CN117169190A - 一种用于特异性检测副溶血性弧菌的比色-sers双模式检测和光热杀菌的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于特异性检测副溶血性弧菌的比色‑SERS双模式检测和光热杀菌的方法及其应用，属于食品安全生物技术领域。本发明以副溶血性弧菌为靶标，通过层层组装制备了具备多功能的磁性复合纳米材料，首先能利用该磁性复合纳米材料的超顺磁分离性能结合磁泳色谱达到快速从复杂食品基质中分离细菌的效果；其次能利用该磁性复合纳米材料的比色和SERS传感信号对细菌进行短时间、高精度和高稳定性的双模式定量检测；最后能利用该磁性复合纳米材料的光热性能对检测到的细菌进行光热杀灭，从而完成检测后端的危害控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于特异性检测副溶血性弧菌的比色-SERS双模式检测和光热杀菌的方法及其应用，属于食品安全生物技术领域。
背景技术
副溶血性弧菌是一种嗜盐的革兰氏阴性细菌，能够在海洋或河口环境中自然生长。它是一种食源性致病菌，一般通过食用生的或未煮熟的水产品会导致感染，表现症状为急性胃肠炎和原发性败血症。随着全球变暖，海洋温度的升高直接导致弧菌的进一步增生和传播，副溶血性弧菌已成为世界范围内海产品食物中毒的主要原因。
关于副溶血性弧菌的检测主要集中在海产品中副溶血性弧菌的检测，而食品中副溶血性弧菌的传统检测方法存在诸多缺陷，难以满足人们日益增长的对食品安全的需要。采用平板计数法步骤繁琐，耗费人力，且检测周期长；采用分子生物学方法在检测速度方面仍不尽如人意，且灵敏度受样品初始细菌数目限制，不经增菌培养难以达到理想的灵敏度；采用免疫学方法则费用高昂，抗体制备繁琐，且易受环境及污染物干扰。因此，有必要建立快速简便的副溶血性弧菌检测方法，以控制食品安全。
发明内容
[技术问题]
其一，现有的检测副溶血性弧菌的材料大多数都分为识别元件和信号探针两部分，很少有研究制备集识别和双信号为一体的材料。其二，传统检测方法存在检测时间长、设备昂贵、操作繁琐的问题，而免疫法存在周期长、特异性不强，抗体不稳定等相对问题。其三，现有的针对副溶血性弧菌检测技术的研究中，在完成定量检测后并未考虑对检测后端的致病菌危害控制。
[技术方案]
本发明提供一种用于特异性识别、检测和杀灭副溶血性弧菌的多功磁性复合纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)通过溶剂热法制得具有超顺磁性的Fe3O4纳米材料；
(2)通过水热反应在Fe3O4表面原位生长MOF-919(Fe-Cu)，制得Fe3O4@MOF(Fe-Cu)复合材料；
(3)通过对Fe3O4@MOF(Fe-Cu)表面进行巯基修饰，然后将金纳米星负载在复合材料表面，制得Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS复合材料；
(4)通过将Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS与4-巯基苯硼酸(4-MBA)共混孵育，制得Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA复合材料；
(5)通过将Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA与副溶血性弧菌适配体共混孵育，制得Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA-Apt复合材料，即多功磁性复合纳米材料。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，是将二水合柠檬酸钠和六水合三氯化铁分散在乙二醇中，随后加入无水乙酸钠，混匀，然后置于高压反应釜中加热反应，反应结束后，冷却，分离收集固体，洗涤，干燥，得到Fe3O4纳米材料。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，溶剂热的条件为200℃下反应10h。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，六水合三氯化铁、二水合柠檬酸钠、无水乙酸钠的质量比为1：(0.1-0.5)：(1-2)。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，六水合三氯化铁相对乙二醇的浓度为0.01-0.05g/mL；具体可选0.03g/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，将FeCl3·6H2O、Cu(NO3)2·3H2O分散在有机溶剂中，加入H2PyC，溶解混匀后再加入步骤(1)所得的Fe3O4纳米材料，混匀、并转移至高温反应釜加热反应，反应结束后，冷却，分离收集固体，洗涤，干燥，得到Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS复合材料。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，加热反应的条件为100℃持续12h。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，FeCl3·6H2O、Cu(NO3)2·3H2O、H2PyC的质量比为(0.5-1)：(2-3)：1。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，H2PyC相对有机溶剂的浓度为5-8mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，有机溶剂可选N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中，金纳米星通过如下方法制备：
