기술은, 크게 나노 입자(nanoparticle), 유기염료(organic dye), 소포(vesicle), 어레이(array)를 이용하는 4가지 분야에서 연구가 계속 진행 중에 있다. 구체적으로, Cu, Hg, Cd 를 포함하는 중금속과 같은 인체 유해 물질이나, 농약 등을 포함하는 유기 화학 물질, 그리고 아미노산과 단백 질 등의 바이오 물질의 검출 등의 다양한 부분에서 연구가 계속 진행 중에 있다.
미국, 유럽, 일본, 중국 등 세계의 많은 연구자들이 비색 센서를 이용하여 방향족 이성질체(aromatic isomers), 엡타머, 항체, 덴드리머, 유기염료 등의 고성능 리셉터 및 지지체의 연구 개발에 매진하고 있으며[Acs Nano, 4(2010) 6387-6394], 식품 유해물질 검출, 유해 화학물질 검출 등을 탐지할 수 있는 각종 나노 입자를 이용한 원천 기술을 얻기 위해 연구를 진행하고 있다. 유해 물질들을 측정하기 위한 센서 기술은, 오염사고 현장이나 유해 물질에 의하여 오염된 환경 주변에서 검출 하고자 하는 다양한 유해 물질의 성분들을 신속하게 분석 및 검출하고, 환경오염 물질 또는 유해 물질들이 확산 되기 전에 모니터링 함으로써 유해 물질들을 제거할 수 있도록 하며, 유해 물질의 실시간 측정과 지속적 관리를 가능하게 하는 핵심 요소 기술이다.
한편, 칼슘 이온(Ca2 +)은 신경 전달 물질 방출, 시냅스 가소성, 유전자 발현, 미토콘드리아 대사, 세포 사멸을 비롯한 다양한 생물학적 활동에 관여한다. 일반적으로, 혈청 내 칼슘 이온 농도는 2.1 mM 내지 2.6 mM 사이로 유지되며 그 변화의 폭이 매우 작다. 때문에 칼슘 이온 농도의 변화는 생체 내에 심각한 질병이 발생하였음을 의미하며, 악성 종양, 부갑상선 기능항진증과 같은 질병의 바이오 마커로서 혈청의 칼슘 이온 농도가 사용되어 왔다. 따라서 칼슘 이온 농도의 정확하고 신속한 측정은 매우 중요하며, 검출 한계가 낮아 적은 양도 민감하게 검출할 수 있는 센서는 매우 유용한 수단이 된다.
칼슘 이온 농도가 질병 지표로서 중요하게 작용한다는 점을 고려하여, 원자 흡광 광도법(atomic absorption spectroscopy), 이온 선택성 전극 및 형광 측정법(ion-selective electrodes and fluorometric probes)을 사용하는 몇가지의 검출 방법이 개발되어 왔다. 그러나, 종래의 검출 방법은 분석 방법이 지나치게 복잡하고 많은 비용이 요구되는 한계점이 있었다. 이에, 저렴하면서도 간단하고 신속하게 칼슘 이온을 검출할 수 있는 방법의 개발이 요구되는 실정이다.
상기와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 두 종류의 디아세틸렌 분자를 중합시켜 제조한 신규한 폴리디아세틸렌 리포좀을 제조하였으며, 이를 이용하여 다른 양이온의 간섭 없이 혈청 내 칼슘 이온을 높은 정확도로 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 Phos-DA[2-(pentacosa-10,12-dienamido)ethyl dihydrogen phosphate] 및 PCDA[10,12-pentacosadiynoic acid]가 중합된 폴리디아세틸렌 분자를 포함하는 지질 이중층을 포함하는 리포좀을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 리포좀을 포함하는 칼슘 이온 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 칼슘 이온 검출용 센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 칼슘 이온 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 칼슘 이온 검출용 센서를 포함하는 칼슘 관련 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 양태는 폴리디아세틸렌 분자를 포함하는 지질 이중층을 포함하고, 상기 폴리디아세틸렌 분자는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물[2-(pentacosa-10,12-dienamido)ethyl dihydrogen phosphate, 이하 'Phos-DA'와 혼용함] 및 화학식 2로 표시되는 화합물[10,12-pentacosadiynoic acid, 이하 'PCDA'와 혼용함]이 중합된 것인 리포좀을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112018100997065-pat00001
[화학식 2]
Figure 112018100997065-pat00002
본 발명에서는 칼슘 이온의 검출을 위한 물질로서 인산기와 카복실기가 공존하는 폴리디아세틸렌 분자를 개발하였다. 인산기와 칼슘 이온은 배위 결합을 이룰 수 있으며 이들이 형성한 인산-칼슘 복합체는 안정성이 우수하지만, 인산기는 칼슘 이온 외의 다른 금속 이온과도 결합 형성이 가능하므로 다양한 양이온이 혼재하는 시료 내에서 칼슘 이온만을 선택적으로 검출하고자 할 때 다른 양이온의 간섭에 의해 검출 신뢰도가 낮아지는 한계점이 있다. 본 발명에서는 인산기와 카복실기를 모두 포함하는 폴리디아세틸렌 리포좀을 이용함으로써 칼슘 이온만을 선택적으로 검출하는 것이 특징으로서, 인산기와 카복실기는 각각 칼슘 이온에 대해 월등히 높은 친화력을 보유하지는 않으나 이들을 적절히 혼합하여 사용함으로써 칼슘 이온에 대한 친화력이 현저히 높아진다는 기술적 사상에 기초하며, 이는 본 발명자들이 최초로 규명한 것이다.
