CN102175794B - 同步定量测定蔬菜中总叶酸及其衍生物含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同步定量测定蔬菜中总叶酸及其衍生物含量的方法，依次包括以下步骤：1）、提取蔬菜中叶酸；2）、在步骤1）所得的蔬菜叶酸提取物中加入老鼠血清轭合酶孵育，离心后，得蔬菜叶酸去轭提取物；3）、固相萃取纯化蔬菜叶酸去轭提取物；4）、色谱柱分离蔬菜中包括四氢叶酸，5-甲基–四氢叶酸，5-甲酰–四氢叶酸和叶酸在内的四种叶酸衍生物；5）、叶酸定量测定。采用本发明的方法可以同步测定蔬菜中总叶酸及不同叶酸衍生物的含量。
Description
技术领域
本发明涉及高效液相色谱-紫外/荧光检测器同步测定蔬菜总叶酸及叶酸衍生物含量的方法。
背景技术
叶酸是指四氢叶酸及其衍生物这一类物质，属于水溶性B族维生素，作为主要一碳单位供体，叶酸参与核酸、氨基酸、蛋白质的生物合成。人体内叶酸缺乏可以导致新生儿神经管畸形、出生缺陷、智力退化、巨幼红细胞贫血等疾病，并增加患心血管疾病和癌症的风险。植物和微生物自身可以合成叶酸，但是人类和其他高等哺乳动物缺乏完整的叶酸合成系统，因此膳食中含有一定量的叶酸十分必要，为此世界范围内开展了一系列的针对叶酸缺乏的预防工作，其中包括叶酸添加剂食物强化的方法，或通过生物强化方法提高作物中的叶酸含量。蔬菜是人类主要的膳食，因此蔬菜是人类获得叶酸的主要来源。利用农业育种技术和基因工程加强蔬菜中叶酸水平也是目前叶酸强化的研究热点之一。然而蔬菜植物体内的叶酸含量水平低，并存在各种叶酸衍生物，这些衍生物具有不稳定性。因此需要建立一个稳定可靠的叶酸检测体系。
在叶酸检测方法体系中，叶酸的提取对于叶酸检测具有重要意义。其直接影响到实验中总叶酸或各种叶酸衍生物测定结果的准确性。叶酸容易在提取过程中被氧化破坏，适宜的提取方法有利保证叶酸最大提取率。而且在作物中叶酸主要以多谷氨酸盐的形式存在，即便是以单谷氨酸盐形式存在，也常是多种衍生物共存，所以在测定时必需应用叶酸轭合酶对叶酸进行降解，以便得到单谷氨酸叶酸或含2个或3个谷氨酸尾的叶酸。叶酸轭合酶来源很多，如人类或大鼠的血清、猪肾脏和鸡胰脏等，选择适宜的叶酸轭合酶才能在提取过程充分发挥去轭合作用。而目前检测叶酸的方法也较多，微生物法具有敏感度高，结果准确等优点，是目前测定叶酸的经典方法，但这个方法周期较长，实验操作比较繁琐，只能获得样品中总叶酸数据不能区分叶酸衍生物。但是因为每种叶酸衍生物的生理功能各不相同，当研究需要检测某些特定叶酸衍生物组分的含量时，这种方法就不适合应用于此类研究中。高效液相色谱技术可分离不同形式叶酸衍生物，但目前较多报道的是利用高效液相紫外检测器法检测组成单一、叶酸含量高的样品，如叶酸药剂中叶酸测定，不适合低叶酸含量的蔬菜样品的测定。因此建立对蔬菜不同叶酸衍生物高效提取，并能同步测定蔬菜中总叶酸含量和不同叶酸衍生物含量的方法对蔬菜叶酸强化相关领域研究具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高效液相色谱-紫外/荧光检测器同步测定蔬菜总叶酸及其衍生物含量的方法。应用此种方法可以同步测定蔬菜中总叶酸及不同叶酸衍生物的含量。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种同步定量测定蔬菜中总叶酸及其衍生物含量的方法，依次包括以下步骤：
1)、提取蔬菜中叶酸：
