CN113295787B - 左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法，该检测方法选择以包含四丁基磷酸二氢铵的磷酸氢二钠缓冲液和甲醇作为混合流动相进行等度洗脱，在等度洗脱的过程中，控制流动相的比例和pH值，不需要复杂的梯度洗脱过程，可以检测出不稳定的杂质10，检测出的杂质多，灵敏度高、专属性好，各杂质峰之间、左亚叶酸主峰及其相邻杂质峰之间的分离度高，对各研究杂质均能有效分离，检测出的杂质多，能快速、有效、准确监控左亚叶酸原料药中的有关物质。

Description

左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法。

背景技术

左亚叶酸(Levofolinic Acid)，化学名为(6S)-N-{4-[[(2-氨基-5-甲酰基-1,4,5,6,7,8-六氢-4-氧代-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基}-L-谷氨酸，其分子式C₂₀H₂₃N₇O₇，分子量为473.45，CAS号为68538-85-2，其结构式如下：

左亚叶酸作为抗肿瘤的解毒剂，其剂量比亚叶酸小，是其0.5倍。左亚叶酸在体内可不经过二氢叶酸还原酶还原，可直接参与利用叶酸盐作为一碳单位来源的反应；而且左亚叶酸在通过细胞膜时，既可以主动转运，也可以进行被动转运。左亚叶酸的基本作用和叶酸相同，但效果优于叶酸。

目前国内上市的类似产品有注射用亚叶酸钠，注射用亚叶酸钙和亚叶酸钙注射液，国外上市的产品有美国惠氏公司的亚叶酸钙注射液和左亚叶酸钙注射液，德国MEDAC公司上市亚叶酸钠注射液和左亚叶酸钠注射液。

原料药左亚叶酸的制备由亚叶酸钙逐步拆分、酸化得到。在此制备过程中，会产生一特殊杂质(杂质10)。杂质10在碱性溶液条件(如左亚叶酸钙盐、左亚叶酸钠盐中)下不会稳定存在，因此，左亚叶酸注射液中无杂质10存在，同时该杂质在EP9.7左亚叶酸钙标准中未收载。同时杂质4、6、10之间存在转化关系，杂质4、6、10为左亚叶酸原料中主要降解产物；杂质4、6为左亚叶酸注射液中主要降解产物，杂质10无法在注射液中(碱性条件)稳定存在，故在制剂生产过程中及放置过程中杂质10转化为杂质4及杂质6，转化过程中存在中间产物10-甲酰四氢叶酸，因其稳定性较差且易于进一步降解为杂质6或杂质4，难以获得，故未在原料及制剂中进行研究，通过未知单杂及杂质10与杂质4、杂质6间接控制。

中国专利CN109030653A公开一种左亚叶酸中有关物质的检测方法，采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶；采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱；所述流动相A采用包含四丁基氢氧化铵的磷酸氢二钠缓冲液；所述流动相B采用甲醇；溶解样品的溶剂采用包含流动相A、流动相B和二甲亚砜的混合溶剂。但是该专利中提供的检测方法，溶解样品的溶剂包含二甲亚砜，对操作人员的身体健康产生不利的影响，在色谱分析的过程中采用梯度洗脱的过程，检测方法复杂，检测的杂质少，灵敏度不佳，总杂含量偏低，准确度偏低。

为了保证药物的安全有效，需要对药物的原料药(API)有关物质进行研究、检测和监控。有关物质主要为工艺副产物及降解产物，API在放置过程中，杂质谱在发生变化，因此，需要根据不同的合成路线和生产工艺、贮藏条件建立合适的检测方法，达到对有关物质准确、有效的检测和监控。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法，该检测方法采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶；采用流动相A和流动相B为混合流动相进行等度洗脱；流动相A采用包含四丁基磷酸二氢铵的磷酸氢二钠缓冲液，用磷酸调节其pH值至6.7-6.9；流动相B采用甲醇，在进行等度洗脱时，流动相A和流动相B的体积比为830～840:170～160；溶解样品的溶剂采用包含流动相A和流动相B的混合溶剂，在混合溶剂中流动相A和流动相B的体积比为830～840:170～160。

