CN116087165B - 一种简单快速检测mtc和/或otc和/或tc的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种简单快速检测MTC和/或OTC和/或TC的方法，属于抗生素检测技术领域。该方法在酸性缓冲溶液中加入表面活性剂PEI、金属离子Mg2+及待测溶液形成待测体系，采用荧光光度分析仪检测待测体系的荧光强度，在525nm处的荧光强度有增强，则待测溶液中含有四环素类抗生素；其中，四环素类抗生素为MTC、OTC、TC中的一种或多种。本发明基于PEI和Mg2+两者对四环素类抗生素的荧光具有显著的协同增敏作用检测牛奶中TCs，适用于弱酸性环境中残留TCs的分析，克服了TCs的弱荧光的特点，简单快速、成本低、耗时短、灵敏度高、特异性好。

Description

一种简单快速检测MTC和/或OTC和/或TC的方法
技术领域
本发明属于抗生素检测技术领域，涉及多种四环素类抗生素的检测，具体涉及在弱酸条件下基于阳离子表面活性剂PEI和金属离子Mg2+协同荧光增敏检测多种四环素类抗生素的方法。
背景技术
四环素类抗生素(tetracyclines，TCs)是一类由放线菌产生的具有并四苯结构的广谱抗生素药物，包括金霉素(chlortetracycline，CTC)、土霉素(oxytetracyline，OTC)、四环素(tetracyline，TC)及半合成衍生物美他环素(metacycline，MTC)等。TCs因抗菌性能良好、成本低廉、副作用小，被广泛地应用于医疗和养殖等行业。近些年来，由于其广泛应用，导致土壤、水以及奶制品等食品中大量积累四环素类抗生素，也对人体健康引起了严重的副作用，如，削弱人体的免疫系统、过敏或中毒反应、抑制骨骼生长、引起抗生素耐药性等危害。基于此，许多国家和监管组织制定了法规来控制动物食品中抗生素的用量或者禁止使用，严格设定了TCs在动物食品源中的最大残留限量(maximum residue limits，MRLs)。我国的最新国标GB31650-2019《食品安全国家标准》规定了TCs的MRLs，在家畜家禽的肌肉、肝和肾中的MRLs分别为200μg/kg、600μg/kg和1200μg/kg；中国以及欧盟规定牛奶中的MRLs为100μg/L(约0.2μmol/L)，因此高灵敏检测TCs对食品安全和公众健康具有重要意义。
目前，常见的四环素类抗生素的检测方法主要有高效液相色谱法(HighPerformance Liquid Chromatography，HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LiquidChromatograph Mass Spectrometer，LC-MS)、薄层分析分析法(Thin LayerChromatography，TLC)、酶联免疫法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)等。这些传统的检测方法虽然已能实现对TCs的精准检测，且选择性强、假阳性低，但样品前处理操作复杂、需要训练有素的操作人员，且耗时长，不利于现场进行检测。因此，建立一种在食品以及环境中快速、简单、有效检测四环素类抗生素是十分必要的。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种简单快速检测多种四环素类抗生素的检测方法，在弱酸条件下基于阳离子表面活性剂PEI和金属离子Mg2+协同荧光增敏检测多种四环素类抗生素。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种简单快速检测MTC和/或OTC和/或TC的方法，包括以下步骤：在酸性缓冲溶液中加入表面活性剂PEI、Mg2+及待测溶液形成待测体系，采用荧光光度分析仪检测待测体系的荧光强度，在525nm处的荧光强度有增强，则待测溶液中含有MTC、OTC、TC中的一种或多种。