利用0.1M磷酸缓冲液煮沸提取蔬菜中的叶酸，冷却并离心后，得上清液；所述上清液为蔬菜叶酸提取物；
2)、添加叶酸轭合酶：
在步骤1)所得的蔬菜叶酸提取物中加入老鼠血清轭合酶，于35～39℃孵育，然后煮沸从而终止老鼠血清轭合酶的活性；离心后取上清液，所述上清液为蔬菜叶酸去轭提取物；
3)、固相萃取(SPE)纯化蔬菜叶酸去轭提取物：
强阴离子交换物质的固相萃取柱活化后，加入步骤2)所得的蔬菜叶酸去轭提取物，经去离子水(2×2.5ml)淋洗，最后用0.1M乙酸钠缓冲液进行洗脱；从0.1M乙酸钠缓冲液洗脱开始，收集含有叶酸衍生物的纯化液；
4)、色谱柱分离蔬菜中包括四氢叶酸，5-甲基-四氢叶酸，5-甲酰-四氢叶酸和叶酸在内的四种叶酸衍生物：
采用250×4.6mm、粒径为5mm的Zorbax SB色谱柱作为分离柱、乙腈-磷酸缓冲液作为流动进行相梯度洗脱(梯度洗脱程序为0min，6∶94；5min，6∶94；20min，25∶75；2min，25∶75；1min，6∶94；14min，6∶94)，流速：0.4mL/min，柱温度23℃；含有叶酸衍生物的纯化液的进样量：20μL；
5)、叶酸定量测定。
作为本发明的同步定量测定蔬菜中总叶酸及其衍生物含量的方法的改进：步骤1)中的0.1M磷酸缓冲液为含有抗坏血酸和二巯基丙醇的0.1M磷酸缓冲液；即，在每升0.1M磷酸缓冲液中含有10g的L(+)-抗坏血酸和10ml的二巯基丙醇。
作为本发明的同步定量测定蔬菜中总叶酸及其衍生物含量的方法的进一步改进：将蔬菜样品研磨成粉末，然后加入含有抗坏血酸和二巯基丙醇的0.1M磷酸缓冲液，在惰性气体的保护下，于95～105℃煮沸10～14分钟，接着冰浴冷却后离心，得上清液。
作为本发明的同步定量测定蔬菜中总叶酸及其衍生物含量的方法的进一步改进：步骤2)中：在每5mL蔬菜叶酸提取物中加入170～180μL的老鼠血清轭合酶。
作为本发明的同步定量测定蔬菜中总叶酸及其衍生物含量的方法的进一步改进：步骤5)为：采用高效液相色谱紫外检测器/荧光检测器对Zorbax SB色谱柱分离到的叶酸的各种衍生物进行定量测定，紫外检测器检测波长为290nm时记录峰面积，按外标法以峰面积得出叶酸含量，荧光检测器激发波长290nm/发射波长360nm时记录峰面积，按外标法以峰面积得出四氢叶酸，5-甲基-四氢叶酸，5-甲酰-四氢叶酸和叶酸含量，再根据叶酸衍生物四氢叶酸，5-甲基-四氢叶酸，5-甲酰-四氢叶酸和叶酸含量及其对应的分子量计算总叶酸含量。
本发明的方法包括以下：(A)提供一种磷酸缓冲液煮沸提取蔬菜中叶酸的方法；(B)提供一种叶酸轭合酶；(C)提供一种固相萃取(SPE)纯化蔬菜叶酸提取物的方法；(D)提供一种色谱柱分离蔬菜中各种叶酸衍生物的方法；(E)提供一种用高效液相色谱仪同步测定蔬菜中不同叶酸衍生物的方法。
本发明的所提供的方法包括以下步骤：
1.试剂的配制方法
本发明所用试剂包括：乙腈(色谱级)，甲醇(色谱级)，其他试剂为分析纯级别。L(+)-抗坏血酸(Sigma，美国)，二巯基丙醇(Sigma，美国)，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，乙酸钠，氯化钠(Merck)，蔬菜叶酸标准物质BCR-485(标准参考物质和方法研究院，比利时)，水为超纯水(Millipore，美国)。叶酸对照品，四氢叶酸钠盐对照品，5-甲基四氢叶酸钠盐对照品，5-甲酰四氢叶酸钠盐对照品均来自瑞士Merck Eprova AG公司。注意上述对照品均需保存在-80℃条件。
