JPWO2006080396A1 - 組換え蛋白質の定量法 - Google Patents
組換え蛋白質の定量法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2006080396A1 JPWO2006080396A1 JP2007500571A JP2007500571A JPWO2006080396A1 JP WO2006080396 A1 JPWO2006080396 A1 JP WO2006080396A1 JP 2007500571 A JP2007500571 A JP 2007500571A JP 2007500571 A JP2007500571 A JP 2007500571A JP WO2006080396 A1 JPWO2006080396 A1 JP WO2006080396A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- epitope
- antibody
- amino acid
- seq
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title claims description 16
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title abstract description 22
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 107
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 100
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 77
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 74
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 32
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 29
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 21
- 108010004469 allophycocyanin Chemical class 0.000 claims description 17
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 7
- 150000002178 europium compounds Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 43
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- 108010051753 Spermidine Synthase Proteins 0.000 description 12
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 12
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 12
- 102100030413 Spermidine synthase Human genes 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000225 bioluminescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 4
- 239000000306 component Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000002868 homogeneous time resolved fluorescence Methods 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- -1 radioisotopes Substances 0.000 description 3
- 238000002821 scintillation proximity assay Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000002877 time resolved fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 3
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 3
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000800130 Bos taurus Thyroglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000701815 Homo sapiens Spermidine synthase Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 101150021841 Pnmt gene Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 101001060868 Strawberry mild yellow edge-associated virus Helicase Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Proteins 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GWQVMPWSEVRGPY-UHFFFAOYSA-N europium cryptate Chemical compound [Eu+3].N=1C2=CC=CC=1CN(CC=1N=C(C=CC=1)C=1N=C(C3)C=CC=1)CC(N=1)=CC(C(=O)NCCN)=CC=1C(N=1)=CC(C(=O)NCCN)=CC=1CN3CC1=CC=CC2=N1 GWQVMPWSEVRGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 2
- VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 101150003509 tag gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N N-ethyl-succinimide Natural products CCN1C(=O)CCC1=O GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229910052771 Terbium Inorganic materials 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 238000003016 alphascreen Methods 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 239000004637 bakelite Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- WSLQHGMJTGELSF-UHFFFAOYSA-L dipotassium;difluoride Chemical compound [F-].[F-].[K+].[K+] WSLQHGMJTGELSF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical class O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940066827 pertussis vaccine Drugs 0.000 description 1
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052761 rare earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical class [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YVSWPCCVTYEEHG-UHFFFAOYSA-N rhodamine B 5-isothiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(N=C=S)C=C1C(O)=O YVSWPCCVTYEEHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- MIDXXTLMKGZDPV-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[6-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)hexanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCCN1C(=O)C=CC1=O MIDXXTLMKGZDPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N terbium atom Chemical compound [Tb] GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本発明は組換え蛋白質を迅速、簡便かつ正確に定量するための方法を提供することを課題とする。その解決手段として２種類のエピトープを有するエピトープタグと標的蛋白質との融合タンパク質を発現させ、各エピトープを特異的に認識する検出抗体を接触させ、両検出抗体が互いに近接することにより生じる現象を検出することにより蛋白質量を測定する。
Description
本発明は、２種類のエピトープを有するエピトープタグを用いた組換え蛋白質の迅速な定量方法に関する。
「プロテオーム」に代表される蛋白質研究において、クローニングした遺伝子を細胞に導入して、組換え蛋白質を発現、分離精製することは、蛋白質の性質や機能を研究するうえで最も重要なテクニックの一つである。
また創薬のスクリーニングや医薬品製造等で蛋白質が大量に必要な場合にも、組換え蛋白質の発現、分離精製は避けて通れないステップである。
組換え蛋白質を発現させ、分離精製する際、予想よりも発現量が少なかったり、発現はするものの不溶性の沈殿となってしまったりすることがしばしば起こる。そのため、発現、分離精製について至適な条件を調べる必要があるが、条件検討をする際、組換え蛋白質を定量する機会が頻繁に発生する。
このような場合、一般的にはタグを用いて精製した後に、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動方法の他、ELISA、ウェスタンブロット等のイムノアッセイ（非特許文献１）が利用されている。このときの精製効率を上げるための多くのタグが知られている（非特許文献２）。
「実験医学別冊 タンパク質実験ハンドブック」、p128〜134、羊土社、2004年 K.Terpe 、Appl Microbiol Biotechnol、p523〜533、2003年
また創薬のスクリーニングや医薬品製造等で蛋白質が大量に必要な場合にも、組換え蛋白質の発現、分離精製は避けて通れないステップである。
組換え蛋白質を発現させ、分離精製する際、予想よりも発現量が少なかったり、発現はするものの不溶性の沈殿となってしまったりすることがしばしば起こる。そのため、発現、分離精製について至適な条件を調べる必要があるが、条件検討をする際、組換え蛋白質を定量する機会が頻繁に発生する。
このような場合、一般的にはタグを用いて精製した後に、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動方法の他、ELISA、ウェスタンブロット等のイムノアッセイ（非特許文献１）が利用されている。このときの精製効率を上げるための多くのタグが知られている（非特許文献２）。
「実験医学別冊 タンパク質実験ハンドブック」、p128〜134、羊土社、2004年 K.Terpe 、Appl Microbiol Biotechnol、p523〜533、2003年