본 발명에 있어서, "폴리디아세틸렌(polydiacetylene) 분자"는 Phos-DA와 PCDA가 중합된 화합물일 수 있다. 상기 "폴리디아세틸렌"은 3중 결합이 번갈아 있는 디아세틸렌(diacetylene) 단량체의 고분자를 의미한다. 디아세틸렌 단량체가 자외선에 노출되는 경우 화학적 개시제나 촉매 없이도 인접한 디아세틸렌 간의 1,4-첨가 반응을 통해 중합이 이루어지며, 그 결과 엔-인(ene-yne) 결합이 교대로 나타나는 구조의 중합체가 형성된다.
상기 Phos-DA와 PCDA는 모두 디아세틸렌기를 가지는 화합물이며, 본 발명에서는 Phos-DA와 PCDA가 디아세틸렌기 사이의 1,4-첨가 반응으로 이들을 중합하여 공유 결합으로 연결되어 있는 구조의 폴리디아세틸렌 분자를 제조하였다. 상기 Phos-DA 및 PCDA의 중합 반응은 자외선 조사, 예컨대 220 nm 내지 300 nm, 또는 254nm 파장의 자외선 조사에 의해 유발될 수 있다.
본 발명에서 폴리디아세틸렌 분자는 이를 포함하는 지질 이중층을 구성하여 리포좀(liposome) 형태의 소포를 형성할 수 있다. 상기 "리포좀"은 포집된 수성 매질을 포함하는 지질 이중층(lipid bilayer membrane)을 포함하는 완전히 폐쇄된 구조이다. 지질 이중층은 소수성 꼬리(tail) 영역과 친수성 머리(head) 영역을 갖는 2개 지질 단일층(monolayer)로 구성되는데, 지질 단일층에서 소수성 꼬리는 이중층의 중심쪽으로 향하여 배열되어 있고, 친수성 머리는 수성상쪽으로 향하여 배열되어 있다.
본 발명에서 Phos-DA 및 PCDA의 디아세틸렌기 사이의 중합 반응으로 제조된 폴리디아세틸렌 분자는 지질 이중층에 포함되어 리포좀을 이룰 수 있으며, 이는 소수성 부분인 교대 엔-인 구조가 지질 이중층의 내부에 서로 맞닿아 있고 친수성 부분인 인산기 및 카복실기가 지질 이중층의 외막 및 내막에 위치하는 구조일 수 있다.
본 발명의 리포좀에서 폴리디아세틸렌 분자에 포함된 인산기와 카복실기는 칼슘 이온과 배위 결합을 이룰 수 있다. 구체적으로, 상기 인산기는 중합 반응 전 Phos-DA에 포함되어 있던 작용기일 수 있고, 카복실기는 중합 반응 전 PCDA에 포함되어 있던 작용기일 수 있다. 폴리디아세틸렌 분자에 함유된 인산기 및 카복실기는 랜덤(random) 또는 교차(alternating)로 반복될 수 있고, 구체적으로 인산기 및 카복실기가 서로 교차하면서 존재할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 폴리디아세틸렌 분자는 인산기 및 카복실기가 함께 칼슘 이온과의 배위 결합을 형성한다는 점에서, 입체 장애(steric constraint)가 감소하고 인식 부위(recognition site)가 많아지므로, 인산기 및 카복실기가 이루는 배위 결합은 칼슘 이온에 대한 친화력이 매우 높게 나타난다. 이에, 다른 양이온의 간섭을 받지 않고 칼슘 이온을 선택적으로 검출하는 것이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에서는, Phos-DA 또는 PCDA를 단독으로 중합하여 제조한 리포좀을 사용하였을 때는 칼슘 이온의 선택적 검출이 어려우며 리포좀의 응집이 발생하는 문제가 있었으나, Phos-DA 및 PCDA를 함께 중합하여 제조한 본 발명의 리포좀의 경우 혈청 내 칼슘 이온을 높은 선택성으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 리포좀은 칼슘 이온과 결합시 630 내지 670 nm에서의 흡광도 대비 520 내지 560 nm에서의 흡광도 값이 증가하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 리포좀은 630 내지 670 nm에서 최대흡수파장을 갖는 청색(blue)을 띨 수 있으며, 외부 자극을 받아 520 내지 560 nm의 최대흡수파장을 띠는 자색(purple)으로 색전이(colorimetric　response)될 수 있다. 색전이 정도는 폴리디아세틸렌 분자에 존재하는 π 결합의 길이와 이에 따라 분자들이 취하는 구조에 따라 달라질 수 있는데, 구체적으로 본 발명에서 폴리디아세틸렌 분자의 인산기 및 카복실기가 칼슘 이온과 배위 결합을 형성하고, 이로 인해 폴리디아세틸렌 분자의 주골격(backbone)인 엔-인 결합에 움직임(perturbation)이 발생함으로써 상기와 같은 청색-자색 색전이가 일어날 수 있다(도 11).
