CN111458440A - 一种液相色谱串联四级杆质谱检测血浆中游离的和总的依折麦布的方法 - Google Patents

一种液相色谱串联四级杆质谱检测血浆中游离的和总的依折麦布的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种液相色谱串联四级杆质谱检测血浆中游离的和总的依折麦布的方法。它包括如下步骤：(1)配制标准曲线工作溶液和内标工作溶液；(2)配制标准曲线血浆样品：取步骤(1)中标准曲线工作溶液，与人空白血浆中混匀配制而成；(3)标准曲线血浆样品和人血浆样品前处理时加入内标工作溶液；(4)将步骤(3)中处理后的样品采用LC‑MS/MS进行检测，以标准曲线血浆样品的依折麦布与依折麦布‑D4色谱峰峰面积比为纵坐标，以标准曲线血浆样品的浓度为横坐标，进行线性回归，得到标准曲线；将所述血浆样品中依折麦布与依折麦布‑D4的色谱峰峰面积比，代入所述标准曲线中计算，即能得到血浆中游离的和总的依折麦布的含量。本发明测定简单、快捷、结果准确。

Description

一种液相色谱串联四级杆质谱检测血浆中游离的和总的依折 麦布的方法
技术领域
本发明涉及一种液相色谱串联四级杆质谱检测血浆中游离的和总的依折麦布的方法，属于药物分析技术领域。
背景技术
依折麦布是第一个也是目前唯一的胆固醇吸收抑制剂，主要抑制肠道对膳食和胆汁中的胆固醇吸收而降低血总胆固醇与低密度脂蛋白胆固醇，本品作为饮食控制以外的辅助治疗，可单独或与HMG-CoA还原酶抑制剂(他汀类)联合应用于治疗原发性(杂合子家族性或非家族性)高胆固醇血症，可降低总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白B(Apo B)。被广泛的应用于原发性高胆固醇血症、纯合子家族性高胆固醇血症和纯合子谷甾醇血症。
Figure BDA0002489769710000011
依折麦布口服后大部分在小肠和肝脏通过葡萄糖醛酸化，快速代谢为有药理活性的酚羟基葡萄糖苷酸化物(依折麦布-葡萄糖苷酸结合物)，随后经胆汁和肾脏分泌，血浆中，依折麦布-葡萄糖苷酸结合物占依折麦布总量的80-90％，且葡萄糖醛酸代谢物比原药能更有效抑制胆固醇吸收，所以检测游离的和结合部分的依折麦布是很有必要的。依折麦布在人体内代谢过程中，会产生三个主要的依折麦布-葡萄糖苷酸结合物异构体，导致难以直接检测依折麦布-葡萄糖苷酸结合物，可以通过酶解得到总的依折麦布，测定游离的和总的依折麦布来间接得到依折麦布-葡萄糖苷酸结合物的含量。由于依折麦布和酚羟基葡萄糖苷酸化物的浓度较低，其体内定量方法，需要一种高灵敏、通用、简单、快捷、准确的方法进行检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种液相色谱串联四级杆质谱检测血浆中游离的和总的依折麦布的方法，本发明采用LC-MS/MS方法定量检测血浆中游离的和总的依折麦布的浓度，测定简单、快捷、结果准确，并将该方法应用于依折麦布的药代动力学研究，为依折麦布的临床生物等效性研究奠定技术基础。
本发明提供的一种液相色谱串联四级杆质谱检测血浆中游离的和总的依折麦布的方法，包括如下步骤：
(1)配制标准曲线工作溶液和内标工作溶液：
所述标准曲线工作溶液为2.00～5000ng/mL的依折麦布标准溶液；
所述内标工作溶液为依折麦布-D4用乙腈稀释成浓度为0.500～5.00ng/mL的依折麦布-D4工作溶液；
(2)配制标准曲线血浆样品：
取步骤(1)中所述标准曲线工作溶液，加入到人空白血浆中涡旋混匀，配制成浓度为0.10～250ng/mL的标准曲线血浆样品；
(3)标准曲线血浆样品、人血浆样品前处理过程如下述a)-b)：
a)用于测定总依折麦布的所述标准曲线血浆样品、所述人血浆样品的前处理：将所述标准曲线血浆样品或所述人血浆样品与0.5M乙酸铵缓冲液、β-葡萄糖醛酸酶混合，然后孵育；经所述孵育完成后加入步骤(1)中所述内标工作溶液涡旋混合，并离心，取上清液并稀释；
