CN102520081A - 一种活血化瘀的中药制剂的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种活血化瘀的中药制剂的检测方法，该检测方法包括采用液相色谱法测定所述中药制剂，其中，所述液相色谱的条件包括：采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；采用以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液(V/V)为流动相B进行梯度洗脱。本发明建立了一种化学测定联合生物测定的方法，该方法能够全面反映中药制剂的整体疗效，对中药制剂，例如复方丹参肠溶片有了全面的评估。

Description

一种活血化瘀的中药制剂的检测方法

技术领域

本发明属于制药技术领域，具体涉及一种活血化瘀的中药制剂的检测方法，特别是涉及复方丹参肠溶片的检测方法。

背景技术

复方丹参肠溶片是由丹参、三七、冰片为原料加辅料制成的中药制剂，并以肠溶包衣避免了冰片对胃部粘膜的刺激。方中丹参为君药，能祛瘀、活血，三七为臣药能加强君药散瘀的功效，瘀散则血自归经，故有散瘀止血之功。全方功效活血化瘀，临床常用于治疗冠心病、心绞痛。

现有技术对丹参制剂的检测方法多为对单一化学成分的定量检测和对多种化学成分的定量检测。由于中药制剂中化学成分众多且活性成分多数不明确，这样的检测方法仅能精确标示某个成分含量，而不能反映药物的活性，难与功效相关。现已发现在复方丹参制剂中，丹参中的丹参酮I、丹参酮II A、丹参酮I B、丹参新酮、二氢丹参酮I、2-异丙基-8-甲基菲-3，4-二酮、异丹参酮IIA、异丹参酮IIB、丹参素、迷迭香酸、丹酚酸C体外具有抗血小板聚集、抗血栓形成作用，三七中的三七素、三七总皂苷也有抗血小板聚集、抗凝和抗血栓的作用，他们都是丹参临床上治疗冠心病、心绞痛的重要物质基础。但研究同时又发现，上述药效物质在含量几乎无变化的情况下，其活血化瘀的功效却可能明显降低甚至消失。所以需要建立适宜的检测方法以对其药效基础成分进行整体控制，从而有效地保证药物疗效。故寻找一种化学测定联合生物活性测定的检测方法来反映中药制剂疗效的好坏尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于建立一种以中药制剂，例如复方丹参肠溶片中化学成分、化学成分组、生物活性的测定来反映临床疗效的方法。本发明的方法包括化学检测方法和生物检测方法。

本发明的目的是采用如下技术方案来实现的。

一种活血化瘀的中药制剂的检测方法，该检测方法包括采用液相色谱法测定所述中药制剂，其中，所述液相色谱的条件包括：

采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

采用以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液(V/V)为流动相B进行梯度洗脱。

上述检测方法中，所述梯度洗脱的程序为：

0～15分钟，流动相A∶流动相B＝20％-40％∶80％-60％；

15～17分钟，流动相A∶流动相B＝40％-60％∶60％-40％；

17～35分钟，流动相A∶流动相B＝60％-100％∶40％-0％；

35～37分钟，流动相A：100％。

上述检测方法中，所述液相色谱的条件还包括：检测波长为250nm-390nm，优选为250nm；柱温为25℃-35℃，优选为30℃-35℃，更优选为35℃；流速为0.6-1mL/min，优选为1mL/min。

在一个具体实施方案中，上述检测方法中，采用液相色谱法测定所述中药制剂包括：

取所述中药制剂，研细，精密称定1.0250g细粉，加入50mL具塞锥形瓶中，加甲醇25ml，称重，超声处理15min，放冷，称重，用甲醇补足损失，摇匀，滤过，取续滤液，得到浓度为41mg/mL的样品溶液，然后采用如下液相色谱条件进行测定：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为200mm，柱内径为4.6mm的Kromasil色谱柱；

以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液(V/V)为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱的程序为：0～15分钟，流动相A∶流动相B＝20％-40％∶80％-60％；15～17分钟，流动相A∶流动相B＝40％-60％∶60％-40％；17～35分钟，流动相A∶流动相B＝60％-100％∶40％-0％；35～37分钟，流动相A：100％；

检测波长为250nm；

柱温为35℃；

流速为1mL/min。

本发明的上述检测方法还包括：

(1)将所述中药制剂制备成浓度为25-100mg/mL的药液，然后与富血小板血浆以体积比为1∶5-10，优选为1∶8.3相混合，测定该混合液在600nm处的吸光度值；