在弱酸性条件下弱荧光且以两性离子形态(TCsH2 ±)的TCs，被富有氨基的阳离子表面活性剂PEI发生去质子化，形成双阴离子形态(TCs2-)，使其荧光增敏。同时，TCs的酮基和羟基分子内的氧发生螯合作用与Mg2+配位形成稳定的六元络合物，加入的PEI与此络合物会形成更稳定的体系，使其荧光强度会大大增强。
进一步的，酸性缓冲溶液为pH为6～7的醋酸缓冲溶液，醋酸缓冲溶液的浓度为20mmol/L。
作为优选，酸性缓冲溶液为pH为6的醋酸缓冲溶液，醋酸缓冲溶液的浓度为20mmol/L。
进一步的，待测体系中的PEI浓度为0.4％，Mg2+浓度为10mmol/L。
一种定量检测MTC或OTC或TC的方法，包括以下步骤：
1)在酸性缓冲溶液中加入表面活性剂PEI、Mg2+及不同标准浓度的MTC或OTC或TC，以MTC或OTC或TC浓度为横坐标，以相对荧光值为纵坐标作标准曲线，计算回归方程及相关系数；
2)在酸性缓冲溶液中加入表面活性剂PEI、Mg2+及待测溶液形成待测体系，采用荧光光度分析仪检测待测体系在525nm处的荧光强度，将测得的相对荧光值代入回归方程中，得到待测溶液中的MTC或OTC或TC浓度。
进一步的，相对荧光值为激发波长370nm时发射波长525nm处的所测MTC或OTC或TC的荧光值与无MTC或OTC或TC时的荧光值差。
进一步的，MTC的线性回归方程为y＝5.3079x+0.0836；OTC的线性回归方程为y＝9.9725x+0.1567；TC的线性回归方程为y＝15.277x-0.0161。
采用本发明方法MTC的检出限为3.6nmol/L；OTC的检出限为4.8nmol/L；TC的检出限为2.7nmol/L。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明基于PEI和Mg2+两者对TCs的荧光具有显著的协同增敏作用检测牛奶中TCs，适用于弱酸性环境中残留TCs的分析，克服了TCs的弱荧光的特点，简单快速、成本低、耗时短、灵敏度高、特异性好。
(2)本发明对牛奶中TCs的检测中具有良好的加标回收率，检测结果可靠。
(3)本发明方法可以检测多种TCs，并对所检测出的TCs进行定量分析。
附图说明
图1为采用本发明方法快速检测四环素类抗生素的工作原理图；
图2是不同金属离子对MTC荧光强度的影响光谱图；图中，金属离子浓度为500μmol/L；MTC浓度为20μmol/L；
图3是在pH 6或pH 7值下不同表面活性剂对MTC荧光强度的影响光谱图；图中，Mg2+浓度为500μmol/L；表面活性剂占缓冲溶液0.1％；缓冲液为醋酸-醋酸钠(20mmol/L，pH＝6)；MTC浓度为20μmol/L；
图4是不同浓度的PEI和Mg2+对检测MTC荧光强度的影响光谱图；图中，MTC浓度为20μmol/L；
图5是TCs浓度与体系荧光强度差值(ΔF525＝F-F0)的标准曲线图；插图为线性关系图，图5中的A为MTC线性关系图，图5中的B为TC线性关系图，图5中的C为OTC线性关系图；
图6是本发明方法的特异性分析图；图中，MTC、OTC、TC的浓度均为5μmol/L，其他抗生素的浓度均为10μmol/L。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中如无特殊说明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
在醋酸缓冲液中，分别加入MTC、PEI+MTC、Mg2++MTC、PEI+Mg2++MTC充分混匀，保持MTC的浓度相同，避光室温静止反应10min，用365nm的紫外灯照射并观察其荧光颜色变化，使用荧光分光光度仪分析其荧光光谱；如图1所示，在酸性溶液中，MTC属于弱荧光物质，在370nm激发条件下，在525nm处几乎没有荧光信号。当加入PEI或Mg2+时，MTC的荧光强度都略微增强，PEI的荧光增敏效果强于Mg2+。当同时将两种物质加入时，MTC在525nm处的荧光强度显著增强，说明PEI和Mg2+的组合对体系中MTC的荧光增敏效果最佳。上述结果表明，本实验构建的荧光增敏法是可行的。
实施例2检测体系中相关因素的确定
1)金属离子的确定