구체적으로, 630 내지 670 nm, 또는 약 642 nm에서 최대흡수파장을 가지는 청색으로부터, 520 내지 560 nm, 또는 약 543 nm에서 최대흡수파장을 가지는 자색으로 색전이가 나타날 수 있다. 즉, 칼슘 이온과 배위 결합을 형성함으로써 배위 결합 이전과 비교하여 약 642nm의 흡광도 대비 약 543 nm의 흡광도 값이 증가하게 된다.
본 발명의 리포좀에 포함된 폴리디아세틸렌 분자는 Phos-DA와 PCDA가 중량 기준으로 2 : 1 내지 1 : 2로 혼합되어 중합된 것일 수 있다.
구체적으로, 중합 전 Phos-DA 및 PCDA의 혼합 비율에 따라 이로부터 제조된 리포좀의 칼슘 이온 검출능이 달라질 수 있으며, 상기 Phos-DA 및 PCDA의 혼합 비율은 검출하고자 하는 시료의 종류, 검출 환경, 시료에 포함된 칼슘 이온의 농도 등에 따라 당업자가 적절한 혼합 비율을 선택할 수 있다. 구체적으로, 칼슘 이온 검출의 시료가 혈청(serum)일 경우, 리포좀에 포함되는 폴리디아세틸렌 분자의 제조를 위한 Phos-DA 및 PCDA의 혼합 비율은 6 : 1 내지 1 : 6, 4 : 1 내지 1 : 4, 구체적으로 2 : 1 내지 1 : 2, 또는 1 : 1의 몰비일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 Phos-DA 및 PCDA를 다양한 비율로 혼합하여 리포좀을 제조한 결과, 이들을 1 : 1로 혼합하였을 때 혈청 내 칼슘 이온의 검출에 가장 적합하다는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 양태는 상기 리포좀을 포함하는 칼슘 이온 검출용 조성물을 제공한다.
"리포좀"은 전술한 바와 같다.
본 발명의 칼슘 이온 검출용 조성물의 검출 가능 농도는 0.97 내지 60 μM일 수 있다. 구체적으로, 칼슘 이온 농도가 0.97 내지 60 μM에 포함될 경우에는 상기 범위 내에서 칼슘 이온 농도가 증가할수록 폴리디아세틸렌 분자와의 배위 결합이 증가하고 또한 630 내지 670 ㎚에서의 흡광도 대비 520 내지 560 ㎚에서의 흡광도 값, 예컨대 642 ㎚에서의 흡광도 대비 543 ㎚에서의 흡광도 값(A543/A642)이 비례하여 증가하게 되므로, 상기 값을 계산함으로써 칼슘 이온 농도를 도출할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 일 실시예에서는, 칼슘 이온 농도 대비 A-A0 값을 나타낸 적정 곡선을 도출하였으며, 이의 반응식은 다음과 같다.
Figure 112018100997065-pat00003
상기 반응식에 시료의 흡광도 값을 측정하여 y값에 대입함으로써 시료에 함유되어 있는 칼슘 이온의 농도인 x값을 도출할 수 있다.
본 발명의 칼슘 이온 검출용 조성물의 검출 한계는 0.1 내지 1.0 μM에 있을 수 있고, 보다 구체적으로 약 0.97 μM일 수 있다.
따라서, 본 발명의 칼슘 이온 검출용 조성물은 칼슘 이온의 농도가 약 2.45 mM인 혈청 시료의 검출을 위해 적절하게 사용될 수 있으며, 이외에도 약 0.97 μM의 칼슘 이온이 포함된 시료에서 칼슘 이온 검출 용도로 사용될 수 있다.
상기 혈청은 인간, 말, 래트, 마우스, 당나귀 등을 포함하는 포유동물의 혈청일 수 있으며, 구체적으로 인간의 혈청일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 양태는 상기 칼슘 이온 검출용 조성물을 포함하는 칼슘 이온 검출용 센서를 제공한다.
본 발명의 칼슘 이온 검출용 센서는 검출 한계가 0.1 내지 1.0 μM에 있어 매우 우수한 감도를 보일 수 있다. 또한, 상기 센서는 다른 양이온에 대한 간섭효과가 전혀 나타나지 않아 칼슘 이온을 포함하는 혼합물에 사용하였을 때 칼슘 이온에 대한 우수한 선택성을 보일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 상기 칼슘 이온 검출용 센서에 시료를 접촉하는 단계를 포함하는 칼슘 이온 검출 방법을 제공한다.
"칼슘 이온 검출용 센서"는 전술한 바와 같다.
본 발명에 있어서, "접촉"은 칼슘 이온 검출용 조성물과 리포좀과 시료를 액체 매질 중에서 혼합하는 것일 수 있고, 상기 혼합은 교반 또는 교반하지 않고 이루어질 수 있다. 상기 매질은 수성 매질일 수 있고, 예를 들어, 물 또는 인산 완충 용액(phosphate buffered saline: PBS)과 같은 버퍼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 칼슘 이온 검출 방법은 청색에서 자색으로의 색전이를 관찰하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 630 내지 670㎚에서의 흡광도 및 520 내지 560㎚에서의 흡광도를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 630 내지 670㎚에서의 흡광도 대비 520 내지 560㎚에서의 흡광도 값으로부터 칼슘 이온 농도를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 642nm에서의 흡광도 대비 543nm에서의 흡광도 값(A543/A642)을 계산하고, 이를 적정하여 칼슘 이온 농도를 계산할 수 있다.