将柠檬酸钠溶液、氯金酸溶液混合加热，随后冷却，制得金种溶液；将HC1溶液与HAuC1溶液混合，搅拌下继续加入金种溶液，同时迅速加入AgNO3溶液和抗坏血酸溶液，搅拌混匀，即得金纳米星溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中具体包括：将Fe3O4@MOF(Fe-Cu)纳米材料溶解在甲苯中，然后与乙二硫醇的甲醇溶液混合，搅拌反应，得到巯基修饰的Fe3O4@MOF(Fe-Cu)材料；然后将巯基修饰的Fe3O4@MOF(Fe-Cu)材料分散在纯水中，加入金纳米星溶液，搅拌反应，得到Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中，将Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS分散在PBS溶液中，配制1mg/mL的分散液，然后加入1mg/mL 4-MBA的乙醇溶液，混合孵育，结束后分离收集固体，洗涤，干燥。其中，分散液与4-MBA的乙醇溶液的体积比为10：1。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中，将Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA分散在PBS溶液中，配制1mg/mL的材料分散液；将副溶血性弧菌适配体分散在PBS溶液中，配制200nM的适配体分散液；随后将配体分散液和TCEP溶液在室温下先混合活化，然后加入材料分散液，孵育一段时间，结束后，收集固体、洗涤，干燥。其中，TCEP溶液的浓度为10mM；配体分散液、TCEP溶液和材料分散液的体积比为1：0.1：1。
本发明基于上述方法制备提供一种用于检测和杀灭副溶血性弧菌的多功能复合磁性纳米材料。
上述多功能磁性复合纳米材料Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA-Apt的多功能表现为以下五点：①超顺磁性能；②纳米酶活性；③SERS性能；④光热转化性能；⑤特异性识别性能。
本发明的多功能磁性复合纳米材料中，
(1)掺杂过渡金属的双金属MOF纳米材料因其兼具MOF材料高度有序的孔隙度和原子分散的双金属节点，故其具有出色的纳米酶活性；
(2)金纳米星是由一个中心核和许多尖端组成的高各向异性金纳米颗粒，由于金纳米星具有优良的局部表面等离子体共振(LSPR)，在SERS或荧光生物传感器的构建中具有广阔的发展前景；此外，金纳米星因其优异的光热性能，其在近红外区域具有较强的吸收，可以将光能转化为热能，从而能够达到吸热杀菌的效果；将灵敏检测与高效灭菌有效结合是对食源性致病菌污染源头控制和避免二次污染最有价值的途径；
(3)磁性纳米材料在外磁场下易于控制，表面积大，易于表面修饰，在对食品基质中微量细菌的富集方面具有明显优势；
(4)此外，核酸适配体(aptamer)作为生物识别元件，凭借其独特的优势已经与表面增强拉曼散射(SERS)和比色等信号结合用于构建特异、灵敏和快速的适配体传感方法，在食品污染物检测等方面应用广泛；
基于上述这些，本发明将纳米酶、SERS、光热灭菌、磁分离以及适配体相互结合并制备了一种可用于双模式检测并光热杀灭副溶血性弧菌的多功能的复合磁性纳米材料，从而开发了一种针对致病菌的高特异性、高准确性以及快速安全的检测和杀灭方法。
本发明还提供一种用于特异性检测副溶血性弧菌的比色-SERS双模式检测和光热杀菌的方法及其应用，主要包括以下步骤：
1)利用制备的具备多功能的磁性复合纳米材料与副溶血性弧菌共混孵育，用于从食品基质中特异性捕获细菌；
2)采用磁泳色谱分离技术，对菌-材料复合物进行分离，并将其用于后续检测；
3)对于分离所得的菌-材料复合物，利用复合磁性纳米材料的纳米酶比色信号和SERS信号对副溶血性弧菌进行定量检测并制备标曲；
4)针对检测液中的副溶血性弧菌，利用磁性复合纳米材料的光热性能对细菌进行光热杀灭，完成检测后端的危害控制；
5)将上述所研究的检测和杀菌方法用于海产品样品中对副溶血性弧菌进行实际应用性能研究。
本发明还提供一种利用比色-SERS技术进行双模式检测和光热杀灭副溶血性弧菌的方法，基于多功能磁性复合纳米材料结合磁泳色谱的检测技术，包括以下步骤：
(a)将上述多功能磁性复合纳米材料加入到一系列已知浓度的靶标副溶血性弧菌溶液中，孵育，磁泳色谱分离，采用比色和SERS双模式检测，测得相应的紫外吸光值和SERS强度；以靶标副溶血性弧菌的浓度分别与紫外吸光值和SERS强度分别进行线性关联，得到相应的标准曲线；
(b)向待测样液中加入多功能磁性复合纳米材料，孵育，磁泳色谱分离，采用比色和SERS双模式检测，测定计算紫外吸光值和SERS强度，代入标准曲线，获得靶标副溶血性弧菌的浓度；
