CN117330677A - 一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法 - Google Patents
一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117330677A CN117330677A CN202311581211.4A CN202311581211A CN117330677A CN 117330677 A CN117330677 A CN 117330677A CN 202311581211 A CN202311581211 A CN 202311581211A CN 117330677 A CN117330677 A CN 117330677A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hesperetin
- solution
- concentration
- standard curve
- quality control
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000001100 (2S)-5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one Substances 0.000 title claims abstract description 92
- AIONOLUJZLIMTK-AWEZNQCLSA-N hesperetin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)C1 AIONOLUJZLIMTK-AWEZNQCLSA-N 0.000 title claims abstract description 90
- AIONOLUJZLIMTK-UHFFFAOYSA-N hesperetin Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1OC2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)C1 AIONOLUJZLIMTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 90
- 235000010209 hesperetin Nutrition 0.000 title claims abstract description 90
- 229960001587 hesperetin Drugs 0.000 title claims abstract description 90
- FTODBIPDTXRIGS-UHFFFAOYSA-N homoeriodictyol Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 FTODBIPDTXRIGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 90
- 241000207199 Citrus Species 0.000 title claims abstract description 19
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 title claims abstract description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N Thermopsosid Natural products O(C)c1c(O)ccc(C=2Oc3c(c(O)cc(O[C@H]4[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O4)c3)C(=O)C=2)c1 GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N 0.000 title abstract description 15
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 title abstract description 15
- 150000002212 flavone derivatives Chemical class 0.000 title abstract description 15
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 title abstract description 15
- VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N vitamin p Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)C=C1C1=CC=CC=C1 VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 15
- 239000012224 working solution Substances 0.000 claims abstract description 84
- JQQBXPCJFAKSPG-SVYIMCMUSA-N Geraniin Chemical compound OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)O[C@H]2[C@@H]3OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C5O[C@@]6(O)C(=O)C=C([C@@H](C5=4)C6(O)O)C(=O)O[C@H]4[C@@H]3OC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC[C@H]4O2)=C1 JQQBXPCJFAKSPG-SVYIMCMUSA-N 0.000 claims abstract description 40
- 229920000061 Geraniin Polymers 0.000 claims abstract description 40
- GJMUCSXZXBCQRZ-UHFFFAOYSA-N geraniin Natural products Oc1cc(cc(O)c1O)C(=O)OC2OC3COC(=O)c4cc(O)c(O)c(O)c4c5cc(C(=O)C67OC3C(O6)C2OC(=O)c8cc(O)c(O)c9OC%10(O)C(C(=CC(=O)C%10(O)O)C7=O)c89)c(O)c(O)c5O GJMUCSXZXBCQRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 40
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 40
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 48
- 239000013062 quality control Sample Substances 0.000 claims description 42
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 37
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 34
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 17
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 12
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 10
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 10