1.1步骤1)所用的0.1M磷酸缓冲液(pH＝6.1)，具体配置如下：取16.2ml浓度为1mol/L磷酸氢二钾，和83.5ml浓度为1mol/L的磷酸二氢钾，加入10g L(+)-抗坏血酸，吸取10ml二巯基丙醇于1L的烧杯中，加水至980ml左右，利用1mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至6.1，然后缓缓倒入1L容量瓶中定容用水至1L。
1.2标准叶酸衍生物贮存溶液配置：分别称取0.2000g的叶酸对照品，四氢叶酸钠盐对照品，5-甲基四氢叶酸钠盐对照品，5-甲酰四氢叶酸钠盐对照品，分别用上述0.1M磷酸缓冲液(pH＝6.1)溶解后，分别定容(用上述0.1M磷酸缓冲液(pH＝6.1))到100mL容量瓶中，制成200μg/mL的标准品的储备液，使用时用0.1M磷酸缓冲液(pH＝6.1)稀释至所需浓度。
1.3叶酸轭合酶配制：取1ml老鼠血清(货号：7684，sigma，美国)加入1g的活性炭，冰浴搅拌1小时，离心后，用0.20μm针式过滤器过滤，所得滤液放入塑料瓶于-80℃保存，所得滤液为老鼠血清轭合酶。
1.40.1M乙酸钠缓冲液配制：100g氯化钠，10g抗坏血酸，1ml的2-巯基乙醇溶解在0.1M的乙酸钠溶液中，利用1mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至6.1，最后用0.1M的乙酸钠溶液定容到1L。
1.5流动相磷酸缓冲液配制：4.087g磷酸二氢钾溶解水中定容在1L的容量瓶，利用1mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至2.3，过0.45μm滤膜。此流动相磷酸缓冲液在2.4的乙腈-磷酸缓冲液用到。
2试验主要操作过程
由于叶酸极容易被氧化破坏，因此配制1.1～1.5所述溶液，以及提取叶酸步骤均在安装黄色荧光灯的房间进行；配制溶液、以及提取叶酸所需的玻璃烧杯、容量瓶、溶液储蓄瓶、塑料离心管均为棕色，或都用锡纸包裹避光。高效液相色谱仪的自动进样玻璃瓶也为棕色。
2.1磷酸缓冲液煮沸提取蔬菜叶酸
称取5g新鲜蔬菜样品放入研磨钵，加入液氮用研磨棒磨碎，转入50ml塑料离心管，向离心管中加入1.1提及的0.1M磷酸缓冲液10ml，并为防止提取物氧化分解冲入氮气15秒，盖上盖子。具盖子的离心管放入100℃煮沸，12分钟后放入冰浴冷却至4℃，转数为27000×g，4℃，离心20分钟，所述上清液转入25mL容量瓶用0.1M，磷酸缓冲液定容至25mL，作为蔬菜叶酸提取物。
2.2添加叶酸轭合酶
吸取2.1制得的蔬菜叶酸提取物5mL加入一个离心管中，向离心管内加入175μL的老鼠血清轭合酶，吹入氮气15秒后。放入37℃水浴摇床中孵育2小时，然后100℃条件下煮沸5分钟终止酶活性。然后在转数为27000×g，4℃，离心20分钟。最终取得的上清液为蔬菜叶酸去轭提取物，可去作为下步纯化用。
2.3固相萃取(SPE)纯化蔬菜叶酸去轭提取物：
强阴离子交换物质的固相萃取柱(型号57030-U，硅胶键合有季胺盐官能团，Supelco美国，)活化后，加入2.2所得的蔬菜叶酸去轭提取物2.5g，经去离子水(2×2.5ml)淋洗，最后用1.4提及的0.1M乙酸钠缓冲液洗脱，开始加入0.1M乙酸钠缓冲液后，收集洗脱下的3.8mL洗脱液，此洗脱液为蔬菜中叶酸的纯化液。并记录改纯化液的重量。
