CN112142651A - 一种快速检测比沙可啶的半抗原bis、人工抗原及其抗体和检测方法 - Google Patents

一种快速检测比沙可啶的半抗原bis、人工抗原及其抗体和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测比沙可啶的半抗原BIS、人工抗原及其抗体和检测方法。本发明首先提供了一种检测比沙可啶的半抗原BIS，其结构式如式(I)所示：
Figure DDA0002712396080000011
应用该半抗原制备得到了用于检测比沙可啶的人工抗原和抗体，该抗体对比沙可啶具有高灵敏度和高特异性的识别能力，其对比沙可啶的检测范围为0.09～4.92μg/kg，最低检测限为0.07μg/kg，说明本发明制备得到的比沙可啶抗体对比沙可啶的检测灵敏度高、特异性强，能够满足大批量样品现场检测要求；另外，半抗原BIS、人工抗原及抗体的制备方法简单、成本低，在检测比沙可啶中具有广阔的应用前景。

Description

一种快速检测比沙可啶的半抗原BIS、人工抗原及其抗体和检 测方法
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域。更具体地，涉及一种快速检测比沙可啶的半抗原BIS、人工抗原及其抗体和检测方法。
背景技术
比沙可啶(Bisacodyl)是一种刺激性的缓泻药物，主要作用于大肠，刺激结肠，阻止肠液被肠壁吸收而引起腹泻，一般用于临床治疗，但临床上过量的使用会对患者造成一定的副作用，如使患者产生腹痛、恶心、呕吐等不良反应。因比沙可啶具有强烈致泄效果，可达到清肠排便、减轻体重的效果，多被不法商家非法添加到青梅、玫瑰茄等果脯、蜜饯类保健食品和减肥类药物中，使其达到清肠排便的目的，对人体危害巨大。
已报道的比沙可啶的检测方法有高效液相色谱法(徐文峰等，高效液相色谱法测定便秘糖衣丸中3种有效成分的含量，中南药学，2019年9月第17卷第9期)、高效液相-质谱联用法(宋晓婉等，HPLC-MS/MS法检测减肥类保健品中4种致泻类非法添加物，食品科技，2020年第45卷第5期)等方法，具有检测效率高、准确度高、抗干扰能力强等特点；但是，检测所需的仪器设备昂贵、成本高、样品前处理繁杂、需专业人员操作，不符合大批量样品现场检测的要求。目前，还未有利用免疫学方法检测比沙可啶的相关报道；而高效快速的免疫学方法获得的关键在于获得灵敏度高、特异性强的抗体，实现这一目标的关键在于合成合适的半抗原和完全抗原。因此，建立一种高效快速、灵敏度高、特异性强的比沙可啶的检测方法十分迫切。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有比沙可啶检测方法的缺陷和不足，提供一种快速检测比沙可啶的半抗原BIS、人工抗原及其抗体和检测方法。
本发明的目的是提供一种检测比沙可啶的半抗原BIS。
本发明另一目的是提供所述半抗原BIS在制备用于检测比沙可啶的人工抗原中的应用。
本发明另一目的是提供一种用于检测比沙可啶的人工抗原。
本发明另一目的是提供所述半抗原BIS或所述人工抗原在制备用于检测比沙可啶的抗体中的应用。
本发明另一目的是提供一种用于检测比沙可啶的抗体。
本发明另一目的是提供一种重组细胞。
本发明另一目的是提供所述抗体或所述重组细胞在检测比沙可啶中的应用。
本发明另一目的是提供一种检测比沙可啶的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种检测比沙可啶的半抗原BIS，其结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002712396060000021
所述半抗原BIS采用系统命名法命名为：4-((4-((4-acetoxyphenyl)(pyridin-2-yl)methyl)phenoxy)methyl)benzoic acid，即4-((4-((4-乙酰氧基苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)甲基)苯甲酸。