본 발명의 칼슘 이온 검출 방법은 특히 혈청을 시료로 하여 혈청 내에 포함된 칼슘 이온을 우수한 선택성으로 검출할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 칼슘 이온 검출용 센서를 포함하는 칼슘 관련 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 의해 진단될 수 있는 칼슘 관련 질환은 고칼슘혈증일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 고칼슘혈증은 그 자체로 피로, 우울, 정신착란(confusion), 식욕감퇴, 멀미, 구토, 변비, 췌장염 또는 증가된 배뇨를 초래할 수 있다. 만성 고칼슘혈증의 경우, 비뇨기계 결석(urinary calculi)(예컨대, 신장 결석 또는 담낭 결석)을 유발할 수 있다. 비정상적인 심장 박동, 짧은 QT 간격 및 넓은 T 파장의 심전도(electrocardiogram)를 통해 간접적으로 고칼슘혈증을 추측할 수 있다.
구체적으로, 상기 칼슘 관련 질환은 악성 종양(malignant tumors), 부갑상선 기능항진증(hyperparathyroidism), 우유 알칼리 증후군(milk-alkali syndrome), 갑상선 기능항진증(hyperthyroidism), 말단 비대증(acromegaly), 다발성골수종(multiple myeloma), 림프종, 백혈병, 폐암, 신장암, 유방암, 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 경구암, 자궁근종, 크롬친화세포종(pheochromocytoma), 비타민 D-대사 질환(vitamin D-metabolic disorders), 만성신부전증, 부신부전(adrenal insufficency), 신장이식, 가족성 양성 고칼슘혈증(familial benign hypercalcemia), 뼈의 파제트병(Paget's disease), 사르코이드증, 결핵, 히스토플라스마증, 콕시디오이데스 진균증(coccidiodomycosis) 및 인산-감소 증후군(phosphate-depletion syndrome)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 칼슘 이온 검출용 조성물은 칼슘 이온에 대한 선택성이 높고 검출 한계가 낮아 우수한 감도를 가지므로, 다른 양이온의 간섭 없이 칼슘 이온을 효과적으로 검출할 수 있는 우수한 성능을 나타낼 수 있다.
도 1은 PCDA로부터 Phos-DA를 합성하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 PCDA 및 Phos-DA를 혼합하여 리포좀을 제조하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 혈청 내 금속 이온 용액 내에서 Phos-DA 및 PCDA로 제조한 리포좀의 색상을 나타낸 것이다.
도 4는 혈청 내 금속 이온 용액 내에서 다양한 비율로 Phos-DA 및 PCDA를 혼합하여 제조한 리포좀의 색상을 나타낸 것이다.
도 5는 Ca2 + 및 Cu2 +가 (a) 10 μM 및 (b) 50 μM일 때의 다양한 비율로 Phos-DA 및 PCDA를 혼합하여 제조한 리포좀의 흡광도 변화를 나타낸 것이다(A0: 금속 이온 부존재 하 543 nm 및 642 nm에서의 흡광도 비, A: 금속 이온 존재 하 543 nm 및 642 nm에서의 흡광도 비).
도 6은 (a) Ca2 + 첨가 후 리포좀의 UV-Vis 스펙트럼, 및 (b) Ca2 +의 농도별 리포좀의 543 및 642 nm에서의 흡광도 비를 나타낸 것이다.
도 7은 Ca2 + 농도 변화에 따른 흡광도 변화를 나타낸 것이다(A0: 금속 이온 부존재 하 543 nm 및 642 nm에서의 흡광도 비, A: 금속 이온 존재 하 543 nm 및 642 nm에서의 흡광도 비).
도 8은 Ca2 + 존재 또는 부존재 하 PC-PDA의 크기 분포를 나타낸 것이다.
도 9는 Ca2 + 존재 또는 부존재 하 PC-PDA의 라만 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10은 (a) 금속 이온 첨가 1시간 후 543 nm 및 642 nm에서의 흡광도, 및 (b) 금속 이온 존재 또는 부존재 하에서의 용액의 색상을 나타낸 것이다.
도 11은 Ca2 + 존재 하 폴리디아세틸렌 분자의 주골격에 발생하는 움직임을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 재료 및 기기
1-1. 재료
PCDA(10,12-Pentacosadiynoic acid) 및 O-포스포릴에탄올-아민(O-phosphorylethanol-amine)은 Sigma-Aldrich에서 구입하여 추가 정제없이 사용하였다. 금속 과염소산염(Ca2 +, Mg2 +, Zn2 +, Cu2 +, Na+, K+, Fe3 +, Ag2 +, Hg2 +, Pb2 +, Mn2 +, Ba2+, Cd2 +, Co2 + 및 Ni2 +)은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 소태아혈청(fetal bovine serum: FBS)은 Hyclone에서 구입하였다. 말, 래트, 마우스 및 당나귀의 혈청은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. Amicon Ultra-0.5 원심분리 필터(3 kDa) 장치는 Millipore로부터 입수하였다.
