CN102192956A - 一种左亚叶酸钠原料药的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种左亚叶酸钠原料药的检测方法，该检测方法包括采用反相高效液相色谱法检测左亚叶酸钠原料药中左亚叶酸根和杂质的含量，其中反相高效液相色谱的条件包括：采用以十八烷基或辛烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；采用包含缓冲剂和四丁基氢氧化铵的pH值为7.0～7.8的、体积比为70∶30～95∶5的水与有机相的混合流动相，其中有机相为甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇或正丙醇。

Description

一种左亚叶酸钠原料药的检测方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种左亚叶酸钠原料药的检测方法。

背景技术

左亚叶酸((6S)-5-甲酰-5，6，7，8-四氢叶酸)是一种叶酸衍生物，其基本作用和叶酸相同，具有刺激白细胞生长成熟的作用，能改善各种原因引起的巨幼细胞性贫血。另外，还主要用于肿瘤化疗，对抗肿瘤细胞对氨基蝶呤或甲氨蝶呤的抗药性，或拮抗氨基蝶呤或甲氨蝶呤对正常细胞的毒性；也用作自身免疫疾病(如银屑病和类风湿性关节炎)的辅助用药。左亚叶酸的效果优于叶酸，因为叶酸在肝及骨髓中先转化为亚叶酸才能起作用。

左旋亚叶酸一般多以钙盐形式做成制剂，但其钙盐的水溶液稳定性不好，容易产生沉淀，使用不便。左亚叶酸的钠盐(结构如式I所示)溶解度较钙盐好，适于制备成高浓度制剂，同时与其他药物制剂的相容性也好于钙盐，因此是比当前广泛应用的亚叶酸钙盐更为可靠的剂型。

然而，由于左亚叶酸钠在合成制备过程中有可能引入诸如原料、副反应产物及其他有关物质，因此，建立相应的含量测定方法和有关物质检测方法，对控制亚叶酸钠的质量有着重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于为更有效地控制左亚叶酸钠原料药质量而提供一种左亚叶酸钠原料药的检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种左亚叶酸钠原料药的检测方法，该检测方法包括采用反相高效液相色谱法检测左亚叶酸钠原料药中杂质和左亚叶酸根的含量，其中反相高效液相色谱的条件包括：

采用以十八烷基或辛烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；

采用包含缓冲剂和四丁基氢氧化铵的pH值为7.0～7.8的、体积比为70∶30～95∶5的水与有机相的混合流动相，其中有机相为甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇或正丙醇。

在上述检测方法中，缓冲剂可以选自磷酸盐，例如，磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，柠檬酸或其盐，酒石酸或其盐，硫酸盐以及高氯酸盐中的一种或多种；优选为磷酸盐，例如，磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中的一种或多种；更优选为磷酸氢二钠。

在上述检测方法中，混合流动相中缓冲剂的浓度可以为0.05～1.5％(重量/体积)，四丁基氢氧化铵的浓度为0.01～0.5％(体积/体积)。混合流动相可以为体积比为70∶30～95∶5的水与甲醇的混合流动相，优选为体积比为75∶25的水与甲醇的混合流动相；或者体积比为70∶30～95∶5的水与乙腈的混合流动相，优选为体积比为80∶20的水与乙腈的混合流动相。更优选地，混合流动相为包含0.28％(重量/体积)磷酸氢二钠和0.1％(体积/体积)四丁基氢氧化铵的体积比为75∶25、pH值为7.4的水与甲醇的混合流动相。混合流动相的pH值优选采用磷酸调节。

在上述检测方法中，反相高效液相色谱条件还包括柱温为25～40，优选为30℃；检测器为紫外检测器，检测波长为286nm。

上述检测方法还可以包括采用已知含量左亚叶酸钠作为对照品，以自身对照法计算杂质的含量；和/或以外标法计算左亚叶酸钠原料药中左亚叶酸根。

优选地，上述检测方法还包括采用高效液相色谱法检测左亚叶酸钠原料药中左亚叶酸钠右旋异构体的含量，其中高效液相色谱条件包括：

采用Pirkle型、纤维素型、环糊精型、蛋白质型或大环糖肽抗生素键合固定相为填充剂的色谱柱；

采用包含缓冲剂的pH值为5.0～7.0的、体积比为70∶30～97∶3的水与有机相的混合流动相，其中有机相为甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇或正丙醇。

其中，缓冲剂也可以选自磷酸盐，例如，磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，柠檬酸或其盐，酒石酸或其盐，硫酸盐以及高氯酸盐中的一种或多种；优选为磷酸盐，例如，磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中的一种或多种；更优选为磷酸氢二钠。

其中，混合流动相中缓冲剂的浓度可以为0.01～1.0mol/L。混合流动相可以为体积比为70∶30～97∶3的水与异丙醇的混合流动相，优选为体积比为90∶10的水与异丙醇的混合流动相。更优选地，混合流动相为包含0.05mol/L磷酸氢二钠的体积比为90∶10、pH值为5.5的水与异丙醇的混合流动相。混合流动相的pH值优选采用磷酸调节。

其中，反相高效液相色谱条件还包括柱温为25～40℃，优选为30℃；检测器为紫外检测器，检测波长为286nm。

其中，还可以包括以归一化法计算左亚叶酸钠右旋异构体的含量。

更优选地，上述检测方法还包括采用原子吸收分光光度法或火焰光度法检测左亚叶酸钠原料药中的钠离子含量。

其中，原子吸收分光光度法可以采用火焰原子化器或石墨炉原子化器，检测波长589nm。

其中，还可以包括以标准曲线法或标准加入法计算钠离子含量。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明的检测方法包括以下检测项目：左亚叶酸根以及杂质含量的检测，左亚叶酸钠右旋异构体含量的检测以及钠离子含量的检测，具体包括如下步骤：

一、杂质含量的检测

(1)供试品溶液的配制

以去离子水溶解左亚叶酸钠原料药，制成浓度为0.01mg/mL～2mg/mL，优选为0.3mg/mL的溶液，作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的配制

将供试品溶液以去离子水稀释100倍，制成对照品溶液；

(3)高效液相色谱检测

采用如下色谱条件对制备的供试品溶液和对照品溶液进行检测：

色谱柱：十八烷基或辛烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：包含0.28％(重量/体积)磷酸氢二钠和0.1％(重量/体积)四丁基氢氧化铵的体积比为75∶25、pH值为7.4的水与甲醇的混合流动相；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

进样量：10μL；

检测波长：286nm；

检测器：紫外检测器。

(4)采用1％自身对照法计算杂质含量。

二、左亚叶酸根含量的检测

(1)供试品溶液的配制

以去离子水溶解左亚叶酸钠原料药，制成浓度为0.01～2mg/mL，优选为0.03mg/mL的溶液，作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的配制

以去离子水溶解左亚叶酸钠对照品，制成浓度为0.01～2mg/mL，优选为0.03mg/mL的溶液，作为对照品溶液；

(3)高效液相色谱检测

采用如下色谱条件对制备的供试品溶液和对照品溶液进行检测：

色谱柱：十八烷基或辛烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：包含0.28％(重量/体积)磷酸氢二钠和0.1％(重量/体积)四丁基氢氧化铵的体积比为75∶25、pH值为7.4的水与甲醇的混合流动相；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

进样量：10μL；

检测波长：286nm；

检测器：紫外检测器。

(4)含量计算

采用外标单点法以峰面积计算左亚叶酸根含量。

三、左亚叶酸钠右旋异构体含量的检测

(1)供试品溶液的配制

以去离子水溶解左亚叶酸钠原料药，制成浓度为0.01～2mg/mL，优选为0.3mg/mL的溶液，作为供试品溶液；

(2)系统适用性溶液的配制

以去离子水溶解混旋亚叶酸钠，制成浓度为0.001～0.3mg/mL，优选为0.01mg/mL的溶液，作为系统适用性溶液；

(3)高效液相色谱检测

采用如下色谱条件进样测定系统适用性溶液，确定左、右旋亚叶酸钠可良好分离后，对制备的供试品溶液进行检测：

色谱柱：人白蛋白手性柱；

流动相：混合流动相为包含0.05mol/L磷酸氢二钠的体积比为90∶10、pH值为5.5的水与异丙醇的混合流动相。；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

进样量：10μL；

检测波长：286nm；

检测器：紫外检测器。

(4)采用面积归一化法计算左亚叶酸钠右旋异构体含量

四、钠离子含量的检测

(1)供试品溶液的配制

以去离子水溶解左亚叶酸钠原料药，制成浓度为0.005～0.25mg/mL，优选为0.025mg/mL的溶液，作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的配制

取1000ppm/mL的氯化钠标准溶液储备液，加去离子水分别制成0.5、1.0、2.0、2.5、3.0和4.0ppm/mL的对照品溶液；

(3)原子吸收分光光度法

采用如下条件对制备的供试品溶液和对照品溶液进行检测：

原子化器：火焰原子化器或石墨炉原子化器；

检测波长：589.0nm；

(4)以标准曲线法计算钠离子含量。

本发明的左亚叶酸钠原料药的检测方法具有以下有益效果：

1、本发明的检测方法使用pH为7.0～7.8的缓冲剂-四丁基氢氧化铵缓冲体系，使色谱柱的耐用性增加；

2、本发明的检测方法除了对左亚叶酸钠原料药的杂质进行检测，还对左亚叶酸钠原料药中左亚叶酸根和钠离子含量进行相应的测定，使检测方法更为完善；

3、针对左亚叶酸钠为光学活性性质的特点，本专利增加了利用手性色谱柱进行的HPLC光学异构体纯度分析，对左亚叶酸钠原料药中右旋光学异构体的含量进行检测。

附图说明

图1是有关物质检查系统适用性试验图谱；

图2是有关物质检查色谱图；

图3是有关物质检查1％对照溶液色谱图；

图4是右旋异构体检查系统适用性试验混旋异构体色谱图；

图5是右消旋异构体检查色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

实施例1

一、左亚叶酸钠原料药的制备

将左亚叶酸钙(购于苏州苏瑞医药化工有限公司)以水溶解，溶液经凝胶型钠型阳离子交换树脂处理，交换阳离子，收集交换液，再以水洗脱一定体积，将该溶液与交换液合并，pH值调至10.0～11.0，减压浓缩，以无水乙醇醇沉，乙醇终浓度为85％，将所得沉淀滤出、真空减压干燥，得到左亚叶酸钠原料药，备用。

二、杂质含量的检测

(1)仪器与药品

仪器：美国安捷伦Agilent 1100高效液相色谱仪；

药品：甲醇，色谱纯，购自天津市康科德科技有限公司；四丁基氢氧化铵、磷酸氢二钠，分析纯，购自天津市康科德科技有限公司；磷酸，分析纯，购自天津市康科德科技有限公司；去离子水；

(2)供试品溶液的配制

以去离子水溶解上述制备的左亚叶酸钠原料药，制成约0.3mg/mL的溶液；

(3)系统适用性溶液的配制

取亚叶酸钠对照品(购于苏州苏瑞医药化工有限公司)和10-甲酰叶酸对照品(购于苏州苏瑞医药化工有限公司)适量，置于同一量瓶中，加水制成每mL分别含亚叶酸钠和10-甲酰叶酸5μg的溶液，作为系统适用性溶液；

(4)对照品溶液的配制

将上述供试品溶液用水稀释100倍，制成对照品溶液；

(5)高效液相色谱检测

取系统适用性溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，如图1所示，其中，7.277处为10-甲酰叶酸的峰，10.831处为亚叶酸的峰，待亚叶酸钠与10-甲酰叶酸的分离度符合中国药典2005年版二部附录的要求后，采用如下色谱条件对制备的供试品溶液和对照品溶液进行检测，结果如图2和图3所示：

色谱柱：C18250mm×4.6mm，5μm(Phenomenex Luna)；

流动相：甲醇∶水相(含0.28％(0.28g/100mL，w/v))磷酸氢二钠和0.1％(0.1g/100mL，w/v)四丁基氢氧化铵，pH以10％(10mL/100mL，v/v)磷酸调至7.4)＝25∶75；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

进样量：10μL；

检测波长：286nm；

检测器：紫外检测器；

(6)含量计算

以1％自身对照法(参照中国药典2005版二部附录VD高效液相色谱法)计算，获得供试样品溶液中杂质的含量为0.43％。

测得的供试品溶液中各杂质峰峰面积之和未大于对照溶液主峰面积的2倍(2.0％)，最大单个峰面积未大于对照溶液主峰面积0.5倍(0.5％)。

三、左亚叶酸根含量的测定

(1)仪器与药品

仪器：美国安捷伦Agilent 1100高效液相色谱仪；

药品：甲醇，色谱纯，购自天津市康科德科技有限公司；四丁基氢氧化铵、磷酸氢二钠，分析纯，购自天津市康科德科技有限公司；磷酸，分析纯，购自天津市康科德科技有限公司；去离子水；左亚叶酸钠对照品，自制，具体制备方法如下：左亚叶酸钠原料药制成0.2g/mL的甲醇-水溶液，经凝胶柱层析纯化得到左亚叶酸钠溶液，经浓缩、冻干制得对照品；

(2)供试品溶液的配制

精密称取上述制备的左亚叶酸钠原料药适量，用去离子水溶解制成浓度为0.03mg/mL的溶液；

(3)对照品溶液的配制

精密称取左亚叶酸钠对照品(自制，具体制备方法如下：左亚叶酸钠原料药制成0.2g/mL的甲醇-水溶液，经凝胶柱层析纯化得到左亚叶酸钠溶液，经浓缩、冻干制得对照品)适量，用去离子水溶解制成浓度为0.03mg/mL的溶液；

(4)高效液相色谱检测

采用如下色谱条件对制备的供试品溶液和对照品溶液进行检测：

色谱柱：C₁₈250mm×4.6mm，5μm(Phenomenex Luna)

流动相：甲醇∶水(含0.28％磷酸氢二钠和0.1％四丁基氢氧化铵，pH调至7.4)＝25∶75；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

进样量：10μL；

检测波长：286nm；

检测器：紫外检测器；

(5)含量计算

采用外标单点法(参照中国药典2005版二部附录VD高效液相色谱法)以峰面积计算供试品溶液中左亚叶酸根含量为99.56％；

四、左亚叶酸钠右旋异构体含量的检测

(1)仪器与药品

仪器：美国安捷伦Agilent 1100高效液相色谱仪；

药品：异丙醇，色谱纯，购自天津市康科德科技有限公司；磷酸氢二钠，分析纯，购自天津市康科德科技有限公司；磷酸，分析纯，购自天津市康科德科技有限公司；去离子水；

(2)供试品溶液的配制

以去离子水溶解上述制备的左亚叶酸钠原料药，制成浓度为0.3mg/mL的溶液；

(3)系统适用性试验溶液的配制

取混旋亚叶酸钠对照品(苏州苏瑞医药化工有限公司提供)适量，加水溶解制成含亚叶酸钠0.01mg/mL的溶液；

(4)高效液相色谱检测

采用如下色谱条件进样测定系统适用性溶液，确定左、右旋亚叶酸钠可良好分离(如图4所示)后，对制备的供试品溶液进行检测，检测结果如图5所示：

色谱柱：人白蛋白手性柱CHIRAL HSA 150mm×4.0mm，5μm(Diacel)；

流动相：异丙醇∶水(含0.05mol/L磷酸氢二钠，用磷酸调节pH调至5.5)＝10∶90；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

进样量：10μL；

检测波长：286nm；

检测器：紫外检测器；

(5)含量计算

采用面积归一化法(参照中国药典2005版二部附录VD高效液相色谱法)计算供试品溶液中左亚叶酸钠右旋异构体含量为0.27％；

五、钠离子含量的检测

(1)仪器与药品

仪器：AA670火焰原子吸收分光光度仪(日本岛津公司)

药品：氯化钠，色谱纯，购自天津市康科德科技有限公司；去离子水

(2)供试品溶液的配制

精密称取上述制备的左亚叶酸钠原料药25mg，溶于1000mL去离子水中；

(3)对照品溶液的配制

精密量取氯化钠对照溶液储备液(1000ppm/mL)适量，加去离子水分别制成0.5、1.0、2.0、2.5、3.0和4.0ppm/mL的对照品溶液；

(4)原子吸收分光光度法检测

采用如下条件对制备的供试品溶液和对照品溶液进行检测：

原子化器：火焰原子化器或石墨炉原子化器；

检测波长：589.0nm；

空气流速：空气流速；8L/min；

乙炔气流速：1.9L/min；

燃烧头：长10cm，高6mm；

(5)含量计算

以标准曲线法(参照中国药典2005版二部附录VD高效液相色谱法)计算供试品溶液中钠的含量为：94.93％。

Claims (19)

1.一种左亚叶酸钠原料药的检测方法，该检测方法包括采用反相高效液相色谱法检测左亚叶酸钠原料药中左亚叶酸根和杂质的含量，其中反相高效液相色谱的条件包括：

采用以十八烷基或辛烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；

采用包含缓冲剂和四丁基氢氧化铵的pH值为7.0～7.8的、体积比为70∶30～95∶5的水与有机相的混合流动相，其中有机相为甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇或正丙醇。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲剂选自磷酸盐，例如，磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，柠檬酸或其盐，酒石酸或其盐，硫酸盐以及高氯酸盐中的一种或多种；优选为磷酸盐，例如，磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中的一种或多种；更优选为磷酸氢二钠。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述混合流动相中缓冲剂的浓度为0.05～1.5％(重量/体积)，四丁基氢氧化铵的浓度为0.01～0.5％(重量/体积)。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述混合流动相为体积比为70∶30～95∶5的水与甲醇的混合流动相，优选为体积比为75∶25的水与甲醇的混合流动相；或者体积比为70∶30～95∶5的水与乙腈的混合流动相，优选为体积比为80∶20的水与乙腈的混合流动相。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述混合流动相为包含0.28％(重量/体积)磷酸氢二钠和0.1％(体积/体积)四丁基氢氧化铵的体积比为75∶25、pH值为7.4的水与甲醇的混合流动相。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述混合流动相的pH值采用磷酸调节。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述反相高效液相色谱条件还包括柱温为25～40℃，优选为30℃；检测器为紫外检测器，检测波长为286nm。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括采用已知含量左亚叶酸钠作为对照品，以外标法计算左亚叶酸钠原料药中左亚叶酸根；和/或以自身对照法计算杂质的含量。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括采用高效液相色谱法检测左亚叶酸钠原料药中左亚叶酸钠右旋异构体的含量，其中高效液相色谱条件包括：

采用Pirkle型、纤维素型、环糊精型、蛋白质型或大环糖肽抗生素键合固定相为填充剂的色谱柱；

采用包含缓冲剂的pH值为5.0～7.0的、体积比为70∶30～97∶3的水与有机相的混合流动相，其中有机相为甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇或正丙醇。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲剂选自磷酸盐，例如，磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，柠檬酸或其盐，酒石酸或其盐，硫酸盐以及高氯酸盐中的一种或多种；优选为磷酸盐，例如，磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中的一种或多种；更优选为磷酸氢二钠。

11.根据权利要求9或10所述的检测方法，其特征在于，所述混合流动相中缓冲剂的浓度为0.01～1.0mol/L。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述混合流动相为体积比为70∶30～97∶3的水与异丙醇的混合流动相，优选为体积比为90∶10的水与异丙醇的混合流动相。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述混合流动相为包含0.05mol/L磷酸氢二钠的体积比为90∶10、pH值为5.5的水与异丙醇的混合流动相。

14.根据权利要求9至13中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述混合流动相的pH值采用磷酸调节。

15.根据权利要求9至14中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述反相高效液相色谱条件还包括柱温为25～40℃，优选为30℃；检测器为紫外检测器，检测波长为286nm。

16.根据权利要求9至15中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括以归一化法计算左亚叶酸钠右旋异构体的含量。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括采用原子吸收分光光度法或火焰光度法检测左亚叶酸钠原料药中的钠离子含量。

18.根据权利要求17所述的检测方法，其特征在于，所述原子吸收分光光度法采用火焰原子化器或石墨炉原子化器，检测波长589nm。

19.根据权利要求17或18所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括以标准曲线法或标准加入法计算钠离子含量。

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