优选地，所述半抗原BIS的制备方法为：
S1.将比沙可啶充分溶解于乙腈中，加入氢氧化钠水溶液，45℃～55℃冷凝回流4～6h，得到脱乙酰比沙可啶；
S2.将步骤S1所得脱乙酰比沙可啶加入乙腈中溶解后，加入4-(溴甲基)苯甲酸甲酯，45℃～55℃冷凝回流9～11h，纯化洗脱，水解，得到水解产物；
S3.将步骤S2所得水解产物与乙酸酐溶解于乙腈中，55℃～65℃再次冷凝回流5～7h，萃取，即得所述半抗原BIS。
优选地，步骤S1所述冷凝回流的温度为50℃，时间为5h。
优选地，步骤S2所述冷凝回流的温度为50℃，时间为10h。
优选地，步骤S3所述再次冷凝回流的温度为60℃，时间为6h。
所述半抗原BIS在制备用于检测比沙可啶的人工抗原中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种用于检测比沙可啶的人工抗原，其结构式如式(II)所示：
Figure BDA0002712396060000031
其中，P为牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)。
优选地，所述人工抗原由所述半抗原BIS与载体蛋白用活泼酯法偶联得到；所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。
所述半抗原BIS或所述人工抗原在制备用于检测比沙可啶的抗体中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种用于检测比沙可啶的抗体，由所述半抗原BIS与牛血清白蛋白偶联得到的完全抗原免疫新西兰大白兔制备得到。
本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞为能够表达所述抗体的细胞。
所述抗体或所述重组细胞在检测比沙可啶中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种检测比沙可啶的方法，以所述半抗原BIS与卵清蛋白偶联得到的完全抗原作为包被原，以所述抗体作为检测抗体进行检测。
本发明具有以下有益效果：
本发明制备得到了一种半抗原BIS，应用该半抗原制备得到了用于检测比沙可啶的人工抗原和抗体，该抗体对比沙可啶具有高灵敏度和高特异性的识别能力，半抑制浓度为0.67μg/kg，对比沙可啶的检测范围为0.09～4.92μg/kg，最低检测限为0.07μg/kg，对比沙可啶的交叉反应率为100％，对脱乙酰比沙可啶的交叉反应率为20％，对匹可硫酸钠、双醋酚丁的交叉反应率均小于1％；说明本发明制备得到的比沙可啶抗体能够满足检测要求，且对比沙可啶的检测灵敏度高、特异性强；另外，半抗原BIS、人工抗原及抗体的制备方法简单、成本低，为建立比沙可啶的免疫学检测方法提供了核心材料，在检测比沙可啶中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明半抗原BIS的合成路线图。
图2是紫外全波长扫描鉴定结果图。
图3是用于检测比沙可啶的抗体间接竞争ELISA标准曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明半抗原BIS的合成路线图如图1所示。
实施例1比沙可啶的半抗原BIS的制备
一种检测比沙可啶的半抗原BIS的制备方法，包括以下步骤：
S1.将1g比沙可啶溶解在10mL乙腈中，加入12mL 3M的氢氧化钠水溶液使pH呈碱性，50℃冷凝回流5h，用1M盐酸水溶液酸化，再用乙酸乙酯和水进行萃取，收集酯层，得到脱乙酰比沙可啶10.99g，转化率为99％。
S2.取步骤S1所得脱乙酰比沙可啶溶解于10mL乙腈，加入40μL 4-(溴甲基)苯甲酸甲酯，50℃冷凝回流10h，得到黄色物质，用硅胶柱纯化，混合溶剂(乙酸乙酯：石油醚的体积比为1:2)洗脱分离，将得到的洗脱产物溶于甲醇中，加入1mL 3M的氢氧化钠水溶液使pH呈碱性，50℃下搅拌2h，用乙酸乙酯和水萃取3次，无水硫酸钠进行干燥，得到水解产物。