2.4液相色谱HPLC条件：
色谱柱为Zorbax SB，规格是250×4.6mm，粒径为5mm(Agilent Technologies，美国)分离各叶酸衍生物效果较好(见附图2)。高效液相色谱仪(Agilent 1200Series)，液相色谱仪运行软件为Agilent公司的ChemStation软件(Rev B.04.01SP1)，在液相色谱仪运行软件中进行流动相乙腈-磷酸缓冲液梯度洗脱的设置，A相为乙腈，B相为磷酸缓冲液(详见1.5)在软件中设置的洗脱顺序从6％乙腈开始持续5min，在随后的20min内线性上升至25％并保持恒定2min，然后在1min内线性下降至6％并保持14min使色谱柱重新平衡。即，梯度洗脱程序为0min，6∶94；5min，6∶94；20min，25∶75；2min，25∶75；1min，6∶94；14min，6∶94；流速：0.4mL/min，柱温：23℃；进样量：20μL；自动进样器温度8℃。本方法在检测叶酸不同衍生物时，发现荧光检测器在激发波长290nm/发射波长360nm时测定四氢叶酸，5-甲基-四氢叶酸，5-甲酰-四氢叶酸出现峰高最高，干扰物质少，灵敏度较好(见附图2)，因此选取激发波长290nm/发射波长360nm作为荧光检测器的检测波长。而紫外检测器可以检测到荧光检测器检测不到的叶酸衍生物--叶酸含量，在波长290nm时紫外检测器叶酸检测限和灵敏度较好，确定紫外检测器检测叶酸衍生物--叶酸含量的检测波长是290nm(见附图2)。因此本方法采用高效液相色谱-紫外/荧光检测器可以同时测定四氢叶酸，5-甲基-四氢叶酸，5-甲酰-四氢叶酸，叶酸这四种叶酸衍生物。
2.5叶酸定量测定实验
在本发明的色谱条件(即如2.4所述)下，分别进样对照品溶液四氢叶酸，5-甲基-四氢叶酸，5-甲酰-四氢叶酸和叶酸，进行分析对照品溶液四氢叶酸(0.5-100ng/mL)，5-甲基-四氢叶酸(0.3-100ng/mL)，5-甲酰-四氢叶酸(10-600ng/mL)和叶酸(10-600ng/mL)，并测定供试样品的叶酸。进样量为20μl，记录主峰峰面积，液相色谱仪ChemStation软件按外标法以峰面积自动计算得出相对应各叶酸衍生物含量(ng/mL)。然后根据以下公式换算出蔬菜样品中四氢叶酸含量(μg/100g)，5-甲基-四氢叶酸含量(μg/100g)5-甲基-四氢叶酸含量(μg/100g)，5-甲酰-四氢叶酸含量(μg/100g))叶酸含量(μg/100g)，总叶酸含量(μg/100g)。
由于老鼠血清含有一定量的5-甲基-四氢叶酸，因此蔬菜样品中的5-甲基-四氢叶酸含量需要测定出的蔬菜样品中的5-甲基-四氢叶酸含量减去空白样品溶液的5-甲基-四氢叶酸含量得到。注明空白样品不添加蔬菜样品，然后按2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，最后检测空白样品中5-甲基-四氢叶酸含量。
1)四氢叶酸含量(μg/100g)＝四氢叶酸(ng/mL)×100g×25(mL)×蔬菜中叶酸纯化液重量(g)/蔬菜样品重量(g)×蔬菜叶酸去轭提取物重量(g)×1000
2)5-甲基-四氢叶酸含量(μg/100g)＝(5-甲基-四氢叶酸测定值-空白样品)(ng/mL)×100g×25(mL)×蔬菜中叶酸纯化液重量(g)/蔬菜样品重量(g)×蔬菜叶酸去轭提取物重量(g)×1000