1-2. 기기
NMR 스펙트럼은 s(singlet), d(doublet), t(triplet), q(quartet) 및 m(multiplet)과 같은 분할 패턴을 갖는 JEOL(400 MHz) NMR 분광기를 사용하여 얻었다. Agilent ESI-Q/TOF(quadrupole/time-of-flight) 질량 분석기를 사용하여 질량 스펙트럼을 얻었다. UV-Vis 분광법을 JASCO V-630 분광 광도계로 모니터링하였다. 동적광산란법(dynamic light scattering: DLS)은 OTSUKA ELS-Z를 사용하여 측정하였다. 라만 스펙트럼(raman spectra)은 785 nm 레이저 소스에 의해 여기되어 QE65 프로 라만 분광기(Ocean Optics)로 기록하였다. Perkin Elmer OPTIMA 8300의 유도결합플라즈마 원자방출분광기(inductively coupled plasma atomic emission spectrometer: ICP-AES)를 실험에 사용하였다.
실시예 2. PCDA로부터 Phos -DA의 합성
도 1에 나타난 바와 같이, PCDA로부터 2단계에 걸쳐 Phos-DA를 합성하였다.
2-1. PCDA - NHS (2,5- dioxopyrrolidin -1- yl pentacosa -10,12- diynoate )의 합성
20mL의 DCM 중 PCDA 용액(1.5 g, 4 mmol)에 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, 0.55 g, 4.8 mmol) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드히드로클로라이드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride, 0.92 g, 4.8 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1일 동안 교반하고 감압 하에서 증발시킨 후, Et2O(2×50 mL)로 희석하였다. 유기 층을 회수하고 H2O, 염수로 세척한 후 MgSO4 상에서 건조시키고 여과하였다. 여액을 감압 하에 증발시켜 PCDA-NHS를 백색 고체로서 수득하였다(1.8g, 95%).
- mp: 69 - 70 ℃
- 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 2.84 (d, J = 4.6 Hz, 4H), 2.60 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.24 (t, J = 6.9 Hz, 4H), 1.80-1.69 (m, 2H), 1.55-1.45 (m, 4H), 1.43-1.21 (m, 26H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 3H)
2-2. Phos -DA(2-( pentacosa -10,12- dienamido )ethyl dihydrogen phosphate)의 합성
5 mL의 H2O 중 O-포스포릴에탄올아민(O-phosphorylethanolamine, 0.18 g, 1.3 mmol) 및 NaHCO3(0.25 g, 3 mmol)의 용액에 8 mL의 THF 중 PCDA-NHS(0.47 g, 1 mmol)를 N2 하에서 적가하고 실온에서 28시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0.1N HCl로 pH 2로 산성화시키고 DCM으로 세척하였다. 수성 층을 회수하고 MeOH를 첨가하고, 침전물을 여과하고 MeOH로 세척하여 Phos-DA를 푸른색 고체로서 수득하였다(0.3g, 60%).
- 1H-NMR (400 MHz, 0.1 M NaOD in D2O : THF-d 8 = 1:1): δ 3.99 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 3.55 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 7.3 Hz, 6H), 1.81-1.71 (m, 2H), 1.71-1.62 (m, 4H), 1.61-1.41 (m, 26H), 1.07 (t, J = 6.4 Hz, 3H)
- 13C-NMR (100 MHz, 0.1 M NaOD in D2O : THF-d 8 = 1:1) δ 175.92, 77.52, 76.85, 65.88, 65.51, 62.75, 62.71, 40.88, 40.80, 36.19, 32.15, 29.83, 29.78, 29.69, 29.64, 29.55, 29.30, 29.27, 29.16, 28.94, 28.77, 28.61, 25.96, 22.86, 18.97, 18.93, 13.87
- ESI-MS(m/z): C27H47NO5P [M - H]-에 대한 계산치 496.3197; 실측치 496.3193
실시예 3. Phos -DA 및 PCDA를 포함하는 리포좀 (이하, 'PDA 리포좀 ') 제조
두 가지의 단량체로 구성된 PDA 리포좀의 제조를 위해, 10 mM의 CHCl3 내에서 Phos-DA와 PCDA를 다양한 비율(1 : 0, 7 : 1, 3 : 1, 1 : 1, 1 : 3, 1 : 7, 0 : 1)로 바이알에서 혼합하였다. N2를 불어넣어 CHCl3를 증발시키고, pH 8.0의 20 mM HEPES-HCl 10 mL에 재현탁시켰다. 용액을 80℃에서 20분 동안 초음파 처리하고 분산된 용액을 여과하여 응집체를 제거하였다. 혼합물을 원추형 튜브에 옮기고 4℃에서 12시간에 걸쳐 배양하였다. 배양 후, 254 nm의 UV(6 Wcm- 2)를 4분 동안 조사하여 단량체를 중합시켰다(도 2).