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 7
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 claims description 7
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 claims description 7
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 7
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 claims description 7
- 125000002350 geranyl group Chemical group [H]C([*])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 6
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 claims description 6
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 6
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 4
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 4
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 claims description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 23
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 abstract description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 28
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 20
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 11
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 10
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- 229930182480 glucuronide Natural products 0.000 description 5
- 150000008134 glucuronides Chemical class 0.000 description 5
- VUYDGVRIQRPHFX-UHFFFAOYSA-N hesperidin Natural products COc1cc(ccc1O)C2CC(=O)c3c(O)cc(OC4OC(COC5OC(O)C(O)C(O)C5O)C(O)C(O)C4O)cc3O2 VUYDGVRIQRPHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N Aglycone of yadanzioside D Natural products COC(=O)C12OCC34C(CC5C(=CC(O)C(O)C5(C)C3C(O)C1O)C)OC(=O)C(OC(=O)C)C24 TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N Astrantiagenin E-methylester Natural products CC12CCC(O)C(C)(CO)C1CCC1(C)C2CC=C2C3CC(C)(C)CCC3(C(=O)OC)CCC21C PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QAGGICSUEVNSGH-UHFFFAOYSA-N Diosmetin Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1=CC(=O)C2=CC=C(O)C=C2O1 QAGGICSUEVNSGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MBNGWHIJMBWFHU-UHFFFAOYSA-N diosmetin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1=CC(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 MBNGWHIJMBWFHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000015428 diosmetin Nutrition 0.000 description 4
- 229960001876 diosmetin Drugs 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N homoegonol Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1=CC2=CC(CCCO)=CC(OC)=C2O1 PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- GZSOSUNBTXMUFQ-NJGQXECBSA-N 5,7,3'-Trihydroxy-4'-methoxyflavone 7-O-rutinoside Natural products O(C[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](Oc2cc(O)c3C(=O)C=C(c4cc(O)c(OC)cc4)Oc3c2)O1)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O1 GZSOSUNBTXMUFQ-NJGQXECBSA-N 0.000 description 3
- GZSOSUNBTXMUFQ-YFAPSIMESA-N diosmin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1C(OC1=C2)=CC(=O)C1=C(O)C=C2O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O2)O)O1 GZSOSUNBTXMUFQ-YFAPSIMESA-N 0.000 description 3
- 229960004352 diosmin Drugs 0.000 description 3