(c)在比色和SERS双模式检测完成之后，采用近红外光照的方式对检测液中的副溶血性弧菌进行光热杀灭，以完成检测后端的危害控制。
在本发明的一种实施方式中，步骤(a)或(b)中，多功能磁性复合纳米材料相对靶标副溶血性弧菌溶液或者待测样液的添加量为150μg/mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(a)或(b)中，孵育结束后，通过磁分离将材料从混合液中分离出来，然后再分散到PBS中进行磁泳色谱分离。
在本发明的一种实施方式中，步骤(a)或(b)中，磁泳色谱分离的条件为：以25wt％的PEG水溶液作为分离通道。
在本发明的一种实施方式中，步骤(a)或(b)中，比色检测采集652nm处的紫外吸光值；SERS检测采集1068cm-1处的SERS强度。
[有益效果]
本发明以副溶血性弧菌为靶标，通过层层组装制备了具备多功能的磁性复合纳米材料，首先能利用该磁性复合纳米材料的超顺磁分离性能结合磁泳色谱达到快速从复杂食品基质中分离细菌的效果；其次能利用该磁性复合纳米材料的比色和SERS传感信号对细菌进行短时间、高精度和高稳定性的双模式定量检测；最后能利用该磁性复合纳米材料的光热性能对检测到的细菌进行光热杀灭，从而完成检测后端的危害控制。
现有的副溶血性弧菌检测技术多为单模式检测，针对双模式定量检测方法的开发较少，本发明选择利用比色和SERS双模式信号，利用所制备的具备多功能的磁性复合纳米材料对细菌进行定量检测。
现有的针对致病菌检测技术的研究中，大多未考虑对检测后端的致病菌危害控制，本发明选择对检测液用近红外光照的方式，利用所制备的具备多功能的磁性复合纳米材料对细菌进行光热杀灭以完成检测后端的危害控制。
附图说明
图1为实施例2中对各类材料的表征数据图谱；包括：Fe3O4(A)、Fe3O4@MOF(Fe-Cu)(B)、Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS(C)、金纳米星(D)的TEM图像；Fe3O4@MOF(Fe-Cu)的傅里叶变换红外光谱(E)；Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS的粉末X射线衍射图(F)；Fe3O4纳米颗粒、Fe3O4@MOF和Fe3O4@MOF-GNS的Zeta电位图(G)；Fe3O4@MOF-GNS的XPS光谱(H)；FMG、FMG-MBA、FMG-MBA-Apt的Zeta电位图(I)；适配体修饰前后的紫外可见吸收光谱(J)。
图2为实施例3中对各类材料的磁性能测试结果；包括：Fe3O4、Fe3O4@MOF(Fe-Cu)和Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS的超顺磁性测试图(A)；Fe3O4、Fe3O4@MOF和Fe3O4@MOF-GNS在外磁场下在30秒内表现出快速响应照片(B)。
图3为实施例3中复合材料和物理混合的比色条件优化对比图；包括：不同pH条件(A)、不同温度条件(B)、不同复合方式(C)。
图4为实施例3中不同4-MBA浓度所得复合材料的SERS信号的优化结果；包括：不同4-MBA浓度的SERS信号对比图(A)；1mg·mL-14-MBA所得Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA和单纯MBA的SERS信号(B)；1mg·mL-14-MBA所得Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA在五个使用循环内SERS强度对比图(C)。
图5为实施例3中复合材料的光热性能结果图；包括：Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS在5分钟的暴露时间内的温度变化(A)；材料悬浮液和纯水(对照)随时间的温度变化(B)；Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS在五个使用循环内的光热转换能力变化(C)。
图6为实施例3中复合材料的捕获效率优化；包括Fe3O4@MOF-GNS-MBA-Apt和副溶血性弧菌结合的形态学图像(A)；不同材料添加量对副溶血性弧菌的捕获效率对比(B)。
图7为实施例4中磁泳色谱分离的PEG浓度优化对比图。
图8为实施例4中分离检测副溶血性弧菌菌的结果；包括磁泳色谱分离含有不同浓度副溶血性弧菌菌液后的移液器尖端的光学图像(A)；不同副溶血性弧菌浓度的紫外吸光强度变化(B)；不同副溶血性弧菌浓度的SERS强度变化(D)；副溶血性弧菌浓度分别与紫外吸光强度(C)和SERS强度(E)的标准曲线。
图9为实施例5中利用材料的光热性能对检测溶液的副溶血性弧菌危害控制对比图。
图10为实施例5中加标样品检测液经光热处理4分钟的菌落图像。
图11为本发明多功能磁性复合纳米材料的制备和检测应用示意图。其中(a)是多功能磁性复合纳米材料的制备过程；(b)副溶血性弧菌双模检测及光热灭菌流程原理图。
具体实施方式
实施例1具有多功能磁性复合纳米材料的制备过程
1.Fe3O4纳米材料的制备
采用热溶剂一步法制备：称取0.664g二水合柠檬酸钠和2.4g六水合三氯化铁，超声使其溶于80mL乙二醇中，随后加入3.84g无水乙酸钠，磁力搅拌1h后，得到的深色溶液置于高压反应釜中，于200℃反应10h，反应结束后冷却至室温，所得产物分别用纯水、无水乙醇洗涤几次后，60℃干燥，即得具有羧基改性的Fe3O4纳米材料，备用。
2.Fe3O4@MOF(Fe-Cu)纳米材料的制备
采用溶剂热反应制备：将FeCl3·6H2O(35.5mg)和Cu(NO3)2·3H2O(114.5mg)添加到10mL DMF中，然后添加H2PyC(54.0mg)，通过超声溶解上述混合物后，最后添加100mg羧基改性的Fe3O4，搅拌均匀后，转移至高温反应釜中100℃持续12h。冷却至室温，通过离心收集固体，多次水洗后60℃真空干燥12h，得到Fe3O4@MOF(Fe-Cu)纳米材料，备用。
3.金纳米星溶液的制备
在剧烈搅拌条件下，将柠檬酸钠水溶液(Na3C6H5O7·2H2O)(1wt％，15mL)加入到85℃的氯金酸水溶液(HAuCl4)(1mM，100mL)中加热15分钟，随后将溶液冷却，制得金种溶液，并将金种溶液放置在4℃下避光保存。室温下，在150mL玻璃瓶中，首先将HC1溶液(1M，100mL)加入HAuC1水溶液(0.25mM，100mL)中，适度搅拌下，继续加入1mL上述柠檬酸钠稳定的金种溶液，同时迅速加入AgNO3水溶液(1mM，1mL)和抗坏血酸水溶液(100mM，0.5mL)，搅拌1分钟后，即得金纳米星溶液(Au NS溶液)。该金纳米星溶液在4℃避光长期保存。
4.Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS纳米材料的制备
称取0.1g Fe3O4@MOF(Fe-Cu)纳米材料，120℃干燥12h后，加入10mL无水甲苯，超声溶解后，再加入1mL乙二硫醇的甲醇溶液(0.24mol/L)，室温下搅拌24h后，用纯水和无水乙醇进行洗涤，60℃干燥，得到巯基修饰的Fe3O4@MOF(Fe-Cu)材料，备用。称取50mg巯基修饰的Fe3O4@MOF材料，超声溶于10mL纯水中，与50mL上述制备的Au NS溶液在室温下剧烈搅拌3h，结束后用乙醇洗涤数次以去除未连接的Au NS。最后，60℃真空干燥，即得Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS纳米材料，备用。
5.Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA纳米材料的制备
取1mLFe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS的PBS溶液(1mg/mL)加入100μL4-MBA乙醇溶液(1mg/mL)，室温下共混1h。结束后，用纯水和乙醇洗去未反应的4-MBA，干燥，即得Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA纳米材料。
6.Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA-Apt多功能的磁性复合纳米材料的制备
取1mL副溶血性弧菌适配体的PBS溶液(200nM)与0.1mL新鲜配置的TCEP(10mM)混合并室温活化1h，再将其添加到1mL Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA的PBS溶液(1mg/mL)中，37℃孵育过夜。最后，用PBS缓冲液(10mM，pH 7.4)洗涤三次后，即得Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA-Apt多功能的磁性复合纳米材料。所得多功能的磁性复合纳米材料可重溶于PBS缓冲液中置于冰箱中保存备用。
其中，副溶血性弧菌适配体序列5’-SH-TTTTTTTTTCAACGAAACAGTGACTCGTTG-3’由上海生工生物技术有限公司合成。
实施例2多功能磁性复合纳米材料的表征
1.Fe3O4、Fe3O4@MOF(Fe-Cu)和Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS的表征
据图1显示合成的Fe3O4纳米颗粒具有良好的均匀性和单分散性，平均粒径约为281.08nm。随后，MOF(Fe-Cu)在Fe3O4纳米颗粒上原位生长，获得的Fe3O4@MOF(Fe-Cu)具有较为清晰的核壳结构，其平均粒径增加到约为301.84nm，这表明MOF(Fe-Cu)成功地包覆在Fe3O4纳米颗粒表面。然后将通过两步法制备的的金纳米星连接在Fe3O4@MOF(Fe-Cu)表面，通过金硫化学键合制备Fe3O4@MOF-GNS。根据TEM图像显示，高密度的金纳米星均匀分布在Fe3O4@MOF表面，说明金纳米星负载成功。
通过测定傅里叶变换红外光谱进一步验证了Fe3O4@MOF(Fe-Cu)的核壳结构。如图1所示，625～582cm-1处是Fe-O的伸缩振动峰，997cm-1处是N-Cu-N振动特征带，1630、1440、1330和800cm-1处对应C＝O，C-C，C-N，C-H的拉伸振动。表征结果说明通过高温水热法合成的Fe3O4表面含有大量的羧基；对比图中Fe3O4和MOF(Fe-Cu)证明了双金属Fe-Cu MOF成功生长到Fe3O4表面。使用乙二硫醇对核壳材料功能化后，虽然在2581cm-1未出现明显的S-H振动峰，但在682cm-1出现了小而尖锐的新峰，其对应为C-S的伸缩振动峰。该结果证明已成功将巯基修饰在了核壳结构表面。