실험예 1. Phos -DA 및 PCDA의 혼합 효과 및 최적의 혼합 비율
1-1. Phos -DA와 PCDA의 혼합 효과
Phos-DA와 PCDA의 시너지 효과를 확인하기 위해, 다양한 금속 이온(Ca2 +, Mg2+, Zn2 +, Cu2 +, Na+, K+, Fe3 +, Ag2 +, Hg2 +, Pb2 +, Mn2 +, Ba2 +, Cd2 +, Co2 + 및 Ni2 +)을 10 μM 및 50 μM로 준비하고, 다양한 비율(1 : 0, 7 : 1, 3 : 1, 1 : 1, 1 : 3, 1 : 7, 0 : 1)로 혼합하여 중합시킨 20 mM HEPES-HCl(pH 7.4) 중의 PDA(100 μM)에 첨가하고 용액의 색전이를 육안으로 관찰하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, Phos-DA만으로 제조한 리포좀은 Ca2 +, Mg2 +, Zn2 + 등 몇가지 금속을 50 μM 농도로 사용하였을 때 응집 현상이 발생하였고, PCDA만으로 제조한 리포좀의 경우 10 μM 및 50 μM 모두에서 전혀 변화가 나타나지 않았다. 이러한 결과로부터, 인산기 또는 카복실기는 단독적으로는 Ca2 +를 선택적으로 검출할 수 없어, 인산기 및 카복실기의 조합이 필수적임을 알 수 있었다.
Mg2 +과 Ca2 + 모두 혈청에 풍부하게 존재하고, 종래 알려진 Ca2 + 검출 방법 대부분에서 Mg2 +에 의한 간섭이 관찰되기 때문에, Mg2 +에 대한 Ca2 +의 선택성은 결정적인 요인이다. 그러나, Phos-DA 및 PCDA를 단독으로 사용한 경우 Mg2 +에 대한 Ca2 +의 선택성이 나타나지 않아서, Ca2 +만을 선택적으로 검출하기에는 부족한 것을 알 수 있었다.
반면, 도 4에서 보듯이, Phos-DA와 PCDA를 혼합하여 제조한 PDA 리포좀에서는 다양한 혼합 비율에서 Mg2 +에 의한 간섭 없이 Ca2 +를 효율적으로 검출할 수 있었다. Pb2 +, Mn2 +, Cd2 + 등 일부 금속에서도 색전이가 나타났지만, 이러한 금속은 혈청의 주요 금속이 아니기 때문에 혈청 내 Ca2 +의 검출에는 중대한 영향을 미치지 않을 것이므로, Phos-DA와 PCDA를 혼합하여 제조한 PDA 리포좀을 이용하여 혈청 내 Ca2 +를 선택적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
1-2. Phos -DA 및 PCDA의 최적의 혼합 비율
Mg2 +에 대한 Ca2 +의 선택성은 두 단량체(Phos-DA, PCDA)의 조합에 의해 유지되었지만, 주요 혈청 금속 이온의 하나인 Cu2 +를 첨가하였을 때에도 색전이가 관찰되었다. Cu2+에 대한 Ca2 +의 선택적 검출을 위한 Phos-DA 및 PCDA의 최적의 혼합 비율을 찾기 위해, Ca2 + 및 Cu2 +의 존재 하에서 Phos-DA 및 PCDA의 혼합 비율을 변경하면서 543 nm 및 642 nm에서의 흡광도 비의 변화를 평가하였다.
구체적으로, 다양한 비율의 PDA(100 μM)를 함유한 pH 8.0의 20 mM HEPES-HCl에 Ca2 + 및 Cu2 +(10 및 50 μM)를 첨가하고 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 UV-Vis 스펙트럼을 측정하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, Ca2 + 및 Cu2 +의 농도가 50 μM일 때, 모든 혼합 비율에서 Cu2 +보다 Ca2 +에 대한 민감한 반응이 나타났다. 금속 이온 농도가 10 μM일 때에도 마찬가지로 대부분의 혼합 비율에서 Ca2 +에 대한 높은 선택성을 보였으며, 특히 Phos-DA와 PCDA의 혼합 비율이 1 : 1일 때 Cu2 +에 비하여 Ca2 + 검출이 두드러지게 나타남을 확인하였다.
실험예 2. PDA 리포좀의 Ca 2 + 검출 한계
Ca2 + 검출 한계를 평가하기 위해 다양한 농도의 Ca2 +에서 흡광도의 변화를 모니터링했다. 구체적으로, 다양한 농도의 Ca2 +(0, 1, 2, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 μM)를 PC-PDA(100 μM)를 포함하는 HEPES 완충액(20 mM, pH 8.0)에 첨가하였다. 1시간 동안 배양한 후, UV-Vis 분광 광도계로 흡광도를 측정하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, Phos-DA와 PCDA를 중합시킨 PDA 리포좀은 642 nm에서의 흡광도가 높게 나타났다. Ca2 +를 첨가한 후, Ca2 + 농도에 비례하여 642 nm에서의 흡광도는 점차 감소하였고, 543 nm에서의 흡광도는 점차 증가하였다. 이러한 흡광도의 변화를 통해, PDA 리포좀의 청색-자색 색전이(blue-to-purple color transition)가 동반되었음을 확인하였다. 약 60 μM의 Ca2 +를 첨가한 이후에는 색전이가 포화 상태에 이르렀다. 이를 적정한 결과로부터, Ca2 + 검출 한계는 약 0.97 μM인 것을 계산하였다(도 7).