3)5-甲酰-四氢叶酸含量(μg/100g)＝5-甲酰-四氢叶酸含量(ng/mL)×100g×25(mL)×蔬菜中叶酸纯化液重量(g)/蔬菜样品重量(g)×蔬菜叶酸去轭提取物重量(g)×1000
4)叶酸含量(μg/100g)＝叶酸含量(ng/mL)×100g×25(mL)×蔬菜中叶酸纯化液重量(g)/蔬菜样品重量(g)×蔬菜叶酸去轭提取物重量(g)×1000
5)总叶酸含量(μg/100g)＝445.4×四氢叶酸含量(μg/100g)+459.5×5-甲基-四氢叶酸含量(μg/100g)+473.5×5-甲酰-四氢叶酸含量(μg/100g)+441.4×叶酸含量(μg/100g)
注：445.4为四氢叶酸分子量，459.5为5-甲基-四氢叶酸分子量，473.5为5-甲酰-四氢叶酸的分子量，441.4为叶酸的分子量。此公式适用于所有蔬菜的检测。
本发明的蔬菜中不同叶酸及其衍生物含量测定方法具有以下特点：
(1)利用含VC和二巯基丙醇磷酸缓冲液煮沸法，预防了蔬菜叶酸的氧化破坏的同时使样品中的叶酸结合蛋白解链释放所结合的叶酸；并通过添加老鼠血清(RS)轭合酶法，充分水解叶酸。提高了蔬菜中叶酸衍生物在前处理的提取率。提取率高达96％以上。
(2)在本发明中，蔬菜中叶酸提取物以强阴离子交换(SAX)为固相萃取柱，并采用0.1M乙酸钠缓冲液洗脱得到预期纯化物质。
即，本发明利用固相萃取纯化法(SPE)降低了蔬菜叶酸提取物中的复杂干扰因素，提高检测正确性，而且纯化步骤简单和快速。
(3)色谱柱Zorbax SB结合高效液相色谱紫外/荧光检测器可以分离蔬菜用不同的叶酸衍生物，并对蔬菜中总叶酸含量和不同形式叶酸衍生物含量进行同步检测。
本发明蔬菜中不同叶酸及其衍生物含量测定方法，具有以下有益效果：
(1)本发明灵敏度高，适合于成分复杂、低叶酸含量的蔬菜样品叶酸含量的测定。
(2)本发明可以分离蔬菜样品中的不同叶酸及其衍生物，并可以定量分析叶酸及其衍生物含量。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是不同叶酸衍生物的结构图；
图2是荧光检测器(Ex＝290nm，Em＝360nm)和紫外检测器(290nm)测定不同形式叶酸盐对照品的HPLC色谱图；所用样品为混合的叶酸盐对照品(四氢叶酸100ng/ml，5-甲基-四氢叶酸100ng/ml和5-甲酰-四氢叶酸600ng/ml，叶酸600ng/ml)，按照本发明的色谱条件方法测定，进样量：20μl，峰：1-四氢叶酸，2-5-甲基-四氢叶酸，3-5-甲酰-四氢叶酸，4-叶酸；
图3是荧光检测器(Ex＝290nm，Em＝360nm)和紫外检测器(290nm)测定蔬菜叶酸标准物质BCR-485的HPLC色谱图；所用样品为BCR-485，按照本发明的色谱条件方法测定，进样量：20μl，峰：1-四氢叶酸；2-5-甲基-四氢叶酸；
图4是荧光检测器(Ex＝290nm，Em＝360nm)和紫外检测器(290nm)测定菠菜HPLC色谱图；所用样品为市场购得的菠菜，按照本发明的色谱条件方法测定，进样量：20μl，峰：1-四氢叶酸；2-5-甲基-四氢叶酸；3-5-甲酰-四氢叶酸。
具体实施方式
实施例1.就本发明检测蔬菜叶酸标准物质BCR-485(来自标准参考物质和方法研究院，比利时)的试验事例说明。
1.线性关系考察和敏感度试验
在本发明的色谱条件下，分别选用标准叶酸衍生物溶液：四氢叶酸(0.5，1，5，15，30，75，100ng/mL)，5-甲基-四氢叶酸(0.3，1，5，15，30，75，100ng/mL)，5-甲酰-四氢叶酸(10，30，50，100，200，400，600ng/mL)和叶酸(10，30，50，100，200，400，600ng/mL)，进样量为20μl，测得峰面积分值，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得线性回归方程，回归系数如表1。
标准叶酸衍生物四氢叶酸(0.5-100ng/mL)，5-甲基-四氢叶酸(0.3-100ng/mL)，5-甲酰-四氢叶酸(10-600ng/mL)和叶酸(10-600ng/mL)以3倍信噪比条件下对应的样品浓度计算四氢叶酸，5-甲基-四氢叶酸，5-甲酰-四氢叶酸，叶酸，检测限见表1。以10倍信噪比条件下对应的样品浓度计算四氢叶酸，5-甲基-四氢叶酸，5-甲酰-四氢叶酸，叶酸定量限，结果如表1。由数据可以看出四氢叶酸含量在0.5-100ng/mL，5-甲基-四氢叶酸含量在0.3-100ng/mL，5-甲酰-四氢叶酸含量在10-600ng/mL，叶酸含量在10-600ng/mL范围内线性良好，四氢叶酸，5-甲基-四氢叶酸，5-甲酰-四氢叶酸，叶酸检测限分别是0.15ng/ml，0.1ng/ml，2.3ng/ml，2.3ng/ml。四氢叶酸，5-甲基-四氢叶酸，5-甲酰-四氢叶酸，叶酸定量限分别0.5ng/ml，0.3ng/ml，10.0ng/ml，10.0ng/ml。表明本发明方法具有良好的检测限和定量限。
表1.对照品中不同形式叶酸盐的线性关系考察，检出限和定量限的测定结果
2.精确度试验
称取5g蔬菜类标准参考物质BCR-485(货号：BCR-485，比利时)，蔬菜类标准参考物质BCR-485由多种蔬菜的混合制成，在国际上作为检测蔬菜类叶酸方法可靠性的标准参考物质，由标准参考物质和方法研究院(IRRM)提供总叶酸含量，5-甲基-四氢叶酸含量值为标准参考值，标准参考值见表2。或比利时标准参考物质和方法研究院提供的资料http://www.irmm.jrc.be/html/reference_materials_catalogue/catalogue/attachements/BCR-485_c ert.pdf)，照“2.1，2.2，2.3”项方法制备供试品溶液，并配置标准叶酸衍生物品溶液，按本方法的色谱条件详见“2.4”，样品进样量：20μl，记录主峰峰面积，按外标法以峰面积得到各形式叶酸衍生物含量(ng/ml)。根据2.5公式计算得出蔬菜类标准参考样品BCR-485的四氢叶酸，5-甲基-四氢叶酸，5-甲酰-四氢叶酸，总叶酸含量的测定值(μg/100g)。测定结果看出BCR-485主要的叶酸衍生物主要是四氢叶酸和5-甲基-四氢叶酸。在比较总叶酸含量时，发现本发明利用高效色谱仪测定总叶酸含量低于比利时标准参考物质和方法研究院总叶酸标准参考值24.9％。分析原因比利时标准参考物质和方法研究院采用微生物测定总叶酸区别于本发明的HPLC色谱仪-紫外和荧光检测器，不同检测方法检测值可比性较差。由于比利时标准参考物质和方法研究院认为5-甲基-四氢叶酸是蔬菜中叶酸的主要形式，并没有提供四氢叶酸数据，本发明方法测定得到四氢叶酸平均值为11.77μg/100g。而比较基于相同检测方法-高效液相色谱荧光检测器法检测5-甲基-四氢叶酸含量时，发现本发明方法检测的5-甲基-四氢叶酸数据与比利时标准参考物质和方法研究院提供的标准参考值一致，因此本发明方法测定结果准确可靠。
表2.蔬菜叶酸标准物质BCR-485的精确度检测
aHPLC测定的BCR-485中5-甲基-四氢叶酸的标准参考值
b微生物测定BCR-485总叶酸的标准参考值
3.回收率试验
称取5g蔬菜叶酸标准参考物质BCR-485中分别加入标准叶酸衍生物品溶液：四氢叶酸，5-甲基-四氢叶酸，加入量均为30μg/100g(即，在蔬菜叶酸标准参考物质BCR-485中分别加入四氢叶酸和5-甲基-四氢叶酸这2种标准叶酸衍生物品溶液储备液，从而分别获得2份测试样，每个测试样做两个重复。加入的两种标准溶液的量是按照四氢叶酸或5-甲基-四氢叶酸与BCR-485为30μg/100g)，混均匀后，获得待测样品，按照“2.1，2.2，2.3”项制备供试液，同时制备标准叶酸衍生物品溶液，按上述色谱条件测定详见“2.4”，样品进样量：20μl，记录主峰峰面积，按外标法以峰面积得出四氢叶酸，5-甲基-四氢叶酸含量(ng/ml)，并根据2.5计算供试样品中四氢叶酸，5-甲基-四氢叶酸含量(μg/100g)。
回收率＝(测得含量-样品含量)/加入量，测得含量指加入标准叶酸衍生物溶液的样品后测定得到的对应的叶酸衍生物的含量，样品含量指叶酸标准物质BCR-485未加标准叶酸衍生物溶液前对应的叶酸衍生物的含量，加入量指加入的标准叶酸衍生物溶液的含量。回收率结果如表3。由回收率试验可以看出本发明方法具有较好的回收率。
表3回收率试验结果
实施例1从线性关系考察和敏感度试验，精确度试验和回收率试验，可以证明本发明方法具有敏感度高，精确度和回收率较好的特点。而选用同实施例1中所用的蔬菜类标准参考物质BCR-485，采用与比利时标准参考物质和方法研究院(IRRM)报道的相同的高效液相色谱荧光检测器法检测到的5-甲基-四氢叶酸数据与标准参考值一致，因此本发明方法结果准确可靠。从实施例1中也可以看到蔬菜含有不同的叶酸衍生物，本方法测定得出BCR-485样品叶酸衍生物主要四氢叶酸和5-甲基-四氢叶酸，这为今后研究蔬菜中叶酸衍生物研究提供了一种可行性方法。
实施例2、就本发明检测市场购得的一个菠菜样品中总叶酸及其衍生物含量的试验实例说明
取市场购得的一个菠菜样品，照“2.1，2.2，2.3”项方法制备供试品溶液，同时制备标准叶酸衍生物品溶液，按上述色谱条件测定“2.4”，样品进样量：20μl，记录主峰峰面积，按外标法以峰面积获得叶酸衍生物含量(ng/ml)。再根据公式见2.5计算蔬菜中各种叶酸衍生物含量(μg/100g)，菠菜不同形式叶酸衍生物的定性和定量分析结果见表4。市场的一个菠菜样品总叶酸含量平均值为126.38μg/100g，菠菜中主要的叶酸衍生物主要有5-甲基-四氢叶酸，四氢叶酸和5-甲酰-四氢叶酸，平均值分别是69.2(μg/100g)，34.2(μg/100g)，27.88(μg/100g)。
表4.测定菠菜中总叶酸含量及其不同叶酸衍生物含量结果
| 叶酸盐形式 | 含量(μg/100g)(n＝2) |
| 四氢叶酸 | 34.2±2.4 |
| 5-甲基-四氢叶酸 | 69.2±1.7 |
| 5-甲酰-四氢叶酸 | 27.88±3.4 |
| 总叶酸含量 | 126.38±2.5 |
对比实例1、选用同实施例2中所用的菠菜，采用2005年版《中国药典》中报道的高效液相紫外检测法测定叶酸，但由于菠菜叶酸含量低于检测器检测下限，该方法应用在蔬菜类叶酸含量时敏感度很低。因此高效液相紫外检测法并不适用于蔬菜类叶酸含量的测定。而本发明方法提供了一个可以测定叶酸含量低的蔬菜样品的方法。此方法检测到菠菜中叶酸衍生物主要是5-甲基-四氢叶酸，四氢叶酸和5-甲酰-四氢叶酸三种，并也同时可以检测总叶酸含量，在国内来说尚属首次。
以上举例仅仅是本发明的两个具体实例。根据以上实例可以证明，本发明所述的高效液相色谱-紫外/荧光检测器同步测定蔬菜总叶酸及叶酸衍生物含量的方法是一种具有敏感度高，结果准确可靠，回收率高，并可以同步测定蔬菜中总叶酸及其叶酸衍生物的方法。这种测定蔬菜中叶酸及其衍生物的方法适合应用于蔬菜叶酸强化相关领域研究。该领域的其他技术人员从本发明公开的内容中直接推导出的或联想到的其他变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.同步定量测定蔬菜中总叶酸及其衍生物含量的方法，其特征是依次包括以下步骤：
1）、提取蔬菜中叶酸：
利用含有抗坏血酸和二巯基丙醇的0.1 M磷酸缓冲液煮沸提取蔬菜中的叶酸，冷却并离心后，得上清液；所述上清液为蔬菜叶酸提取物；
所述含有抗坏血酸和二巯基丙醇的0.1 M磷酸缓冲液为：在每升0.1M磷酸缓冲液中含有10g的L(+)-抗坏血酸和10ml的二巯基丙醇；
2）、添加叶酸轭合酶：
在步骤1）所得的蔬菜叶酸提取物中加入老鼠血清轭合酶，于35~39°C孵育，然后煮沸从而终止老鼠血清轭合酶的活性；离心后取上清液，所述上清液为蔬菜叶酸去轭提取物；
3）、固相萃取纯化蔬菜叶酸去轭提取物：
强阴离子交换物质的固相萃取柱活化后，加入步骤2）所得的蔬菜叶酸去轭提取物，经去离子水淋洗，最后用0.1M乙酸钠缓冲液进行洗脱；从0.1M乙酸钠缓冲液洗脱开始，收集含有叶酸衍生物的纯化液；
4）、色谱柱分离蔬菜中包括四氢叶酸，5-甲基–四氢叶酸，5-甲酰–四氢叶酸和叶酸在内的四种叶酸衍生物：
采用250 × 4.6 mm 、粒径为5 mm的 Zorbax SB色谱柱作为分离柱、乙腈-磷酸缓冲液作为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为0min，6∶94；5min，6∶94；20 min， 25∶75； 2min，25∶75；1 min，6∶94；14 min，6∶94；流速：0.4 mL/min，柱温度23°C；含有叶酸衍生物的纯化液的进样量：20μL；
5）、叶酸定量测定：
采用高效液相色谱紫外检测器/荧光检测器对Zorbax SB色谱柱分离到的叶酸的各种衍生物进行定量测定，紫外检测器检测波长为290 nm时记录峰面积，按外标法以峰面积得出叶酸含量，荧光检测器激发波长290 nm /发射波长360 nm时记录峰面积，按外标法以峰面积得出四氢叶酸，5-甲基–四氢叶酸，5-甲酰–四氢叶酸和叶酸含量，再根据叶酸衍生物四氢叶酸，5-甲基–四氢叶酸，5-甲酰–四氢叶酸和叶酸含量及其对应的分子量计算总叶酸含量。
2.根据权利要求1所述的同步定量测定蔬菜中总叶酸及其衍生物含量的方法，其特征是所述步骤1）中：将蔬菜样品研磨成粉末，然后加入含有抗坏血酸和二巯基丙醇的0.1 M磷酸缓冲液，在惰性气体的保护下，于95~105℃煮沸10~14分钟，接着冰浴冷却后离心，得上清液。
3.根据权利要求2所述的同步定量测定蔬菜中总叶酸及其衍生物含量的方法，其特征是：所述步骤2）中：在每5 mL 蔬菜叶酸提取物中加入170~180μL的老鼠血清轭合酶。
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