しかしながら、従来の組換え蛋白質の定量法は、洗浄など他の物質との分離工程が必要となるため、複雑な操作過程及び時間を要していた。また、従来の組換え蛋白質の定量法は、組換え蛋白質の発現を確認するための定性的なものにとどまり、正確な定量を行うまでには至らなかった。また培地中など混合物の状態では、目的の組換え蛋白質を正確に定量することは困難であった。
従って、本発明の課題は、迅速、簡便かつ正確に組換え蛋白質を定量するための方法を提供することである。
従って、本発明の課題は、迅速、簡便かつ正確に組換え蛋白質を定量するための方法を提供することである。
即ち本発明によれば、
[１]
第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグと標的蛋白質との融合タンパク質に、第１エピトープを認識する検出抗体と第２エピトープを認識する検出抗体を接触させ、該両検出抗体が互いに近接することにより生じる現象を検出する工程を含み、該第１エピトープ及び第２エピトープが、それぞれを認識する検出抗体が結合した場合に該両検出抗体が互いに近接することができるように配置されていることを特徴とする標的蛋白質の定量方法、
[２]
該検出抗体が蛍光物質、発光体、ラジオアイソトープ及びビーズのいずれかにより標識されたものである上記[１]記載の方法、
[３]
該検出抗体がともに蛍光物質により標識されたものである上記[２]記載の方法、
[４]
該蛍光物質がユウロピウム化合物及びアロフィコシアニン誘導体の組み合わせからなる上記[３]記載の方法、
[５]
該現象が蛍光の共鳴によるエネルギーの転移である上記[１]から[４]のいずれかに記載の方法、
[６]
該検出抗体のいずれか一方のVH領域のアミノ酸配列が配列番号４として示されるものであり、VL領域のアミノ酸配列が配列番号５として示されるものである上記[１]記載の方法、
[７]
該検出抗体のいずれか一方のVH領域のアミノ酸配列が配列番号６として示されるものであり、VL領域のアミノ酸配列が配列番号７として示されるものである上記[１]または[６]に記載の方法、
[８]
該エピトープがいずれも６個以上８個以下のアミノ酸残基からなる上記[１]記載の方法、
[９]
該エピトープのいずれか一方のアミノ酸配列が配列番号１に示されるものである上記[８]記載の方法、
[１０]
該エピトープのいずれか一方のアミノ酸配列が配列番号２に示されるものである上記[８]または[９]に記載の方法、
[１１]
第１エピトープと第２エピトープが、ペプチドリンカーを通じて互いに連結されている上記[１]記載の方法、
[１２]
該ペプチドリンカーが３個以上６個以下のアミノ酸残基からなる上記[１１]記載の方法、
[１３]
該エピトープタグが１５個以上２２個以下のアミノ酸残基からなる上記[１]記載の方法、
[１４]
該エピトープタグのアミノ酸配列が配列番号３に示されるものである上記[１３]記載の方法、
[１５]
配列番号１４に示される配列からなる遺伝子を有する発現ベクター、
[１６]
第１エピトープを認識する検出抗体、第２エピトープを認識する検出抗体、並びに第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグをコードする遺伝子配列からなる遺伝子を有する発現ベクターを含んでなる標的蛋白質の定量用キット、
[１７]
上記[６]に記載の検出抗体、上記[７]に記載の検出抗体、及び上記[１５]に記載の発現ベクターを含んでなる上記[１６]の標的蛋白質の定量用キット、
が提供される。
[１８]
請求項[１]の方法を使用するためのキット。
[１９]
第１エピトープを認識する検出抗体及び第２エピトープを認識する検出抗体と、第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグと標的蛋白質との融合タンパク質の複合体。
[１]
第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグと標的蛋白質との融合タンパク質に、第１エピトープを認識する検出抗体と第２エピトープを認識する検出抗体を接触させ、該両検出抗体が互いに近接することにより生じる現象を検出する工程を含み、該第１エピトープ及び第２エピトープが、それぞれを認識する検出抗体が結合した場合に該両検出抗体が互いに近接することができるように配置されていることを特徴とする標的蛋白質の定量方法、
[２]
該検出抗体が蛍光物質、発光体、ラジオアイソトープ及びビーズのいずれかにより標識されたものである上記[１]記載の方法、
[３]
該検出抗体がともに蛍光物質により標識されたものである上記[２]記載の方法、
[４]
該蛍光物質がユウロピウム化合物及びアロフィコシアニン誘導体の組み合わせからなる上記[３]記載の方法、
[５]
該現象が蛍光の共鳴によるエネルギーの転移である上記[１]から[４]のいずれかに記載の方法、
[６]
該検出抗体のいずれか一方のVH領域のアミノ酸配列が配列番号４として示されるものであり、VL領域のアミノ酸配列が配列番号５として示されるものである上記[１]記載の方法、
[７]
該検出抗体のいずれか一方のVH領域のアミノ酸配列が配列番号６として示されるものであり、VL領域のアミノ酸配列が配列番号７として示されるものである上記[１]または[６]に記載の方法、
[８]
該エピトープがいずれも６個以上８個以下のアミノ酸残基からなる上記[１]記載の方法、
[９]
該エピトープのいずれか一方のアミノ酸配列が配列番号１に示されるものである上記[８]記載の方法、
[１０]
該エピトープのいずれか一方のアミノ酸配列が配列番号２に示されるものである上記[８]または[９]に記載の方法、
[１１]
第１エピトープと第２エピトープが、ペプチドリンカーを通じて互いに連結されている上記[１]記載の方法、
[１２]
該ペプチドリンカーが３個以上６個以下のアミノ酸残基からなる上記[１１]記載の方法、
[１３]
該エピトープタグが１５個以上２２個以下のアミノ酸残基からなる上記[１]記載の方法、
[１４]
該エピトープタグのアミノ酸配列が配列番号３に示されるものである上記[１３]記載の方法、
[１５]
配列番号１４に示される配列からなる遺伝子を有する発現ベクター、
[１６]
第１エピトープを認識する検出抗体、第２エピトープを認識する検出抗体、並びに第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグをコードする遺伝子配列からなる遺伝子を有する発現ベクターを含んでなる標的蛋白質の定量用キット、
[１７]
上記[６]に記載の検出抗体、上記[７]に記載の検出抗体、及び上記[１５]に記載の発現ベクターを含んでなる上記[１６]の標的蛋白質の定量用キット、
が提供される。
[１８]
請求項[１]の方法を使用するためのキット。
[１９]
第１エピトープを認識する検出抗体及び第２エピトープを認識する検出抗体と、第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグと標的蛋白質との融合タンパク質の複合体。
本発明を利用することにより、従来の技術では時間を要していた組換え蛋白質の定量が短時間で可能となる。また精製などの分離操作をすることなく定量が可能となることから、煩雑なステップを踏むことなく簡易に組換え蛋白質の正確な定量が可能となる。そのため、組換え蛋白質を発現させた培地中に他の蛋白質とともに存在する状態でも組換え蛋白質量を測定することもできる。なお、本発明はあらゆる種類の蛋白質に汎用できる技術である。
本発明は、第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグと標的蛋白質との融合タンパク質に、第１エピトープを認識する検出抗体と第２エピトープを認識する検出抗体を接触させ、該両検出抗体が互いに近接することにより生じる現象を検出する工程を含み、該第１エピトープ及び第２エピトープが、それぞれを認識する検出抗体が結合した場合に該検出抗体が互いに近接することができるように配置されていることを特徴とする標的蛋白質の定量方法である。以下に詳細を説明する。
本発明は、下記の（１）ないし（３）の工程を含むことを特徴とする。
（１）第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグを標的蛋白質に融合させた融合蛋白質を作製する。ここで、第１エピトープ及び第２エピトープは、それぞれを認識する以下の検出抗体が結合した場合に該両検出抗体が互いに近接することができるように配置されている工程。
（２）第１エピトープを認識する検出抗体と第２エピトープを認識する検出抗体を該融合蛋白質に接触させる工程。
（３）各エピトープに結合した検出抗体が互いに近接することにより生じる現象を検出する工程。
本発明に用いられる標的蛋白質とは、該蛋白質をコードするDNAを取得することが可能であって、そのDNAを発現させて蛋白質として生成できるものであればいかなるものであってもよい。また天然に存在する蛋白質、その変異体、人工蛋白質、及びその変異体等いずれも用いることができる。天然に存在する蛋白質としては、種々の生物の器官、組織または細胞に由来するcDNAライブラリーから転写翻訳されて得られるものでもよい。人工蛋白質としては、天然に存在する蛋白質の全てもしくは一部のアミノ酸配列を組み合わせた配列、またはランダムなアミノ酸配列を含むもの等が挙げられる。以下の実施例において、標的蛋白質としてスペルミジン合成酵素（SPDS）を定量する方法を示す。
（１）第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグを標的蛋白質に融合させた融合蛋白質を作製する。ここで、第１エピトープ及び第２エピトープは、それぞれを認識する以下の検出抗体が結合した場合に該両検出抗体が互いに近接することができるように配置されている工程。
（２）第１エピトープを認識する検出抗体と第２エピトープを認識する検出抗体を該融合蛋白質に接触させる工程。
（３）各エピトープに結合した検出抗体が互いに近接することにより生じる現象を検出する工程。
本発明に用いられる標的蛋白質とは、該蛋白質をコードするDNAを取得することが可能であって、そのDNAを発現させて蛋白質として生成できるものであればいかなるものであってもよい。また天然に存在する蛋白質、その変異体、人工蛋白質、及びその変異体等いずれも用いることができる。天然に存在する蛋白質としては、種々の生物の器官、組織または細胞に由来するcDNAライブラリーから転写翻訳されて得られるものでもよい。人工蛋白質としては、天然に存在する蛋白質の全てもしくは一部のアミノ酸配列を組み合わせた配列、またはランダムなアミノ酸配列を含むもの等が挙げられる。以下の実施例において、標的蛋白質としてスペルミジン合成酵素（SPDS）を定量する方法を示す。
抗原分子上に存在する抗体結合領域はエピトープと呼ばれる。抗体およびその抗体のエピトープの種類については特に限定されないが、本発明を実施するには抗体およびその抗体のエピトープが特定されていることが必要である。また、標的蛋白質に連結させることができるエピトープをエピトープタグと呼び、抗原抗体反応を利用して、タグを融合させた蛋白質の追跡、分離精製に利用されている。本発明において、エピトープタグは少なくとも二種類のエピトープ（たとえば、第１エピトープ及び第２エピトープ）を有することを特徴とする。
本発明の実施において使用するエピトープはそのアミノ酸配列が特定されていることが重要である。このとき、エピトープの配列としては、エピトープとして既知のアミノ酸配列を利用してもよく、また自らその配列を設計しても良い。このときエピトープは6個以上10個以下、好ましくは6個以上8個以下のアミノ酸残基から構成されることが望ましい。例えば、FLAG（DYKDDDDK、シグマ社、登録商標）、c-myc（EQKLISEEL）、ポリヒスチジン（HHHHHH）等はこの分野の当業者において公知のエピトープであり、これらのエピトープと特異的に結合できる抗体は市販されているので抗体の入手も容易である。これらのアミノ酸配列を含むものであればその前後にいかなるアミノ酸が添加されたものでも本発明のエピトープとして用いることができる。また、自らアミノ酸配列を設計する場合は、エピトープが抗体と特異的に結合する性質を有することを以下に示す記載の方法等によって確認することにより、本発明のエピトープとして用いることができる。
抗体のエピトープを特定する方法としては、（A）ある抗体と特異的に結合するアミノ酸配列を特定することにより決定する方法と、（B）特定のペプチド抗原により免疫して作製した抗体を用いる方法があるが、本発明の方法を実施するにあたってはいずれかの方法に限定されるものではない。