상기 결과로부터, Phos-DA와 PCDA를 중합하여 제조한 PDA 리포좀은 Ca2 + 검출 한계가 우수하며, 혈청 내의 Ca2 + 농도가 약 2 mM임을 고려할 때 혈청 내 Ca2 +를 검출하기에 충분하게 적용될 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 3. PDA 리포좀의 Ca 2 + 검출 메커니즘 연구
PDA 리포좀의 크기 변화를 측정하여 Ca2 + 검출의 메커니즘을 확인하였다. 구체적으로, PC-PDA(100 μM)를 함유한 HEPES 완충액(20 mM, pH 8.0)에 Ca2 +(60 μM)을 첨가하였다. 1시간 배양한 후, 혼합물을 5배 희석하고 25 ℃에서 DLS를 측정하였다. 50회 측정하여 평균 값으로부터 결과를 도출하였다. 라만 스펙트럼을 모니터하기 위해, Ca2 +(200 μM)를 PC-PDA(500 μM)에 첨가하고 1시간동안 배양하였다. 배양 후, PC-PDA를 785 nm 레이저로 여기시키고, Ca2 +의 존재 및 부존재 하에서의 라만 스펙트럼을 측정하였다.
DLS 결과, Ca2 +가 없는 경우 PDA 리포좀의 평균 크기는 131.3 nm로 나타났다. 반면, PDA 리포좀에 Ca2 +(60 μM)을 첨가한 후 평균 크기는 144.1 nm였다(도 8). PDA 리포좀의 응집 및 집합체에 의한 검출의 경우 리포좀의 크기가 몇배 이상 상승하였을 것이다. 이러한 결과를 바탕으로, 본 발명의 PDA 리포좀의 색전이에 의한 Ca2+ 검출은 PDA 리포좀의 응집이 아닌 주골격(backbone)의 움직임(perturbation)으로부터 유도된 것임을 알 수 있었다.
라만 스펙트럼을 분석하여 Ca2 +의 첨가시 PC-PDA 주골격의 전자 구조를 관찰하였다(도 9). PC-PDA는 Ca2 +가 없는 상태에서 785 nm 레이저를 사용하여 여기되었고, 탄소의 이중 결합인 1449 cm-1 및 삼중 결합인 2081 cm-1에서 피크가 나타났다. 이는 청색 영역에서 PDA 주골격의 피크를 나타낸다. Ca2 +의 첨가 후, 적색 영역의 PDA에 해당하는 1515 cm-1 및 2118 cm-1에서 강도가 증가하였다. 이러한 피크의 이동은 Ca2 +를 첨가한 후에 주골격의 전자 특성의 변화에 의해 유도되었다. 즉, Ca2 + 첨가에 의한 주골격의 움직임은 PC-PDA에서 청색에서 자색으로의 색전이를 유도하였다.
실험예 4. 혈청 내 주요 금속에 대한 Ca 2 + 의 선택성
혈청 내 Ca2 + 검출시 혈청 중 주요 금속에 의한 간섭을 확인하였다. Phos-DA(50 μM) 및 PCDA(50 μM)를 함유한 HEPES 완충액(20 mM, pH 8.0)에 주요 혈청 금속(Ca2+, Mg2 +, Zn2 +, Cu2 +, Na+, K+, Fe3 +, 60 μM)을 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 혼합물의 흡광도를 UV-Vis 분광 광도계로 모니터링하였다.
혈청 내 Ca2 + 검출시 혈청 중 주요 금속에 의한 간섭을 확인하였다. Phos-DA(50 μM) 및 PCDA(50 μM)를 함유한 HEPES 완충액(20 mM, pH 8.0)에 주요 혈청 금속(Ca2+, Mg2 +, Zn2 +, Cu2 +, Na+, K+, Fe3 +, 60 μM)을 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 혼합물의 흡광도를 UV-Vis 분광 광도계로 모니터링하였다.
인간의 혈청 내에 포함된 금속 이온의 농도가 Ca2 +(~2.45 mM), Mg2 +(~0.9 mM), Zn2 +(~10 μM), Cu2 +(~1 μM), Na+(~145 mM), K+(~4.11 mM), Fe3 +(~22 μM)임을 고려할 때, Zn2 +, Cu2 + 및 Fe3 +로부터의 간섭은 혈청 샘플에서 Ca2 +의 검출에 결정적으로 영향을주지 않을 것임을 도출하였다. 또한, PDA 리포좀을 실제 검출에 적용하기 위해서는 혈청 샘플의 Ca2 + 농도를 검출 가능한 범위 내로 설정하기 위해서는 100배 이상 희석해서 사용해야 하는데, 이 경우 금속 이온의 농도는 약 10-220 nM에 불과하므로, 혈청에서의 Ca2+ 검출을 방해하지는 않을 것임을 알 수 있었다.
실험예 5. 혈청 내 Ca 2 + 검출에의 적용
실제 혈청 내 Ca2 +를 검출하기 위한 적용 가능성을 시험하기 위해, 다양한 종류의 혈청을 사용하여 Ca2+ 농도를 측정해보았다.