本发明通过筛选流动相和优化流动相的比例，选择以包含四丁基磷酸二氢铵的磷酸氢二钠缓冲液和甲醇作为混合流动相进行等度洗脱，在等度洗脱的过程中，控制流动相的pH值，在其他条件配合下，可以检测出不稳定的杂质10，检测出的杂质多，不需要复杂的梯度洗脱过程，即可快速、有效、准确监控左亚叶酸原料药中的有关物质。在进行等度洗脱时，流动相A和流动相B的体积比为830～840:170～160，可以但不局限于830:170、831:169、832:168、833:167、834:166、835:165、836:164、837:163、838:162、839:161或840:160，在一种优选方案中，流动相A和流动相B的体积比为830:170或835:165。

本发明提供的检测方法，在选择最佳的流动相之后，严格控制流动相的pH值，采用简单的等度洗脱过程，即可快速、有效、准确监控左亚叶酸原料药中的有关物质，可以准确分离不稳定的杂质10，检出的杂质多，各杂质峰之间、左亚叶酸主峰及其相邻杂质峰之间的分离度高，能够准确监控左亚叶酸原料药中的有关物质。对于本发明而言，流动相A采用包含四丁基磷酸二氢铵的磷酸氢二钠缓冲液，用磷酸调节其pH值至6.7-6.9，具体pH值可以但不局限于6.7、6.72、6.74、6.76、6.78、6.8、6.82、6.84、6.86、6.88或6.9。

采用本发明的检测方法，溶解样品的溶剂采用包含流动相A和流动相B的混合溶剂，在混合溶剂中流动相A和流动相B的体积比为830～840:170～160，可以但不局限于830:170、831:169、832:168、833:167、834:166、835:165、836:164、837:163、838:162、839:161或840:160，在一种优选方案中，流动相A和流动相B的体积比为830:170或835:165。为了简化实验过程，一般采用等度洗脱时，由流动相A和流动相B组成的混合流动相作为混合溶剂来溶解样品，无需另外配制。

本发明中提到的流动相A的制备可包括以下步骤：将浓度为0.5～1.5mol/L四丁基磷酸二氢铵溶液、磷酸氢二钠和水配制成溶液，再用磷酸调节pH值至6.7-6.9，即得。

在一种优选方案中，流动相A的制备可包括以下步骤：将浓度为1.0mol/L四丁基磷酸二氢铵溶液4.0ml、磷酸氢二钠1.42g和水配制成835ml溶液，再用磷酸调节pH值至6.7-6.9，即得。

在一种优选方案中，流动相A的制备可包括以下步骤：将浓度为1.0mol/L四丁基磷酸二氢铵溶液4.0ml、磷酸氢二钠1.42g和水配制成835ml溶液，再用磷酸调节pH值至6.8，即得。

本发明提到的高效液相色谱法的条件还包括：色谱柱为Hypersil ODS C18，优选地，色谱柱的长度为250mm，直径为4.0mm，填料粒径为5μm。

进一步地，柱温为35～45℃，优选为40℃；流速为1.0～1.5ml/min，优选为1.25ml/min；进样量为5-50μl，优选为10μl。

采用本发明的检测方法，检测器不需要较高的波长，检测波长为250～260nm，优选为254nm。

本发明提供的左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法，所述有关物质包括以下物质：

其中，杂质1(又名杂质A)，杂质2(又名杂质B)，杂质3(又名杂质C)，杂质4(又名杂质D)，杂质5(又名杂质E)，杂质6(又名杂质F)，杂质7(又名杂质G)，杂质9(又名杂质I)，杂质10(又名杂质J)。

本发明提供的检测方法的具体步骤为：分别配制杂质及左亚叶酸定位溶液、供试品溶液、对照品溶液并进样，计算杂质的含量。

杂质及左亚叶酸定位溶液为：取杂质1、2、3、4、6、7、9、10和左亚叶酸样品适量，加混合溶剂(流动相A-流动相B的体积比为830～840:170～160，优选为835:165)溶解并稀释制成每1ml中含杂质1 3μg、其他各杂质2μg和左亚叶酸1.0mg的溶液，作为杂质及左亚叶酸定位溶液。

供试品溶液为：取左亚叶酸供试品约25mg，精密称定后，置25ml量瓶中，加混合溶剂(流动相A-流动相B的体积比为830～840:170～160，优选为835:165)溶解并定容，摇匀，作为供试品溶液。

本发明通过筛选合适流动相并优化流动相中各组分比例，以及筛选合适的其他色谱条件，对左亚叶酸以及所述8个杂质进行色谱检测，确定了本发明检测方法，通过对各杂质和左亚叶酸的峰定位试验，干扰性试验和左亚叶酸的降解试验对本发明进行专属性验证。

采用本发明的技术方案，优势如下:

本发明提供的左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法，选择以包含四丁基磷酸二氢铵的磷酸氢二钠缓冲液和甲醇作为混合流动相进行等度洗脱，在等度洗脱的过程中，控制流动相的比例和pH值，不需要复杂的梯度洗脱过程和检测方法，可以检测出不稳定的杂质10，检测出的杂质多，灵敏度高、专属性好，各杂质峰之间、左亚叶酸主峰及其相邻杂质峰之间的分离度高，对研究各杂质均能有效分离，检测出的杂质多，能快速、有效、准确监控左亚叶酸原料药中的有关物质。

附图说明

图1是杂质及左亚叶酸定位溶液的高效液相色谱图；

图2是实施例1中供试品溶液的高效液相色谱图；

图3是实施例2中供试品溶液的高效液相色谱图；

图4是对比例1中供试品溶液的高效液相色谱图；

图5是对比例2中供试品溶液的高效液相色谱图；

图6是对比例3中供试品溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

通过以下实施例并结合附图对本发明的检测方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。

实施例1

高效液相色谱条件：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Hypersil ODS C18 250mm×4.0mm，5μm)；以含四丁基磷酸二氢铵的磷酸氢二钠的缓冲液(取浓度为1.0mol/L四丁基磷酸二氢铵溶液4.0ml、磷酸氢二钠1.42g和水配制成835ml溶液，再用磷酸调节pH值至6.8)-甲醇(体积比为835:165)为混合流动相进行等度洗脱；柱温为40℃，检测波长为254nm，流速为1.25ml/min。

样品配制：

取左亚叶酸供试品约25mg，精密称定后，置25ml量瓶中，加混合溶剂(流动相A-流动相B的体积比为835:165)溶解并定容，摇匀，作为供试品溶液(临用新制)。

试验操作：取供试品溶液10μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图2。

取左亚叶酸配制供试品溶液，进样并记录图谱，按加校正因子自身对照法计算供试品中杂质的含量，结果见表1和图2。

表1 左亚叶酸中各杂质的含量测定结果

批号	杂质1(％)	杂质4(％)	杂质6(％)	杂质10(％)	其他最大单杂(％)	总杂(％)
							含量％	0.022	0.077	0.134	0.451	0.090	0.914

由表1和图2可以看出，左亚叶酸供试品中已知不稳定杂质10有检出，除已知单杂外其他最大单杂为0.09％，总杂为0.914％。其中杂质10与其相邻杂质的分离度分别为3.69、7.48，均大于2.0，能够有效分离杂质。

本发明通过筛选合适流动相并优化流动相pH，以及筛选合适的溶剂及检测波长，对左亚叶酸以及上述8个杂质进行色谱检测，确定了本发明实施例1中的检测方法，能有效分离检测杂质1、2、3、4、5、6、7、9、10。

通过对各杂质和左亚叶酸的峰定位试验，干扰性试验和左亚叶酸的降解试验对本发明进行专属性验证。

杂质及左亚叶酸定位溶液为：取杂质1、2、3、4、6、7、9、10和左亚叶酸样品适量，加混合溶剂(流动相A-流动相B的体积比为835:165)溶解并稀释制成每1ml中含杂质1 3μg、其他各杂质2μg和左亚叶酸1.0mg的溶液，作为杂质及左亚叶酸定位溶液。取杂质及左亚叶酸定位溶液，按本例的高效液相色谱条件和方法进行检测，结果见表2和图1。

表2 专属性验证结果

由表2和图1可以看出，各杂质峰之间、左亚叶酸主峰及其相邻杂质峰之间的分离度均符合规定，峰纯度均较好，本发明的专属性好。

称取各个杂质对照品适量，加混合溶剂(流动相A-流动相B的体积比为835:165)进行适合的稀释，使得进样10μl，以信噪比S/N＝3、S/N＝10分别作为检测限和定量限。分别精密量取杂质1、2、3、4、6、7、9、10以及主成分贮备液适量，配制成一系列梯度浓度溶液，分别精密量取上述系列梯度浓度溶液各10μl，从低浓度到高浓度依次进样分析，记录色谱图，结果见表3。

表3 左亚叶酸和各杂质的检测限、定量限、线性试验结果

由表3可以看出，本发明左亚叶酸和各杂质检测灵敏度均较高，其检测限和定量限均较小，并且各杂质在较低浓度范围内线性关系良好。

本发明人配制供试品溶液，分别于配制后的0H、2.5H、5H和8H进样检测，杂质1、2、4、6、10均有检出，在室温下，左亚叶酸样品在8H内，杂质6峰面积显著增大，杂质10峰面积减小，说明样品溶液不稳定，需临用现配。

表4 各杂质的回收率验证结果

试验	回收率90-108％	回收率RSD≤6.0％
			杂质1	103.55-107.12％	1.08
杂质2	90.35-97.40％	3.03
			杂质3	100.23-107.00％	2.33
杂质4	98.98-101.37％	0.77
			杂质6	92.10-107.76％	5.89
杂质7	92.40-104.52％	3.80
			杂质10	93.16-104.86％	3.85

由表4可以看出，本发明的回收率试验结果符合要求，本发明回收率高。

实施例2

高效液相色谱条件：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Hypersil ODS C18 250mm×4.0mm，5μm)；以含四丁基磷酸二氢铵的磷酸氢二钠的缓冲液(取浓度为1.0mol/L四丁基磷酸二氢铵溶液4.0ml、磷酸氢二钠1.42g和水配制成835ml溶液，再用磷酸调节pH值至6.8)-甲醇(体积比为830:170)为混合流动相进行等度洗脱；柱温为40℃，检测波长为254nm，流速为1.25ml/min。

样品配制：

取左亚叶酸供试品约25mg，精密称定后，置25ml量瓶中，加混合溶剂(流动相A-流动相B的体积比为830:170)溶解并定容，摇匀，作为供试品溶液(临用新制)。

试验操作：取供试品溶液10μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图3。

在本对比例中将混合流动相中流动相A和流动相B的比例修改为830:170，各成分的保留时间有微小变化，供试品溶液中各杂质检出量无明显差异。

对比例1

高效液相色谱条件：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(Hypersil ODS C18 4.0×250mm，5μm)，以含四丁基氢氧化铵的磷酸氢二钠缓冲液(取10％四丁基氢氧化铵溶液8.0ml和磷酸氢二钠2.2g，加水溶解使成780ml，并用磷酸调节pH值至7.8)为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为280nm，柱温：40℃，流速：1.0ml/min，进样量：20μl。

梯度洗脱过程为：0-20分钟内，流动相A和流动相B的体积比为86:14等度洗脱；20-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比从86:14匀速渐变至70:30；35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持70:30不变；45-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比从70:30匀速渐变至86:14；50-62分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持86:14不变。

样品配制：

取左亚叶酸供试品适量，加溶剂(流动相A-流动相B-二甲亚砜＝86:14:100)超声溶解并制成每1ml中约含0.5mg左亚叶酸的溶液，作为供试品溶液。

试验操作：取供试品溶液20μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图4，结果见表4。

表5 左亚叶酸中各杂质的含量测定结果

批号

杂质1(％)

杂质4(％)

杂质6(％)

杂质10(％)

最大单杂(％)

总杂(％)

含量％

0.016

0.132

0.095

未检出

0.095

0.447

由图4可知，本对比例中供试品中杂质10未检出，总杂仅为0.447％，总杂的检出量较小。

对比例2

高效液相色谱条件：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Hypersil ODS C18 250mm×4.0mm，5μm)；以含四丁基磷酸二氢铵的磷酸氢二钠的缓冲液(取浓度为1.0mol/L四丁基磷酸二氢铵溶液4.0ml、磷酸氢二钠1.42g和水配制成835ml溶液，再用磷酸调节pH值至7.7)-甲醇(835:165)为混合流动相进行等度洗脱；柱温为40℃，检测波长为254nm，流速为1.25ml/min。

样品配制：

取左亚叶酸供试品约25mg，精密称定后，置25ml量瓶中，加混合溶剂(流动相A-流动相B的体积比为835:165)溶解并定容，摇匀，作为供试品溶液(临用新制)。

试验操作：取供试品溶液10μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图5。

本对比例中在流动相的pH为7.7时，由图5可知：杂质10有检出，该杂质10的色谱峰峰形前延，峰形不佳，而杂质1在6.942min出峰，杂质10与杂质1的分离度不佳，干扰杂质1的检出。