- IGBKNLGEMMEWKD-UHFFFAOYSA-N diosmin Natural products COc1ccc(cc1)C2=C(O)C(=O)c3c(O)cc(OC4OC(COC5OC(C)C(O)C(O)C5O)C(O)C(O)C4O)cc3O2 IGBKNLGEMMEWKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- JMGZEFIQIZZSBH-UHFFFAOYSA-N Bioquercetin Natural products CC1OC(OCC(O)C2OC(OC3=C(Oc4cc(O)cc(O)c4C3=O)c5ccc(O)c(O)c5)C(O)C2O)C(O)C(O)C1O JMGZEFIQIZZSBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QUQPHWDTPGMPEX-UHFFFAOYSA-N Hesperidine Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1OC2=CC(OC3C(C(O)C(O)C(COC4C(C(O)C(O)C(C)O4)O)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 QUQPHWDTPGMPEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZONYXWQDUYMKFB-UHFFFAOYSA-N SJ000286395 Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)CC1C1=CC=CC=C1 ZONYXWQDUYMKFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWCSNWXARWMZTG-UHFFFAOYSA-N Trigonegenin A Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CCC(O)C=C4CCC3C2C2)C)C2OC11CCC(C)CO1 DWCSNWXARWMZTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- QUQPHWDTPGMPEX-UTWYECKDSA-N aurantiamarin Natural products COc1ccc(cc1O)[C@H]1CC(=O)c2c(O)cc(O[C@@H]3O[C@H](CO[C@@H]4O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]4O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]3O)cc2O1 QUQPHWDTPGMPEX-UTWYECKDSA-N 0.000 description 2
- APSNPMVGBGZYAJ-GLOOOPAXSA-N clematine Natural products COc1cc(ccc1O)[C@@H]2CC(=O)c3c(O)cc(O[C@@H]4O[C@H](CO[C@H]5O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]5O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]4O)cc3O2 APSNPMVGBGZYAJ-GLOOOPAXSA-N 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- WQLVFSAGQJTQCK-VKROHFNGSA-N diosgenin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)CC[C@H](O)CC4=CC[C@H]3[C@@H]2C1)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 WQLVFSAGQJTQCK-VKROHFNGSA-N 0.000 description 2
- WQLVFSAGQJTQCK-UHFFFAOYSA-N diosgenin Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CCC(O)CC4=CCC3C2C2)C)C2OC11CCC(C)CO1 WQLVFSAGQJTQCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IVTMALDHFAHOGL-UHFFFAOYSA-N eriodictyol 7-O-rutinoside Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC=2C=C3C(C(C(O)=C(O3)C=3C=C(O)C(O)=CC=3)=O)=C(O)C=2)O1 IVTMALDHFAHOGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229930003949 flavanone Natural products 0.000 description 2
- 150000002207 flavanone derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 235000011981 flavanones Nutrition 0.000 description 2
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 2
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 2
- 208000014617 hemorrhoid Diseases 0.000 description 2
- QUQPHWDTPGMPEX-QJBIFVCTSA-N hesperidin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@H]4[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O4)O)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 QUQPHWDTPGMPEX-QJBIFVCTSA-N 0.000 description 2
- 229940025878 hesperidin Drugs 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ARGKVCXINMKCAZ-UHFFFAOYSA-N neohesperidine Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1OC2=CC(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)OC3C(C(O)C(O)C(C)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 ARGKVCXINMKCAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SLCKJKWFULXZBD-ZOTFFYTFSA-O pelargonin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=[O+]C1=CC(O)=C2)C=3C=CC(O)=CC=3)=CC1=C2O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SLCKJKWFULXZBD-ZOTFFYTFSA-O 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- FDRQPMVGJOQVTL-UHFFFAOYSA-N quercetin rutinoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2C=2C=C(O)C(O)=CC=2)=O)O1 FDRQPMVGJOQVTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IKGXIBQEEMLURG-BKUODXTLSA-N rutin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@@H]1OC[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](OC=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2C=2C=C(O)C(O)=CC=2)=O)O1 IKGXIBQEEMLURG-BKUODXTLSA-N 0.000 description 2