选取了锰、铬、铜、铁、纳、钙、镁、锌、钾、铝等金属离子，将其分别加入到醋酸-醋酸钠缓冲溶液(20mmol/L，pH 6)中，并加入了MTC，其中金属离子浓度为500μmol/L，MTC浓度为20μmol/L，设置对照组和实验组(0和20μmol/L TCs)检测体系的荧光强度。如图2所示，Fe3+、Cu2+、Mn2+会明显地猝灭该体系的荧光强度，可能是因为这些离子与之络合的TCs激发态分子之间容易进行电子转移，由于热振动无辐射跃迁消耗能量使已被激发的电子能量消耗掉从而使其荧光猝灭。而Mg2+、Ca2+具有明显地使该体系在525nm处荧光强度增强的效果，尤其是Mg2+，因此本发明选择Mg2+作为增敏剂。
2)表面活性剂种类及缓冲液pH的确定
向pH 6和pH 7的缓冲溶液体系中加入20μmol/L MTC，500μmol/L Mg2+；并分别加入0.1％的阳离子型表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和阳离子型表面活性剂支链型聚乙烯亚胺(PEI)、非离子型表面活性剂曲拉通X-100(Triton X-100)和Tween 20，如图3所示，相比于其他表面活性剂PEI对MTC荧光增强效果更明显，因此本发明选用PEI为荧光增敏剂，且缓冲溶液为pH 6时该体系荧光强度已趋于饱和状态，其他金属离子或表面活性剂的干扰较少，所以选择的pH 6的醋酸-醋酸钠缓冲溶。
3)PEI和Mg2+浓度的确定
在醋酸-醋酸钠缓冲液(20mmol/L，pH 6)中加入不同浓度的PEI，使待测体系中的PEI浓度分别为0％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.8％、1.0％，设置对照组和实验组(0和20μmol/L MTC)，检测体系的荧光强度，如图4所示，当PEI的浓度为0.4％时，体系荧光F525的值逐渐达到饱和，所以选择0.4％的PEI的浓度。
在醋酸-醋酸钠缓冲液(20mmol/L，pH 6)中加入不同浓度的Mg2+，设置在待测体系中的Mg2+浓度分别为0mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、5.0mmol/L，设置对照组和实验组(0和20μmol/LMTC)，检测体系的荧光强度，如图4所示，随着Mg2+的浓度的增加，该体系荧光强度逐渐增强，当Mg2+的浓度达到0.5mmol/L的时体系在525nm处的荧光强度趋于稳定，所以最终选择的Mg2+浓度为0.5mmol/L。
实施例3
与实施例2基本相同，不同的是将MTC替换为OTC或TC，也能获得与实施例2相同或相近的技术效果。
实施例4TCs标准浓度梯度曲线绘制
配制不同浓度的MTC、OTC、TC溶液，分别加入到含PEI和Mg2+的的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(20mmol/L，pH 6)中，其中PEI浓度为0.4％，Mg2+浓度为0.5mmol/L，使反应溶液中的MTC或OTC或TC浓度分别为0、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、40μmol/L，室温下避光反应10min后，使用荧光光谱仪测定体系的荧光强度。如图5所示，随着TCs浓度的升高体系在525nm处的荧光强度逐渐增强，故在525nm处绘制线性关系曲线。在5～100nmol/L的浓度范围内，MTC的荧光强度与其浓度呈现良好的线性关系，R2为0.939，回归方程为y＝5.3079x+0.0836，检测限(LOD)低至3.6nmol/L；在10～2000nmol/L的范围内，OTC的荧光强度与其浓度呈现良好的线性关系，R2为0.999，回归方程为y＝9.9725x+0.1567，检测限(LOD)低至4.8nmol/L；在5～200nmol/L的范围内，TC的荧光强度与其浓度呈现良好的线性关系，R2为0.997，回归方程为y＝15.277x-0.0161，检测限(LOD)低至2.7nmol/L。
实施例5常见抗生素的特异性实验