(2)加入体积为所述药液2-4倍，优选为2倍量的浓度为10％(即10g/100ml)的胶原，测定加入胶原后混合液在600nm处的吸光度值；

(3)按以下公式计算血小板聚集率和药物对血小板聚集抑制率：

血小板聚集率＝(加入胶原前吸光度值-加入胶原后吸光度值)/加入胶原前吸光度值

药物对血小板聚集抑制率＝(空白组血小板聚集率-给药组血小板聚集率)/空白组血小板聚集率。

在一个具体实施方案中，所述检测方法还包括：

(1)将富血小板血浆移入硅化比色杯中在37℃下温育5min，用贫血小板血浆调零，测其在600nm处吸光度值，然后用所述贫血小板血浆调节所述富血小板血浆的吸光度值在0.5-0.7之间，将2.5mL调好的富血小板血浆放入比色杯中，加入浓度为25-100mg/mL的所述中药制剂的药液0.3mL，同时调零管中加入相应浓度的所述中药制剂的药液调零，作用3min后，测吸光度值；

(2)加入10％(即10g/100ml)浓度的胶原0.6mL，同时调零管中加入相同体积的生理盐水，分别测定加入胶原后600nm处的吸光度值；

(3)按以下公式计算血小板聚集率和药物对血小板聚集抑制率：

血小板聚集率＝(加入胶原前吸光度值-加入胶原后吸光度值)/加入胶原前吸光度值

药物对血小板聚集抑制率＝(空白组血小板聚集率-给药组血小板聚集率)/空白组血小板聚集率。

上述检测方法中，所述中药制剂由丹参、三七和冰片为原料制备而成，以重量百分比计，丹参为70-85％，优选为75.13％；三七为15-25％，优选为23.54％；冰片为0.8-1.5％，优选为1.33％。在一个优选的实施方案中，其配比如下：丹参450g，三七141g，冰片8g。

其制备方法如下：

以上三味，丹参加5倍乙醇加热回流1.5小时，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，备用；药渣加50％乙醇5倍，加热回流1.5小时，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，备用；药渣加水12倍，煎煮2小时，煎液滤过，滤液浓缩至适量，备用；

三七粉碎成细粉，与上述浓缩液和适量的辅料制成颗粒，干燥；或将上述提取液合并，浓缩至相对密度1.28-1.30(50℃)，真空干燥，粉碎，加入三七细粉(100目筛)，加入，混匀，以85％乙醇制成颗粒，干燥；

冰片研细，与硬脂酸镁(0.2％)、羧甲基淀粉钠(5％)及上述颗粒混匀，压片(例如1000片)，即得。优选地，可以在压片后，包肠溶衣，制成丹参肠溶片。

与现有技术相比，本发明至少具备以下有益的技术效果：

本发明克服了用化学含量间接评估药品疗效，导致测定结果与药效评估不相关的缺点。

本发明建立了一种化学测定联合生物测定的方法，该方法能够全面反映中药制剂的整体疗效，对中药制剂，例如复方丹参肠溶片有了全面的评估。

本发明采用指纹图谱与生物活性的双重检测，利用了化学检测与活性检测的优点，并互补了不足，化学检测不体现活性，但精度高用于鉴别真伪，生物活性测定体现活性，用于比较临床效果。既能鉴别真伪，又能判断有无活性。

本发明中包含的生物活性测定方法还能够针对由个体差异引起的对血小板聚集的抑制率不同，制定个体给药方案，引导临床用药剂量。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1不同流动相对色谱图的影响，其中，a.流动相A相为水；b流动相A相为0.1％冰醋酸溶液；c流动相A相为0.1％甲酸溶液；

图2为丹参肠溶片3D图；

图3为不同波长对色谱图的影响，其中，a.250nm，b.280nm，c.310nm，d.350nm，e.390nm；

图4为不同柱温对色谱图的影响，其中，a.25℃，b.30℃，c.35℃，d.40℃；

图5为不同流速对色谱图的影响，其中，a.0.6ml/min，b.0.8ml/min，c.1.0ml/min；

图6为不同色谱柱对色谱图的影响，其中，a.Waters X Bridge^TM RP18(150mm×4.6mm，3.5μm)色谱柱；b.Kromasil C18(200mm×4.6mm，5μm)色谱柱；