（A）抗体と特異的に結合するアミノ酸配列を決定する方法としては、該抗体を用いたウェスタンブロット（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76,3116(1979)）により特定していく方法が挙げられる。具体的には、例えば抗原として蛋白質を用いた場合には、まず蛋白質をコードするDNAを50〜200個程度のアミノ酸をコードする断片に制限酵素等により切断し、それぞれのDNA断片を適当な発現ベクターに挿入し、これを適当な宿主により転写、翻訳させて蛋白質を発現させ、この蛋白質と抗体との結合性を調べる。適当な発現ベクターとは、これを導入する宿主に適したものであればいかなるものであってもよいが、例えば宿主として大腸菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等を用いる場合には、それぞれpET、pNMT、p cDNA、pFastBac（すべてインビトロジェン社などから入手可）等を用いることができる。また転写、翻訳を行う系として、ウサギ網状赤血球、抽出小麦胚芽、大腸菌からの抽出液（大腸菌Ｓ30抽出液）等に基づいて調製された無細胞転写翻訳系を用いることもできる。これによりあるペプチド断片にエピトープを絞り込み、引き続いてそのペプチド断片中のアミノ酸配列5〜50個程度をコードするDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）や合成オリゴヌクレオチド等で作製し、これを適当な蛋白質と連結させて融合蛋白質として発現させ、抗体との結合性を調べる。この融合蛋白質に用いる適当な蛋白質とは、解析する抗体に結合しないものであればいかなるものであってもよい。かくして抗体に結合するために必要かつ十分な最も小さい単位のポリペプチドであるエピトープを特定することができる。
（A）抗体と特異的に結合するアミノ酸配列を決定する方法としては、該抗体を用いたウェスタンブロット（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76,3116(1979)）により特定していく方法が挙げられる。具体的には、例えば抗原として蛋白質を用いた場合には、まず蛋白質をコードするDNAを50〜200個程度のアミノ酸をコードする断片に制限酵素等により切断し、それぞれのDNA断片を適当な発現ベクターに挿入し、これを適当な宿主により転写、翻訳させて蛋白質を発現させ、この蛋白質と抗体との結合性を調べる。適当な発現ベクターとは、これを導入する宿主に適したものであればいかなるものであってもよいが、例えば宿主として大腸菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等を用いる場合には、それぞれpET、pNMT、p cDNA、pFastBac（すべてインビトロジェン社などから入手可）等を用いることができる。また転写、翻訳を行う系として、ウサギ網状赤血球、抽出小麦胚芽、大腸菌からの抽出液（大腸菌Ｓ30抽出液）等に基づいて調製された無細胞転写翻訳系を用いることもできる。これによりあるペプチド断片にエピトープを絞り込み、引き続いてそのペプチド断片中のアミノ酸配列5〜50個程度をコードするDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）や合成オリゴヌクレオチド等で作製し、これを適当な蛋白質と連結させて融合蛋白質として発現させ、抗体との結合性を調べる。この融合蛋白質に用いる適当な蛋白質とは、解析する抗体に結合しないものであればいかなるものであってもよい。かくして抗体に結合するために必要かつ十分な最も小さい単位のポリペプチドであるエピトープを特定することができる。
（B）一方、特定のペプチド抗原により免疫して作製した抗体を用いる方法とは、抗体を作製する際に予め特定のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、抗体のスクリーニングも該ペプチドにより行う方法である。このように作製された抗体のエピトープはすでに決定されているのであるから、該ペプチドを該抗体のエピトープとして特定することができる。
ある蛋白質に含まれる特定のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体の作製方法としては、例えば、Antibodies：A Laboratory Manual (1989)（Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法等を用いることができる。具体的には以下の通りである。抗体を作製するにあたり、まず免疫原が必要となる。「免疫原」とは、通常生体内において免疫応答を生じる、あるいは引き起こす能力を有する物質を表す。免疫原は、それ自体公知あるいはそれに準ずる方法（Antibodies：A Laboratory Manual，(1989)（Cold Spring Harbor Laboratory Press））にしたがって製造することができる。免疫原は必要に応じて、例えばウシ血清アルブミン（BSA）、ウシチログロブリン（BTG）、カギアナカサガイのヘモシアニン(KLH) などのキャリアタンパクとの複合体として用いられる。 通常ペプチドは分子量が小さいため免疫応答性を有しないためこのような複合体を免疫原として用いることが望ましい。
免疫は、例えば上記の免疫原を哺乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射などにより投与することにより行い得る。より具体的には、例えば免疫原を生理食塩水含有リン酸緩衝液(PBS)、生理食塩水などで適当濃度に希釈し、所望により通常のアジュバントと併用して、供試動物に2〜6週間間隔で計3〜10回程度投与する。免疫される哺乳動物としては、一般には、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラットなどが用いられる。マウスを用いる場合は、一回の投与量を一匹あたり50μg程度とする。ここで前記アジュバントとは抗原と共に投与したとき、非特異的に抗原に対する免疫反応を増強する物質をいう。通常用いられるアジュバントとしては、百日咳ワクチン、フロインドアジュバントなどを例示できる。最終免疫後3〜10日目に哺乳動物の採血を行うことによって、ポリクロナル抗体を得ることができる。
モノクロナル抗体の製造方法は、免疫原で免疫した哺乳動物の形質細胞(免疫細胞)と哺乳動物の形質細胞腫細胞(ミエローマ細胞)との融合細胞(ハイブリドーマ、hybridoma)を作製し、これより所望の抗原を認識するモノクロナル抗体を産生するクローンを選択し、該クローンを培養することにより実施できる。このモノクロナル抗体の製造は、基本的には常法に従うことができる(Kohler, G. and Milstein, C., Nature, 256, 495-497.(1975）参照)。
該方法において、免疫される哺乳動物は、細胞融合に使用する形質細胞腫細胞との適合性を考慮して選択するのが望ましく、マウス、ラットなどが用いられる。
得られた免疫細胞からハイブリドーマを得るには、例えば、「分子細胞生物学基礎実験法」（南江堂 堀江武一ら 1994）等に記載されている方法により、継代培養可能な細胞とすることを目的として、例えば、ポリエチレングリコール存在下、形質細胞腫細胞と抗体を産生する免疫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得ることができる。ここで用いられる形質細胞腫細胞は、同じ恒温動物でも同種の恒温動物由来の形質細胞腫細胞を用いることが望ましく、例えばマウスを免疫動物として得られた脾臓細胞と融合させる場合、マウスミエローマ細胞を用いることが好ましい。形質細胞腫細胞はp3x63-Ag8.UIなどの公知のものを利用できる。
ハイブリドーマは、通常HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）において培養することにより選択することができる。コロニーが確認された段階で、培養上清に分泌される抗体と抗原との結合を調べる（スクリーニングする）ことにより目的の抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。スクリーニングする方法としては、例えば、スポット法、凝集反応法、ウエスタンブロット法、ELISA法などの一般に抗体の検出に用いられている種々の方法が挙げられるが、好ましくは、ハイブリドーマの培養上清について、抗原との反応性を指標とするELISA法に従い実施される。このスクリーニングによって、抗原と特異的に反応する目的抗体産生株を選択することができる。
目的抗体産生株のクローニングは、通常、限界希釈法などにより実施できる。クローニングされたハイブリドーマは、必要に応じて、血清培地または無血清培地で大量培養することができる。この培養によれば、比較的高純度の所望抗体を培養上清として得ることができる。また、ハイブリドーマと適合性のある哺乳動物、例えばマウスなどの腹腔に、ハイブリドーマを接種して、所望抗体をマウス腹水として大量に回収することもできる。
本発明の抗体産生ハイブリドーマの培養上清およびマウスなどの腹水は、そのまま粗製抗体液として用いることができる。または硫酸アンモニウム分画、塩析、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテイクロマトグラフィ法などにより精製することができる。
本発明の実施例において使用するエピトープとして、Downs等（Journal of Immunological Methods 247,2001年）によって 既に特定されているヒト2型コラーゲンに由来する配列番号１及び配列番号２として配列表に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを用いた。また、本エピトープを特異的に認識するモノクロナル抗体は本明細書中に記載の方法に従って作製した。
このようにして作製した本発明の方法に使用できる抗体の具体的な例としては、例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体としてハイブリドーマTAG-6G4により産生されるモノクローナル抗体（以下、「6G4抗体」と称することがある）、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体としてハイブリドーマTAG-2E6により産生されるモノクローナル抗体（以下、「2E6抗体」と称することがある）が挙げられる。これらのハイブリドーマは、平成18年1月13日に、独立行政法人 産業技術総合研究所内 特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1 中央第6)に、「Mouse-Mouse Hybridoma TAG-2E6」（受領番号FERM ABP-10482）及び「Mouse-Mouse Hybridoma TAG-6G4」（受領番号FERM ABP-10483）なる表示で特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づいて国際寄託されている。
これらの抗体は、以下の理化学的および免疫学的性質を有している。
6G4抗体
（a）アミノ酸配列GEPGDDAPSからなるペプチドと特異的に結合する。
（b）配列番号4で示されるH鎖の可変領域（VH領域）と、配列番号5で示されるL鎖の可変領域（VL領域）をもつH鎖50kDa、L鎖27kDaからなる150ｋDaの蛋白質である。
（c）免疫グロブリンクラスIgG１（k）に属する。
2E6抗体
（d）アミノ酸配列GPPGPQGからなるペプチドと特異的に結合する。
（e）配列番号6で示されるVH領域と、配列番号7で示されるVL領域をもつH鎖50kDa、L鎖27kDaからなる150ｋDaの蛋白質である。
（f）免疫グロブリンクラスIgG2b（k）に属する。
6G4抗体
（a）アミノ酸配列GEPGDDAPSからなるペプチドと特異的に結合する。
（b）配列番号4で示されるH鎖の可変領域（VH領域）と、配列番号5で示されるL鎖の可変領域（VL領域）をもつH鎖50kDa、L鎖27kDaからなる150ｋDaの蛋白質である。
（c）免疫グロブリンクラスIgG１（k）に属する。
2E6抗体
（d）アミノ酸配列GPPGPQGからなるペプチドと特異的に結合する。
（e）配列番号6で示されるVH領域と、配列番号7で示されるVL領域をもつH鎖50kDa、L鎖27kDaからなる150ｋDaの蛋白質である。
（f）免疫グロブリンクラスIgG2b（k）に属する。