b)用于测定游离依折麦布的所述标准曲线血浆样品、所述人血浆样品的前处理：将所述标准曲线血浆样品或所述人血浆样品与步骤(1)中所述内标工作溶液涡旋混合，并离心，取上清液并稀释；
(4)对所述标准曲线血浆样品、所述血浆样品经(3)-a)或(3)-b)前处理后，分别采用LC-MS/MS进行检测，以所述标准曲线血浆样品的依折麦布与依折麦布-D4的色谱峰峰面积比为纵坐标，以所述标准曲线血浆样品的浓度为横坐标，进行线性回归，得到标准曲线；将所述血浆样品中依折麦布与依折麦布-D4的色谱峰峰面积比，代入所述标准曲线中计算，即能得到血浆中游离的和总的依折麦布的含量。
上述的方法中，所述依折麦布标准溶液的配制过程如下：称取依折麦布标准品至玻璃瓶中，加入二甲基亚砜甲醇溶液配制成浓度为1.00～5.00mg/mL的依折麦布储备液，将所述依折麦布储备液用甲醇水溶液稀释成浓度为2.00～5000ng/mL的依折麦布标准溶液；其中，所述二甲基亚砜甲醇溶液为体积比为1:1的二甲基亚砜和甲醇配制，所述甲醇水溶液为体积比为1:1的甲醇和水配制；
不同浓度的所述标准曲线血浆样品的浓度点为6～8个；
用于测定总依折麦布的所述标准曲线血浆样品的浓度具体可为250、225、125、30.0、10.0、3.00、1.00、0.500ng/mL；
用于测定游离依折麦布的所述标准曲线血浆样品具体可为30.0、27.0、15.0、5.00、2.00、0.500、0.200、0.100ng/mL。
上述的方法中，所述内标工作溶液配制过程如下：称取所述依折麦布-D4内标标准品至玻璃瓶中，加入二甲基亚砜甲醇溶液配制成浓度可为1.00～5.00mg/mL的依折麦布储备液，将所述依折麦布储备液用乙腈稀释成浓度可为0.500～5.00ng/mL的依折麦布-D4工作溶液；其中，所述二甲基亚砜甲醇溶液为1:1的二甲基亚砜和甲醇配制；
所述内标工作溶液的浓度具体可为0.500ng/mL和5.00ng/mL，其中0.500ng/mL用于测定游离依折麦布的时加入样品中；5.00ng/mL用于测定总依折麦布的时加入样品中。
本发明中，上述所有的储备液和工作溶液均在0～10℃保存，备用。
上述的方法中，步骤(3)-a)中，所述孵育的温度可为50～80℃，时间可为10～45min；
步骤(3)-a)、(3)-b)中，所述离心的温度均可为2～8℃，时间均可为5～10min，转速≥10000g离心力；所述人血浆样品与所述内标工作溶液的体积比为1:3～9；具体可为1:9；
所述上清液均采用乙腈水溶液稀释，并涡旋3～5min混匀；所述乙腈水溶液为体积比为1:9的乙腈和水配制。
上述的方法中，所述LC-MS/MS检测过程中工作色谱条件如下：
色谱柱为Agela Technologies Venusil MP C18，2.1×50mm，5μm；
流动相：流动相A为含体积百分比0.1％乙酸的水溶液；流动相B为含体积百分比0.1％乙酸的乙腈溶液；
柱温可为30～50℃，流速可为0.2～0.8mL/min，具体可为0.4mL/min；
洗脱方式为梯度洗脱，洗脱梯度：0～0.30min，A相体积分数为55％、B相体积分数为45％；0.30～1.50min，A相体积分数从55％降至5％、B相体积分数从45％升值95％；1.50～2.49min，A相体积分数为5％、B相体积分数为95％；2.45～2.50min，A相体积分数从5％升至55％，B相体积分数从95％降至45％；2.50～3.80min，A相体积分数为55％、B相体积分数为45％。
上述的方法中，所述色谱条件还包括：自动进样器清洗溶液为体积比1:1的甲醇水溶液；自动进样器温度：2～8℃；自动进样器清洗模式：进样前和进样后清洗；自动进样器清洗体积：300～600μL；自动进样器清洗时浸泡时间为2～5秒；自动进样器进样体积：5～10μL。
上述的方法中，所述LC-MS/MS检测过程中工作质谱条件如下：
离子源：离子源类型为电喷雾离子化源(ESI)，采用负离子(Negtive)电离方式；
检测方式：多反应监测(MRM)检测模式；
电喷雾电压为-4000～-4500eV；