通过粉末X射线衍射分析进一步验证了金纳米星成功负载在Fe3O4@MOF核壳结构表面。由图1所示，Fe3O4的衍射峰对应的2θ为30.06°、35.54°、43.22°、52.68°、57.28°和62.58°；金纳米星的衍射峰2θ为38.08°。此外，通过测定Fe3O4@MOF-GNS的XPS光谱，其结果表明所制备的复合材料中的确存在Fe、Cu、Au、C和O等元素，其结果充分说明双金属MOF(Fe-Cu)与金纳米星成功负载在Fe3O4表面。
此外，Fe3O4纳米颗粒、Fe3O4@MOF和Fe3O4@MOF-GNS的Zeta电位变化验证了MOF壳层和金纳米星在Fe3O4纳米颗粒表面的顺序修饰。合成的羧基化Fe3O4使磁性颗粒具有表面负电荷(zeta电位：-4.62mV)。将双金属Fe-Cu MOF原位生长到羧基化Fe3O4表面，使核壳结构具有表面正电荷(zeta电位:2.86mV)。随后，核壳结构与带负电荷的金纳米星相互作用后，使复合结构具有表面负电荷(zeta电位：-14.03mV)。这些结果均相互证明了所设计的Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS的成功制备。
2.Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA和Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA-Apt纳米材料的表征
为了进一步确定经过每步修饰之后纳米颗粒电荷性质的变化，分别利用紫外可见吸收光谱和Zeta电位检测仪表征Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS(以下简称为FMG)与适配体的连接。结果如图所示，FMG(即Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS)的平均电位值为-14.03mV。随后，FMG-MBA(即Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA)的平均电位值为-21.3mV，电位值有一定程度的下降。最终经过副溶血性弧菌适配体的修饰，形成的复合材料FMG-MBA-Apt(即Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA-Apt)的平均电位值为-30.1mV，呈现明显的电负性。这是因为核酸适配体的表面含有十分丰富的带负电荷的磷酸基团，经过修饰FMG的表面结合了大量的适配体，这就导致FMG-MBA的表面呈现更为明显的电负性，这也进一步证明了副溶血性弧菌适配体成功修饰到了FMG上。此外，由于适配体在260nm处具有紫外特征吸收峰，可以通过监测反应上清液中260nm处吸光值的变化来表征适配体和材料FMG-MBA的连接。如图1所示，相比于相同浓度适配体溶液，反应上清液中260nm处的吸光值显著下降。以上结果均表明信号分子和适配体成功负载到复合材料表面。
实施例3多功能磁性复合纳米材料的性能探究与制备条件优化。
3.1磁性能探究
在外加磁场下，通过振动样品磁强法分析了Fe3O4、Fe3O4@MOF(Fe-Cu)和Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS的超顺磁性。如图2所示，制备好的Fe3O4纳米颗粒、Fe3O4@MOF(Fe-Cu)和Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS的饱和磁化强度分别为64.40、55.95和47.55emu·g-1。与Fe3O4纳米颗粒相比，Fe3O4@MOF和Fe3O4@MOF-GNS表现出降低的饱和磁化强度，这可能是由于MOF壳和金纳米星包覆在Fe3O4纳米颗粒表面的磁屏蔽效应所致。尽管如此，与Fe3O4纳米颗粒类似，Fe3O4@MOF和Fe3O4@MOF-GNS在外磁场下在30秒内表现出快速响应，从而确保了从复杂样品中快速有效地磁分离和富集目标分析物。
3.2Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS纳米酶活性探究及制备条件优化
本实施例采用H2O2催化氧化TMB，研究了Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS颗粒的过氧化物酶样活性。oxTMB的类酶活性可以通过检测其在652nm处的紫外吸收峰来表征。
比色反应体系(1mL)为：HAc-NaAc溶液(0.1M,pH 4.5,850μL)，H2O2(1M,50μL)，TMB(10mM,50μL)，其中复合材料的添加量为50mg(1mg/mL,50μL)。
(1)对比了pH和温度对Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS的酶活性的影响
具体考察了Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS在pH为4～6的HAc-NaAc缓冲液中的理想效率。当pH为4.5时，该材料酶活性最强；当pH超过4.5后，其过氧化物酶样活性急剧下降。结果表明，pH＝4.5为最优pH值。为了找到材料过氧化物酶样活性的最佳温度，从20℃到50℃的范围对材料酶活性进行了评估，结果显示在超过40℃的温度下，酶活性会下降，从而选择40℃作为进一步分析的最佳温度。