- ALABRVAAKCSLSC-UHFFFAOYSA-N rutin Natural products CC1OC(OCC2OC(O)C(O)C(O)C2O)C(O)C(O)C1OC3=C(Oc4cc(O)cc(O)c4C3=O)c5ccc(O)c(O)c5 ALABRVAAKCSLSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000005493 rutin Nutrition 0.000 description 2
- 229960004555 rutoside Drugs 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000270673 Pelargonium graveolens Species 0.000 description 1
- 235000017927 Pelargonium graveolens Nutrition 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004856 capillary permeability Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 210000000245 forearm Anatomy 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000007935 oral tablet Substances 0.000 description 1
- 229940096978 oral tablet Drugs 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 150000004684 trihydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 201000002282 venous insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- -1 vortex for 2min Substances 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明属于生物药学分析化学领域，公开了一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法，包括如下步骤：步骤1：血浆样品孵育所需的溶液的准备，溶液包括替代生物基质、β‑葡萄糖醛酸酶溶液、标准曲线替代生物基质和内标工作溶液；步骤2：水解孵育及样品前处理条件，按照温度37℃和时间18h条件进行孵育，步骤3：采用液相色谱‑质谱法对标准曲线进样液进行检测，并制作标准曲线；然后采用液相色谱‑质谱法对待测样品进样液进行检测，并将检测结果从标准曲线获取对应的香叶木素和橙皮素的浓度；本发明能有效检测出柑橘黄酮片中香叶木素和橙皮素的含量，有利于评价仿制药与原研药在人体内是否具有生物等效性。
Description
技术领域
本发明属于生物药学分析化学领域，具体涉及一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法。
背景技术
静脉活性药物可用于治疗急性和慢性痔，其确切的作用机制尚不清楚，但已证明可改善静脉张力，稳定毛细血管通透性和增加淋巴引流。
柑橘黄酮片为复方制剂，其就是静脉活性药物中的一种，每片含柑橘黄酮（纯化微粒化黄酮成份）500mg，由450mg类黄酮糖苷地奥司明和50mg黄烷酮苷橙皮苷构成；临床上常用于治疗静脉淋巴功能不全和急性痔疮发作等相关病症，在多国指南中作为一线/A级推荐。研究表明，该药物具有多种药理活性，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤等，应用前景广阔。依据国家药品监督管理总局（NMPA）对于仿制药的审评要求，国内口服片剂仿制药需要开展一致性评价，即评价仿制药与原研药在人体内是否具有生物等效性。
其中，类黄酮糖苷地奥司明是芸香苷，即苷元与葡萄糖和鼠李糖的7位糖苷相连，口服后在肠道内被肠道菌群水解成苷元（香叶木素）而吸收入血，而苷元又会被Ⅱ相酶迅速转化成结合代谢物，如硫酸盐和葡萄糖醛酸苷进行循环，主要存在形式为3-O-葡萄糖醛酸香叶木素和3,7-O-双葡萄糖醛酸香叶木素，故在血浆中较难检测到地奥司明和香叶木素。
黄烷酮苷橙皮苷也是芸香苷，口服后被肠道菌群水解为苷元（橙皮素），在血浆中以葡萄糖醛酸苷和磺基葡萄糖苷酸的形式循环，其中橙皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和橙皮素-3’-O-β-D-葡萄糖醛酸苷为主要的橙皮素-葡萄糖醛酸苷。所以，血浆中同样难以检测到游离的橙皮素。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法，该方法能有效检测出柑橘黄酮片中香叶木素和橙皮素的含量，有利于评价仿制药与原研药在人体内是否具有生物等效性。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法，包括如下步骤：
步骤1：血浆样品孵育所需的溶液的准备
替代生物基质：按照体积比为1:5将含1%BSA的1×PBS缓冲溶液和超纯水混合；
β-葡萄糖醛酸酶溶液：称取一定量的β-葡萄糖醛酸酶，加入到所述替代生物基质中溶解，且溶解后溶液浓度为5000U/mL，然后再加入摩尔浓度为1M且pH值为5的乙酸钠缓冲液混合搅拌获得β-葡萄糖醛酸酶溶液，β-葡萄糖醛酸酶溶液的浓度为2500U/mL；
标准曲线替代生物基质：称取一定量的香叶木素、橙皮素，分别加入二甲基亚砜溶液溶解制备成1mg/ml的香叶木素储备液和橙皮素储备液；再分别取香叶木素储备液和橙皮素储备液加入甲醇稀释，按照梯度稀释成香叶木素标准曲线工作溶液和橙皮素标准曲线工作溶液，香叶木素标准曲线工作溶液的浓度为2~600ng/mL，橙皮素标准曲线工作溶液的浓度为1~300ng/mL；然后按照体积比为1:1将香叶木素标准曲线工作溶液和橙皮素标准曲线工作溶液混合形成若干组的标准曲线工作溶液，标准曲线工作溶液中的香叶木素和橙皮素的摩尔比为2:1；将若干组的标准曲线工作溶液按照体积比为1:19加入所述替代生物基质中形成若干个标准曲线替代生物基质；
内标工作溶液：称取一定量的同位素标记橙皮素Rac-hesperetin-13C2H3，加入二甲基亚砜溶液溶解制备成1mg/mL的内标储备液；取内标储备液加入稀释溶剂甲醇稀释成浓度为10ng/mL的内标工作溶液；
步骤2：水解孵育及样品前处理条件
取制备好的标准曲线替代生物基质和待测样品100μL，并向其加入100μL的β-葡萄糖醛酸酶溶液；涡旋1min后，置于37℃水浴锅中水浴18h；
水浴后降温，然后加入50μL内标工作溶液，再涡旋1min；然后加入400μL乙腈沉淀蛋白，涡旋5min后置高速冷冻离心机中离心10min，高速冷冻离心机的工作温度为4℃、转速为4000rpm；
取上清液50μL，加入100μL的超纯水，涡旋2min获取标准曲线进样液和待测样品进样液；
步骤3：采用液相色谱-质谱法对标准曲线进样液进行检测，并制作标准曲线；然后采用液相色谱-质谱法对待测样品进样液进行检测，并将检测结果从标准曲线获取对应的香叶木素和橙皮素的浓度；
在液相色谱-质谱法中选用C18反相色谱柱，柱温40℃，进样体积3µL，流动相A相为超纯水，B相为乙腈，流速为0.4 mL/min，洗脱梯度如下：
；
在液相色谱-质谱法中的质谱条件为电喷雾电离，正离子模式，多反应监测，气帘气30psi，碰撞气8psi，离子源喷雾电压-4500V，离子源温度500℃，喷雾气40psi，辅助加热气50psi，香叶木素和橙皮素的离子对分别为299.1/256.0、301.1/164.0，内标的离子对为305.0/164.0。
进一步地，步骤（1）中所述摩尔浓度为1M且pH值为5的乙酸钠缓冲液的制备方法为：称取2.042g乙酸钠粉末，加入15mL超纯水，充分搅拌溶解后加入400μL冰乙酸调节pH为5。
进一步地，步骤（1）中所述含1%BSA的1×PBS缓冲溶液的制备方法为：称取1g牛血清白蛋白（BSA），加入5mL20×PBS缓冲液和95mL超纯水，充分搅拌溶解。
进一步地，标准曲线替代生物基质有7组，其中，香叶木素浓度分别为0.1、0.2、1、4、15、24、30ng/mL，橙皮素浓度分别为0.05、0.1、0.4、1.6、7.5、12、15ng/mL。