向含0.4％PEI和0.5mmol/L Mg2+的醋酸-醋酸钠缓冲液(20mmol/L，pH 6)中，分别加入美他环素(MTC)、土霉素(OTC)、四环素(TC)、金霉素(CTC)、氧氟沙星(OFL)、米诺环素(MIN)、环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)、诺氟沙星(NOR)、罗红霉素(ROX)、磺胺甲恶唑(SMX)(其中，MTC、OTC、TC的浓度为5μmol/L，其他抗生素浓度均为10μmol/L)，室温避光反应10min后，检测其荧光强度。如图6所示，结果表明，其他常见抗生素对该体系几乎没有干扰，该体系仅对TCs类中的MTC、OTC和TC的效果最强，不包括金霉素(CTC)和米诺环素(MIN)。因此，本方法可以特异性识别TCs类中MTC、OTC或TC。
实施例6实际牛奶中的加标实验
选取的水样类型如下：鲜牛奶(悦鲜活)、高脂牛奶(特仑苏)、普通牛奶(蒙牛)进行加标回收率实验。以及实验室用超纯水。设定1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L为最终加标各水样后测量的MTC浓度，利用荧光光谱仪测量各牛奶样品的荧光强度，以超纯水作为对照组，重复三组实验。
如表1所示，此方法对鲜牛奶、高脂牛奶、普通牛奶三种牛奶中的MTC的加标回收率较高，均分布在91.64％～103.21％之间，且相对标准偏差(RSD)均分布在1.20～10.62％，表明该体系在实际样本中对MTC的检测具有准确性和可靠性，可适用于牛奶中MTC的定量检测。
表1不同种类的牛奶与回收率

Claims (7)

1.一种检测MTC和/或OTC和/或TC的方法，其特征在于，包括以下步骤：在酸性缓冲溶液中加入表面活性剂PEI、金属离子Mg2+及待测溶液形成待测体系，采用荧光光度分析仪检测待测体系的荧光强度，在525nm处的荧光强度有增强，则待测溶液中含有MTC、OTC、TC中的一种或多种；所述酸性缓冲溶液为pH为6～7的醋酸缓冲溶液；所述待测体系中的PEI浓度为0.4%，Mg2+浓度为10mmol/L；所述MTC为美他环素，OTC为土霉素，TC为四环素。
2.根据权利要求1所述的检测MTC和/或OTC和/或TC的方法，其特征在于，醋酸缓冲溶液的浓度为20mmol/L。
3.根据权利要求1所述的检测MTC和/或OTC和/或TC的方法，其特征在于，酸性缓冲溶液为pH为6的醋酸缓冲溶液，醋酸缓冲溶液的浓度为20mmol/L。
4.一种定量检测MTC或OTC或TC的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在酸性缓冲溶液中加入表面活性剂PEI、Mg2+及不同标准浓度的MTC或OTC或TC，以MTC或OTC或TC浓度为横坐标，以相对荧光值为纵坐标作标准曲线，计算回归方程及相关系数；其中，相对荧光值为激发波长370nm时发射波长525nm处的所测MTC或OTC或TC的荧光值与无MTC或OTC或TC时的荧光值差；
2)在酸性缓冲溶液中加入表面活性剂PEI、Mg2+及待测溶液形成待测体系，采用荧光光度分析仪检测待测体系在激发波长370nm时发射波长525nm处的荧光强度，将测得的相对荧光值代入回归方程中，得到待测溶液中的MTC或OTC或TC浓度；
其中，在5～100nmol/L的浓度范围内，MTC的线性方程为y＝5.3079x+0.0836；在10～2000nmol/L的浓度范围内，OTC的线性方程为y＝9.9725x+0.1567；在5～200nmol/L的浓度范围内，TC的线性方程为y＝15.277x-0.0161；
所述MTC为美他环素，OTC为土霉素，TC为四环素。
5.根据权利要求4所述的定量检测MTC或OTC或TC的方法，其特征在于，所述的MTC的检出限为3.6nmol/L。
6.根据权利要求4所述的定量检测MTC或O TC或TC的方法，其特征在于，所述的OTC的检出限为4.8nmol/L。
7.根据权利要求4所述的定量检测MTC或OTC或TC的方法，其特征在于，所述的TC的检出限为2.7nmol/L。
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