S3.将步骤S2所得水解产物与乙酸酐溶解于乙腈中，60℃再次冷凝回流6h，用乙酸乙酯和水萃取后，收集乙酸乙酯层，即得半抗原BIS。
实施例2比沙可啶的半抗原BIS的制备
一种检测比沙可啶的半抗原BIS的制备方法，包括以下步骤：
S1.将1g比沙可啶溶解在10mL乙腈中，加入12mL 3M的氢氧化钠水溶液使pH呈碱性，45℃冷凝回流6h，用1M盐酸水溶液酸化，再用乙酸乙酯和水进行萃取，收集酯层，得到脱乙酰比沙可啶10.99g，转化率为99％。
S2.取步骤S1所得脱乙酰比沙可啶溶解于10mL乙腈，加入40μL 4-(溴甲基)苯甲酸甲酯，55℃冷凝回流9h，得到黄色物质，用硅胶柱纯化，混合溶剂(乙酸乙酯：石油醚的体积比为1:2)洗脱分离，将得到的洗脱产物溶于甲醇中，加入1mL 3M的氢氧化钠水溶液使pH呈碱性，50℃下搅拌2h，用乙酸乙酯和水萃取3次，无水硫酸钠进行干燥，得到水解产物。
S3.将步骤S2所得水解产物与乙酸酐溶解于乙腈中，55℃再次冷凝回流7h，用乙酸乙酯和水萃取后，收集乙酸乙酯层，即得半抗原BIS。
实施例3比沙可啶的半抗原BIS的制备
一种检测比沙可啶的半抗原BIS的制备方法，包括以下步骤：
S1.将1g比沙可啶溶解在10mL乙腈中，加入12mL 3M的氢氧化钠水溶液使pH呈碱性，55℃冷凝回流4h，用1M盐酸水溶液酸化，再用乙酸乙酯和水进行萃取，收集酯层，得到脱乙酰比沙可啶10.99g，转化率为99％。
S2.取步骤S1所得脱乙酰比沙可啶溶解于10mL乙腈，加入40μL 4-(溴甲基)苯甲酸甲酯，45℃冷凝回流11h，得到黄色物质，用硅胶柱纯化，混合溶剂(乙酸乙酯：石油醚的体积比为1:2)洗脱分离，将得到的洗脱产物溶于甲醇中，加入1mL 3M的氢氧化钠水溶液使pH呈碱性，50℃下搅拌2h，用乙酸乙酯和水萃取3次，无水硫酸钠进行干燥，得到水解产物。
S3.将步骤S2所得水解产物与乙酸酐溶解于乙腈中，65℃再次冷凝回流5h，用乙酸乙酯和水萃取后，收集乙酸乙酯层，即得半抗原BIS。
实施例4比沙可啶的半抗原BIS的鉴定
1、实验方法
以实施例1为例，将以上实施例1～3制备得到的半抗原BIS进行核磁共振氢谱鉴定和质谱确定。
2、实验结果
半抗原BIS的质谱结果如下：MS:C20H24N2O3:453，ESI+[M-H]+:454。
半抗原BIS的核磁共振氢谱结果如下：1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.07(d,J＝8.3Hz,1H),7.49(d,J＝8.4Hz,1H),7.26(s,2H),7.16(d,J＝8.5Hz,2H),7.08(d,J＝8.7Hz,1H),7.02(d,J＝8.6Hz,1H),6.89(d,J＝8.8Hz,1H),5.08(s,1H),4.12(q,J＝7.1Hz,1H),2.28(s,2H),2.04(s,1H),1.37–1.23(m,6H),0.07(s,5H)。
根据核磁共振氢谱和质谱结果可以看出，衍生位点正确且成功，说明本发明成功制备得到了半抗原BIS，其结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002712396060000061
半抗原BIS采用系统命名法命名为：4-((4-((4-acetoxyphenyl)(pyridin-2-yl)methyl)phenoxy)methyl)benzoic acid，即4-((4-((4-乙酰氧基苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)甲基)苯甲酸。
实施例5用于检测比沙可啶的人工抗原合成与鉴定
1、合成