本发明还包括质控检测，所述质控检测包括如下步骤：
质控样品工作溶液制作：称取一定量的香叶木素、橙皮素，分别加入二甲基亚砜溶液溶解制备成1mg/ml的香叶木素储备液和橙皮素储备液；再分别取香叶木素储备液和橙皮素储备液加入甲醇稀释，按照梯度稀释成香叶木素质控样品工作溶液和橙皮素质控样品工作溶液，香叶木素质控样品工作溶液的浓度为2~450ng/mL，橙皮素质控样品工作溶液的浓度为1~225ng/mL；然后按照体积比为1:1将香叶木素标准曲线工作溶液和橙皮素标准曲线工作溶液混合形成质控样品工作溶液，质控样品工作溶液有4组，香叶木素浓度分别为0.1、0.3、12、22.5ng/mL，橙皮素浓度分别为0.05、0.15、6、11.25ng/mL；香叶木素浓度为0.1ng/mL且橙皮素浓度为0.05的质控样品工作溶液按照体积比为1:19加入所述替代生物基质中形成质控样品替代生物基质，将剩余3组质控样品工作溶液按照体积比为1:19加入到空白血浆基质中形成质控样品空白血浆基质；
按照步骤（3）所述的水解孵育及样品前处理条件对质控样品替代生物基质和质控样品空白血浆基质进行处理并进样；然后再采用液相色谱-质谱法对质控样品进样液进行重复检测，根据重复检测结果的变异系数判定质控结果。
本发明的有益效果为：通过加入β-葡萄糖醛酸酶进行预孵育的方法，将血浆中的葡萄糖醛酸苷结合型香叶木素和橙皮素转化为游离型香叶木素和橙皮素，并构建液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）方法对两种成份进行同时定量检测，用于支持柑橘黄酮片在人体内的药代动力学研究。
附图说明
图1为本发明空白血浆中香叶木素的色谱图。
图2为本发明LLOQ样品中香叶木素的色谱图。
图3为本发明空白血浆中橙皮素的色谱图。
图4为本发明LLOQ样品中橙皮素的色谱图。
图5为本发明空白血浆中内标的色谱图。
图6为本发明LLOQ样品中内标的色谱图。
图7为本发明香叶木素的标准曲线图。
图8为本发明橙皮素的标准曲线图。
图9为本发明应用于临床中香叶木素血药浓度-时间曲线图。
图10为本发明应用于临床中橙皮素血药浓度-时间曲线图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法，该方法通过加入β-葡萄糖醛酸酶进行预孵育的方法，将血浆中的葡萄糖醛酸苷结合型香叶木素和橙皮素转化为游离型香叶木素和橙皮素，并构建LC-MS/MS方法对两种成份进行同时定量检测，解决了无法直接测定血浆中香叶木素和橙皮素浓度的问题，为柑橘黄酮片仿制制剂的生物等效性研究提供了技术支撑。
材料：香叶木素（中国食品药品检定研究院）、橙皮素（质量控制化学品）、同位素标记橙皮素Rac-hesperetin-13C2H3（梯尔希药物研发有限公司）、香叶木素-3-O-葡糖苷酸（梯尔希药物研发有限公司）、橙皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（梯尔希药物研发有限公司）、β-葡萄糖醛酸酶（西格玛奥德里奇）、牛血清白蛋白（BSA，Sigma-Aldrich）、20×PBS缓冲液（生工生物工程股份有限公司）、甲酸（HPLC，迪马）、甲醇（HPLC，诺尔施）、乙腈（HPLC，诺尔施）、二甲亚砜（DMSO，AR，成都科隆化学品有限公司）、乙酸钠粉末、三水（HPLC，诺尔施）、冰乙酸（AR，成都科隆化学品有限公司）。
检测设备：超高效液相色谱仪（日本岛津，LC-40D XS；SIL-40C XS）、质谱仪（美国sciex仪器公司，Triple QuadTM 6500+）、反相色谱柱（WATERS XBridge C18，2.1mm I.D.×150mm，5µm）、液相色谱柱（美国菲罗门C18，4.0mm×2.0mmI.D.）、高速冷冻离心机（湖南湘仪，H2050R）、超纯水仪（赛默飞世尔科技公司，MICROPUREUV/UF with Tank）、十万分之一天平（梅特勒-托利多，XSR105DU）。
（1-1）摩尔浓度为1M且pH值为5的乙酸钠缓冲液：称取2.042g乙酸钠粉末，加入15mL超纯水（超纯水仪），充分搅拌溶解后加入400μL冰乙酸调节pH为5，制备的乙酸钠缓冲液有效保质期为5天。
（1-2）含1%BSA的1×PBS缓冲溶液：称取1g牛血清白蛋白（BSA），加入5mL20×PBS缓冲液和95mL超纯水，充分搅拌溶解。
（1-3）替代生物基质：取步骤（1-2）制备的含1%BSA的1×PBS缓冲溶液和超纯水按照体积比为1:5混合获得。
（1-4）β-葡萄糖醛酸酶溶液：称取一定量的β-葡萄糖醛酸酶，加入到步骤（1-3）制备的替代生物基质中溶解，且溶解后溶液浓度为5000 U/mL，然后再加入步骤（1-1）制备的摩尔浓度为1M且pH值为5的乙酸钠缓冲液混合搅拌获得β-葡萄糖醛酸酶溶液，β-葡萄糖醛酸酶溶液的浓度为2500U/mL，需要说明的是，β-葡萄糖醛酸酶溶液需要每次新配。
（1-5）标准曲线和质控样品工作溶液：
称取一定量的香叶木素、橙皮素，分别加入二甲基亚砜溶液溶解制备成1mg/ml的香叶木素储备液和橙皮素储备液；分别取香叶木素储备液和橙皮素储备液加入稀释溶剂甲醇稀释，按照梯度稀释成香叶木素标准曲线工作溶液、香叶木素质控样品工作溶液、橙皮素标准曲线工作溶液、橙皮素质控样品工作溶液，然后按照体积比为1:1将香叶木素和橙皮素储标准曲线工作溶液混合构成若干组标准曲线工作溶液，以及若干组质控样品工作溶液。
表1 香叶木素标准曲线工作溶液和质控样品工作溶液
表2橙皮素标准曲线工作溶液和质控样品工作溶液
表1为本实施例制备的香叶木素标准曲线工业溶液和质控样品工作溶液，表2为本实施例制备的橙皮素的标准曲线工业溶液和质控样品工作溶液，表中XYMS为香叶木素，CPS为橙皮素，MID为中间溶液，STD1~STD7为标准曲线工作溶液，QC1~QC4为质控样品工作溶液。将上述XYMS-STD1和CPS-STD1按照体积比1:1混合形成STD1标准曲线工作溶液，以此类推形成STD2~STD7标准曲线工作溶液、以及QC1~QC4质控样品工作溶液。
（1-6）内标工作溶液：称取一定量的同位素标记橙皮素Rac-hesperetin-13C2H3，加入二甲基亚砜溶液溶解制备成1mg/mL的内标储备液；取内标储备液加入稀释溶剂甲醇稀释成浓度为10ng/mL的内标工作溶液。
（1-7）葡萄糖醛酸苷结合型待测物工作溶液：称取一定量的香叶木素-3-O-葡糖苷酸和橙皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，分别加入二甲基亚砜溶液溶解制备成1mg/mL的D-3-OG储备液和H-7-OG储备液；取D-3-OG储备液加入稀释溶剂甲醇稀释成浓度为1600ng/mL的D-3-OG工作溶液，取H-7-OG储备液加入稀释溶剂甲醇稀释成浓度为800ng/mL的H-7-OG的工作溶液；将D-3-OG工作溶液和H-7-OG的工作溶液按照体积比为1:1混合成结合型待测物混合工作溶液。
因香叶木素和橙皮素均为人体内源性物质，定量检测时极易受到血浆基质中背景信号的干扰，所以标准曲线工作溶液STD1~STD7和质控样品工作溶液QC1含药样品需使用替代生物基质进行制备，而质控样品工作溶液QC2~QC4需采用筛选后的空白血浆基质进行制备。
取STD1~STD7标准曲线工作溶液和QC1质控样品工作溶液按照体积比为1:19加入到替代生物基质、以及QC2~QC4质控样品工作溶液按照体积比为1:19加入空白血浆基质中获得含药替代生物基质或空白血浆基质。
其中，STD1~STD7的含药替代生物基质中香叶木素浓度分别为0.1ng/mL、0.2ng/mL、1ng/mL、4ng/mL、15ng/mL、24ng/mL、30ng/mL，橙皮素浓度分别为0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.4ng/mL、1.6ng/mL、7.5ng/mL、12ng/mL、15ng/mL；QC1含药替代生物基质、QC2~QC4含药空白血浆中香叶木素浓度分别为0.1ng/mL、0.3ng/mL、12ng/mL、22.5ng/mL；橙皮素的浓度分别为0.05ng/mL、0.15ng/mL、6ng/mL、11.25ng/mL。
