CN107727752B - 免疫抑制剂依维莫司的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫抑制剂依维莫司的分析方法，该方法采用高效液相色谱法；其中，固定相为反相硅胶；流动相由水相和有机相组成，所述有机相为乙腈和甲醇的混合液。本发明所提供的依维莫司分析方法，具有实用可靠、准确稳定、操作简单、分析时间短等优点，并且主峰与杂质峰之间、杂质峰与杂质峰之间均能达到基线分离，是一种实用于质量保证管理的有效手段。

Description

免疫抑制剂依维莫司的分析方法
技术领域
本发明涉及免疫抑制剂化合物的分析方法领域，具体涉及依维莫司的分析方法。
背景技术
依维莫司由诺华公司(Novartis)首先研制开发，于2009年3月美国FDA批准其在美国上市销售。
依维莫司(Everolimus)是一种大环内酯类药物，依维莫司是西罗莫司(sirolimus，西罗莫司又称雷帕霉素，即rapamycin)的衍生物，故依维莫司又称40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素，或40-O-(2-羟乙基)-西罗莫司。
依维莫司功能上属于mTOR激酶抑制剂，作用机制主要是与细胞内蛋白FKBP-12结合形成抑制复合物，从而抑制mTOR激酶的活性，降低mTOR的下游效应物S6核糖体蛋白激酶(S6K1)和真核延伸因子4E结合蛋白(4E-BP)的活性，干扰癌细胞的生长、分化和代谢，发挥抗肿瘤效应。研究显示，依维莫司具有免疫抑制作用、抗肿瘤作用、抗病毒作用、血管保护作用等。
“HPLC法测定依维莫司原料药中依维莫司”(《现代药物与临床》，2015年，第06期，663-665页)公开了一种HPLC法测定依维莫司原料药中依维莫司的方法，该方法采用Hypersil-ODS C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈–水(70∶30)；检测波长：276nm；柱温：50℃；体积流量：0.8mL/min；进样量：10μL。然而，现有技术提供的方法难以实现依维莫司与杂质之间以及各杂质之间的有效分离，且处理量小，分析效率不高。
发明内容
本发明为克服现有技术中的缺陷，提供一种依维莫司的分析方法。
本发明的分析对象，即依维莫司样品中，所含杂质一般包括雷帕霉素原料中所含的脯氨酰雷帕霉素(Prolylrapamycin)、雷帕霉素异构体A、雷帕霉素互变异构体等；还可以包括依维莫司合成副产物27-O-去甲基依维莫司、28-乙基羟基依维莫司、去水依维莫司、脱甲基依维莫司、依维莫司开环化合物等。
具体而言，本发明提供的依维莫司的分析方法采用高效液相色谱法；其中，固定相为反相硅胶；流动相由水相和有机相组成，所述有机相为乙腈和甲醇的混合液。
针对本发明的分离对象，单独采用一种有机溶剂对杂质的分离不完全。本发明通过大量实践发现，采用乙腈和甲醇的混合液作为有机相，可以提高依维莫司与杂质之间的分离效果，同时有效提高不同杂质之间的分离效果。作为本发明的优选方案，所述有机相由乙腈和甲醇以体积比2：2.5～3.5混合而成，进一步优选以体积比2:3混合而成。本发明通过将乙腈和甲醇以一定比例混合使用，利用二者极性的差异来改变主峰与杂质的分离度，实现各成分之间的有效分离。
为了进一步提高分离效果，本发明所述水相优选为甲酸水溶液，所述甲酸水溶液的体积百分比优选为0.08～0.12％，更优选为0.1％。
本发明在对流动相组成进行优选的基础上，对两相之间的比例进行优选，以提高洗脱效果。具体而言，所述水相占所述流动相总体积的百分比为10～35％。
本发明所述流动相的洗脱方式可以采用等度洗脱或梯度洗脱。发明通过大量的实验发现，若采用等度洗脱(如恒定为水相35％)会大大延长依维莫司的出峰时间，降低检测效率；而采用流动相梯度洗脱方式可以显著提高依维莫司以及各杂质之间的分离度。具体而言，所述流动相的梯度洗脱方式具体为：
0～20.00min，水相的体积百分比由35％减少至27％；
20.00～22.00min，水相的体积百分比由27％减少至10％；
22.00～25.00min，水相的体积百分比为10％；
25.00～25.01min，水相的体积百分比由10％增加至35％；
25.01～30.00min，水相的体积百分比为35％。
上述洗脱方式可以消除测定时流动相对检测的干扰因素，以提高可靠性、准确性，提高各峰间的分离度，使依维莫司与杂质达到有效分离。
本发明采用的固定相优选为十八烷基硅烷键合硅胶。
本发明所述方法能够以较小的进样体积以及较快的流动相流速进行分离，从而提高分析效率，减少检测所需的样品量和时间，利于实际应用。具体而言，本发明所述方法中，进样体积为5～25μl，优选为5～8μl。所述方法中，流动相流速为：1.0～1.5ml/min。
本发明所述方法采用二极管阵列检测器进行检测，检测波长为275～280nm，优选为277nm。
本发明所述方法还包括溶液的配制，具体为：
样品溶液的配制：精密称定依维莫司样品，置于容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀即得；
标准品溶液的配制：精密称定依维莫司标准品，置于容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
本发明优选样品溶液以及标准品溶液的终浓度均为1mg/ml，可以确保在上述流动相以及梯度洗脱的分离条件下，实现样品的高效分离检测。
作为本发明的优选方案，所述方法包括以下步骤：
(1)样品溶液和标准品溶液的配制：精密称定依维莫司样品和标准品，分别置于容量瓶中，分别加乙腈溶解并稀释至1mg/ml，摇匀即得；
(2)采用高效液相色谱法进行分离：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相由水相和有机相组成，所述水相为0.1％甲酸水溶液，所述有机相由乙腈和甲醇以体积比2:2.5～3.5组成；
取样品溶液与标准品溶液，分别以5～8μl进样，进样器冷却温度为4～5℃，色谱柱柱温为45～50℃；
流动相以流速1.0～1.5ml/min按照以下方式进行梯度洗脱：
0～20.00min，水相的体积百分比由35％减少至27％；
20.00～22.00min，水相的体积百分比由27％减少至10％；
22.00～25.00min，水相的体积百分比为10％；
25.00～25.01min，水相的体积百分比由10％增加至35％；
25.01～30.00min，水相的体积百分比为35％；
(3)采用二极管阵列检测器在277nm波长下进行检测，分别获得样品溶液与标准品溶液的色谱图，采用外标法计算所述样品溶液中依维莫司的含量。
还可以进一步依据所述样品溶液的色谱图，采用峰面积归一化法计算样品中杂质的含量。
本发明所提供的依维莫司分析方法，具有实用可靠、准确稳定、操作简单、分析时间短等优点，并且主峰与杂质峰能达到基线分离，分离度大于1.5；杂质峰与杂质峰也能达到基线分离，分离度大于1.5，是一种实用于质量保证管理的有效手段。
附图说明
图1为实施例1所得样品溶液的色谱图。
图2实验例2所得回归曲线图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
以下实施例中，采用安捷伦1260型高效液相色谱仪，安捷伦DAD检测器，色谱分析记录由安捷伦工作站完成。
依维莫司标准品中依维莫司含量≥98％。
色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料Thermo Accucore C18 100mm×4.6mm 2.6μm或等效色谱柱。
乙腈、甲醇、甲酸均为HPLC级，流动相和溶液用水均为二次蒸馏水。所用空白为乙腈。
实施例1
按照以下方法进行依维莫司的分离检测：
(1)溶液的配制：
样品溶液的配制：精密称定依维莫司样品25mg，置于25ml容量瓶中，加适量乙腈溶解并稀释至刻度(所得溶液浓度为1mg/ml)，摇匀即得；
标准品溶液的配制：精密称定依维莫司标准品25mg，置于25ml容量瓶中，加适量乙腈溶解并稀释至刻度(所得溶液浓度为1mg/ml)，摇匀即得；
(2)采用高效液相色谱法进行分离：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相由水相和有机相组成，所述水相为0.1％甲酸水溶液，所述有机相由乙腈和甲醇以体积比2:3组成；
以5μl进样，进样器冷却温度为5℃，色谱柱柱温为50℃；流动相以流速1.5ml/min按照以下方式进行梯度洗脱：
0～20.00min，水相的体积百分比由35％减少至27％；
20.00～22.00min，水相的体积百分比由27％减少至10％；
22.00～25.00min，水相的体积百分比为10％；
25.00～25.01min，水相的体积百分比由10％增加至35％；
25.01～30.00min，水相的体积百分比为35％；
(3)采用二极管阵列检测器在277nm波长下进行检测，获取色谱图，色谱图如图1所示；经与对照品溶液进行对比，确认样品溶液中出峰时间为20min左右的色谱峰为依维莫司，采用外标法进行计算，所述样品中依维莫司的含量99.5％。
实施例2
与实施例1相比，区别仅在于：柱温为45℃，流动相流速为1.5ml/min，所得色谱图与实施例1无实质性差异。
实验例1：重复性测定
配制标准溶液：取依维莫司标准品约25mg，精密称定，置于25ml容量瓶中，加适量乙腈溶解并稀释至刻度(所得溶液浓度为1mg/ml)，摇匀即得。
以上溶液连续进6针，检测参数及方法同实施例1。以所得色谱图中依维莫司的峰面积计算RDS％，结果见表1。
表1：重复性
序号 依维莫司(峰面积) 依维莫司(峰高)
1 13640.4 512.7
2 13710.6 513.1
3 13539.1 510.9
4 13691.8 513.1
5 13725.7 514.8
6 13695.3 513.4
RSD％ 0.51 0.25
由表1可知，本发明提供的方法对依维莫司检测的RSD％小，重复性良好。
实验例2：线性测定
配制标准溶液：取依维莫司标准品约25mg，精密称定，置于25ml容量瓶中，加适量乙腈溶解并稀释至刻度(所得溶液浓度为1mg/ml)，摇匀即得。
以上溶液分别以进样体积5μl、10μl、15μl、20μl、25μl进样，每种进样体积进3针，检测方法及参数同实施例1。所得色谱图中，以依维莫司的峰面积计算回归方程，结果见表2，回归曲线如图2所示。
表2：回归参数
由以上结果可知，本发明提供的分离检测方法线性良好。
实验例3：分离度测定
计算实施例1所得色谱图中依维莫司与各杂质之间的分离度，如表3所示。
表3：分离度
由表3结果可知，本发明提供的方法对依维莫司与杂质之间的分离度良好，且各杂质之间的分离度良好。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.免疫抑制剂依维莫司的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品溶液和标准品溶液的配制：精密称定依维莫司样品和标准品，分别置于容量瓶中，分别加乙腈溶解并稀释至1mg/ml，摇匀即得；
(2)采用高效液相色谱法进行分离：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相由水相和有机相组成，所述水相为0.1％甲酸水溶液，所述有机相由乙腈和甲醇以体积比2:2.5～3.5组成；
取样品溶液与标准品溶液，分别以5～8μl进样，进样器冷却温度为4～5℃，色谱柱柱温为45～50℃；
流动相以流速1.0～1.5ml/min按照以下方式进行梯度洗脱：
0～20.00min，水相的体积百分比由35％减少至27％；
20.00～22.00min，水相的体积百分比由27％减少至10％；
22.00～25.00min，水相的体积百分比为10％；
25.00～25.01min，水相的体积百分比由10％增加至35％；
25.01～30.00min，水相的体积百分比为35％；
(3)采用二极管阵列检测器在277nm波长下进行检测，分别获得样品溶液与标准品溶液的色谱图，采用外标法计算所述样品溶液中依维莫司的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步采用峰面积归一化法计算样品中杂质的含量。
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