(2)复合方式的对比
在相同的比色反应体系(TMB+H2O2)中分别添加一定质量的复合材料(Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS)(100mg)和与复合材料中各物质等量的材料的物理混合物(83.2mg Fe3O4+6.3mgMOF(Fe-Cu)+10.5mg金纳米星)作为比较，利用其催化H2O2产生的羟基自由基去催化TMB(无色)转变为oxTMB(蓝色)的信号强度进行类酶活性比较。
结果如图3所示，在两个实验组中的比色反应体系均具有明显的吸收峰，但最高的吸收峰出现在复合材料Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS体系中。结果表明，实施例1制备的复合材料(Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS)具有出色的过氧化物酶样催化活性，并显著优于简单地将Fe3O4、MOF-919(Fe-Cu)和金纳米星物理混合的方式。说明，其复合结构之间存在协同增效的作用，能够进一步改善增强复合材料整体的类酶活性。
3.3SERS性能探究及制备条件优化
为了让信号分子和适体探针更好的与材料功能化结合，用于副溶血性弧菌的高灵敏检测，本发明对材料连接4-MBA的浓度进行了条件优化。因此，通过Au-S键将不同浓度的4-MBA(0.001、0.01、0.1、1、10mg·mL-1)修饰到材料的表面，通过检测其拉曼信号强度来评估4-MBA的浓度对材料的拉曼增强效果。结果如图4所示，随着4-MBA浓度的增加，Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA的拉曼信号强度逐渐增加，并在4-MBA的浓度为1mg·mL-1时达到峰值，然后逐渐下降。这表明1mg·mL-1为4-MBA的最优孵育浓度，当浓度超过1mg·mL-1后引起拉曼信号强度的下降，这可能是因为高浓度的4-MBA导致了材料的聚集，从而降低了其拉曼信号强度，影响了检测效果。因此，确定1mg·mL-1为Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS上4-MBA的最优浓度。此外，进一步通过探究材料的SERS稳定性，本实施例发现材料的SERS性能在五个使用循环内仍能保持出色的拉曼信号强度。
3.4光热性能的探究及制备条件优化
对Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS的光热灭活细菌的能力进行了研究。由于实施例1所制备的Au NS在675nm左右有一个宽的LSPR吸收峰，故用0.25cm2红色光斑(660nm，2.0W/cm2)照射，记录材料悬浮液和纯水(对照)随时间的温度变化。
从图5中可以看到，Fe3O4@MOF-GNS在5分钟的暴露时间内将温度从20.8℃大幅提高到65.1℃，而纯水作为对照，仅将温度提高0.4℃。结果表明，Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS具有良好的光热转换能力。此外，进一步通过探究材料的光热稳定性，发现材料的光热性能在五个使用循环内仍能保持出色的光热转换能力。综上所述，说明本发明制备的Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS材料具有较好的光热性能，并可用于定量检测后方便杀灭试验溶液中的细菌，从而提高一次性材料分析的安全性，尤其适用于致病菌的检测。
3.5捕获性能探究及制备条件优化
如图6所示，通过扫描电镜下确认了Fe3O4@MOF-GNS-MBA-Apt和副溶血性弧菌结合的形态学图像。所制备的复合材料可以通过适配体的特异性作用准确靶向并紧密粘附在副溶血性弧菌表面。为了获得良好的捕获细菌效果，通过调整Fe3O4@MOF-GNS-MBA-Apt的用量范围，优化了捕获条件。为了确定适当的材料添加量，将副溶血性弧菌(105cfu·mL-1)用作捕获模型上限。在PBS(10mM，pH 7.4)中，通过向1mL的副溶血性弧菌溶液(105cfu·mL-1)中添加不同数量的Fe3O4@MOF-GNS-MBA-Apt与菌结合实现特异性捕获，再在37℃下孵育60分钟后，通过磁力架分离材料-菌复合物。从图6可知，当Fe3O4@MOF-GNS-MBA-Apt用量持续增加到150μg时，捕获效率显著提高，可达到97.8％。但当用量超过150μg时，捕获效率无明显提高。结果说明150μg的材料添加量可作为下一步分析的的适宜用量。以上结果充分证明，经适体修饰后的材料对副溶血性弧菌具有优异的特异性捕获性能，可用于进一步检测分析。
实施例4利用磁泳色谱技术结合多功能磁性复合纳米材料检测虾样品中的副溶血性弧菌含量的方法
4.1探究磁泳色谱中分离游离材料和菌-材料复合物的PEG浓度优化
将多功能材料(Fe3O4@MOF-GNS-MBA-Apt，150μg)添加到含有副溶血性弧菌的溶液(105cfu·mL-1，1mL)中孵育60分钟后，通过磁分离将材料从混合液中分离出来，然后再分散到PBS(50μL)中进行磁泳分离。磁泳分离前，移液管尖端上层液体中既包含游离材料，也含有菌-材料复合物。