为考察香叶木素-3-O-葡糖苷酸和橙皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷水解为香叶木素和橙皮素的孵育条件，需制备含D-3-OG和H-7-OG的血浆样品。取结合型待测物混合工作溶液适量按体积比1:19加入到空白血浆当中，涡旋混匀后获得结合形待测物空白血浆基质，其中D-3-OG空白血浆浓度为40ng/mL，H-7-OG空白血浆浓度为20ng/mL。
（3-1）取制备好的含药样品替代生物基质或空白血浆基质100μL放入96孔板中，并向其加入100μL的β-葡萄糖醛酸酶溶液；涡旋1min后，置于37℃水浴锅中水浴18h；
（3-2）水浴后置于冰上降温，然后加入50μL内标工作溶液，再涡旋1min；然后加入400μL乙腈沉淀蛋白，涡旋5min后置高速冷冻离心机中，高速冷冻离心机的工作温度4℃、转速为4000rpm，离心10min；
（3-3）取上清液50μL转移至新的96孔板中，加入100μL的超纯水，涡旋2min后进样。
（4-1）设置色谱条件，如表3所示：
表3 色谱条件
（2）设置质谱条件，如表4所示：
表4质谱条件
取制备好的结合型待测物空白血浆基质100μL加入96孔板中，加入100μL的β-葡萄糖醛酸酶溶液，涡旋1min后于水浴锅中水浴一定时间，水浴锅温度依次设定为37℃和60℃，孵育时间依次设定为2h、4h、8h、18h。
当达到对应的孵育时间后，取出水浴后的样品于冰上降温，加入50μL内标工作溶液，涡旋1min；然后加入400μL乙腈沉淀蛋白，涡旋5min后置高速冷冻离心机中，温度为4℃，转速4000rpm，离心10min。
取上清液50μL转移至另一96孔板中，加入100μL超纯水，涡旋2min后进样。
同时进样提前制备好的含对应理论水解后浓度的香叶木素和橙皮素血浆样品。通过比较水解样品和理论浓度样品中香叶木素和橙皮素与内标的峰面积比，判断是否达到完全水解，判断标准为偏差在±15%之间。
结果显示，当孵育时间为2h时，孵育温度设为37℃和60℃水解转化率没有显著差异，而随着孵育时间延长，37℃的水解转化率优于60℃。另一方面，当孵育时间为2h、4h、8h时，水解转化率随着孵育时间延长而逐渐增加，但未能达到完全转化。当孵育时间延长至18h时，D-3-OG和H-7-OG的转化率约为100%。所以，在后续正式实验中均按照温度37℃和时间18h条件进行孵育。
（6-1）选择性
取空白替代生物基质、STD1标准曲线含药替代生物基质（LLOQ）各100μL，按照水解孵育及样品前处理条件进行处理，然后进样分析，评价方法的选择性。结果如图1~图6所示，该方法对香叶木素和橙皮素以及内标具有较高的选择性。在空白替代基质样品中，内源性化合物对待测物和内标的保留时间以及响应没有明显干扰。
（6-2）标准曲线
采用加权的最小二乘线性回归模型对待测物与内标的峰面积比（y）与对应的理论浓度（x）进行拟合（权重因子W=1/x 2）。接受标准为非零浓度点应在理论浓度的±15%（LLOQ为±20%）之间且最少应有6个浓度点符合该标准，线性相关系数（r 2）不小于0.98。
香叶木素和橙皮素的标准曲线分别如图7、图8所示，香叶木素的典型回归方程为y=0.2727x+0.005412（r 2=0.9969），在0.1~30ng/mL范围内线性关系良好，橙皮素的典型回归方程为y=0.5945x–0.001152（r 2=0.9983），在0.05~15ng/mL范围内线性关系良好。
（6-3）精密度和准确度
本实施例的批内准确度和精密度通过在一个分析批内对4个浓度水平（QC1~QC4）的QC重复测定6次来进行评估，而批间准确度和精密度在3天内进行评估。准确度的接受标准为各浓度测定的均值在理论浓度的±15%（LLOQ为±20%）之间，精密度的接受标准为各浓度水平的变异系数（CV%）在±15%（LLOQ为±20%）之间。
结果显示，本实施例测定香叶木素和橙皮素的准确度和精密度均在可接受范围之内，结果可重复，方法准确可靠。
（6-4）提取回收率与基质效应
采用QC2、QC3和QC4进行提取回收率的评价。将经过筛选后的空白血浆基质提取后，向其中添加QC2、QC3和QC4浓度的待测物和内标制得（每个浓度各6份），得到待测物及内标未提取测定的峰面积（REC.POST）。以准确度精密度同浓度样本，作为提取后测定的峰面积（REC.PRE），以不同浓度配制样品提取后测定的峰面积（REC.PRE）分别与相同浓度未提取样品测定的峰面积（REC.POST）平均值之比计算提取回收率。每个浓度待测物和内标提取回收率的变异系数及不同浓度的待测物和内标总体CV%均不超过15.00%。
采用QC2和QC4进行基质效应的评价。使用6个不同来源经过筛选的血浆。分别考察含有基质的峰面积和不含基质（溶液）的峰面积，分别计算待测物和内标基质效应因子和内标归一化的基质效应因子，不同来源基质的内标归一化基质效应因子的CV%应不超过15.00%。
结果表明，在3个QC浓度水平进行评价，香叶木素的提取回收率在88.1%~95.6%之间，橙皮素的提取回收率在87.7%~95.2%之间，内标的提取回收率在100.4%~102.2%之间，CV%在8.8%以内。在QC2和QC4浓度水平下，香叶木素的内标归一化基质效应因子均值分别为0.92和0.77，橙皮素的内标归一化基质效应因子均值分别为1.51和1.32，CV%在7.6%以内。因此，香叶木素和橙皮素的提取回收率和基质效应在各QC水平上均可接受。
本实施例为柑橘黄酮片受试制剂与参比制剂的临床生物等效性研究，本实施例为预实验，采用了三序列三周期重复交叉设计，共纳入了18例受试者，按先后顺序随机分配至A、B、C组，每组6例。给药剂量为500mg，分别于给药前-24h、-18h、-12h、给药前0h（给药前90min内）及给药后20min、40min、60min、80min、100min、120min、140min、160min、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、12h、24h、48h、72h、96h，由前臂静脉采血4mL至已标记好的含有EDTA-K2负压真空采血管中。血样采集完毕后在1h内放入低温离心机中，温度设置4℃，以1700g离心10分钟，分离血浆，按照水解孵育及样品前处理条件进行处理后进样检测。
香叶木素和橙皮素的血药浓度-时间曲线分别如图9、图10所示，其中R为参比制剂，T为受试制剂，可见参比制剂和受试制剂的体内过程存在较大差别。
以上所述仅是本发明优选的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何基于本发明所提供的技术方案和发明构思进行的改造和替换都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (5)
1.一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：血浆样品孵育所需的溶液的准备
替代生物基质：按照体积比为1:5将含1%BSA的1×PBS缓冲溶液和超纯水混合；
β-葡萄糖醛酸酶溶液：称取一定量的β-葡萄糖醛酸酶，加入到所述替代生物基质中溶解，且溶解后溶液浓度为5000U/mL，然后再加入摩尔浓度为1M且pH值为5的乙酸钠缓冲液混合搅拌获得β-葡萄糖醛酸酶溶液，β-葡萄糖醛酸酶溶液的浓度为2500U/mL；
标准曲线替代生物基质：称取一定量的香叶木素、橙皮素，分别加入二甲基亚砜溶液溶解制备成1mg/ml的香叶木素储备液和橙皮素储备液；再分别取香叶木素储备液和橙皮素储备液加入甲醇稀释，按照梯度稀释成香叶木素标准曲线工作溶液和橙皮素标准曲线工作溶液，香叶木素标准曲线工作溶液的浓度为2~600ng/mL，橙皮素标准曲线工作溶液的浓度为1~300ng/mL；然后按照体积比为1:1将香叶木素标准曲线工作溶液和橙皮素标准曲线工作溶液混合形成若干组的标准曲线工作溶液，标准曲线工作溶液中的香叶木素和橙皮素的摩尔比为2:1；将若干组的标准曲线工作溶液按照体积比为1:19加入所述替代生物基质中形成若干个标准曲线替代生物基质；
内标工作溶液：称取一定量的同位素标记橙皮素，加入二甲基亚砜溶液溶解制备成1mg/mL的内标储备液；取内标储备液加入稀释溶剂甲醇稀释成浓度为10ng/mL的内标工作溶液；
步骤2：水解孵育及样品前处理条件
取制备好的标准曲线替代生物基质和待测样品100μL，并向其加入100μL的β-葡萄糖醛酸酶溶液；涡旋1min后，置于37℃水浴锅中水浴18h；