혈청 샘플(FBS, 말, 래트, 마우스 및 당나귀 혈청)을 준비하였다. 정확한 농도를 분석하기 위해 단백질에 결합된 Ca2 +는 분리하였다. 구체적으로, 0.1N HCl을 사용하여 혈청을 pH 2로 산성화시키고, 80 ℃에서 3시간 동안 배양하였다. 간섭을 받은 단백질을 제거하기 위해, 용액을 14,000 x g에서 20분 동안 원심분리하여 3 kDa 원심분리 필터를 통과시켰다. 이어서, 처리된 혈청을 완충액으로 30배 희석시키고, PC-PDA(100 μM)를 함유한 HEPES(20 mM, pH 8.0) 0.9 mL에 희석된 혈청 0.1 mL를 넣었다. 혼합물을 1시간 동안 배양하고 543 및 642 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 상기 실험예 2의 칼슘 적정 결과로부터, Ca2 +의 농도를 도출하였다. 또한, ICP-AES를 사용하여 처리된 혈청 중의 Ca2 + 농도를 측정하였다. 그 결과는 표 1에 나타내었다.
ICP-AES (mM) PDA (mM)
FBS 3.72±0.06 3.34±0.07
말 2.91±0.02 2.75±0.04
래트 1.83±0.02 1.95±0.03
마우스 1.73±0.02 1.87±0.02
당나귀 2.63±0.03 2.77±0.17
상기 표 1에서 알 수 있듯이, 본 발명의 검출 방법과 ICP-AES 방법을 통한 결과는 낮은 오차(10% 이내) 내에서 유사한 결과를 나타내었다. 이는 본 발명의 검출 방법을 이용한 혈청 내 Ca2 + 검출 결과는 실제 결과와 일치한다는 것을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (18)

  1. 폴리디아세틸렌(polydiacetylene) 분자를 포함하는 지질 이중층을 포함하고,
    상기 폴리디아세틸렌 분자는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 화학식 2로 표시되는 화합물이 중합된 것인, 리포좀:
    [화학식 1]
    Figure 112018100997065-pat00004

    [화학식 2]
    Figure 112018100997065-pat00005
    .
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리디아세틸렌 분자는 화학식 1로 표시되는 화합물과 화학식 2로 표시되는 화합물이 중량 기준으로 2 : 1 내지 1 : 2로 혼합되어 중합된 것인, 리포좀.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리디아세틸렌 분자는 화학식 1로 표시되는 화합물과 화학식 2로 표시되는 화합물이 디아세틸렌기 사이의 중합 반응에 의하여 공유 결합으로 연결되어 있는 구조인, 리포좀.
  4. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 인산기와 화학식 2로 표시되는 화합물의 카복실기는 칼슘 이온과 배위 결합하는 것인, 리포좀.
  5. 제1항에 있어서, 상기 리포좀은 칼슘 이온 존재시 630 내지 670㎚에서의 흡광도 대비 520 내지 560㎚에서의 흡광도 값이 증가하는 것인, 리포좀.
  6. 제1항에 있어서, 상기 리포좀은 칼슘 이온 존재시 청색에서 자색으로의 색전이가 나타나는 것인, 리포좀.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 리포좀을 포함하는 칼슘 이온 검출용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조성물의 검출 가능 농도는 0.97 내지 70 μM인, 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 조성물의 검출 한계는 0.1 내지 1.0 μM에 있는 것인, 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 혈청 시료의 칼슘 이온을 검출하기 위해 이용되는 것인, 조성물.
  11. 제7항의 조성물을 포함하는 칼슘 이온 검출용 센서.
  12. 제11항의 센서에 시료를 접촉시키는 단계; 및
    청색에서 자색으로의 색전이를 관찰하고, 색전이가 관찰되는 경우 시료에 칼슘 이온을 함유하는 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 칼슘 이온 검출 방법.
  13. 삭제
  14. 제12항에 있어서, 630 내지 670 ㎚ 에서의 흡광도 및 520 내지 560 ㎚에서의 흡광도를 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 칼슘 이온 검출 방법.
  15. 제14항에 있어서, 630 내지 670 ㎚ 에서의 흡광도 대비 520 내지 560 ㎚에서의 흡광도 값으로부터 칼슘 이온 농도를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 칼슘 이온 검출 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 시료는 혈청인, 칼슘 이온 검출 방법.
  17. 삭제
  18. 제11항의 센서를 포함하는, 악성 종양(malignant tumors), 부갑상선 기능항진증(hyperparathyroidism), 우유 알칼리 증후군(milk-alkali syndrome), 갑상선 기능항진증(hyperthyroidism), 말단 비대증(acromegaly), 다발성골수종(multiple myeloma), 림프종, 백혈병, 폐암, 신장암, 유방암, 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 경구암, 자궁근종, 크롬친화세포종(pheochromocytoma), 비타민 D-대사 질환(vitamin D-metabolic disorders), 만성신부전증, 부신부전(adrenal insufficency), 신장이식, 가족성 양성 고칼슘혈증(familial benign hypercalcemia), 뼈의 파제트병(Paget's disease), 사르코이드증, 결핵, 히스토플라스마증, 콕시디오이데스 진균증(coccidiodomycosis) 및 인산-감소 증후군(phosphate-depletion syndrome)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의, 칼슘 관련 질환 진단용 키트.
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