对比例3

高效液相色谱条件：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Hypersil ODS C18 250mm×4.0mm，5μm)；以含四丁基磷酸二氢铵的磷酸氢二钠的缓冲液(取浓度为1.0mol/L四丁基磷酸二氢铵溶液4.0ml、磷酸氢二钠1.42g和水配制成835ml溶液，再用磷酸调节pH值至6.5)-甲醇(835:165)为混合流动相进行等度洗脱；柱温为40℃，检测波长为254nm，流速为1.25ml/min。

样品配制：

杂质及左亚叶酸定位溶液为：取杂质1、2、3、4、6、7、9、10和左亚叶酸样品适量，加混合溶剂(流动相A-流动相B的体积比为835:165)溶解并稀释制成每1ml中含杂质1 3μg、其他各杂质2μg和左亚叶酸1.0mg的溶液，作为杂质及左亚叶酸定位溶液。

取左亚叶酸供试品约25mg，精密称定后，置25ml量瓶中，加混合溶剂(流动相A-流动相B的体积比为835:165)溶解并定容，摇匀，作为供试品溶液(临用新制)。

试验操作：取供试品溶液10μl进样，记录色谱图，典型色谱图见图6。

本对比例中在流动相的pH为6.5时，由图6可知：杂质10有检出，出现很多未知杂质峰，且主成分出峰时间延后，约为21min出峰。由于供试品中不含杂质9，无法确定杂质4对杂质9的干扰问题。在杂质及左亚叶酸定位溶液中，杂质4出峰保留时间提前至29.143，导致杂质4与杂质9的出峰时间重合，干扰杂质9的检出，从而证实在此色谱条件下杂质4对杂质9存在干扰。

本发明提供的检测方法能快速、有效、准确检测左亚叶酸原料药中的有关物质，同时能有效检测原料药中不稳定杂质(杂质10)，且检测杂质多，专属性较好、各杂质之间、左亚叶酸及其相邻杂质峰之间的分离度均符合规定，杂质和主峰可有效分离；灵敏度较高，准确度较高，可以准确测定左亚叶酸原料中的有关物质；本发明可以准确累积数据，观察稳定性考察中各杂质的转换趋势。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (13)

1.一种左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，该检测方法采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶；采用流动相A和流动相B为混合流动相进行等度洗脱；所述流动相A采用包含四丁基磷酸二氢铵的磷酸氢二钠缓冲液，用磷酸调节其pH值至6.7-6.9；所述流动相B采用甲醇，在进行等度洗脱时，流动相A和流动相B的体积比为830～840:170～160；溶解样品的溶剂采用包含流动相A和流动相B的混合溶剂，在混合溶剂中流动相A和流动相B的体积比为830～840:170～160；所述有关物质包括以下物质：

2.根据权利要求1所述的左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，在等度洗脱时，流动相A和流动相B的体积比为835:165。

3.根据权利要求1所述的左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相A的制备包括以下步骤：将浓度为0.5～1.5mol/L四丁基磷酸二氢铵溶液、磷酸氢二钠和水配制成溶液，再用磷酸调节pH值至6.7-6.9，即得。

4.根据权利要求3所述的左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相A的制备包括以下步骤：将浓度为1.0mol/L四丁基磷酸二氢铵溶液4.0ml、磷酸氢二钠1.42g和水配制成835ml溶液，再用磷酸调节pH值至6.7-6.9，即得。

5.根据权利要求4所述的左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相A的制备包括以下步骤：将浓度为1.0mol/L四丁基磷酸二氢铵溶液4.0ml、磷酸氢二钠1.42g和水配制成835ml溶液，再用磷酸调节pH值至6.8，即得。

6.根据权利要求1所述的左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为Hypersil ODS C18。

7.根据权利要求6所述的左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的长度为250mm，直径为4.0mm，填料粒径为5μm。

8.根据权利要求1所述的左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：检测波长为250～260nm。

9.根据权利要求8所述的左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：检测波长为254nm。

10.根据权利要求1所述的左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：柱温为35～45℃；流速为1.0～1.5ml/min。

11.根据权利要求10所述的左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：柱温为40℃；流速为1.25ml/min。

12.根据权利要求1所述的左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：进样量为5-50μl。

13.根据权利要求12所述的左亚叶酸原料药中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：进样量为10μl。

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