首先，本实施例考察了含有游离材料和菌-材料复合物在无磁场作用力仅通过菌体重力作用的磁泳分离效果。由图7中第一竖列可知，在无磁场作用下，10min内游离材料与菌-材料复合物在15wt％PEG水溶液通道中有微弱的沉降，但在10min内仅凭重力作用力无法突破20wt％PEG水溶液通道。因此在20wt％PEG水溶液通道中无法通过重力分离游离材料和菌-材料复合物。其次考察了仅含有游离材料在磁场作用力下的磁泳分离效果。由图7中第二竖列可知，在磁场作用下，10min内游离材料通过磁力作用能突破15wt％、20wt％PEG通道中的粘滞阻力并产生粒子沉降，但在10min内无法突破25wt％PEG通道。因此在25wt％PEG通道中无法通过磁力分离游离材料。基于以上对磁泳色谱中单个作用力(菌体重力和磁力)的探究，为达到最佳分离效果，本实施例进一步探究了含有游离材料和菌-材料复合物在磁场作用力下的磁泳分离效果。由图7中第三竖列可知，在磁场作用力和菌体重力双重作用力下，10min内菌-材料复合物不仅能突破15-25wt％PEG通道中的粘滞阻力并产生粒子沉降，还能微弱通过30wt％PEG通道。因此在25wt％PEG通道中可以通过磁力和重力的复合力分离游离材料和菌-材料复合物。经磁泳色谱分离后，菌-材料复合物在PEG通道底部收集，而游离材料停留在PEG通道中无法到达底部。考虑到为了检测信号收集的准确性，从而确定磁泳色谱中PEG最佳浓度为25wt％。
4.2基于多功能磁性复合纳米材料的比色性能和SERS性能构建副溶血性弧菌的比色-SERS双模分析检测方法
使用复合材料对含有不同浓度的副溶血性弧菌菌液进行孵育捕获，在磁泳结束后，收集移液管底部的沉淀颗粒并将其分散于PBS(100μL)溶液中。将上述悬浮液(50μL)转移至预先配制好的比色反应体系:HAc-NaAc溶液(0.1M，pH 4.5，850μL)；H2O2(1M，50μL)，TMB(10mM，50μL)。将反应混合物在40℃黑暗中孵育15分钟，测定其在652nm处的吸光度。将剩余的悬浮液(50μL)分批滴投到干净的玻璃载玻片上，在785nm激发下用共聚焦拉曼光谱仪扫描SERS信号。
比色法检测副溶血性弧菌。如图8所示，随着副溶血性弧菌浓度的增加，溶液的颜色逐渐加深变成深蓝色。通过测量652nm处的紫外吸光值，定量测定每个溶液中副溶血性弧菌的浓度，溶液的吸收峰强度随着菌浓度的增加而增加。比色检测体系的吸光值与副溶血性弧菌浓度的对数之间线性关系良好，线性回归方程为y＝0.303x-0.101(R2＝0.997)。在101-105cfu·mL-1浓度范围内，对副溶血性弧菌的检测限为9cfu·mL-1。
SERS检测副溶血性弧菌。如图8所示，体系中的SERS信号强度也随副溶血性弧菌浓度的增加而增强，选择4-MBA在1068cm-1处的SERS强度进行定量检测。SERS检测体系的相对SERS强度与副溶血性弧菌浓度的对数之间线性关系良好，线性回归方程为y＝118.6x-96.27(R2＝0.9893)。在101-105cfu·mL-1浓度范围内，对副溶血性弧菌的检测限为7cfu·mL-1。
为了测试传感器的分析性能，使用传统的平板计数法和所提出的双模式检测方法同时检测鲜虾人工污染样品中的副溶血性弧菌含量。
结果总结在表1中，两种方法获得的结果之间并没有显著性差异，采用比色和SERS法测定鲜虾样品中副溶血性弧菌的回收率分别为94.6％～99.1％和89.3％～96.7％，其结果与加标浓度具有良好的一致性，证明了本文开发的比色-SERS适配体传感器可用于复杂食品样品中副溶血性弧菌的测定。
表1利用本发明所开发的双模式检测鲜虾加标样品
实施例5利用多功能磁性复合纳米材料光热杀灭虾样品检测液中的副溶血性弧菌的方法
在NIR光源照射下，利用光热成像仪记录孔内检测液(为确保其杀菌效果，本实施例选用105cfu mL-1的检测液作为检测上限以探究最佳杀菌时间)温度随时间的变化。从图9可以看出，随光照时间的增加，检测液中靶向副溶血性弧菌的材料具有出色的光热效应，在5分钟内使检测液整体的温度从20.5℃急剧上升到64.7℃。通过将经光照处理后的检测液直接涂平板，以便直接观察光热杀菌效果。由图9可见，不经光照处理的对照组平板上具有大量密集的菌落；而经不同时间光热处理的各组平板菌落数均低于对照组，且呈现出极速下降的趋势。值得注意的是，大多数微生物在50℃以上就能被高温灭活。由于在材料表面修饰了具有特异性靶向副溶血性弧菌的适配体，使菌-材料复合物紧紧连接，从而经近红外光照后产生局部高温有效杀菌。由图9可知，在光照处理3分钟后，琼脂板上仅长出极少数菌落(18cfu)，检测液中的副溶血性弧菌存活率仅达到4.36％；在光照处理4分钟以后，检测液中所捕获的的副溶血性弧菌已被全部杀灭。因此，确定将近红外光照4分钟应用于检测后端的杀菌操作。
在实际样品检测实验中，当定量检测完成后立即利用NIR照射进行光热杀菌，进一步完成对检测后端的致病菌危害控制。由图10可见，对磁泳检测到的三个加标样品中的副溶血性弧菌进行NIR光照4分钟杀菌处理后，其琼脂培养板上均未长出菌落。其结果充分证明了在4分钟NIR光照处理下，可以彻底杀灭检测液中的副溶血性弧菌，从而可以确保不会因检测致病菌而对环境造成二次污染。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种用于特异性识别、检测和杀灭副溶血性弧菌的多功磁性复合纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过溶剂热法制得具有超顺磁性的Fe3O4纳米材料；
(2)通过水热反应在Fe3O4表面原位生长MOF-919(Fe-Cu)，制得Fe3O4@MOF(Fe-Cu)复合材料；
(3)通过对Fe3O4@MOF(Fe-Cu)表面进行巯基修饰，然后将金纳米星负载在复合材料表面，制得Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS复合材料；
(4)通过将Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS与4-MBA共混孵育，制得Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA复合材料；
(5)通过将Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA与副溶血性弧菌适配体共混孵育，制得Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS-MBA-Apt复合材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，是将二水合柠檬酸钠和六水合三氯化铁分散在乙二醇中，随后加入无水乙酸钠，混匀，然后置于高压反应釜中加热反应，反应结束后，冷却，分离收集固体，洗涤，干燥，得到Fe3O4纳米材料；所述溶剂热的条件为200℃下反应10h；六水合三氯化铁、二水合柠檬酸钠、无水乙酸钠的质量比为1：(0.1-0.5)：(1-2)；六水合三氯化铁相对乙二醇的浓度为0.01-0.05g/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将FeCl3·6H2O、Cu(NO3)2·3H2O分散在有机溶剂中，加入H2PyC，溶解混匀后再加入步骤(1)所得的Fe3O4纳米材料，混匀、并转移至高温反应釜加热反应，反应结束后，冷却，分离收集固体，洗涤，干燥，得到Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS复合材料；加热反应的条件为100℃持续12h；FeCl3·6H2O、Cu(NO3)2·3H2O、H2PyC的质量比为(0.5-1)：(2-3)：1；H2PyC相对有机溶剂的浓度为5-8mg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括：将Fe3O4@MOF(Fe-Cu)纳米材料溶解在甲苯中，然后与乙二硫醇的甲醇溶液混合，搅拌反应，得到巯基修饰的Fe3O4@MOF(Fe-Cu)材料；然后将巯基修饰的Fe3O4@MOF(Fe-Cu)材料分散在纯水中，加入金纳米星溶液，搅拌反应，得到Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS；其中所述金纳米星溶液通过如下方法制备：
将柠檬酸钠溶液、氯金酸溶液混合加热，随后冷却，制得金种溶液；将HC1溶液与HAuC1溶液混合，搅拌下继续加入金种溶液，同时迅速加入AgNO3溶液和抗坏血酸溶液，搅拌混匀，即得金纳米星溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，将Fe3O4@MOF(Fe-Cu)-GNS分散在PBS溶液中，配制1mg/mL的分散液，然后加入1mg/mL 4-MBA的乙醇溶液，混合孵育，结束后分离收集固体，洗涤，干燥；其中，分散液与4-MBA的乙醇溶液的体积比为10：1。
6.权利要求1-5任一项所述方法制备得到的一种特异性识别、检测和杀灭副溶血性弧菌的的多功能复合磁性纳米材料。
7.一种利用比色-SERS技术进行双模式检测和光热杀灭副溶血性弧菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将权利要求6所述的多功能磁性复合纳米材料加入到一系列已知浓度的靶标副溶血性弧菌溶液中，孵育，磁泳色谱分离，采用比色和SERS双模式检测，测得相应的紫外吸光值和SERS强度；以靶标副溶血性弧菌的浓度分别与紫外吸光值和SERS强度分别进行线性关联，得到相应的标准曲线；
(b)向待测样液中加入多功能磁性复合纳米材料，孵育，磁泳色谱分离，采用比色和SERS双模式检测，测定计算紫外吸光值和SERS强度，代入标准曲线，获得靶标副溶血性弧菌的浓度；
(c)在比色和SERS双模式检测完成之后，采用近红外光照的方式对检测液中的副溶血性弧菌进行光热杀灭，以完成检测后端的危害控制。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(a)或(b)中，多功能磁性复合纳米材料相对靶标副溶血性弧菌溶液或者待测样液的添加量为150μg/mL。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(a)或(b)中，孵育结束后，通过磁分离将材料从混合液中分离出来，然后再分散到PBS中进行磁泳色谱分离；磁泳色谱分离的条件为：以25wt％的PEG溶液作为分离通道。
10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于，步骤(a)或(b)中，比色检测采集652nm处的紫外吸光值；SERS检测采集1068cm-1处的SERS强度。
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