离子源温度为450～600℃；气帘气30psi；碰撞池气体为7psi，雾化气Gas1为55psi；辅助加热气为70psi；数据收集时间为3～6min。
上述的方法中，所述LC-MS/MS检测过程中，所述依折麦布的监测离子对为m/z408.2→m/z 271.2；具体一次实验中，四极杆驻留时间为80ms，去簇电压为-90eV，碰撞能量为-19eV。
上述的方法中，所述LC-MS/MS检测过程中，所述依折麦布-D4的监测离子对为m/z412.2→m/z 271.2；具体一次实验中，四极杆驻留时间为80ms，去簇电压为-90eV，碰撞能量为-25eV。
本发明中，测定时，所述待测血浆样品中MRM模式中，所述依折麦布特征离子对色谱峰的保留时间与所述依折麦布标准曲线样品一致，判定为依折麦布色谱峰。
上述的方法中，所述方法步骤(2)中还包括配制所述标准曲线工作溶液的同时取等量的步骤(1)中所述标准曲线工作溶液配制质控样品的步骤，所述质控样品经步骤(3)处理后，采用步骤(4)中LC-MS/MS进行检测，得到的所述质控样品中依折麦布与依折麦布-D4色谱峰峰面积比及其浓度数据对建立的所述标准曲线方法进行验证。
上述的方法中，对测定所述血浆样品中总依折麦布的所述标准曲线方法进行验证时，所述质控样品包括浓度为200、20.0、1.50、0.500ng/mL和2组所述DQC样品的浓度，其中所述DQC样品的浓度为400和2000ng/mL，稀释因子分别为2和10，其中400和2000ng/mL分别为DQCL和DQCH浓度；
对测定所述血浆样品中游离依折麦布的所述标准曲线方法进行验证时，所述质控样品的浓度包括24.0、3.00、0.300、0.100ng/mL和2组所述DQC样品的浓度，其中所述DQC样品的浓度为48.0和240ng/mL，稀释因子分别为2和10。
本发明具有以下优点：
1.本发明采用液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)法具有很高的选择性，可以有效降低背景干扰，对复杂样品仍然可以达到很高的灵敏度，具有分辨率高、质量范围宽、扫描快等优点；本发明能进行定性和定量，且采用多反应监测模式，能够有效提高定性准确度和方法的灵敏度，最低监测线可达到皮克级，分析时间短，所需要的样品量少；2.本发明在人血浆样品中加入乙腈作为沉淀剂，较传统的液液萃取和固相萃取前处理方法；操作更简单，处理速度快，引进误差小，分离效果好，检测效率高；3.本发明利用β-葡萄糖醛酸酶处理血浆，检测总的依折麦布，能为依折麦布体内药代动力学研究提供更准确和科学地数据。
附图说明
图1为本发明实施例1中人血浆中游离依折麦布测定的代表性标准曲线。
图2为本发明实施例1中人血浆中总依折麦布测定的代表性标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的实验耗材与仪器：
Watson LIMS系统7.5SP1，Thermo公司；
液相系统：Exion LC控制器、Exion LC五路在线脱气机、Exion LC AC二元高压泵、Exion LC AC柱温箱、Exion LC AC自动进样器，AB Sciex公司；
API 5500三重四级杆质谱，AB Sciex公司；
Analyst 1.6.3软件，AB Sciex公司；
梅特勒LabX 2017系统电子天平：XPE26、XPE205，LabX 2017软件；
混匀仪：MX-S，SCILOGEX；
数显多试管混合器：DVX-2500，VWR；
纯水仪：Milli-Q reference超纯水系统，Millipore；
低温高速离心机：3-18KS，Sigma；
移液器：2～20ul、20～200ul、100～1000ul，Eppendorft；
超声清洗器：SB-5200DTD，SCIENTZ；
聚丙烯离心管：1.5ml，Eppendorft；
96孔进样板：Axygen；
玻璃瓶：Agilent；
96孔进样板密封垫：Axygen。
实施例1、
人血浆中游离的和结合的依折麦布浓度LC-MS/MS方法的建立：
(1)标准工作溶液的配制：分别精密称取两份依折麦布标准物质约3mg，加入适量的体积比为1:1的二甲基亚砜甲醇溶液，涡旋，超声溶解，配制成浓度为1.00mg/mL的标准物质储备液，标记为EZT-Stock01和EZT-Stock02。将配制好的依折麦布储备液用体积比为1:1的甲醇水溶液逐级稀释成600、540、300、100、40.0、10.0、4.00、2.00ng/mL和浓度为5000、4500、2500、600、200、60.0、20.0、10.0的依折麦布工作溶液，用于配制标准曲线；将另一份依折麦布储备液用体积比为1:1的甲醇水溶液逐级稀4800、960、480、60.0、6.00、2.00和40000、8000、4000、400、30.0、10.0的工作液，用于配制质控样品，其中，上述标准曲线和质控样品的低线性范围为测定游离的依折麦布的工作液，上述标准曲线和质控样品的高线性范围为测定总的依折麦布的工作液。
(2)精密称取依折麦布-D4内标，加入适量的体积比为1:1的二甲基亚砜甲醇溶液，涡旋，超声溶解，配制成浓度为1.00mg/mL的依折麦布-D4内标储备液，标记为EZT-D4-Stock01。所有储备液保存在2～8℃冰箱中，备用；用乙腈将依折麦布-D4储备液稀释至0.500ng/mL(用于测定游离的依折麦布)和5.00ng/mL(用于测定总的依折麦布)的内标工作溶液；所有工作溶液保存在2～8℃冰箱中，备用；
(3)标准曲线质控样品配制过程：取20μL步骤(1)所述依折麦布工作液，加入到380μL的人空白血浆中，涡旋混匀，配制成：
用于测定游离的依折麦布的样品：30.0、27.0、15.0、5.00、2.00、0.500、0.200、0.100ng/mL的标准曲线样品；24.0、3.00、0.300、0.100ng/mL的质控样品；240、48.0ng/mL的DQC样品，用于考察稀释可靠性；
用于测定总的依折麦布的的样品：250、225、125、30.0、10.0、3.00、1.00、0.500ng/mL的标准曲线样品；200、20.0、1.50、0.500ng/mL的质控样品；2000、400ng/mL的DQC样品；
(4)标准曲线样品、质控样品、人血浆样品前处理：
a)测定游离的依折麦布的样品处理：
精密吸取50μL各样品，置于1.5mL EP管中；分别加入步骤(2)中200μL乙腈(含内标EZT-d4，0.500ng/mL)，2500rpm涡旋3.0min，混合均匀；在低温(2～8℃)、12000g条件下，高速离心5min；吸取上清液70μL于96孔板中；加入体积比为1:9乙腈水溶液70μL，1500rpm涡旋1.0min，混合均匀；进样8.0μL进行HPLC-MS/MS分析。
b)总的依折麦布常规样品处理方法：
精密吸取50μL各样品，置于1.5mL EP管中；加入0.5M乙酸铵缓冲液100μL；加入15μL的β-Glucuronidase from Helix pomatia(β-葡萄糖醛酸酶)，2500rpm涡旋1.0min，混合均匀；然后置于60℃恒温水浴锅内，以70rpm转速孵育20min；分别加入450μL乙腈(含内标EZT-D4，5ng/mL)溶液，2500rpm涡旋3.0min，混合均匀；在低温(4℃)、12000g条件下，高速离心5min；吸取上清液70μL于96孔板中；加入体积比为1:9乙腈水溶液70μL，1500rpm涡旋1.0min，混合均匀；进样8.0μL进行HPLC-MS/MS分析。
(5)LC-MS/MS测定过程
依折麦布和氘代内标依折麦布-D4的色谱图采集和色谱峰积分由软件Analyst1.6.3软件(AB Sciex公司)进行处理，分别以依折麦布和依折麦布-D4的色谱峰面积比为纵坐标，用加权(W＝1/x2)最小二乘法以血浆中依折麦布的浓度(X)与峰面积比(Y)进行线性回归，所得的回归方程(Y＝a+bX)即为标准曲线，根据标准曲线计算人血浆样品中游离的和结合的依折麦布浓度。
LC-MS/MS测定过程工作条件为：
A、液相条件：
色谱柱：Agela Technologies Venusil MP C18(2.1×50mm,5μm)
流动相A：水(含0.1％乙酸)溶液
流动相B：乙腈(含0.1％乙酸)溶液
自动进样器清洗溶液：体积比1:1的甲醇水溶液
柱温箱温度：40℃
流速：0.4mL/mim
自动进样器温度：6℃
自动进样器清洗模式：进样前和进样后清洗
自动进样器洗针体积：400μL
自动进样器进样针清洗时浸泡时间：2s
自动进样器进样体积：8μL
洗脱梯度：0～0.30min，A相体积分数为55％、B相体积分数为45％；0.30～1.50min，A相体积分数从55％降至5％、B相体积分数从45％升值95％；1.50～2.49min，A相体积分数为5％、B相体积分数为95％；2.45～2.50min，A相体积分数从5％升至55％，B相体积分数从95％降至45％；2.50～3.80min，A相体积分数为55％、B相体积分数为45％；如下表1所示：
表1 洗脱梯度
时间(min) ％A ％B 流速(mL/min)
0.30 55 45 0.4
1.50 5 95 0.4
2.49 5 95 0.4
2.50 55 45 0.4
3.80 55 45 0.4
质谱条件：
离子化模式：为负离子(Negtive)电喷雾离子化源(ESI)
扫描模式：多反应监测(MRM)检测模式
电喷雾电压：-4500eV；
离子源温度：550℃；
气帘气30psi；
碰撞池气体：7psi，
雾化气Gas1：55psi；
辅助加热气：70psi；
数据收集时间：3.8min。质谱检测结果如表2所示。
表2 质谱检测结果
Figure BDA0002489769710000081
(6)分析结果：以依折麦布和依折麦布-D4的色谱峰面积比为纵坐标，用加权(W＝1/x2)最小二乘法以血浆中依折麦布的浓度(X)与峰面积比(Y)进行线性回归。所得的游离和结合的依折麦布标准曲线Y＝0.6965X+0.0056，相关系数r2＝0.9933(如附图1)和Y＝0.6965X+0.0056，相关系数r2＝0.9933(如图2所示)结果表明依折麦布在0.100～30.0ng/mL，0.500～250ng/mL范围内线性良好。
实施例2、
对本发明实施例1中LC-MS/MS方法测定人血浆中游离的和总的依折麦布的准确度、精密度进行评价。取50μL上述的DQCH、DQCL、HQC、MQC、LQC和LLOQ6个浓度的质控样品各一份，按上述方法操作，于1日内每个浓度6个样品重复测定6次，并分别在不同天测定3个分析批次，计算精密度，结果如下表3-4所表示：
表3 游离的依折麦布批间精密度和准确度
Figure BDA0002489769710000082
表4 总的依折麦布批间精密度和准确度
Figure BDA0002489769710000083
本发明人血浆中游离的和总的依折麦布的定量检测方法各项指标均符合生物样品分析检定要求。采用本方法能够高效、谨慎、便捷、准确、真实的进行样品分析，获得相应研究的PK参数和一致性评价的数据，能更好的为制药企业服务，使老百姓用上安全、放心、有效且便宜的药。
对比例、
采用文献“A rapid and sensitive supercritical fluid chromatography/tandem mass spectrometry method for detection of ezetimibe in dog plasma andits application in pharmacokinetic studies”中方法进行了精密度和准确度与本发明对比研究。按照文献样本处理方法及条件进行实验，步骤如下：100μL人血浆样品、0.5M缓冲液100μL和50μL的β-Glucuronidase from Helix pomatia(β-葡萄糖醛酸酶)混合均匀；然后置于37℃恒温水浴锅内孵育60min；孵育后加入100ng/mL的内标溶液100μL和0.1M的硼酸盐溶液100μL，涡旋1.0min，混合均匀；然后加入甲基叔丁基醚(MTBE)2.0mL，室温涡旋3.0min，3500rpm条件下，离心10min；吸取上层有机试剂层，氮气下，40℃条件下吹干，时间约需要30min；然后加入100μL甲醇溶液涡旋3min，13000g离心3.0min；进样10μL进行SPC-MS/MS测定，具体条件同文献。结果见5-6，对比显示：二者的精密度和准确度均符合相关法规的要求。
与上述对比例相比，本发明操作步骤更简单(步骤越少，系统误差就会更小)、所使用试剂更少(节约成本)、花费的时间更短(单样本测定时，本发明需要30min左右，对比例需要2个小时左右)、也更安全(对比例选用MTBE毒性比本发明筛选后采用的乙腈毒性大)。综上所述，本发明与现有方法对比，本发明成本低、更准、更快、更安全。
表5 两种方法操作过程比对
Figure BDA0002489769710000091
表6 两种方法精密度准确度比对
Figure BDA0002489769710000092
备注：每一浓度水平质控样品浓度均值的％DEV在±15.0％内(LLOQ在±20.0％内)、％CV不超过15.0％(LLOQ不超过20.0％)。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种液相色谱串联四级杆质谱检测血浆中游离的和总的依折麦布的方法，包括如下步骤：
(1)配制标准曲线工作溶液和内标工作溶液：
所述标准曲线工作溶液为2.00～5000ng/mL的依折麦布标准溶液；
所述内标工作溶液为依折麦布-D4用乙腈稀释成浓度为0.500～5.00ng/mL的依折麦布-D4工作溶液；
(2)配制标准曲线血浆样品：
取步骤(1)中所述标准曲线工作溶液，加入到人空白血浆中涡旋混匀，配制成浓度为0.10～250ng/mL的标准曲线血浆样品；
(3)标准曲线血浆样品、人血浆样品前处理过程如下述a)-b)：
a)用于测定总依折麦布的所述标准曲线血浆样品、所述人血浆样品的前处理：将所述标准曲线血浆样品或所述人血浆样品与0.5M乙酸铵缓冲液、β-葡萄糖醛酸酶混合，然后孵育；经所述孵育完成后加入步骤(1)中所述内标工作溶液涡旋混合，并离心，取上清液并稀释；
b)用于测定游离依折麦布的所述标准曲线血浆样品、所述人血浆样品的前处理：将所述标准曲线血浆样品或所述人血浆样品与步骤(1)中所述内标工作溶液涡旋混合，并离心，取上清液并稀释；
(4)对所述标准曲线血浆样品、所述血浆样品经(3)-a)或(3)-b)前处理后，分别采用LC-MS/MS进行检测，以所述标准曲线血浆样品的依折麦布与依折麦布-D4的色谱峰峰面积比为纵坐标，以所述标准曲线血浆样品的浓度为横坐标，进行线性回归，得到标准曲线；将所述血浆样品中依折麦布与依折麦布-D4的色谱峰峰面积比，代入所述标准曲线中计算，即能得到血浆中游离的和总的依折麦布的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述依折麦布标准溶液的配制过程如下：称取依折麦布标准品至玻璃瓶中，加入二甲基亚砜甲醇溶液配制成浓度为1.00～5.00mg/mL的依折麦布储备液，将所述依折麦布储备液用甲醇水溶液稀释成浓度为2.00～5000ng/mL的依折麦布标准溶液；其中，所述二甲基亚砜甲醇溶液为体积比为1:1的二甲基亚砜和甲醇配制，所述甲醇水溶液为体积比为1:1的甲醇和水配制；
不同浓度的所述依折麦布标准曲线血浆样品浓度点为6～8个；
用于测定总依折麦布的所述标准曲线血浆样品的浓度具体为250、225、125、30.0、10.0、3.00、1.00、0.500ng/mL；
用于测定游离依折麦布的所述标准曲线血浆样品具体为30.0、27.0、15.0、5.00、2.00、0.500、0.200、0.100ng/mL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述内标工作溶液配制过程如下：称取所述依折麦布-D4内标标准品至玻璃瓶中，加入二甲基亚砜甲醇溶液配制成浓度为1.00～5.00mg/mL的依折麦布储备液，将所述依折麦布储备液用乙腈稀释成浓度为0.500～5.00ng/mL的依折麦布-D4工作溶液；其中，所述二甲基亚砜甲醇溶液为1:1的二甲基亚砜和甲醇配制。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：步骤(3)-a)中，所述孵育的温度为50～80℃，时间为10～45min；
步骤(3)-a)、(3)-b)中，所述离心的温度均为2～8℃，时间均为5～10min，转速≥10000g离心力；所述人血浆样品与所述内标工作溶液的体积比为1:3～9；
所述上清液均采用乙腈水溶液稀释，并涡旋3～5min混匀；所述乙腈水溶液为体积比为1:9的乙腈和水配制。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述LC-MS/MS检测过程中工作色谱条件如下：
色谱柱为Agela Technologies Venusil MP C18，2.1×50mm，5μm；
流动相：流动相A为含体积百分比0.1％乙酸的水溶液；流动相B为含体积百分比0.1％乙酸的乙腈溶液；
柱温为30～50℃，流速为0.2～0.8mL/min；
洗脱方式为梯度洗脱；洗脱梯度：0～0.30min，A相体积分数为55％、B相体积分数为45％；0.30～1.50min，A相体积分数从55％降至5％、B相体积分数从45％升值95％；1.50～2.49min，A相体积分数为5％、B相体积分数为95％；2.45～2.50min，A相体积分数从5％升至55％，B相体积分数从95％降至45％；2.50～3.80min，A相体积分数为55％、B相体积分数为45％。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述色谱条件还包括：自动进样器清洗溶液为体积比1:1的甲醇水溶液；自动进样器温度：2～8℃；自动进样器清洗模式：进样前和进样后清洗；自动进样器清洗体积：300～600μL；自动进样器清洗时浸泡时间为2～5秒；自动进样器进样体积：5～10μL。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：所述LC-MS/MS检测过程中工作质谱条件如下：
离子源：离子源类型为电喷雾离子化源，采用负离子电离方式；
检测方式：多反应监测检测模式；
电喷雾电压为-4000～-4500eV；
离子源温度为450～600℃；气帘气30psi；碰撞池气体为7psi，雾化气Gas1为55psi；辅助加热气为70psi；数据收集时间为3～6min。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于：所述LC-MS/MS检测过程中，所述依折麦布的监测离子对为m/z408.2→m/z 271.2；
所述LC-MS/MS检测过程中，所述依折麦布-D4的监测离子对为m/z412.2→m/z 271.2。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(2)中还包括配制所述标准曲线工作溶液的同时取等量的步骤(1)中所述标准曲线工作溶液配制质控样品的步骤，所述质控样品经步骤(3)处理后，采用步骤(4)中LC-MS/MS进行检测，得到的所述质控样品中依折麦布与依折麦布-D4色谱峰峰面积比及其浓度数据对建立的所述标准曲线方法进行验证。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于：对测定所述血浆样品中总依折麦布的所述标准曲线方法进行验证时，所述质控样品包括浓度为200、20.0、1.50、0.500ng/mL和2组所述DQC样品的浓度，其中所述DQC样品的浓度为400和2000ng/mL，稀释因子分别为2和10；
对测定所述血浆样品中游离依折麦布的所述标准曲线方法进行验证时，所述质控样品的浓度包括24.0、3.00、0.300、0.100ng/mL和2组所述DQC样品的浓度，其中所述DQC样品的浓度为48.0和240ng/mL，稀释因子分别为2和10。
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