取实施例1制备得到的半抗原BIS 3.4mg，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)1mL溶解，加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)1.6mg、碳二亚胺(EDC)5.2mg，室温搅拌反应3h，得到半抗原溶液A液；取牛血清白蛋白(BSA)10mg，加1mL PBS缓冲液溶解，得到B液；将A液逐滴加到B液中，4℃避光搅拌反应12h，用PBS缓冲液透析纯化两天，每天换液4次，得到与牛血清白蛋白偶联的人工抗原BIS-BSA，分装，-20℃保存。
同理，用卵清蛋白(OVA)替代牛血清白蛋白(BSA)，用相同的方法制备得到与卵清蛋白偶联的人工抗原BIS-OVA，分装，-20℃保存。
取上述BSA、OVA、半抗原BIS、人工抗原BIS-BSA、人工抗原BIS-OVA，分别用紫外全波长扫描法(200～400nm)进行鉴定。
2、鉴定
紫外全波长扫描鉴定结果如图2所示，比较偶连前后的BSA、OVA、半抗原BIS、人工抗原BIS-BSA、人工抗原BIS-OVA的最高吸光值可知，BIS-BSA、BIS-OVA的吸收曲线与BSA、OVA的吸收曲线明显不同，BIS-BSA、BIS-OVA的吸收曲线在280nm处出现了与BSA、OVA吸收曲线不同的偏移；因此，BIS-BSA、BIS-OVA的吸收曲线是BSA、OVA分别与半抗原BIS的累加吸收峰；说明半抗原BIS分别与BSA、OVA成功偶联，本发明成功制备得到了人工抗原BIS-BSA、人工抗原BIS-OVA。
实施例6用于检测比沙可啶的抗体的制备
用于检测比沙可啶的抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)取健康的6周的新西兰大白兔两只(雌、雄各一只)，初次免疫用弗氏完全佐剂乳化后背部皮下多点注射，每只免疫剂量为500μg与牛血清白蛋白偶联的人工抗原；之后每隔三周加强免疫，用弗氏不完全佐剂进行乳化，共加强免疫四次。
(2)第三次免疫后隔一周兔耳静脉取血，离心取上清，-20℃保存，用于ELISA检测免疫效果。
(3)第五次免疫后进行心脏取血，将所得兔血在37℃温育2h后，在4℃条件下放置过夜(12h)，第二天将水层清液取出，然后在4℃条件下，3000r/min离心10min，去除沉淀，获得上清液，分装，标记，-20℃保存，即得用于检测比沙可啶的抗体。
实施例7比沙可啶的间接竞争ELISA检测方法的建立
1、实验方法
一种检测比沙可啶的间接竞争ELISA方法，包括以下步骤：
(1)将人工抗原BIS-OVA作为包被原，用包被液稀释至1μg/mL，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，37℃孵育过夜(12h)；
(2)弃去包被液，洗涤2次，拍干；
(3)每孔加入120μL封闭液(即1％鱼胶蛋白)，37℃封闭30min；
(4)弃去封闭液，拍板，37℃烘干30min后取出，用自封袋装好备用；
(5)用PBST 1:8000倍稀释比沙可啶抗体，并将比沙可啶稀释至1000ng/mL，100ng/mL，10ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL，0.001ng/mL；
(6)每行加入50μL比沙可啶稀释液(三组平行)，再加50μL/孔兔血清稀释液，37℃孵育40min，洗涤5次；
(7)加入羊抗兔二抗-HRP(4000倍稀释)，37℃温育30min，洗涤5次，拍干；
(8)加入显色液，每孔100μL，显色10min；
(9)加入50μL 10％H2SO4终止反应，并在450nm处读取OD值。
2、实验结果
用于检测比沙可啶的抗体间接竞争ELISA标准曲线如图3所示，可知用于检测比沙可啶的抗体的半抑制浓度(IC50)为0.67μg/kg，定量检测范围为0.09～4.92μg/kg，最低检测限为0.07μg/kg；说明本发明制备得到的用于检测比沙可啶的抗体可以满足检测要求，且对比沙可啶的识别能力高、特异性强、检测灵敏度高。