エピトープタグは、周知技術に従って標的蛋白質を分離精製するためにも使用できる。例えば、本発明により標的蛋白質の定量した後、本発明において使用されたエピトープタグ及び該タグを認識する抗体等を利用して、標的蛋白質を分離精製することができる。典型的には、まずエピトープタグに対する結合性リガンド（例えば、抗体、金属など）を固体表面に共有結合又は非共有結合させて通常用いられるカラムチューブ等に充填する。次に標的蛋白質を含む懸濁液等をカラムに添加した後、該カラムを適当な緩衝液などで洗浄する。洗浄後、カラムの適当な溶出液を添加すること、あるいは合成エピトープペプチド鎖により標的蛋白質を溶出し、他の蛋白質や培地中の成分から分離することが可能となる。
本発明の方法に使用するエピトープタグにおいては、少なくとも二つのエピトープが、それぞれのエピトープを認識する検出抗体が結合した場合に、該両検出抗体が互いに近接することができるように配置されていることを特徴とする。つまり、あるエピトープ（以下、「第１エピトープ」と称する）に免疫反応特異的に結合することができる検出抗体と、別のエピトープ（以下、「第２エピトープ」と称する）に免疫反応特異的に結合することができる検出抗体がエピトープにお互いが立体障害となることなく結合することを許容し、かつ各検出抗体が結合した状態で標識間に生じる反応を検出することができる位置関係にあることを意味する。２つのエピトープは直接連結されてもよく、適当なペプチドリンカーにより架橋されることもできる。一般的に抗体は分子量150KDaと、エピトープタグの大きさに比べて大きく、各検出抗体どうしの立体障害により抗体自身のエピトープへの結合を妨げる場合が生じる。そのため、適当な長さのペプチドリンカーを第１エピトープ及び第２エピトープ間に挿入することが望ましい。ペプチドリンカーにより２つのエピトープを架橋する場合は、通常0個以上20個以下、好ましくは3個以上6個以下のアミノ酸残基を挿入することが望ましい。またリンカーとして使用できるアミノ酸残基は特に限定されないが、エピトープ配列と交差反応性はなく、かつ、比較的小さな側鎖をもつように選ばれる。また第１エピトープ及び第２エピトープのアミノ酸配列については同一種由来に限定されず異種由来であっても良い。
エピトープタグの長さは特に限定されないが、標的蛋白質と融合蛋白質として作製した時に、標的蛋白質の構造に影響を及ぼさない程度の大きさが望ましく、通常12個以上40個以下、好ましくは15個以上22個以下のアミノ酸残基で構成されるのが好ましい。またシスチン形成による重合を避けるためにエピトープタグのアミノ酸配列中にシステイン残基を含まないことが望ましい。エピトープタグ自身は生物活性を有さないだけでなく標的蛋白質の生物活性に影響を及ぼさないことが望ましい。
本発明の方法に使用できるエピトープタグの具体的な例として、配列番号１として配列表に示すアミノ酸配列及び配列番号２として配列表に示すアミノ酸配列が３残基のペプチドリンカーを介して結合された19残基からなるアミノ酸配列（配列番号３）を有するポリペプチドが挙げられる。
上記のような標的蛋白質と第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグとの融合蛋白質の発現方法としては、標的蛋白質、及びエピトープタグをコードするDNA断片をフレームが合うように結合して適当なプロモーターの制御下におかれるように適当な発現ベクターに導入し、これを適当な宿主により転写、翻訳させて発現させることにより行う方法が挙げられる。上記エピトープタグと標的蛋白質の結合の順序は特に制限はなく、アミノ末端、カルボキシル末端のどちらに結合させてもよい。またエピトープタグと標的蛋白質との間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターXaなど）が認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、エピトープタグをこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。
このときエピトープタグの遺伝子と、標的蛋白質の遺伝子を挿入するための制限酵素サイトを、あらかじめ挿入したベクターを調製しておくと汎用性があり、発現ベクターの構築が容易になる。このようなエピトープタグ融合蛋白質発現ベクターとして、例えば、図１に示すようなエピトープタグ遺伝子として、配列番号14を挿入した構成を有する発現ベクターが挙げられる。またこのようなエピトープタグをコードする遺伝子配列からなる遺伝子を有する発現ベクターは、発現された融合蛋白質のエピトープタグを認識できる２種類以上の抗体（例えば、6G4抗体や2E6抗体）を後述するように標識した検出抗体と組み合わせることにより標的蛋白質の定量用キットとして使用することができる。また、本キットは、組換え蛋白質の作製にも使用できる。
適当な発現ベクターとしてはこれを導入する宿主に適したものであればいかなるものであってもよいが、例えば宿主として大腸菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等を用いる場合には、それぞれpET、pNMT、pcDNA、pFastBac（すべてインビトロジェン社などから入手可）等を用いることができる。また転写、翻訳を行う系として、ウサギ網状赤血球、抽出小麦胚芽、大腸菌からの抽出液（大腸菌Ｓ30抽出液）等に基づいて調製された無細胞転写翻訳系を用いることもできる。
本発明の方法は、２種類の検出抗体を上記のように発現したエピトープタグ融合蛋白質に接触させることを特徴とする。２種類のエピトープに免疫特異的に結合することができる抗体を利用して目的の組換え蛋白質を定量する方法は、従来から知られている（例えば、 特開平14−191364号公報等）。しかし、いずれの方法も組換え蛋白質を定量する場合、一般的手法としてこの分野の当業者に公知であるウエスタンブロットや、ELISAが利用されてきた。これらの方法は、混在物を電気泳動法等により分離する、もしくは混在物より捕獲抗体を介して固体表面に結合させた後に洗浄を繰り返す、などの分離操作を必要としていた。そのため蛋白質の定量操作は煩雑となり時間を要するものであった。一方、本発明の方法では、エピトープタグ及び２種類の検出抗体を組み合わせることによって他の蛋白質からの前記のような分離操作を不要とするため迅速・簡便な蛋白質の定量が可能となった。これらは組換え蛋白質の生産工程において有用な技術であると言える。
このとき検出抗体とは、抗体同士の近接を検出するため、標識物質により標識された抗体をさす。この検出抗体は予め宿主を培養する培地中に添加して培養してもよく、また培養終了後に添加、もしくは精製操作の後に添加しても良い。抗体は該エピトープを含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを特異的に認識するものであればモノクローナル、ポリクローナルのどちらでもよいが、前者の方が望ましい。抗体の作製は上述した方法に準ずることにより可能となる。また、抗体を標識物質により標識するには、例えば「分子細胞生物学基礎実験法」（南江堂 堀江武一ら1994年）等に記載されている常法により、もしくは標識物質に附属するマニュアルに従って行うことができる。
標識物質としては発光体、酵素、蛍光物質、ビーズ、ラジオアイソトープ、金属類、ビオチン等が挙げられる。発光体とは例えばルシフェノール、ルミノール、エクオリン、アクリジニウムエステルなどの化学発光物質をさす。酵素とは例えばルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどをさす。蛍光物質とは例えば、ユウロピウム(Eu)やテルビウム(Tb)などのランタニド元素、ユウロピウムクリプテートなどのランタニド元素誘導体、FITC（fluorescein isothiocyanate）などフルオロセイン誘導体、RITC（tetramethylrhodamin isothiocyanate）などローダミン誘導体、YFP、GFP、CFP、BFPアロフィコシアニン等の蛍光蛋白質が含まれる。ビーズとは例えばプロテイン Aビーズ、wheat germ agglutinin（WGA）ビーズ、ストレプトアビジンビーズなど特殊な処理を施されたビーズをさす。ラジオアイソトープとは例えば14C、125Ｉ、3H、35Ｓなどをさす。またこれらで標識された化合物も含むものとする。金属類とは例えばフェリチンや金コロイドなどをさす。
ただし、標識物質を選択するにあたっては後述するように、検出抗体の近接に伴う現象を検出できるような組み合わせを選択する必要がある。このような組み合わせとして、例えば蛍光物質標識と蛍光物質標識、発光体標識と蛍光物質標識、放射性同位体標識とビーズ等の組み合わせが一般に知られている。
本発明の方法は、２種類の検出抗体をエピトープタグ融合蛋白質に接触させた後に、両抗体が互いに近接することにより生じる現象を検出することを特徴とする。「近接することにより生じる現象を検出」とは、前記エピトープタグ融合蛋白質の第１エピトープを認識する検出抗体、第２エピトープを認識する検出抗体が結合して複合体を形成した状態において、二つの検出抗体の標識が互いに接近することにより生じる現象を検出することをさす。このような近接した二つの蛋白質（検出抗体）の相互作用を検出する方法はこの分野における研究者においてはよく知られており、例えばBRET法、FRET法、AlphaScreen法（登録商標）、SPA法(Scintillation Proximity Assay、登録商標）等が挙げられる。
近接することにより生じる現象を検出する方法の好ましい形態としては、共鳴による励起エネルギーの移動を検出する方法を挙げることができる。例えば、蛍光物質は励起光が照射されると励起状態となりそのエネルギーは蛍光もしくは熱エネルギーとして放出して基底状態に戻る（消光）。このとき近くに別の蛍光物質が存在すると、エネルギーを受けることによりこの蛍光物質がさらに励起されて同様に蛍光を発するという現象が生じる。このような現象は、蛍光共鳴エネルギー移動( fluorescence resonance energy transfer：以下FRETともいう)として知られている。このときの蛍光強度をルミノメーター等の測定機器で測定すれば溶液中に存在する標的蛋白質を測定することが可能となる。
この場合において、特に好ましい形態としては、蛍光寿命（消光するまでの時間）の長い蛍光物質をドナー（エネルギーを提供する分子）として選択する方法を挙げることができる。この方法ではプラスチックなどの妨害物質の蛍光が短寿命であるため、励起後、一定時間経過後に測定すればバックグラウンドの蛍光の影響を排除できる。このようなFRETを、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（TR-FRET）と呼ぶ。TR-FRETを検出する方法として、HTRF（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence、登録商標、CISバイオインターナショナル社）やLANCE（パーキンエルマーライフサイエンス社、登録商標）等が挙げられる。
HTRFは二種類の蛍光物質を用いることを特徴とする。具体的にはユウロピウム化合物であるユウロピウムクリプテート（以下クリプテート、トリスビピリジンの籠状構造の中に希土類元素のユウロピウムイオンが配位した構造をもつ）及び、アロフィコシアニン誘導体のXL665（藍藻由来蛍光性タンパクであるアロフィコシアニンを3分子架橋して安定化したもの）である。クリプテートに337nmの励起光を照射すると620nmの長寿命蛍光を発するが、検出抗体同士が接近して近傍にXL665が存在する場合、FRETにより、励起エネルギーがXL665へ移動するのでXL665から665nmの長寿命蛍光が生ずる。この長寿命蛍光を測定すればエピトープタグ融合蛋白質を測定することが可能となる。この方法の利点としてはクリプテートを励起後一定時間経過してから蛍光を測定することにより、測定試料や測定チューブに含まれる蛍光性物質に起因する短寿命のバックグラウンド蛍光（〜1 0ナノ秒）を排除して、長寿命蛍光（〜1ミリ秒）のみを選択的に検出することを可能にすることが挙げられる。また、XL665の665nmの蛍光とクリプテートの620nmの蛍光を同時に測定することにより、測定値を（665nmの蛍光強度÷620nmの蛍光強度）×10,000、で表すことで試薬添加量のばらつきや測定試料のカラークエンチング効果（インナーフィルター効果）による測定値の変動を補正することも可能にする。
他の形態としてBRET(Bioluminescence resonance energy transfer)と呼ばれる、生体発光共鳴によるエネルギー転移を利用する検出方法も挙げられる。例えば、二種類の検出抗体として、ルシフェラーゼ及びGreen Fluorescent protein変異体（GFP変異体）により標識した抗体を用いる。これらの検出抗体が近接すると、ルシフェリンとルシフェラーゼの発光反応により生じたエネルギーの一部がGFP変異体に移動して蛍光を発する現象(BRET)が生じる。このとき、蛍光強度を測定することにより、エピトープタグ融合蛋白質量ひいては標的蛋白質量を測定することが可能となる。
その他の形態として、ビーズ（例えばSPAビーズ、登録商標）及びラジオアイソトープ（例えば3H、14Cや125Ｉ等）で標識した検出抗体を組み合わせて使用する方法が挙げられる。２つの検出抗体が接近した場合、ラジオアイソトープから発せられたβ線などの放射線がビーズ内のシンチレーターに到達し、発光現象が生じるので、この発光を検出することにより、エピトープタグ融合蛋白質量ひいては標的蛋白質量を測定することが可能となる。
また、上記検出方法において、濃度既知のエピトープタグ融合蛋白質（以下、「標準物質蛋白質」と称することがある）を用いることにより、試験試料に含まれるエピトープタグ融合蛋白質もしくは標的蛋白質を正確に定量することができる。
更に、本発明に係わる上記の方法は、特定のキットの利用により簡便に実施可能であり、本発明はかかるキットをも提供する。
本発明に係わるキットは、少なくとも、発現ベクター及び検出抗体をその構成成分としている。発現ベクターには、第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグをコードする遺伝子配列が含まれており、ベクターに目的遺伝子を組み込んで常法に従えば２種類のエピトープを有するタグを末端に有した蛋白質をクローニングすることができる。また、検出抗体は２種類以上からなり各検出抗体はエピトープタグ部分に結合することができるものとする。また検出抗体は予め標識されたものであってもよい。さらに高効率な形質転換を可能とする宿主株を構成成分としてもよい。
以下において、実施例により本発明をより具体的にするが本発明はこれらに限定されるものではない。
エピトープを認識するモノクロナル抗体の作製
（１）6G4抗体の作製
ヒト２型コラーゲンのアミノ酸番号757-765に相当する領域（配列番号１）のC末端側にシステインを付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドとカギアナカサガイのヘモシアニン（KLH、ピアス社製）を、スルフォスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート（sulfo-SMCC、ピアス社製）を用いてコンジュゲートさせ、免疫原とした。免疫原をフロイントの完全アジュバント（ディフコ社製）と混合してエマルジョンとし、3週間毎にマウス（Balb/c CrSlc、6週齢、雌）の腹腔内に40μg投与した。4回免疫後にマウスの脾臓を摘出し、PEG法によりミエローマ細胞（p3×63-Ag8.UI、東京腫瘤研究所）と融合させ、ハイブリドーマを調製した。培養9日目に培養上清を採取し、抗体産生ハイブリドーマを含む陽性ウェルのスクリーニングを行った。スクリーニングは以下に述べる時間分解蛍光イムノアッセイ（DELFIA、アマシャム社、登録商標）で行った。抗マウスIgG抗体（シバヤギ社製）を固相したマイクロタイタープレート（住友ベークライト社製）に、測定緩衝液（150ｍM NaCl、0.01％Tween80、0.5％BSA、0.05％NaN3を含む50 mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5））50μl、培養上清50μl、標識抗原（20ng/mlビオチン標識抗原ペプチドと100ng/mlユウロピウム標識ストレプトアビジン（パーキンエルマーライフサイエンス社製）を含む測定緩衝液）50μlを連続して加え、4℃で16時間反応させた。洗浄液（150mM NaCl、0.02％NaN3、0.01％Tween20）200μlでプレートを2回洗浄した後、エンハンスメントソルーション（パーキンエルマーライフサイエンス社製）を150μl加え、1420ARVOsxマルチラベルカウンタ（パーキンエルマーライフサイエンス社製）で時間分解蛍光を測定した。本スクリーニングで反応性の高かった1ウェルを選択し、限界希釈法によるクローニングを2回繰り返して抗体産生ハイブリドーマTAG-6G4を確立した。TAG-6G4のサブクラスをマウスモノクロナル抗体アイソタイピングELISAキット（BD バイオサイエンス社製）で調べたところ、IgG1（k）であった。ハイブリドーマTAG-６G4をヌードマウス（BALB/cANNCrj-nu-nu）の腹腔内に投与して腹水を採取した（ラボプロダクツ社に委託）。プロテインAカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより腹水から精製抗体を得た。
（１）6G4抗体の作製
ヒト２型コラーゲンのアミノ酸番号757-765に相当する領域（配列番号１）のC末端側にシステインを付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドとカギアナカサガイのヘモシアニン（KLH、ピアス社製）を、スルフォスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート（sulfo-SMCC、ピアス社製）を用いてコンジュゲートさせ、免疫原とした。免疫原をフロイントの完全アジュバント（ディフコ社製）と混合してエマルジョンとし、3週間毎にマウス（Balb/c CrSlc、6週齢、雌）の腹腔内に40μg投与した。4回免疫後にマウスの脾臓を摘出し、PEG法によりミエローマ細胞（p3×63-Ag8.UI、東京腫瘤研究所）と融合させ、ハイブリドーマを調製した。培養9日目に培養上清を採取し、抗体産生ハイブリドーマを含む陽性ウェルのスクリーニングを行った。スクリーニングは以下に述べる時間分解蛍光イムノアッセイ（DELFIA、アマシャム社、登録商標）で行った。抗マウスIgG抗体（シバヤギ社製）を固相したマイクロタイタープレート（住友ベークライト社製）に、測定緩衝液（150ｍM NaCl、0.01％Tween80、0.5％BSA、0.05％NaN3を含む50 mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5））50μl、培養上清50μl、標識抗原（20ng/mlビオチン標識抗原ペプチドと100ng/mlユウロピウム標識ストレプトアビジン（パーキンエルマーライフサイエンス社製）を含む測定緩衝液）50μlを連続して加え、4℃で16時間反応させた。洗浄液（150mM NaCl、0.02％NaN3、0.01％Tween20）200μlでプレートを2回洗浄した後、エンハンスメントソルーション（パーキンエルマーライフサイエンス社製）を150μl加え、1420ARVOsxマルチラベルカウンタ（パーキンエルマーライフサイエンス社製）で時間分解蛍光を測定した。本スクリーニングで反応性の高かった1ウェルを選択し、限界希釈法によるクローニングを2回繰り返して抗体産生ハイブリドーマTAG-6G4を確立した。TAG-6G4のサブクラスをマウスモノクロナル抗体アイソタイピングELISAキット（BD バイオサイエンス社製）で調べたところ、IgG1（k）であった。ハイブリドーマTAG-６G4をヌードマウス（BALB/cANNCrj-nu-nu）の腹腔内に投与して腹水を採取した（ラボプロダクツ社に委託）。プロテインAカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより腹水から精製抗体を得た。
（２）2E6抗体の作製
ヒト2型コラーゲンのアミノ酸番号769-775に相当する領域（配列番号２）のN末端側にシステインを付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドとウシ血清アルブミン（BSA、ピアス社製）を（N-e-マレイミドカプロイロキシ）スルフォスクシンイミドエステル（Sulfo-EMCS、ピアス社製）を用いてコンジュゲートさせ、免疫原とした。TAG-6G4と同様、免疫原をマウス（A/J Jms Slc、6週齢、雌）へ投与し、脾臓を摘出して細胞融合を行った。DELFIAによるスクリーニングとクローニングを行い、抗体産生ハイブリドーマTAG-2E6を確立した。抗体のサブクラスはIgG2b（k）であった。ヌードマウスの腹水化とプロテインAカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製抗体を得た。
ヒト2型コラーゲンのアミノ酸番号769-775に相当する領域（配列番号２）のN末端側にシステインを付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドとウシ血清アルブミン（BSA、ピアス社製）を（N-e-マレイミドカプロイロキシ）スルフォスクシンイミドエステル（Sulfo-EMCS、ピアス社製）を用いてコンジュゲートさせ、免疫原とした。TAG-6G4と同様、免疫原をマウス（A/J Jms Slc、6週齢、雌）へ投与し、脾臓を摘出して細胞融合を行った。DELFIAによるスクリーニングとクローニングを行い、抗体産生ハイブリドーマTAG-2E6を確立した。抗体のサブクラスはIgG2b（k）であった。ヌードマウスの腹水化とプロテインAカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製抗体を得た。
（３）VH領域とVL領域のアミノ酸配列の決定
RneasyMiniキット（キアゲン社製）を用いて１×107個のハイブリドーマからtotal RNAを精製した。SMARTTMRACE cDNA増幅キット（BDバイオサイエンス社製）を利用して、キットの操作手順に従ってVH領域とVL領域の遺伝子配列を決定した。SMARTIIAオリゴヌクレオチドとTAG-6G4のVH領域に特異的なプライマー（配列番号8）、TAG-２E6のVH領域に特異的なプライマー（配列番号9）、Vl領域に特異的なプライマー（配列番号10）を用いてｃDNAを合成した。これらのｃDNAを鋳型として、ユニバーサルプライマーとTAG-6G4のVH領域に特異的なプライマー（配列番号11）、TAG-２E6のVH領域に特異的なプライマー（配列番号12）、Vl領域に特異的なプライマー（配列番号13）、を用いてPCRを行い、VH遺伝子、VL遺伝子を増幅した。これらのPCR産物をTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）でクローニングし、シークエンスを解析した（オペロンバイオテクノロジー社に依託）。得られた遺伝子配列からVH領域とVL領域のアミノ酸配列を決定した。
RneasyMiniキット（キアゲン社製）を用いて１×107個のハイブリドーマからtotal RNAを精製した。SMARTTMRACE cDNA増幅キット（BDバイオサイエンス社製）を利用して、キットの操作手順に従ってVH領域とVL領域の遺伝子配列を決定した。SMARTIIAオリゴヌクレオチドとTAG-6G4のVH領域に特異的なプライマー（配列番号8）、TAG-２E6のVH領域に特異的なプライマー（配列番号9）、Vl領域に特異的なプライマー（配列番号10）を用いてｃDNAを合成した。これらのｃDNAを鋳型として、ユニバーサルプライマーとTAG-6G4のVH領域に特異的なプライマー（配列番号11）、TAG-２E6のVH領域に特異的なプライマー（配列番号12）、Vl領域に特異的なプライマー（配列番号13）、を用いてPCRを行い、VH遺伝子、VL遺伝子を増幅した。これらのPCR産物をTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）でクローニングし、シークエンスを解析した（オペロンバイオテクノロジー社に依託）。得られた遺伝子配列からVH領域とVL領域のアミノ酸配列を決定した。
エピトープタグ融合蛋白質の作製
（１）発現ベクターの作製
Gatewayテクノロジー（インビトロジェン社）を利用して行った。標的蛋白質として、配列番号15として配列表に示されるヒトスペルミジン合成酵素(SPDS、GenBank Accession No.NP003123 )を用いた。この遺伝子を当業者に公知の方法でクローニングした後、制限酵素サイトSacIとNotIを介してエントリーベクターpENTR11に挿入し、エントリークローンを得た。さらに3×FLAGタグ（シグマ社製）とGateway Vector Conversion Systemの Reading Frame Cassette Aを連結した遺伝子をPCRで増幅し、NheIとKpnIの制限酵素サイトを介してpShuttleベクター（クロンテック社製）に挿入し、デスティネーションベクターとした。エントリークローンとデスティネーションベクターをClonase存在下混合してattサイト間の部位特異的組み換えを誘導することにより、アミノ末端に3×FLAGタグを繋いだヒトSPDSの発現ベクターをクローニングした。さらにSPDS遺伝子のApaIサイトとNotIサイト間の領域を取り除き、同領域にエピトープタグをコードする遺伝子配列（配列番号14）を有するDNAを連結させ、エピトープタグ融合蛋白質の発現ベクターとした。
（１）発現ベクターの作製
Gatewayテクノロジー（インビトロジェン社）を利用して行った。標的蛋白質として、配列番号15として配列表に示されるヒトスペルミジン合成酵素(SPDS、GenBank Accession No.NP003123 )を用いた。この遺伝子を当業者に公知の方法でクローニングした後、制限酵素サイトSacIとNotIを介してエントリーベクターpENTR11に挿入し、エントリークローンを得た。さらに3×FLAGタグ（シグマ社製）とGateway Vector Conversion Systemの Reading Frame Cassette Aを連結した遺伝子をPCRで増幅し、NheIとKpnIの制限酵素サイトを介してpShuttleベクター（クロンテック社製）に挿入し、デスティネーションベクターとした。エントリークローンとデスティネーションベクターをClonase存在下混合してattサイト間の部位特異的組み換えを誘導することにより、アミノ末端に3×FLAGタグを繋いだヒトSPDSの発現ベクターをクローニングした。さらにSPDS遺伝子のApaIサイトとNotIサイト間の領域を取り除き、同領域にエピトープタグをコードする遺伝子配列（配列番号14）を有するDNAを連結させ、エピトープタグ融合蛋白質の発現ベクターとした。
（２）エピトープタグ融合蛋白質 の発現と精製
リポフェクトアミン2000（インビトロジェン社製）と前記発現ベクターを用い、手順書に従ってHEK293細胞（ヒト胎児腎臓由来、アメリカンタイプカルチャーコレクション社より入手）にトランスフェクトした。この細胞を2日間培養した後、遠心分離して回収し、少量のプロテアーゼインヒビターカクテルを含む氷冷PBSに懸濁させ、超音波処理で破砕した。PBSで平衡化した2E6抗体を結合させた担体カラム（ピアス社製アミノリンク固定化キットを用いて手順書に従って調製したもの）に細胞破砕液を通し、PBSで十分に洗浄した。最後に0.2 Mグリシン緩衝液（pH3.0）をカラムに通してタンパク溶出分画を回収し、トリス塩酸（pH9.0）で中和してPBSで透析した。プロテインアッセイ試薬（バイオラッド社製）でタンパク濃度を決定し、標準物質とした。
リポフェクトアミン2000（インビトロジェン社製）と前記発現ベクターを用い、手順書に従ってHEK293細胞（ヒト胎児腎臓由来、アメリカンタイプカルチャーコレクション社より入手）にトランスフェクトした。この細胞を2日間培養した後、遠心分離して回収し、少量のプロテアーゼインヒビターカクテルを含む氷冷PBSに懸濁させ、超音波処理で破砕した。PBSで平衡化した2E6抗体を結合させた担体カラム（ピアス社製アミノリンク固定化キットを用いて手順書に従って調製したもの）に細胞破砕液を通し、PBSで十分に洗浄した。最後に0.2 Mグリシン緩衝液（pH3.0）をカラムに通してタンパク溶出分画を回収し、トリス塩酸（pH9.0）で中和してPBSで透析した。プロテインアッセイ試薬（バイオラッド社製）でタンパク濃度を決定し、標準物質とした。
ウエスタンブロットによるエピトープタグ融合蛋白質の定量
ウエスタンブロットは一般的な手法（例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition（2001））で行った。アッセイバッファー（0.5%BSA、150mM NaClを含む50mMトリス緩衝液（pH7.4））を用いて標準物質 の2倍希釈系列を調製し、各々10μlを5-10％アクリルアミドゲル（アトー社製）で展開し、PVDFメンブレン（ミリポア社製）へ転写した。メンブレンをブロックエース（大日本製薬社製）でブロッキングした後、6G4抗体または2E6抗体を0.5-1μg/ml含むブロックエースに浸し、室温で1時間反応させた。メンブレンを洗浄バッファー（0.05%Tween20を含むPBS）で十分に洗浄した後、HRP標識抗マウスIgG抗体（アマシャム社製）をブロックエースで5,000倍に希釈した液に浸し、室温で0.5時間反応させた。メンブレンを再度洗浄した後、手順書に従って、化学発光試薬ECL plus（アマシャム社製）と反応させ、HyperFilm-ECL（アマシャム社製）に露光させた。
ウエスタンブロットは一般的な手法（例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition（2001））で行った。アッセイバッファー（0.5%BSA、150mM NaClを含む50mMトリス緩衝液（pH7.4））を用いて標準物質 の2倍希釈系列を調製し、各々10μlを5-10％アクリルアミドゲル（アトー社製）で展開し、PVDFメンブレン（ミリポア社製）へ転写した。メンブレンをブロックエース（大日本製薬社製）でブロッキングした後、6G4抗体または2E6抗体を0.5-1μg/ml含むブロックエースに浸し、室温で1時間反応させた。メンブレンを洗浄バッファー（0.05%Tween20を含むPBS）で十分に洗浄した後、HRP標識抗マウスIgG抗体（アマシャム社製）をブロックエースで5,000倍に希釈した液に浸し、室温で0.5時間反応させた。メンブレンを再度洗浄した後、手順書に従って、化学発光試薬ECL plus（アマシャム社製）と反応させ、HyperFilm-ECL（アマシャム社製）に露光させた。
（結果）ウエスタンブロットによるエピトープタグ融合蛋白質の測定結果を図2に示す。
6G4抗体、2E6抗体どちらを使った場合も、分子量3.5kDaの位置にエピトープタグ融合蛋白質に相当すると思われる単一のバンドが得られた。これらのバンドは使用した標準物質の量に依存して強くなった。またエピトープタグ融合蛋白質の検出限界は、6G4抗体を用いた場合が8.9fmol、2E6抗体を用いた場合が18fmolであった。
6G4抗体、2E6抗体どちらを使った場合も、分子量3.5kDaの位置にエピトープタグ融合蛋白質に相当すると思われる単一のバンドが得られた。これらのバンドは使用した標準物質の量に依存して強くなった。またエピトープタグ融合蛋白質の検出限界は、6G4抗体を用いた場合が8.9fmol、2E6抗体を用いた場合が18fmolであった。
本発明の方法によるエピトープ融合蛋白質の定量
（１）6G4抗体のクリプテート標識
6G4抗体を0.1 Mリン酸塩緩衝液（pH8.0）で1 mg/mlとした。抗体1モルに対してクリプテートTBPモノスベレート（CIS バイオインターナショナル社製）を15モル加えて、25 ℃で1時間反応させた。反応液につき、PBSで予め平衡化したPD- 10カラム（アマシャム社製）を用いたゲルろ過を行い標識抗体を分取した。標識抗体は0.1 % ウシ血清アルブミン、0.1 % Tween20、0.05%アジ化ナトリウムを添加して-70 ℃で保存した。
（１）6G4抗体のクリプテート標識
6G4抗体を0.1 Mリン酸塩緩衝液（pH8.0）で1 mg/mlとした。抗体1モルに対してクリプテートTBPモノスベレート（CIS バイオインターナショナル社製）を15モル加えて、25 ℃で1時間反応させた。反応液につき、PBSで予め平衡化したPD- 10カラム（アマシャム社製）を用いたゲルろ過を行い標識抗体を分取した。標識抗体は0.1 % ウシ血清アルブミン、0.1 % Tween20、0.05%アジ化ナトリウムを添加して-70 ℃で保存した。
（２）2E6抗体のXL665標識
0.1 Mリン酸塩緩衝液（pH7.0）に溶かした2E6抗体に、8倍モル量のN- スクシンイミジル 3- (2- ピリジルジチオ) プロピオネート（SPDP、Pierce社製）を加えて25 ℃で20分間反応させた。反応液に終濃度10 mMのジチオスレイトール（DTT）を加えてさらに10分間反応させた後、10 mM EDTAを含む0.1 Mリン酸塩緩衝液（pH7.0）で予め平衡化したPD-10カラムを用いたゲルろ過を行い、システイン基を導入した2E6抗体を分取した（SH-2E6抗体）。XL665（CISバイオインターナショナル社製）を0.1 Mリン酸塩緩衝液（pH7.0）に薄め、5倍モル量のSulfo-SMCCを加えて25 ℃で30分間反応させた。0.1 Mリン酸塩緩衝液（pH7.0）で予め平衡化したPD-10カラムを用いたゲルろ過を行い、マレイミド基を導入したXL665を分取した（マレイミド化XL665）。１モルのマレイミド化XL665に対して上記のSH- 2E6抗体を3モル加えて4 ℃で16時間反応させ、XL665標識抗体を得た。標識抗体は100倍モル量のN-エチルマレイミドを加えて室温で10分間放置した後、0.1 % ウシ血清アルブミン、0.1 % Tween20、0.05%アジ化ナトリウムを添加して-70 ℃で保存した。
0.1 Mリン酸塩緩衝液（pH7.0）に溶かした2E6抗体に、8倍モル量のN- スクシンイミジル 3- (2- ピリジルジチオ) プロピオネート（SPDP、Pierce社製）を加えて25 ℃で20分間反応させた。反応液に終濃度10 mMのジチオスレイトール（DTT）を加えてさらに10分間反応させた後、10 mM EDTAを含む0.1 Mリン酸塩緩衝液（pH7.0）で予め平衡化したPD-10カラムを用いたゲルろ過を行い、システイン基を導入した2E6抗体を分取した（SH-2E6抗体）。XL665（CISバイオインターナショナル社製）を0.1 Mリン酸塩緩衝液（pH7.0）に薄め、5倍モル量のSulfo-SMCCを加えて25 ℃で30分間反応させた。0.1 Mリン酸塩緩衝液（pH7.0）で予め平衡化したPD-10カラムを用いたゲルろ過を行い、マレイミド基を導入したXL665を分取した（マレイミド化XL665）。１モルのマレイミド化XL665に対して上記のSH- 2E6抗体を3モル加えて4 ℃で16時間反応させ、XL665標識抗体を得た。標識抗体は100倍モル量のN-エチルマレイミドを加えて室温で10分間放置した後、0.1 % ウシ血清アルブミン、0.1 % Tween20、0.05%アジ化ナトリウムを添加して-70 ℃で保存した。
（３）エピトープタグ融合蛋白質の測定
アッセイバッファー（0.5%BSAを含むトリス緩衝生理食塩水（TBS））、動物細胞（HEK293細胞）、昆虫細胞（Sf9細胞）、分裂酵母および大腸菌を破砕した抽出液あるいはこれらの培養上清によって標準物質（実施例２参照）の2倍希釈系列を作製した。これらの標準物質希釈液を384ウェルアッセイプレートに1ウェルあたり10μlずつ添加し、さらに２種類の検出抗体を含むアッセイバッファー（200ng/mlクリプテート標識6G4抗体、5,000ng/ml XL665標識2E 6抗体、0.8Mフッ化カリウム、0.5%BSAを含むTBS）を10 μl添加して室温で反応させた。反応開始5分後及び24時間後について、各ウェルの蛍光強度をRubystar（BMG Labtechnologis社製）により測定した。
次に、実施例2により作製した発現用プラスミドを用いてリポフェクトアミン2000（インビトロジェン社製）によりHEK293細胞をトランスフェクションして5％CO2存在下、37℃で三日間培養した後、遠心分離により細胞を回収し、プロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ社製）を含むP BSに懸濁させた。細胞を超音波破砕し、抽出液中に存在する蛋白質量を本発明の方法により測定した。
アッセイバッファー（0.5%BSAを含むトリス緩衝生理食塩水（TBS））、動物細胞（HEK293細胞）、昆虫細胞（Sf9細胞）、分裂酵母および大腸菌を破砕した抽出液あるいはこれらの培養上清によって標準物質（実施例２参照）の2倍希釈系列を作製した。これらの標準物質希釈液を384ウェルアッセイプレートに1ウェルあたり10μlずつ添加し、さらに２種類の検出抗体を含むアッセイバッファー（200ng/mlクリプテート標識6G4抗体、5,000ng/ml XL665標識2E 6抗体、0.8Mフッ化カリウム、0.5%BSAを含むTBS）を10 μl添加して室温で反応させた。反応開始5分後及び24時間後について、各ウェルの蛍光強度をRubystar（BMG Labtechnologis社製）により測定した。
次に、実施例2により作製した発現用プラスミドを用いてリポフェクトアミン2000（インビトロジェン社製）によりHEK293細胞をトランスフェクションして5％CO2存在下、37℃で三日間培養した後、遠心分離により細胞を回収し、プロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ社製）を含むP BSに懸濁させた。細胞を超音波破砕し、抽出液中に存在する蛋白質量を本発明の方法により測定した。