图7为不同色谱仪得到的色谱图，其中，a.Waters AcquityUPLC^TM，H-CLASS液相色谱仪，b.Waters Acquity UPLC^TM液相色谱仪；

图8不同进样量对色谱图的影响，其中S1表示进样量为2ul；S2表示进样量为4ul；S3表示进样量为6ul；S4表示进样量为8ul；S5表示进样量为10ul；

图9复方丹参肠溶片标准指纹图谱，其中，1表示紫草酸；2表示丹酚酸B；4表示丹酚酸A；7表示隐丹参酮；9表示丹参酮IIA；

图10复方丹参肠溶片HPLC指纹图谱精密度；

图11复方丹参肠溶片稳定性试验。

具体实施方式

下面通过实施例详细说明本发明，应当理解，下述实施例仅用于说明本发明，而不以任何方式限制本发明的范围。以下实施例中使用的药品如无特别说明，均为市场购买获得。

实施例1复方丹参肠溶片组成及制备方法

本实施例的复方丹参肠溶片为活血化瘀的肠溶中药制剂，其由丹参、三七和冰片为原料制备而成，其配比如下：丹参450g，三七141g，冰片8g。

所述肠溶中药制剂的制备方法如下：

以上三味，丹参加5倍乙醇加热回流1.5小时，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，备用；药渣加50％乙醇5倍，加热回流1.5小时，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，备用；药渣加水12倍，煎煮2小时，煎液滤过，滤液浓缩至适量，备用；

三七粉碎成细粉，与上述浓缩液和适量的辅料制成颗粒，干燥；或将上述提取液合并，浓缩至50℃下相对密度为1.28-1.30，真空干燥，粉碎，加入过100目筛的三七细粉，加入，混匀，以85％乙醇制成颗粒，干燥；

冰片研细，与0.2重量％(g/g)硬脂酸镁、5重量％(g/g)羧甲基淀粉钠及上述颗粒混匀，压制成1000片，包肠溶衣，即得。

实施例2复方丹参肠溶片的化学检测方法

1.仪器与试剂

仪器：Waters Acquity UPLC^TM，H-CLASS，Empower 2软件，配有四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、PDA检测器。

试剂：乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)，冰醋酸(分析纯，汕头市西陇化工厂有限公司)，甲酸(分析纯，汕头市西陇化工厂有限公司)，超纯水(优普超纯水机制备)，复方丹参肠溶片，由实施例1的处方及制备方法制备而成，该复方丹参肠溶片也可获自北京汉典制药有限公司。

2.色谱条件的考察

2.1流动相的选择

复方丹参肠溶片含有丹参、三七、冰片三味药材，成分复杂，极性差别较大，有必要应用梯度分离方法来使大部分各种性质的成分在37分钟内得到较好的分离。选择A相为乙腈是为了操作简便，减少溶剂配制引起的误差。考虑到应用液-质的要求，实验中，对B相进行了水、0.1％冰醋酸溶液(V/V)及0.1％甲酸溶液(V/V)的考察，结果如图1所示。由图1可知，B相为水时，无法完全分离(见图1a)；B相为0.1％冰醋酸溶液，峰的形状不好，基线分离不完全(见图1b)；只有应用0.1％甲酸溶液(V/V)生成的色谱图有最好的效果(见图1c)。

2.2波长的选择

本实验采用光电二极管阵列检测器(PDA检测器)，得到指纹图谱3D图(图2)，并且选择了250nm、280nm、310nm、350nm、390nm(图3)五个吸收波长色谱图进行对比，结果250nm波长下的色谱图各物质的吸收相对较好，整体较美观(图3a)；其他波长下，存在分离不完全、峰形不好、基线分离不完全等缺点(图3b-3e)，因此，选择250nm作为最佳吸收波长。

2.3梯度时间的设定

考虑到色谱峰的最佳保留时间为5～30分钟，设定A相的起始浓度为20％；0～15分钟，A相20％→40％，是为了此段色谱峰尽可能的有效分离；15～17分钟，A相40％→60％，更有效地缩短了此梯度的时间，因为经多次实验发现这个范围的流动相比例下没有色谱峰；35～37分钟时，A相保持100％，可有效冲洗色谱柱，使色谱柱不会因连续进样而产生样品残留，影响下一样品的测定。在此条件下，可使大部分色谱峰达到较好分离，保留时间适中，无浪费空间，且30分钟之后无其它色谱峰。

2.4柱温的选择

为了保持色谱分析的一致性，选择35℃柱温来控制在不同环境下每次进样的同一性。曾对25℃、30℃、35℃、40℃柱温进行考察(如图4所示)，结果提高柱温，可以适当的提高分离度，25℃、30℃、35℃的色谱图没有较大差别，40℃色谱图的前半部峰的吸收度减小。综合考虑，决定柱温设在35℃。

2.5流速的设定

对流速为0.6mL/min、0.8mL/min、1.0mL/min分别进行考察(如图5所示)，结果：不同流速下保留时间有所改变，低流速下的分离度不好，因此，选择1.0mL/min为最佳流速。

2.6色谱柱的考察

曾在Kromasil C₁₈色谱柱(200mm×4.6mm，5μm)和WatersXBridge^TMRP18(150mm×4.6mm，3.5μm)色谱柱上进行实验，结果如图6所示，结果显示在相同的色谱条件下，色谱图差别较大，KromasilC₁₈色谱柱较好，该结果也提示建立本品指纹图谱需固定色谱柱型号。

2.7不同仪器的测定

应用同一个色谱柱，在相同的色谱条件下，分别在Waters AcquityUPLC^TM，H-CLASS及Waters Acquity UPLC^TM液相色谱仪上进行检测，结果得到相同的色谱图，如图7所示，这说明不同仪器对实验结果没有影响。

2.8进样量的考察：供试品溶液分别进样2μL、4μL、6μL、8μL、10μL，结果如图8所示，可以看到进样10μL时，没有任何峰出现过载，而小进样量则其它成分峰面积过低，故选定进样量为10μL。

3、测定

根据以上选择的最佳条件进行测定，具体测定方法如下：

取复方丹参肠溶片10片，研细，精密称定1.0250g细粉，加入50mL具塞锥形瓶中，加甲醇25mL，称重，超声处理(功率100W，频率40KHz)15min，放冷，称重，用甲醇补足损失，摇匀，滤过，取续滤液，即得浓度为41mg/mL样品溶液。

精密吸取上述样品溶液10μL注入液相色谱仪，采用如下色谱条件进行测定，记录37min内色谱图。

色谱条件：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的Kromasil色谱柱(柱长为200mm，柱内径为4.6mm)；以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸水(V/V)为流动相B进行梯度洗脱；检测波长250nm；柱温35℃；流速为每分钟1mL，梯度洗脱程序如下：

测定结果如图9所示，由该图可知，有相应9个特征峰，其中主要大峰为：1表示紫草酸；2表示丹酚酸B；4表示丹酚酸A；7表示隐丹参酮；9表示丹参酮IIA。

4方法学考察

4.1仪器精密度考察

样品溶液的制备和测定方法如前所述。取样品溶液，连续进样5次，考察指纹图谱精密度。将精密度试验色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004，1.0A版)(图10)，计算相似度及各指纹峰的相对标准偏差(RSD)。结果(如表1和2所示)显示各色谱峰的峰面积较为稳定(RSD均在5％以内)，有较高的相似度(相似度均在1.0)。结果表明仪器精密度较高。

表1复方丹参肠溶片HPLC指纹图谱精密度计算结果

表2复方丹参肠溶片HPLC指纹图谱精密度相似度

4.2指纹图谱重复性试验

样品溶液的制备和测定方法如前所述，取同一份复方丹参肠溶片粉末，平行制备6份供试品，考察指纹图谱的变化情况，将重复性试验色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004，1.0A版)(图11)，计算相似度及各指纹峰的相对标准偏差(RSD)。结果(见表3、4)表明，各色谱峰的峰面积较稳定(RSD值在5％以内)，有较高的相似度(相似度均在0.9以上)。

表3复方丹参肠溶片HPLC指纹图谱重复性计算结果

表4复方丹参肠溶片HPLC指纹图谱重复性相似度

实施例3复方丹参肠溶片的生物检测方法

1、实验药物：复方丹参肠溶片，由实施例1的处方及制备方法制备而成，该复方丹参肠溶片也可获自北京汉典制药有限公司。

2、实验试剂及材料：

10％胶原(g/ml)，由中国医学科学院药用植物所提供、生理盐水等。

3、实验仪器：

紫外可见分光光度计(日本津岛公司，型号：UV-2550)、计时器。

4、溶液配制：

4.10.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)：

①称取二水合磷酸二氢钠0.624g(或一水合磷酸二氢钠0.552g)加蒸馏水至20ml溶解，得到0.2mol/L的磷酸二氢钠。

②称取十二水合磷酸氢二钠1.432g(或7水合磷酸氢二钠1.072g或二水合磷酸氢二钠0.712g)加蒸馏水至20ml溶解，得到0.2mol/L的磷酸氢二钠。

③取3.8ml 0.2mol/L的磷酸二氢钠和16.2ml 0.2mol/L的磷酸氢二钠充分混合即为0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。

4.2二磷酸腺苷(ADP)溶液：称取0.050717gADP钠盐加入10mL pH7.40.2mol/L磷酸盐缓冲液，即得10000μmol/L的ADP溶液，分装后冰冻保存。

4.3复方丹参溶液的配置：称取1g复方丹参肠溶片粉末药材溶解于10ml生理盐水中，超声振荡40min后离心取上清液，配成100mg/ml浓度药液，依次稀释成50mg/ml、25mg/ml浓度的药液。

5、将富血小板血浆(PRP)移入硅化比色杯中37℃温育5min，用贫血小板血浆(PPP)调零，测其在600nm处吸光度值(A)，用PPP调PRP的A值在0.5-0.7之间，将2.5ml(或3.2ml或2.55ml)调好的PRP放入比色杯中，加入不同浓度复方丹参溶液0.3ml(或0.4ml或0.3ml)(同时调零管中加入相应浓度的复方丹参溶液调零)作用3min后，测A值；

随后加入10％浓度的胶原0.6ml(或0.4ml或0.15ml)或者ADP溶液(同时调零管中加入相同体积的生理盐水或磷酸缓冲盐溶液)，分别测定加入胶原或者ADP溶液后2、4、6、8、10min(或2min、5min)时600nm处的吸光度值，按以下公式计算血小板聚集率(AR)和药物对血小板聚集抑制率(AIR)。

AR＝(加入胶原(或者ADP溶液)前A值-加入胶原(或者ADP溶液)后A值)/加入胶原(或者ADP溶液)前A值

AIR＝(空白组AR--给药组AR)/空白组AR

6、测定结果

表5空白比色皿中各试验药物加入的体积

表6给药比色皿中各试验药物加入的体积

表7复方丹参对终浓度为100μmol/L ADP诱导血小板聚集的抑制作用

表8复方丹参对终浓度为500umol/L ADP诱导血小板聚集的抑制作用

表9终浓度为17.6mg/ml胶原诱导的血小板聚集率(A值)

表10终浓度为17.6mg/ml胶原诱导的血小板聚集率(AR)

表11复方丹参对终浓度为17.6mg/ml胶原诱导血小板聚集的抑制作用(AIR)

上述测定结果显示，不同浓度复方丹参对ADP诱导的血小板聚集并未显示抑制作用，但是对胶原诱导的血小板聚集具有明显的抑制作用，因此，可以采用该结果对复方丹参肠溶片进行生物检测。

7.生物活性测定方法的重复性试验(其中，复方丹参肠溶片获自北京汉典制药有限公司)

7.1同批次样品生物活性的测定

配置同一批号为20100901的2.5％复方丹参肠溶片溶液(相当于终浓度2.2mg/ml)6个样品，按5项下的方法操作，测定加入胶原后2min时600nm处的吸光度值，计算AIR及结果的RSD值。结果见表12。

表12生物活性测定方法的重复性试验

6次实验的RSD值为2.16％，小于5％，可见该方法可重复性较高。

7.2多批次样品生物活性的测定

配置用于实验的9个批次的2.5％复方丹参肠溶片溶液，按5项下的方法操作，测定加入胶原后2min时600nm处的吸光度值，计算AIR，结果见表13。

表13多批次复方丹参肠溶片生物活性测定

从九批次复方丹参肠溶片的抗血小板聚集的抑制率平均87.43％以及单批次数据看，以抗血小板聚集的抑制率达到80％以上作为检验复方丹参肠溶片的生物活性有效的标准较为适宜。

Claims (9)

1.一种活血化瘀的中药制剂的检测方法，该检测方法包括采用液相色谱法测定所述中药制剂，其中，所述液相色谱的条件包括：

采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

采用以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液(V/V)为流动相B进行梯度洗脱。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：

0～15分钟，流动相A∶流动相B＝20％-40％∶80％-60％；

15～17分钟，流动相A∶流动相B＝40％-60％∶60％-40％；

17～35分钟，流动相A∶流动相B＝60％-100％∶40％-0％；

35～37分钟，流动相A∶100％。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱的条件还包括：检测波长为250nm-390nm，优选为250nm；柱温为25℃-35℃，优选为30-35℃，更优选为35℃；流速为0.6-1mL/min，优选为1mL/min。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定所述中药制剂包括：

取所述中药制剂，研细，精密称定1.0250g细粉，加入50mL具塞锥形瓶中，加甲醇25ml，称重，超声处理15min，放冷，称重，用甲醇补足损失，摇匀，滤过，取续滤液，得到浓度为41mg/mL的样品溶液，然后采用如下液相色谱条件进行测定：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为200mm，柱内径为4.6mm的Kromasil色谱柱；

以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液(V/V)为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱的程序为：0～15分钟，流动相A∶流动相B＝20％-40％∶80％-60％；15～17分钟，流动相A∶流动相B＝40％-60％∶60％-40％；17～35分钟，流动相A∶流动相B＝60％-100％∶40％-0％；35～37分钟，使用流动相A；

检测波长为250nm；

柱温为35℃；

流速为1mL/min。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括：

(1)将所述中药制剂制备成浓度为25-100mg/mL的药液，然后与富血小板血浆以体积比为1∶5-10，优选为1∶8.3相混合，测定该混合液在600nm处的吸光度值；

(2)加入体积为所述药液2-4倍，优选为2倍量的浓度为10％(g/ml)的胶原，测定加入胶原后混合液在600nm处的吸光度值；

(3)按以下公式计算血小板聚集率和药物对血小板聚集抑制率：

血小板聚集率＝(加入胶原前吸光度值-加入胶原后吸光度值)/加入胶原前吸光度值

药物对血小板聚集抑制率＝(空白组血小板聚集率-给药组血小板聚集率)/空白组血小板聚集率。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括：

(1)将富血小板血浆移入硅化比色杯中在37℃下温育5min，用贫血小板血浆调零，测其在600nm处吸光度值，然后用所述贫血小板血浆调节所述富血小板血浆的吸光度值在0.5-0.7之间，将2.5mL调好的富血小板血浆放入比色杯中，加入浓度为25-100mg/mL的所述中药制剂的药液0.3mL，同时调零管中加入相应浓度的所述中药制剂的药液调零，作用3min后，测吸光度值；

(2)加入10％(g/ml)浓度的胶原0.6mL，同时调零管中加入相同体积的生理盐水，分别测定加入胶原后600nm处的吸光度值；

(3)按以下公式计算血小板聚集率和药物对血小板聚集抑制率：

血小板聚集率＝(加入胶原前吸光度值-加入胶原后吸光度值)/加入胶原前吸光度值

药物对血小板聚集抑制率＝(空白组血小板聚集率-给药组血小板聚集率)/空白组血小板聚集率。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述中药制剂由丹参、三七和冰片为原料制备而成，以重量百分比计，丹参为70-85％，优选为75.13％；三七为15-25％，优选为23.54％；冰片为0.8-1.5％，优选为1.33％。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述中药制剂由丹参、三七和冰片为原料制备而成，其配比如下：丹参450g，三七141g，冰片8g。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述中药制剂的制备方法如下：

以上三味，丹参加5倍乙醇加热回流1.5小时，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，备用；药渣加50％乙醇5倍，加热回流1.5小时，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至适量，备用；药渣加水12倍，煎煮2小时，煎液滤过，滤液浓缩至适量，备用；

三七粉碎成细粉，与上述浓缩液和适量的辅料制成颗粒，干燥；或将上述提取液合并，浓缩至50℃下相对密度为1.28-1.30，真空干燥，粉碎，加入过100目筛的三七细粉，加入，混匀，以85％乙醇制成颗粒，干燥；冰片研细，与0.2重量％硬脂酸镁、5重量％羧甲基淀粉钠及上述颗粒混匀，压片，即得。

Images