实施例8用于检测比沙可啶的抗体的特异性评价
1、实验方法
通过比沙可啶与其类似物进行交叉反应实验来确定用于检测比沙可啶的特异性，其抗体的特异性用交叉反应率(CR)表示，交叉反应率越小，特异性越强。将比沙可啶及其类似物(脱乙酰比沙可啶、匹克硫酸钠、双醋酚丁)分别作倍比稀释，采用间接竞争ELISA法进行测定，步骤同实施例7的灵敏度验证方法，得到各类似物的IC50值，按照以下公式计算比沙可啶交叉反应率(CR)：
CR(％)＝IC50(比沙可啶)/IC50(类似物)×100％。
2、实验结果
比沙可啶与其类似物的交叉反应结果如表1所示，可知用于检测比沙可啶的抗体对比沙可啶的交叉反应率为100％，IC50为0.67μg/kg，对脱乙酰比沙可啶的交叉反应率为20％，对匹可硫酸钠、双醋酚丁的交叉反应率均小于1％；说明用于检测比沙可啶的抗体对比沙可啶的特异性强，可以有效地排除其类似物(脱乙酰比沙可啶、匹克硫酸钠、双醋酚丁)对比沙可啶检测的干扰，能够专门用于对比沙可啶的检测。
表1比沙可啶与其类似物的交叉反应结果
Figure BDA0002712396060000081
注：NR表示无反应。
实施例9比沙可啶的添加回收率
1、实验方法
采用经测定不含有比沙可啶的青梅、减肥茶、减肥胶囊样品，分别添加3种不同浓度(50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg)的比沙可啶标准溶液，进行添加回收率的测定。
2、实验结果
比沙可啶的添加回收率结果如表2所示，可知比沙可啶在3种不同浓度时的添加回收率为85％～95％。
表2比沙可啶的添加回收率结果
Figure BDA0002712396060000091
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测比沙可啶的半抗原BIS，其特征在于，其结构式如式(I)所示：
Figure FDA0002712396050000011
2.根据权利要求1所述半抗原BIS，其特征在于，其制备方法为：
S1.将比沙可啶充分溶解于乙腈中，加入氢氧化钠水溶液，45℃～55℃冷凝回流4～6h，得到脱乙酰比沙可啶；
S2.将步骤S1所得脱乙酰比沙可啶加入乙腈中溶解后，加入4-(溴甲基)苯甲酸甲酯，45℃～55℃冷凝回流9～11h，纯化洗脱，水解，得到水解产物；
S3.将步骤S2所得水解产物与乙酸酐溶解于乙腈中，55℃～65℃再次冷凝回流5～7h，萃取，即得所述半抗原BIS。
3.权利要求1或2所述半抗原BIS在制备用于检测比沙可啶的人工抗原中的应用。
4.一种用于检测比沙可啶的人工抗原，其特征在于，其结构式如式(II)所示：
Figure FDA0002712396050000012
其中，P为牛血清白蛋白或卵清蛋白。
5.根据权利要求4所述人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述半抗原BIS与载体蛋白用活泼酯法偶联得到；所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。
6.权利要求1～2任一所述半抗原BIS或权利要求4～5任一所述人工抗原在制备用于检测比沙可啶的抗体中的应用。
7.一种用于检测比沙可啶的抗体，其特征在于，由权利要求1所述半抗原BIS与牛血清白蛋白偶联得到的完全抗原免疫新西兰大白兔制备得到。
8.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为能够表达权利要求7所述抗体的细胞。
9.权利要求7所述抗体或权利要求8所述重组细胞在检测比沙可啶中的应用。
10.一种检测比沙可啶的方法，其特征在于，以权利要求1～2任一所述半抗原BIS与卵清蛋白偶联得到的完全抗原作为包被原，以权利要求7所述抗体作为检测抗体进行检测。
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