水浴后降温，然后加入50μL内标工作溶液，再涡旋1min；然后加入400μL乙腈沉淀蛋白，涡旋5min后置高速冷冻离心机中离心10min，高速冷冻离心机的工作温度为4℃、转速为4000rpm；
取上清液50μL，加入100μL的超纯水，涡旋2min获取标准曲线进样液和待测样品进样液；
步骤3：采用液相色谱-质谱法对标准曲线进样液进行检测，并制作标准曲线；然后采用液相色谱-质谱法对待测样品进样液进行检测，并将检测结果从标准曲线获取对应的香叶木素和橙皮素的浓度；
在液相色谱-质谱法中选用C18反相色谱柱，柱温40℃，进样体积3µL，流动相A相为超纯水，B相为乙腈，流速为0.4 mL/min，洗脱梯度如下：
；
在液相色谱-质谱法中的质谱条件为电喷雾电离，正离子模式，多反应监测，气帘气30psi，碰撞气8psi，离子源喷雾电压-4500V，离子源温度500℃，喷雾气40psi，辅助加热气50psi，香叶木素和橙皮素的离子对分别为299.1/256.0、301.1/164.0，内标的离子对为305.0/164.0。
2.根据权利要求1所述的一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法，其特征在于，步骤（1）中所述摩尔浓度为1M且pH值为5的乙酸钠缓冲液的制备方法为：称取2.042g乙酸钠粉末，加入15mL超纯水，充分搅拌溶解后加入400μL冰乙酸调节pH为5。
3.根据权利要求1所述的一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法，其特征在于，步骤（1）中所述含1%BSA的1×PBS缓冲溶液的制备方法为：称取1g牛血清白蛋白，加入5mL20×PBS缓冲液和95mL超纯水，充分搅拌溶解。
4.根据权利要求1所述的一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法，其特征在于，标准曲线替代生物基质有7组，其中，香叶木素浓度分别为0.1、0.2、1、4、15、24、30ng/mL，橙皮素浓度分别为0.05、0.1、0.4、1.6、7.5、12、15ng/mL。
5.根据权利要求1~3任一所述的一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法，其特征在于，还包括质控检测，所述质控检测包括如下步骤：
质控样品工作溶液制作：称取一定量的香叶木素、橙皮素，分别加入二甲基亚砜溶液溶解制备成1mg/ml的香叶木素储备液和橙皮素储备液；再分别取香叶木素储备液和橙皮素储备液加入甲醇稀释，按照梯度稀释成香叶木素质控样品工作溶液和橙皮素质控样品工作溶液，香叶木素质控样品工作溶液的浓度为2~450ng/mL，橙皮素质控样品工作溶液的浓度为1~225ng/mL；然后按照体积比为1:1将香叶木素标准曲线工作溶液和橙皮素标准曲线工作溶液混合形成质控样品工作溶液，质控样品工作溶液有4组，香叶木素浓度分别为0.1、0.3、12、22.5ng/mL，橙皮素浓度分别为0.05、0.15、6、11.25ng/mL；香叶木素浓度为0.1ng/mL且橙皮素浓度为0.05的质控样品工作溶液按照体积比为1:19加入所述替代生物基质中形成质控样品替代生物基质，将剩余3组质控样品工作溶液按照体积比为1:19加入到空白血浆基质中形成质控样品空白血浆基质；
按照步骤（3）所述的水解孵育及样品前处理条件对质控样品替代生物基质和质控样品空白血浆基质进行处理并进样；然后再采用液相色谱-质谱法对质控样品进样液进行重复检测，根据重复检测结果的变异系数判定质控结果。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311581211.4A CN117330677B (zh) | 2023-11-24 | 2023-11-24 | 一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311581211.4A CN117330677B (zh) | 2023-11-24 | 2023-11-24 | 一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117330677A true CN117330677A (zh) | 2024-01-02 |
| CN117330677B CN117330677B (zh) | 2024-02-23 |
Family
ID=89277651
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311581211.4A Active CN117330677B (zh) | 2023-11-24 | 2023-11-24 | 一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117330677B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117969722A (zh) * | 2024-04-02 | 2024-05-03 | 湖南科锐斯医药科技有限公司 | 一种血浆中同时检测香叶木素与橙皮素的生物分析方法 |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060229358A1 (en) * | 2005-04-12 | 2006-10-12 | Taipei Medical University | Pharmaceutical composition containing flavonoids |
| JP2014047173A (ja) * | 2012-08-31 | 2014-03-17 | Ezaki Glico Co Ltd | ヘスペレチン代謝物を長時間血中に保つための組成物およびその製造法 |
| WO2015124113A1 (zh) * | 2014-02-23 | 2015-08-27 | 闻永举 | 木犀草素、木犀草苷、木犀草素芸香糖苷半合成的方法 |
| EP3132692A1 (en) * | 2015-03-24 | 2017-02-22 | Biosens Croatia | Compositions comprising small molecular inhibitors suitable to inhibit and stimulate signaling pathways in a manner leading to prevention of muscle atrophy |
| CN111458440A (zh) * | 2020-05-13 | 2020-07-28 | 北京阳光德美医药科技有限公司 | 一种液相色谱串联四级杆质谱检测血浆中游离的和总的依折麦布的方法 |
| CN113533565A (zh) * | 2021-07-12 | 2021-10-22 | 新疆医科大学 | Uplc-ms/ms法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法 |
| CN113574177A (zh) * | 2019-02-11 | 2021-10-29 | 法国施维雅药厂 | 在微生物中生物合成香叶木苷和/或橙皮苷的方法 |
| CN113984926A (zh) * | 2021-10-22 | 2022-01-28 | 成都亚中生物制药有限责任公司 | 一种同时检测柑橘黄酮原料药中地奥司明和橙皮苷的方法 |
| CN117092228A (zh) * | 2022-12-20 | 2023-11-21 | 海南省药品检验所 | 一种基于hplc-ms/ms联用检测生物样品中水黄皮素的方法 |
-
2023
- 2023-11-24 CN CN202311581211.4A patent/CN117330677B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060229358A1 (en) * | 2005-04-12 | 2006-10-12 | Taipei Medical University | Pharmaceutical composition containing flavonoids |
| JP2014047173A (ja) * | 2012-08-31 | 2014-03-17 | Ezaki Glico Co Ltd | ヘスペレチン代謝物を長時間血中に保つための組成物およびその製造法 |
| WO2015124113A1 (zh) * | 2014-02-23 | 2015-08-27 | 闻永举 | 木犀草素、木犀草苷、木犀草素芸香糖苷半合成的方法 |
| EP3132692A1 (en) * | 2015-03-24 | 2017-02-22 | Biosens Croatia | Compositions comprising small molecular inhibitors suitable to inhibit and stimulate signaling pathways in a manner leading to prevention of muscle atrophy |
| CN113574177A (zh) * | 2019-02-11 | 2021-10-29 | 法国施维雅药厂 | 在微生物中生物合成香叶木苷和/或橙皮苷的方法 |
| CN111458440A (zh) * | 2020-05-13 | 2020-07-28 | 北京阳光德美医药科技有限公司 | 一种液相色谱串联四级杆质谱检测血浆中游离的和总的依折麦布的方法 |
| CN113533565A (zh) * | 2021-07-12 | 2021-10-22 | 新疆医科大学 | Uplc-ms/ms法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法 |
| CN113984926A (zh) * | 2021-10-22 | 2022-01-28 | 成都亚中生物制药有限责任公司 | 一种同时检测柑橘黄酮原料药中地奥司明和橙皮苷的方法 |
| CN117092228A (zh) * | 2022-12-20 | 2023-11-21 | 海南省药品检验所 | 一种基于hplc-ms/ms联用检测生物样品中水黄皮素的方法 |
Non-Patent Citations (8)
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117969722A (zh) * | 2024-04-02 | 2024-05-03 | 湖南科锐斯医药科技有限公司 | 一种血浆中同时检测香叶木素与橙皮素的生物分析方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117330677B (zh) | 2024-02-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN117330677B (zh) | 一种用于柑橘黄酮片生物等效性研究的香叶木素和橙皮素定量检测的方法 | |
| CN109324126B (zh) | 一种利用uplc-ms/ms同时测定酸枣仁中9种化学成分的方法 | |
| CN105136957B (zh) | 一种同时测定人血浆中oxc以及代谢产物mhd和mhd-g的检测方法 | |
| CN104655771B (zh) | 一种测定配方奶粉中低聚半乳糖含量的检测方法 | |
| CN107449841A (zh) | 一种基于衍生化测定单胺类神经递质的检测方法 | |
| CN111562322B (zh) | 一种血样中五种抗肿瘤药物的富集检测方法及应用 | |
| Jin et al. | Determination of quercetin in human plasma after ingestion of commercial canned green tea by semi‐micro HPLC with electrochemical detection | |
| CN113588804B (zh) | 一种检测血清中5-羟色胺和褪黑素浓度的试剂盒 | |
| CN112684057A (zh) | 一种检测血清中11种抗肿瘤药物浓度的试剂盒及其应用 | |
| Guo et al. | A strategy to discover selective α-glucosidase/acetylcholinesterase inhibitors from five function-similar citrus herbs through LC-Q-TOF-MS, bioassay and virtual screening | |
| CN102735764A (zh) | 一种血浆中利巴韦林含量的测定方法 | |
| CN113433232B (zh) | 一种测定人参属中药中人参皂苷含量的方法 | |
| CN112834678A (zh) | 一种检测血清中11种抗肿瘤药物浓度的方法 | |
| Zhou et al. | Development and validation of a reversed‐phase HPLC method for quantitative determination of ginsenosides Rb1, Rd, F2, and compound K during the process of biotransformation of ginsenoside Rb1 | |
| CN114280178B (zh) | 一种多种水溶性维生素的检测方法 | |
| CN115840011A (zh) | 一种利用液相色谱-串联质谱分析血浆样本中替米沙坦浓度的方法 | |
| Qiu et al. | Pharmacokinetic and excretion study of eight active constituents in rat by LC-MS/MS after oral administration of the Toddalia asiatica extract | |
| CN103575820B (zh) | 血浆中5种黄酮苷的分析方法及其在药代动力学中的应用 | |
| CN112198269A (zh) | 一种测定Beagle犬血浆中羟基酪醇的方法 | |
| CN111796035A (zh) | 一种定量分析人血浆维格列汀浓度的lc-ms/ms检测方法 | |
| CN111679005A (zh) | 血浆中甘草酸苷的检测方法 | |
| CN116223690B (zh) | 一种从血浆中提取并检测6项儿茶酚胺及其代谢物的lc-ms/ms试剂盒 | |
| Weng et al. | Quantitative Determination of Ginsenoside Rg1 in Rat Plasma by Ultra-high Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS) and its Application in a Pharmacokinetics and Bioavailability Study | |
| CN116026971B (zh) | 一种用于人血清和血浆中全谱脂溶性维生素及其代谢物检测的试剂盒及检测方法 | |
| CN112114080A (zh) | 一种阿立哌唑相关物质的检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A quantitative detection method for lignin and hesperidin in citrus flavonoids tablets for bioequivalence study Granted publication date: 20240223 Pledgee: Chenghua sub branch of Bank of Chengdu Co.,Ltd. Pledgor: CHENGDU FANWEIXI MEDICINE TECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2024510000142 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |