CN114354820A - 一种检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒及检测方法，试剂盒包括盒体、内衬、广口瓶、第一样本收集管、第二样本收集管和第三样本收集管，广口瓶内放有样本萃取液，第一样本收集管内放有校准品，第二样本收集管内放有质控品，第三样本收集管内放有空白质控品，第一样本收集管、第二样本收集管和第三样本收集管的内部均设置有玻璃纤维滤纸，玻璃纤维滤纸用于作为标准品和质控品的载体。基于本发明提供的试剂盒的检测方法，先对样本进行前处理，再结合液相色谱串联质谱仪上样检测，最终采用内标法对环孢霉素进行定量分析。本发明避免了红细胞压积效应的影响，降低了职业暴露的风险，提高了检测的稳定性和试剂盒的实用性。

Description

一种检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒及检测 方法

技术领域

本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒及检测方法。

背景技术

环孢霉素是强效免疫抑制剂之一，对组织移植后可能发生的排异反应以及同种异体器官具有较好的预防作用。环孢霉素被广泛用于提高接受器官移植患者的存活率，许多研究也证明环孢霉素在抵抗器官移植后的免疫排斥方面具有重要作用。环孢霉素由于其药动学的个体差异性和非常窄的治疗窗，患者移植后免疫抑制剂的监测对于降低其毒性和急性排斥反应就非常重要，同时对实施个体化给药亦有实际意义。

目前，环孢霉素血药浓度监测目前全部在医院的检验科与第三方实验室开展，项目模式大多为实验室自建方法(laboratory developed tests,LDT)，需要自行配制校准品、质控品、提取溶液。LDT模式的检测项目大多缺乏有效的质量控制，分析批、试剂批的不稳定性将造成重现性的巨大风险，实验数据的准确度、精密度、可靠性难以保证。LDT模式项目的开展费时费力，便利性差，试剂配制、方法建立、仪器参数等需要专业、责任心强的员工来保证。以上也是临床科室关心的主要问题点及需求点，同时LDT模式监管难度大，在美国、欧洲、日本等国家监管方式都不一致，部分市场较为混乱。传统的检测方法大多样本量需求大、灵敏度准确度低、同时自配试剂多采用人源样本，存在实验人员医学暴露的风险。

干血片(Dried Blood Spot,DBS)检测技术，是将生物样本(通常为全血)滴加到滤纸片上干燥保存，再经过萃取后检测干血片样本中分析物的一种方法，其具有采集方便，采血量少，样本易于保存运输的优点，上世纪六十年代开始被用于苯丙酮尿症的新生儿筛查，目前干血片检测应用最成熟的领域依然为新生儿遗传代谢类疾病的筛查，同时其应用逐渐向内源性生物标志物检测，治疗药物监测(therapeutic drug monitoring,TDM)等领域扩展。

目前使用最广泛的采血卡为棉质滤纸，材质为均匀的棉花纤维，能够使吸收的全血均匀分布。干血片的采集通常为非定量采血，直接将指尖血点到采血卡上，或者用微量毛细管转移。传统的萃取步骤为从干血片中心打下一块固定大小的圆片，置于合适的容器中，用适当的萃取液萃取分析物，检测仪器常为高灵敏度的液相色谱(HPLC)或色谱-质谱联用仪(LC-MS)。这种常用的方法相比静脉血液样本在定量准确度上会受到更多的干扰，这也是导致其应用局限性的主要原因。其主要的影响因素红细胞压积效应。

红细胞压积效应(HCT)是影响干血片定量准确度的最主要因素，HCT变化会极大的影响血液黏度，进而影响全血在滤纸中的扩散特性，而临床上患者血液样本HCT值跨度从20％～60％不等。当HCT升高时，干血片的扩散面积减少，则打下相同面积的干血片含有的样本体积增多，导致检测结果受到显著干扰。

综上所述，本领域迫切需要一种便捷性强、准确度高、采样量少、样本致病性弱、保存稳定、在严格法规框架下高质量的的新型环孢霉素检测方式。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒及检测方法，一种检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒，包括盒体、内衬、样本萃取液、干血片环孢霉素校准品、干血片环孢霉素质控品和空白质控品，其特征在于，所述内衬设置在盒体内部的底端，所述内衬上设置有多个容置槽，所述容置槽内分别放置有广口瓶、第一样本收集管、第二样本收集管和第三样本收集管，所述样本萃取液存放于广口瓶的内部，所述干血片环孢霉素校准品存放于第一样本收集管的内部，所述干血片环孢霉素质控品存放于第二样本收集管的内部，所述空白质控品存放于第三样本收集管的内部，所述第一样本收集管、第二样本收集管和第三样本收集管的内部均设置有玻璃纤维滤纸，所述玻璃纤维滤纸用于作为标准品和质控品的载体。

具体地，所述第一样本收集管、第二样本收集管和第三样本收集管的底部均设置有环形凸起，所述环形凸起用于固定玻璃纤维滤纸。

具体地，所述第一样本收集管、第二样本收集管和第三样本收集管的内部均设置有固定管，每一个所述固定管内均设置有干燥剂，所述固定管用于分别将干燥剂固定在第一样本收集管、第二样本收集管和第三样本收集管的内部。

具体地，所述广口瓶为60mL广口瓶，所述玻璃纤维滤纸为预先打孔的玻璃纤维滤纸。

具体地，所述盒体还包括与所述盒体一体成形的盒盖，所述盒盖用于完全封闭盒体的顶部。

具体地，所述干血片环孢霉素校准品和干血片环孢霉素质控品均包含环孢霉素、兔全血和防腐剂，所述空白质控品包含甲醇、兔全血和防腐剂，所述干血片环孢霉素校准品包含50.0-1500.0ng/mL线性范围内的6个校准点，所述干血片环孢霉素质控品包括高浓度质控品、中浓度质控品和低浓度质控品，所述高浓度质控品的环孢霉素浓度为1200ng/mL，所述中浓度质控品的环孢霉素浓度为600ng/mL，所述低浓度质控品的环孢霉素浓度为300ng/mL。

具体地，所述防腐剂为0.2％ProClin950和0.1％叠氮化钠。

具体地，所述样本萃取液包括乙腈、水和环孢霉素-D4，所述乙腈和水的体积比为7：3，所述样本萃取液中环孢霉素-D4的浓度为20ng/mL。

本发明还提供了一种检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的检测方法，所述方法以检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒为载体，采用内标法，结合液相色谱串联质谱仪，对干血片样本中环孢霉素药物浓度进行定量检测，包括以下步骤：

1)样本前处理：

先取2支第三样本收集管，一支中加入300μL的乙腈和水混合溶液，作为双空白样本，乙腈和水的体积比为7：3，另一支中加入300μL样本萃取液作为单空白样本；

再取第一样本收集管、第二样本收集管和待测干血片样本的样本收集管，加入300μL样本萃取液，将所有样本收集管静置15min，随后在2500rpm转速下振荡混匀15min；

将样本收集管置于离心机中，在4℃、13000rpm条件下离心10min，取200μL上清液用于LC-MS/MS分析备用；

2)LC-MS/MS质谱进样分析：取200μL进行前处理后的样本，进行LC-MS/MS质谱分析；

3)结果分析：

先通过六个所述干血片环孢霉素校准品的标示浓度和干血片环孢霉素校准品中环孢霉素和环孢霉素同位素内标的峰面积比值，绘制校准曲线，并拟合校准曲线方程；

再将检测样品的环孢霉素峰面积与环孢霉素同位素内标的峰面积比值带入校准曲线方程，即可定量计算样本中环孢霉素的浓度。

具体地，步骤2)中，所述LC-MS/MS质谱分析的检测条件为：

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18，2.1mm×50mm，1.7μm，柱温为60℃，流动相A为0.1％甲酸4mmol/L甲酸铵-水溶液，流动相B为0.1％甲酸4mmol/L甲酸铵-甲醇溶液，洗针液为90％甲醇。

具体地，步骤2)中，所述LC-MS/MS质谱分析的洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为：

0min流动相组成为80％A+20％B，0.2min流动相组成为80％A+20％B，0.8min流动相组成为2％A+98％B，1.4min流动相组成为2％A+98％B，1.5min流动相组成为80％A+20％B，1.8min流动相组成为80％A+20％B，洗脱过程中流速为0.6mL/min。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明采用玻璃纤维滤纸，且对玻璃纤维滤纸预先打孔，能够避免常规采血和萃取方式导致的红细胞压积效应，从而从根本上消除红细胞压积效应对定量检测带来的影响，同时简化了萃取操作，无须使用专业工具在样本中心打下固定面积的血片，避免了交叉污染；

2.本发明的试剂盒布局合理，结构简单，方便实验员操作和携带，提高了分析检测的效率；

3.本发明的试剂盒中质控品和校准品均采用基质替代兔全血配制，极大的降低了职业暴露的风险，且相比起现有的全血环孢霉素测定试剂盒仅能在2-8℃或更低温度下保存的性质，本试剂盒中设置有干燥剂，能够在常温下保存，且即开即用，增强了试剂盒的实用性；

4.以本发明的试剂盒为载体的干血片环孢霉素检测方法，前处理时间短，且前处理的操作简单，分析用样本量仅为10μL，减少了病患的标本取样量，同时提高了分析检测的效率。

附图说明

图1是本发明的试剂盒一具体实施方式的立体结构示意图；

图2是本发明的试剂盒的内衬的俯视图；

图3是本发明的试剂盒的样本收集管的结构示意图；

图4是本发明的试剂盒的样本收集管的另一视角的结构示意图

图5是本发明的试剂盒的固定管及干燥剂安装方式的结构示意图；

图6是本发明的实施例四中，对替代基质测定值与人全血基质测定值进行回归分析，得到的回归方程及回归曲线图；

图中：1、盒体；2、内衬；3、广口瓶；4、第一样本收集管；5、第二样本收集管；6、第三样本收集管、；7、玻璃纤维滤纸；8、环形凸起；9、固定管；10、干燥剂；11、盒盖。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中所使用的材料、仪器和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所使用的技术手段，如无特殊说明，均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一

如图1-5所示，一种检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒，包括盒体1、内衬2、样本萃取液、干血片环孢霉素校准品、干血片环孢霉素质控品和空白质控品，其特征在于，内衬2设置在盒体1内部的底端，内衬2上设置有多个容置槽，容置槽内分别放置有广口瓶3、第一样本收集管4、第二样本收集管5和第三样本收集管6，样本萃取液存放于广口瓶3的内部，干血片环孢霉素校准品存放于第一样本收集管4的内部，干血片环孢霉素质控品存放于第二样本收集管5的内部，空白质控品存放于第三样本收集管6的内部，第一样本收集管4、第二样本收集管5和第三样本收集管6的内部均设置有玻璃纤维滤纸7，玻璃纤维滤纸7用于作为标准品和质控品的载体。

第一样本收集管4、第二样本收集管5和第三样本收集管6的底部均设置有环形凸起8，环形凸起用于固定玻璃纤维滤纸7。

第一样本收集管4、第二样本收集管5和第三样本收集管6的内部均设置有固定管9，每一个固定管9内均设置有干燥剂10，固定管9用于分别将干燥剂10固定在第一样本收集管4、第二样本收集管5和第三样本收集管6的内部，干燥剂10由干燥片折叠制成，将折叠后的干燥片塞入固定管9中，完成干燥剂10的固定。

广口瓶3为60mL广口瓶3，玻璃纤维滤纸7为预先打孔的玻璃纤维滤纸7，玻璃纤维滤纸7预先打孔，后续仅需加入样本萃取液即可提取出待测物质，简化了检测操作，增强了试剂盒的实用性。

盒体1还包括与盒体1一体成形的盒盖11，盒盖11用于完全封闭盒体1的顶部。

试剂盒的整体布局合理，将整个检测过程所需的试剂和耗材进行预先整合，利于实验员操作，同时便于携带，有效地节省了提前预配试剂的时间，同时避免了因试剂配制而导致的检测误差，有效缩短了检测时耗，提高了检测的效率。

干血片环孢霉素校准品和干血片环孢霉素质控品均包含环孢霉素、兔全血和防腐剂，空白质控品包含甲醇、兔全血和防腐剂，干血片环孢霉素校准品包含50.0-1500.0ng/mL线性范围内的6个校准点，干血片环孢霉素质控品包括高浓度质控品(HQC)、中浓度质控品(MQC)和低浓度质控品(LQC)，高浓度质控品的环孢霉素浓度为1200ng/mL，中浓度质控品的环孢霉素浓度为600ng/mL，低浓度质控品的环孢霉素浓度为300ng/mL。

防腐剂为0.2％ProClin950和0.1％叠氮化钠。

样本萃取液包括乙腈、水和环孢霉素-D4，乙腈和水的体积比为7：3，样本萃取液中环孢霉素-D4的浓度为20ng/mL。

本发明提供的试剂盒中，还包括说明书和靶值表，说明书记载有试剂盒的组成信息以及使用方法。

实施例二 试剂盒的组成及制备方法

基于实施例一的一种试剂盒，本实施例中试剂盒的具体组分及具体浓度如下表所示：

本试剂盒附有高、中、低三个不同浓度的干血片环孢霉素质控品对检测结果进行质量控制，并附有空白对照用于环孢霉素的专属性、特异性评价、高浓度样本残留的监测。

试剂盒具体制备方法如下：

(1)样本收集管及滤纸的组装

用镊子将玻璃纤维滤纸7放置于样本收集管的底部。

(2)干燥剂的组装

在低湿车间内将干燥片折叠后放置于固定管内。

(3)校准品、质控品的配制

A.基质工作液的配制

由移液器移取一定浓度相应体积的环孢霉素储备液，并移取兔全血至容量瓶并定容，混匀，配制成浓度为20μg/mL的基质工作液。

B.空白质控品P-H0的配制

由移液器移取相应体积的甲醇，并移取兔全血至容量瓶并定容，混匀后制得空白质控品P-H0。

C.校准品P-C6的配制

由移液器移取相应体积的基质工作液，并移取兔全血至容量瓶并定容，混匀，配制成浓度为1500ng/mL的校准品P-C6。

D.校准品P-C1～P-C5的配制

C1-C5的校准点，由C6校准点与空白质控品P-H0采用十万级天平按计算比例称重法配制，混合均匀。

E.质控品P-HQC的配制

由移液器移取相应体积的基质工作液，并移取兔全血至容量瓶并定容，混匀，配制其浓度为1200ng/mL的质控品P-HQC。

F.质控品P-LQC和P-MQC的配制

由质控品P-HQC与空白质控品P-H0采用十万级天平按计算比例称重法配制，混匀，得质控品P-LQC和P-MQC。

(4)校准品和质控品的分装

将校准品P-C1～P-C6和质控品P-LQC、P-MQC、P-HQC用移液器分装于样本收集管内的玻璃纤维滤纸7上，分装完成后加入干燥剂10，盖紧管盖。

(5)工艺验证

本发明为质谱法定量检测试剂盒，在一定浓度范围内，仪器的响应与浓度呈正相关。因此本发明对配制后校准品、质控品的偏差进行评价。验证配制过程与理论浓度的偏差及线性相关性。

实验结果如下表所示：

由上表可知，线性相关系数r≥0.9900，线性偏差在±15％内，满足预期要求，且工艺简便，适合于工厂大生产，风险水平低，经验证可控。

现有的全血环孢霉素测定试剂盒的保存条件为2～8℃下，稳定保存1年，本发明提供的干血片环孢霉素测定试剂盒可在常温下稳定保存1年。相比于全血试剂盒，本发明提供的干血片环孢霉素浓度测定试剂盒的稳定性更佳，使用及储存更为方便。

实施例三 使用本试剂盒检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的检测方法

以检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒为载体，采用内标法，结合液相色谱串联质谱仪，对干血片样本中环孢霉素药物浓度进行定量检测，包括以下步骤：

1)样本前处理：

先取2支第三样本收集管，一支中加入300μL的乙腈和水混合溶液，作为双空白样本，乙腈和水的体积比为7：3，另一支中加入300μL样本萃取液作为单空白样本；

再取第一样本收集管、第二样本收集管和待测干血片样本的样本收集管，加入300μL样本萃取液，将所有样本收集管静置15min，随后在2500rpm转速下振荡混匀15min；

将样本收集管置于离心机中，在4℃、13000rpm条件下离心10min，取200μL上清液用于LC-MS/MS分析备用；

2)LC-MS/MS质谱进样分析：取200μL进行前处理后的样本，进行LC-MS/MS质谱分析；

3)结果分析：

先通过六个干血片环孢霉素校准品的标示浓度和干血片环孢霉素校准品中环孢霉素和环孢霉素同位素内标的峰面积比值，绘制校准曲线，并拟合校准曲线方程；

再将检测样品的环孢霉素峰面积与环孢霉素同位素内标的峰面积比值带入校准曲线方程，即可定量计算样本中环孢霉素的浓度。

步骤2)中，LC-MS/MS质谱分析的检测条件为：

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18，2.1mm×50mm，1.7μm，柱温为60℃，流动相A为0.1％甲酸4mmol/L甲酸铵-水溶液，流动相B为0.1％甲酸4mmol/L甲酸铵-甲醇溶液，洗针液为90％甲醇。

步骤2)中，LC-MS/MS质谱分析的洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱程序为：

0min流动相组成为80％A+20％B，0.2min流动相组成为80％A+20％B，0.8min流动相组成为2％A+98％B，1.4min流动相组成为2％A+98％B，1.5min流动相组成为80％A+20％B，1.8min流动相组成为80％A+20％B，洗脱过程中流速为0.6mL/min。

在一具体实施例中，质谱条件如下表所示：

离子源参数

MRM信息

化合物名称	母离子(m/z)	子离子(m/z)	锥孔电压(V)	碰撞能量(V)
					环孢霉素*	1219.97	1203.09	32	16
环孢霉素	1219.97	1185.09	32	32
					环孢霉素-D4*	1223.97	1207.04	44	16

*为定量离子对

实施例四 使用兔全血基质替代人全血基质的可行性研究

用兔全血基质标准曲线和人全血基质标准曲线测定20例人全血样本，实验结果如下表所示：

兔全血替代基质测定值与人全血测定值偏差分析

根据上表结果，对替代基质测定值与人全血基质测定值进行回归分析，得到回归方程及回归曲线如图6所示。分析结果可知，替代基质测定值与人全血测定值偏差≤15％，相关系数r≥0.99，可以得出，替代基质测定值与人全血测定值无明显差异，替代基质可替代人全血用于试剂盒校准品。

实施例五红细胞压积效应影响研究

红细胞压积效应(HCT)是影响干血片定量准确度的最主要因素，HCT变化会极大的影响血液黏度，进而影响全血在滤纸中的扩散特性，当HCT升高时，血片的扩散面积减少，则打下相同面积的干血片含有的样本体积增多，导致检测结果受到显著干扰。

本试剂盒与现有方法相比，无需打孔，可将干血片中的化合物全部萃取，消除红细胞压积效应对定量检测带来的影响。

实验结果：

由上表数据可知，采用不同HCT的兔全血配制20例不同浓度的样本，样本检测结果与理论浓度的偏倚均在±15％以内，表明本试剂盒能够消除红细胞压积效应对定量检测带来的影响。

综上，本发明提供的一种检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒及其检测方法定量准确，相比于全血试剂盒稳定性好，相关关键性能符合行业标准要求，技能有效避免红细胞压积效应的影响，还能降低职业暴露风险，且所需样本量少，检测操作简单方便，高效实用。

综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (11)

1.一种检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒，包括盒体(1)、内衬(2)、样本萃取液、干血片环孢霉素校准品、干血片环孢霉素质控品和空白质控品，其特征在于，所述内衬(2)设置在盒体(1)内部的底端，所述内衬(2)上设置有多个容置槽，所述容置槽内分别放置有广口瓶(3)、第一样本收集管(4)、第二样本收集管(5)和第三样本收集管(6)，所述样本萃取液存放于广口瓶(3)的内部，所述干血片环孢霉素校准品存放于第一样本收集管(4)的内部，所述干血片环孢霉素质控品存放于第二样本收集管(5)的内部，所述空白质控品存放于第三样本收集管(6)的内部，所述第一样本收集管(4)、第二样本收集管(5)和第三样本收集管(6)的内部均设置有玻璃纤维滤纸(7)，所述玻璃纤维滤纸(7)用于作为标准品和质控品的载体。

2.根据权利要求1所述的检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒，其特征在于，所述第一样本收集管(4)、第二样本收集管(5)和第三样本收集管(6)的底部均设置有环形凸起(8)，所述环形凸起用于固定玻璃纤维滤纸(7)。

3.根据权利要求1所述的检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒，其特征在于，所述第一样本收集管(4)、第二样本收集管(5)和第三样本收集管(6)的内部均设置有固定管(9)，每一个所述固定管(9)内均设置有干燥剂(10)，所述固定管(9)用于分别将干燥剂(10)固定在第一样本收集管(4)、第二样本收集管(5)和第三样本收集管(6)的内部。

4.根据权利要求1所述的检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒，其特征在于，所述广口瓶(3)为60mL广口瓶(3)，所述玻璃纤维滤纸(7)为预先打孔的玻璃纤维滤纸(7)。

5.根据权利要求1所述的检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒，其特征在于，所述盒体(1)还包括与所述盒体(1)一体成形的盒盖(11)，所述盒盖(11)用于完全封闭盒体(1)的顶部。

6.根据权利要求1所述的检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒，其特征在于，所述干血片环孢霉素校准品和干血片环孢霉素质控品均包含环孢霉素、兔全血和防腐剂，所述空白质控品包含甲醇、兔全血和防腐剂，所述干血片环孢霉素校准品包含50.0-1500.0ng/mL线性范围内的6个校准点，所述干血片环孢霉素质控品包括高浓度质控品、中浓度质控品和低浓度质控品，所述高浓度质控品的环孢霉素浓度为1200ng/mL，所述中浓度质控品的环孢霉素浓度为600ng/mL，所述低浓度质控品的环孢霉素浓度为300ng/mL。

7.根据权利要求6所述的检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为0.2％ProClin950和0.1％叠氮化钠。

8.根据权利要求1所述的检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒，其特征在于，所述样本萃取液包括乙腈、水和环孢霉素-D4，所述乙腈和水的体积比为7：3，所述样本萃取液中环孢霉素-D4的浓度为20ng/mL。

9.一种利用权利要求1-8中任一项所述的检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述方法以检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒为载体，采用内标法，结合液相色谱串联质谱仪，对干血片样本中环孢霉素药物浓度进行定量检测，包括以下步骤：

1)样本前处理：

先取2支第三样本收集管，一支中加入300μL的乙腈和水混合溶液，作为双空白样本，乙腈和水的体积比为7：3，另一支中加入300μL样本萃取液作为单空白样本；

再取第一样本收集管、第二样本收集管和待测干血片样本的样本收集管，加入300μL样本萃取液，将所有样本收集管静置15min，随后在2500rpm转速下振荡混匀15min；

将样本收集管置于离心机中，在4℃、13000rpm条件下离心10min，取200μL上清液用于LC-MS/MS分析备用；

2)LC-MS/MS质谱进样分析：取200μL进行前处理后的样本，进行LC-MS/MS质谱分析；

3)结果分析：

先通过六个所述干血片环孢霉素校准品的标示浓度和干血片环孢霉素校准品中环孢霉素和环孢霉素同位素内标的峰面积比值，绘制校准曲线，并拟合校准曲线方程；

再将检测样品的环孢霉素峰面积与环孢霉素同位素内标的峰面积比值带入校准曲线方程，即可定量计算样本中环孢霉素的浓度。

10.根据权利要求9所述的检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述LC-MS/MS质谱分析的检测条件为：

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18，2.1mm×50mm，1.7μm，柱温为60℃，流动相A为0.1％甲酸4mmol/L甲酸铵-水溶液，流动相B为0.1％甲酸4mmol/L甲酸铵-甲醇溶液，洗针液为90％甲醇。

11.根据权利要求9所述的检测干血片样本中环孢霉素药物浓度的试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述LC-MS/MS质谱分析的洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为：

0min流动相组成为80％A+20％B，0.2min流动相组成为80％A+20％B，0.8min流动相组成为2％A+98％B，1.4min流动相组成为2％A+98％B，1.5min流动相组成为80％A+20％B，1.8min流动相组成为80％A+20％B，洗脱过程中流速为0.6mL/min。

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