（結果）動物細胞、大腸菌、分裂酵母、昆虫細胞の抽出液及び培地成分におけるエピトープタグ融合蛋白質（SPDS）の標準曲線を図3に示す。これらの結果は、本発明の測定方法が試料の影響をほとんど受けないことを示している。このことは、本発明の定量法に各種発現系の試料を精製することなく直接利用できることを示唆するものである。
次にアッセイで使用したバッファーで調製した既知濃度の標準物質について定量値の変動係数（CV、平均値に対する標準偏差の割合）を求めた（n=16）。このとき変動係数が15％未満の値を示す時の蛋白質の濃度を定量限界値とした。標準物質濃度と変動係数（％）の関係を図4に示す。
本発明の方法で測定を行った場合、5分間後の定量限界値は2.1fmol（210pmol/L）であった。また24時間後では0.27fmol（27pmol/L）であった。いずれの値もウエスタンブロットにおける検出限界（8.9fmol、18fmol）を上回るものであった。これらの結果は、目的のエピトープタグ融合蛋白質の発現量を調べるのに、ウエスタンブロットでは、結果を確認するまでほぼ二日間要するのに対して、本発明の方法では僅か5分間で同等の精度の測定が可能であることを示すものである。また24時間後では、その精度はウエスタンブロット法を超えており微量にしか発現できない組換え蛋白質の測定にも利用できる。
また、実際に標的蛋白質（SPDS）をHEK293細胞により発現させた後、本発明の方法により抽出液中に含まれる標的蛋白質（SPDS）の発現量を測定した結果、僅か5分間の反応で、抽出液中に含まれるエピトープタグ融合蛋白質（SPDS）の測定値を得ることができた（図5）。
以上の結果は、本発明のエピトープタグ融合蛋白質の定量法がウエスタンブロットなどの既存法と比べて迅速、簡便であり、また高感度検出が可能で定量性にも優れていることを示すものといえる。
次にアッセイで使用したバッファーで調製した既知濃度の標準物質について定量値の変動係数（CV、平均値に対する標準偏差の割合）を求めた（n=16）。このとき変動係数が15％未満の値を示す時の蛋白質の濃度を定量限界値とした。標準物質濃度と変動係数（％）の関係を図4に示す。
本発明の方法で測定を行った場合、5分間後の定量限界値は2.1fmol（210pmol/L）であった。また24時間後では0.27fmol（27pmol/L）であった。いずれの値もウエスタンブロットにおける検出限界（8.9fmol、18fmol）を上回るものであった。これらの結果は、目的のエピトープタグ融合蛋白質の発現量を調べるのに、ウエスタンブロットでは、結果を確認するまでほぼ二日間要するのに対して、本発明の方法では僅か5分間で同等の精度の測定が可能であることを示すものである。また24時間後では、その精度はウエスタンブロット法を超えており微量にしか発現できない組換え蛋白質の測定にも利用できる。
また、実際に標的蛋白質（SPDS）をHEK293細胞により発現させた後、本発明の方法により抽出液中に含まれる標的蛋白質（SPDS）の発現量を測定した結果、僅か5分間の反応で、抽出液中に含まれるエピトープタグ融合蛋白質（SPDS）の測定値を得ることができた（図5）。
以上の結果は、本発明のエピトープタグ融合蛋白質の定量法がウエスタンブロットなどの既存法と比べて迅速、簡便であり、また高感度検出が可能で定量性にも優れていることを示すものといえる。
配列番号１は、抗体を作製するのに用いたポリペプチドの配列である。
配列番号２は、抗体を作製するのに用いたポリペプチドの配列である。
配列番号３は、エピトープタグとして用いたポリペプチドの配列である。
配列番号４は、6G4抗体の可変領域（VH）のアミノ酸配列である。
配列番号5は、6G4抗体の可変領域（VL）のアミノ酸配列である。
配列番号6は、2E6抗体の可変領域（VH）のアミノ酸配列である。
配列番号7は、2E6抗体の可変領域（VL）のアミノ酸配列である。
配列番号８は、6G4抗体のVH領域のcDNAを合成するために設計されたオリゴヌクレオチドである。
配列番号9は、2E6抗体のVH領域のcDNAを合成するために設計されたオリゴヌクレオチドである。
配列番号10は、6G4抗体及び2E6抗体のVL領域のcDNAを合成するために設計されたオリゴヌクレオチドである。
配列番号11は、6G4抗体のVH領域の遺伝子を増幅するために設計されたPCRのオリゴプライマーである。
配列番号12は、2E6抗体のVH領域の遺伝子を増幅するために設計されたPCRのオリゴプライマーである。
配列番号1３は、6G4抗体及び2E6抗体のVL領域の遺伝子を増幅するために設計されたPCRのオリゴプライマーである。
配列番号14は、配列番号３に記載したエピトープタグのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列である。
配列番号15は、ヒト由来スペルミジン合成酵素(SPDS)のcDNAである。
配列番号２は、抗体を作製するのに用いたポリペプチドの配列である。
配列番号３は、エピトープタグとして用いたポリペプチドの配列である。
配列番号４は、6G4抗体の可変領域（VH）のアミノ酸配列である。
配列番号5は、6G4抗体の可変領域（VL）のアミノ酸配列である。
配列番号6は、2E6抗体の可変領域（VH）のアミノ酸配列である。
配列番号7は、2E6抗体の可変領域（VL）のアミノ酸配列である。
配列番号８は、6G4抗体のVH領域のcDNAを合成するために設計されたオリゴヌクレオチドである。
配列番号9は、2E6抗体のVH領域のcDNAを合成するために設計されたオリゴヌクレオチドである。
配列番号10は、6G4抗体及び2E6抗体のVL領域のcDNAを合成するために設計されたオリゴヌクレオチドである。
配列番号11は、6G4抗体のVH領域の遺伝子を増幅するために設計されたPCRのオリゴプライマーである。
配列番号12は、2E6抗体のVH領域の遺伝子を増幅するために設計されたPCRのオリゴプライマーである。
配列番号1３は、6G4抗体及び2E6抗体のVL領域の遺伝子を増幅するために設計されたPCRのオリゴプライマーである。
配列番号14は、配列番号３に記載したエピトープタグのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列である。
配列番号15は、ヒト由来スペルミジン合成酵素(SPDS)のcDNAである。
Claims (19)
- 第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグと標的蛋白質との融合タンパク質に、第１エピトープを認識する検出抗体と第２エピトープを認識する検出抗体を接触させ、該両検出抗体が互いに近接することにより生じる現象を検出する工程を含み、該第１エピトープ及び第２エピトープが、それぞれを認識する検出抗体が結合した場合に該両検出抗体が互いに近接することができるように配置されていることを特徴とする標的蛋白質の定量方法。
- 該検出抗体が蛍光物質、発光体、ラジオアイソトープ及びビーズのいずれかにより標識されたものである請求項１記載の方法。
- 該検出抗体がともに蛍光物質により標識されたものである請求項２記載の方法。
- 該蛍光物質がユウロピウム化合物及びアロフィコシアニン誘導体の組み合わせからなる請求項３記載の方法。
- 該現象が蛍光の共鳴によるエネルギーの転移である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
- 該検出抗体のいずれか一方のVH領域のアミノ酸配列が配列番号４として示されるものであり、VL領域のアミノ酸配列が配列番号５として示されるものである請求項１記載の方法。
- 該検出抗体のいずれか一方のVH領域のアミノ酸配列が配列番号６として示されるものであり、VL領域のアミノ酸配列が配列番号７として示されるものである請求項１または６に記載の方法。
- 該エピトープがいずれも６個以上８個以下のアミノ酸残基からなる請求項１記載の方法。
- 該エピトープのいずれか一方のアミノ酸配列が配列番号１に示されるものである請求項８記載の方法。
- 該エピトープのいずれか一方のアミノ酸配列が配列番号２に示されるものである請求項８または9に記載の方法。
- 第１エピトープと第２エピトープが、ペプチドリンカーを通じて互いに連結されている請求項１記載の方法。
- 該ペプチドリンカーが３個以上６個以下のアミノ酸残基からなる請求項１１記載の方法。
- 該エピトープタグが１５個以上２２個以下のアミノ酸残基からなる請求項１記載の方法。
- 該エピトープタグのアミノ酸配列が配列番号３に示されるものである請求項１３記載の方法。
- 配列番号１４に示される配列からなる遺伝子を有する発現ベクター。
- 第１エピトープを認識する検出抗体、第２エピトープを認識する検出抗体、並びに第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグをコードする遺伝子配列からなる遺伝子を有する発現ベクターを含んでなる標的蛋白質の定量用キット。
- 請求項６に記載の検出抗体、請求項７に記載の検出抗体、及び請求項１５記載の発現ベクターを含んでなる請求項１６記載の標的蛋白質の定量用キット。
- 請求項[１]の方法を使用するためのキット。
- 第１エピトープを認識する検出抗体及び第２エピトープを認識する検出抗体と、第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグと標的蛋白質との融合タンパク質の複合体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007500571A JP4683572B2 (ja) | 2005-01-28 | 2006-01-26 | 組換え蛋白質の定量法 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005020856 | 2005-01-28 | ||
| JP2005020856 | 2005-01-28 | ||
| JP2007500571A JP4683572B2 (ja) | 2005-01-28 | 2006-01-26 | 組換え蛋白質の定量法 |
| PCT/JP2006/301226 WO2006080396A1 (ja) | 2005-01-28 | 2006-01-26 | 組換え蛋白質の定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2006080396A1 true JPWO2006080396A1 (ja) | 2008-06-19 |
| JP4683572B2 JP4683572B2 (ja) | 2011-05-18 |
Family
ID=36740422
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007500571A Expired - Fee Related JP4683572B2 (ja) | 2005-01-28 | 2006-01-26 | 組換え蛋白質の定量法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20090298196A1 (ja) |
| EP (1) | EP1845376A4 (ja) |
| JP (1) | JP4683572B2 (ja) |
| WO (1) | WO2006080396A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012528848A (ja) * | 2009-06-01 | 2012-11-15 | ノバルティス アーゲー | 肺炎球菌ＲｒｇＢクレイドの組み合わせ |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006095654A1 (ja) * | 2005-03-07 | 2006-09-14 | Shionogi & Co., Ltd. | レポータ遺伝子アッセイ法 |
| CN102482348B (zh) * | 2009-09-16 | 2014-08-27 | 盐野义制药株式会社 | 胶原新表位抗体 |
| AU2010305150A1 (en) * | 2009-10-09 | 2012-04-05 | Symphogen A/S | Multiplex quantitation of individual recombinant proteins in a mixture by signature peptides and mass spectrometry |
| CN106916839B (zh) * | 2015-12-25 | 2021-01-26 | 中国科学院海洋研究所 | 一种高荧光强度的重组藻胆蛋白串联体的制备方法 |
| WO2024072083A1 (ko) * | 2022-09-28 | 2024-04-04 | (재)씨젠의료재단 | 질량 보정을 위한 신규한 내부표준물질 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10319017A (ja) * | 1997-05-20 | 1998-12-04 | Toyobo Co Ltd | 蛍光エネルギー転移を利用した物質の測定方法およびそのための試薬 |
| JPH11218532A (ja) * | 1997-11-13 | 1999-08-10 | Pfizer Prod Inc | 生物学的媒体中のタンパク質フラグメントの測定のためのアッセイ |
| JP2004514139A (ja) * | 2000-11-16 | 2004-05-13 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 蛍光共鳴エネルギー転移（ｆｒｅｔ）測定用ダイペア |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI963989A (fi) * | 1996-10-04 | 1998-04-05 | Wallac Oy | Homogeenisiä määritysmenetelmiä, jotka perustuvat luminesenssienergiasiirtoon |
| US6642007B1 (en) * | 1998-11-02 | 2003-11-04 | Pfizer Inc. | Assays for measurement of type II collagen fragments in urine |
| JP2001124770A (ja) * | 1999-08-18 | 2001-05-11 | Japan Science & Technology Corp | 物質の濃度測定方法 |
| DE60207700T2 (de) * | 2001-04-23 | 2006-08-10 | Eiken Kagaku K.K. | Analyseverfahren mit intermolekularer wechselwirkung eines reporters (markers) |
| US7282373B2 (en) * | 2004-12-23 | 2007-10-16 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Ultra-high specificity fluorescent labeling |
-
2006
- 2006-01-26 WO PCT/JP2006/301226 patent/WO2006080396A1/ja active Application Filing
- 2006-01-26 US US11/814,957 patent/US20090298196A1/en not_active Abandoned
- 2006-01-26 JP JP2007500571A patent/JP4683572B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-01-26 EP EP06712408A patent/EP1845376A4/en not_active Withdrawn
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10319017A (ja) * | 1997-05-20 | 1998-12-04 | Toyobo Co Ltd | 蛍光エネルギー転移を利用した物質の測定方法およびそのための試薬 |
| JPH11218532A (ja) * | 1997-11-13 | 1999-08-10 | Pfizer Prod Inc | 生物学的媒体中のタンパク質フラグメントの測定のためのアッセイ |
| JP2004514139A (ja) * | 2000-11-16 | 2004-05-13 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 蛍光共鳴エネルギー転移（ｆｒｅｔ）測定用ダイペア |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| JPN6010031358, ＳＵ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．, "Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｔｙｐｅ ＩＩ ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ．", Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．, 1989, Ｖｏｌ．１７， Ｎｏ．２２, ｐ．９４７３ * |
| JPN6010063154, ＡＮＤＥＲＳＥＮ，Ｂ． ｅｔ ａｌ．, "Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｄ１Ａ Ｄｏｐａｍｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ： Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ", Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．, 1998, Ｖｏｌ．１３， Ｎｏ．１, ｐ．１１１−１１９ * |
| JPN6010063155, ＤＯＷＮＳ，Ｊ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．, "Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ ＥＬＩＳＡ．", Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ, 2001, Ｖｏｌ．２４７， Ｎｏ．１／２, ｐ．２５−３４ * |
| JPN6010063156, "Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ １ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ．", Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．, 1996, Ｖｏｌ．２２１， Ｎｏ．３, ｐ．８０７−８１４ * |
| JPN6010063157, ＭＵＥＬＬＥＲ，Ｋ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．, "Ｔａｎｄｅｍ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｅｔａｌ−Ｉｏｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ Ｐｒｏｔｅ", Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．, 1998, Ｖｏｌ．２５９， Ｎｏ．１, ｐ．５４−６１ * |
| JPN7010003569, ＰＡＮＡＧＩＯＴＩＤＩＳ，Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ, "ｐＡＬＥＸ， ａ ｄｕａｌ−ｔａｇ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．", Ｇｅｎｅ, 1995, Ｖｏｌ．１６４， Ｎｏ．１, ｐ．４５−４７ * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012528848A (ja) * | 2009-06-01 | 2012-11-15 | ノバルティス アーゲー | 肺炎球菌ＲｒｇＢクレイドの組み合わせ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1845376A4 (en) | 2008-07-09 |
| US20090298196A1 (en) | 2009-12-03 |
| WO2006080396A1 (ja) | 2006-08-03 |
| EP1845376A1 (en) | 2007-10-17 |
| JP4683572B2 (ja) | 2011-05-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20070040329A (ko) | 센서 구조물 및 검출방법 | |
| JP4683572B2 (ja) | 組換え蛋白質の定量法 | |
| JP6889780B2 (ja) | 遺伝子バリアントを認識する抗体 | |
| US20230032690A1 (en) | New tau species | |
| WO2011034128A1 (ja) | コラーゲンネオエピトープ抗体 | |
| US10808024B2 (en) | Antibodies against immunocomplexes comprising cyanobacterial cyclic peptide hepatotoxins | |
| JP2024045268A (ja) | 新規抗チミジンキナーゼ抗体 | |
| Fagbadebo et al. | A nanobody-based toolset to monitor and modify the mitochondrial GTPase Miro1 | |
| JP7368867B2 (ja) | 対称性ジメチル化アルギニン分析物に対する抗体及びその用途 | |
| JPWO2006095654A1 (ja) | レポータ遺伝子アッセイ法 | |
| US8481310B2 (en) | Tag peptide having a protease recognition sequence and use thereof | |
| US11981728B2 (en) | Monoclonal antibody, measurement reagent for cytokeratin 18 fragment, reagent kit, and measurement method | |
| KR20200131838A (ko) | 항체의 친화성 성숙화를 위한 방법 | |
| JP5605879B2 (ja) | ｓＡＰＰβに対する抗体 | |
| WO2024178117A1 (en) | Method of sequence-independent quantification of proteolytically unstable plasma lambda free light chain protein for al amyloidosis diagnosis | |
| WO2012113718A1 (en) | A diagnostic method for type ii diabetes | |
| JP2011016773A (ja) | 抗ポリヒスチジンタグ抗体及びそれを用いた非特異反応の回避方法 | |
| JP2012070648A (ja) | マウスｈｉｇ１ポリペプチドに対するモノクローナル抗体 | |
| JP2005314397A (ja) | 抗コンドロモジュリン−１特異的抗体及びその利用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20081009 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100622 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100820 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101130 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101207 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110201 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110204 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140218 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |