CN112710766A - 一种检测干血片中五种免疫抑制剂的方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种准确测定干血片中五种免疫抑制剂含量的液相色谱串联质谱方法以及试剂盒。该方法包括：1)将内标工作液与有机溶剂混匀，得到提取液；2)用提取液对待测样本干血片进行提取，结束后离心取上清液I，然后将上清液I氮吹干并复溶成溶液II，涡旋，离心，待测；3)采用液相色谱串联质谱法对溶液II进行检测；内标工作液含有环孢霉素A同位素内标准品、依维莫司同位素内标准品、西罗莫司同位素内标准品、霉酚酸同位素混合内标准品。该方法在检测时，仅需6微升血液样本就可以一次性定量5种免疫抑制剂，且前处理方法简单快捷，节省了操作时间，根据这些指标能够有效的监测免疫抑制血药浓度，及时获得更为完整的治疗用药信息。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测干血片中五种免疫抑制剂的方法及其试剂盒。
背景技术
免疫抑制剂是一类通过抑制细胞及体液免疫反应而使组织损伤得以减轻的化学或生物物质，可抑制机体异常的免疫反应，主要应用于器官移植抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗[1]。自20世纪70年代免疫抑制剂发展以来，目前临床正在应用的免疫抑制剂基本上可以划分为五大类。第一类为细胞因子抑制剂，如环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司等。第二类是DNA合成抑制剂，如硫唑嘌呤、霉酚酸、咪唑立宾等。第三类是糖皮质激素类，如泼尼松、甲泼尼松等。第四类为抗淋巴细胞抗体，如抗淋巴细胞球蛋白、抗胸腺球蛋白等。第五类为其他免疫抑制剂，如AEB071、FTY720等[2]。免疫抑制剂可通过影响机体的免疫应答反应和免疫病理反应来抑制机体的免疫功能，不同的免疫抑制剂作用于淋巴细胞激活的不同时期，可发挥协同作用，目前临床上也多采用联合用药的方法来提高治疗方案的整体有效性和安全性。比如，细胞因子抑制剂(环孢霉素A/他克莫司)+霉酚酸酯+糖皮质激素(泼尼松/泼尼松龙)组成的三联疗法是目前权威的器官移植免疫抑制治疗用药方案，其中霉酚酸酯在体内迅速吸收并代谢为活性成分霉酚酸，泼尼松经肝内代谢为泼尼松龙产生药效。由于免疫抑制剂这类药物治疗窗窄，药动学个体差异较大，当其用量过大时，可能引起严重的毒性反应；用量不足时，患者将发生免疫排斥反应，因此需进行治疗药物监测(therapeutic drug monitoring,TDM)，获得更为完整的治疗用药信息，便于调整个体化给药方案[3-6]。其中，传统观点认为糖皮质激素的治疗窗较宽，并且泼尼松龙的生物半衰期比血浆半衰期长，血浆浓度并不能很好的反应药物治疗效的疗效性和毒性，不必要进行TDM[7]。因此，除了泼尼松龙外，还需对常用的5种免疫抑制剂药物环孢霉素A(CsA)、他克莫司(Tac)、西罗莫司(Sir)、依维莫司(Ever)、霉酚酸(MPA)进行TDM，以确保药物治疗的安全性和有效性。
目前，免疫抑制剂的定量分析方法主要有免疫法、高效液相色谱法(HPLC-UV)和液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)。免疫法由于本身方法的限制，专属性相对较差，每次仅能够测定一种分析物，方法结果差异性较大，因此，在临床和TDM方面可靠性差，单位样本测定费用高。高效液相色谱法由于其方法本身和检测器的限制，仅能够针对一种或几种分析物的测定，且方法本身的检测限较高，无法对含量极低的分析物进行准确定量。而液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)可以同时对不同分析物进行精准的定量，满足临床和TDM对免疫抑制剂的精准检测，具有高通量、快速、低成本的特点。美国的ARUP laboratories、QuestDiagnostics和Mayo Medical laboratories等独立医学实验室已推出了检测全血(血浆)中5种免疫抑制剂浓度(LC-MS/MS法)的项目。
现有所使用LC-MS/MS方法的试剂盒所检测分析物不全面，只包括了四种免疫抑制剂CsA、Tac、Sir、Ever，没有包含临床上常用到的霉酚酸(MPA)，无法对常涉及使用的五种免疫抑制剂同时进行治疗药物监测。
同时值得我们关注的是，在进行免疫抑制剂TDM期间，需多次采集全血，增加了患者和家属的生理负担和经济负担。干血片样品收集技术具有全血样品无法比拟的优势，包括所需样本量少、采集方便、微创、成本更低、样品更稳定、易保存和运输等优势。
基于干血片样本采集方便，成本低，故开发一种用于准确测定干血片中五种免疫抑制剂药物浓度的液相色谱串联质谱方法及其试剂盒具有重要的现实意义。
参考文献：
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发明内容
本发明的目的是提供一种准确测定干血片中五种免疫抑制剂含量的液相色谱串联质谱方法以及试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明所提供的准确测定干血片中五种免疫抑制剂的液相色谱串联质谱方法，所述五种免疫抑制剂包括环孢霉素A(CsA)、他克莫司(Tac)、西罗莫司(Sir)、依维莫司(Ever)和霉酚酸(MPA)，包括下述步骤：
1)提取液的配制：将内标工作液与有机溶剂混合均匀，配制成提取液；
2)样本处理：用所述提取液对待测样本干血片进行提取，提取结束后离心取上清液I，然后将所述上清液I氮吹干并用复溶液复溶成溶液II，涡旋，离心，待测；
3)采用液相色谱串联质谱法对所述溶液II进行检测。
上述方法步骤1)中，所述有机溶剂可为甲醇；所述内标工作液与有机溶剂的体积配比为1:39。
所述内标工作液中含有环孢霉素A同位素内标准品(TRC,C988901)、依维莫司同位素内标准品(CIL,DLM-9855-C)、西罗莫司同位素内标准品(Medical Isotopes Inc.,D13656)、霉酚酸同位素混合内标准品(Cer,M-137)，其浓度依次为环孢霉素同位素内标400ng/mL、依维莫司同位素内标20ng/mL、西罗莫司同位素内标48ng/mL、霉酚酸同位素内标400ng/mL。
本申请中，由于他克莫司在前处理制备和质谱检测过程中比较稳定，受干扰较小，使用外标法定量，其检测结果均满足要求。在满足检测要求的条件下，使用外标法定量他克莫司，能减少样本检测的成本。因此，本申请的内标准品中可以不包含他克莫司内标。
上述方法步骤2)中，所述样本处理在避光条件下进行。
所述提取结束后离心的条件为：4000rpm离心30分钟；所述离心之前还需要进行涡旋，所述涡旋的条件可为：600rpm，涡旋混匀30分钟。
所述复溶后的涡旋、离心条件可为：600rpm涡旋5分钟，4000rpm离心5分钟。
所述复溶液是体积分数为40％～45％的甲醇水溶液；
上述方法步骤3)中，所述液相色谱串联质谱的条件如下：
色谱条件：
流动相，包括流动相A和流动相B；
所述流动相A由去离子水、乙酸铵和甲酸组成，其中，乙酸铵浓度为2mmol/，甲酸体积分数为0.1％；
所述流动相B由甲醇、乙酸铵和甲酸组成，其中，乙酸铵浓度为2mmol/，甲酸体积分数为0.1％。
超高效液相色谱：Waters ACQUITY i-class UPLC液相系统
色谱柱：ACE Excel 2 C18-PFP 2μm色谱柱(2.1×50mm)
柱温：50℃
样品池温度：8℃
进样体积：10.0μL
洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的洗脱程序按照下表进行：
质谱条件(Waters Xevo TQ-S)：采用多反应监测MRM模式；
进一步的，所述质谱条件为：正离子模式下，采用ESI离子源，毛细管电压(Capillary)1.2kV；离子源补偿电压(Source Offset)为50V，脱溶剂温度(DesolvationTemp)为400℃，脱溶剂气流量(Desolvation)为900L/h，锥孔气流速(Cone gas)为150L/h。
所述MRM的参数如下，*为定量离子对：
所述方法还进一步包括，制备环孢霉素A(CsA)、他克莫司(Tac)、西罗莫司(Sir)、依维莫司(Ever)和霉酚酸(MPA)的标准曲线的步骤，具体如下：
a)将含不同浓度的环孢霉素A(CsA)、他克莫司(Tac)、西罗莫司(Sir)、依维莫司(Ever)和霉酚酸(MPA)的标准曲线干血片按照上述步骤1)中的方法进行处理，然后对得到的溶液II按照上述步骤3)中所述的液相色谱串联质谱法进行检测，并分别记录每个浓度的环孢霉素A(CsA)、他克莫司(Tac)、西罗莫司(Sir)、依维莫司(Ever)和霉酚酸(MPA)以及对应的内标物的峰面积，以上述各免疫抑制剂与对应的内标峰面积比值为纵坐标，以各免疫抑制剂对应的浓度为横坐标，线性回归得到各免疫抑制剂的标准曲线方程；
b)将待测样本测定的各免疫抑制剂和对应的内标物的峰面积比值代入标准曲线方程，计算得出待测干血片中各免疫抑制剂含量。
其中，上述步骤a)中所述标准曲线干血片是含有环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司和霉酚酸的人全血滤纸干血片；具体制备方法包括下述步骤：将标准品溶液与健康人全血混合均匀，再用所述健康人全血依次稀释成系列浓度的标准品混合液，再分别将所述混合液滴到滤纸上晾干即得。
本发明还提供了一种快速定量检测干血片中五种免疫抑制剂的试剂盒。
本发明所提供的试剂盒用于采用液相色谱串联质谱对待测干血片样本进行检测，该试剂盒包括独立包装的下述组分：
a)内标准品干粉；
b)标准曲线样品干血片(blank、cal1-cal7)；
c)质控样品干血片(低、中、高)；
d)QA干粉；
其中，所述内标准品含有环孢霉素A同位素内标准品(TRC,C988901)、依维莫司同位素内标准品(CIL,DLM-9855-C)、西罗莫司同位素内标准品(Medical Isotopes Inc.,D13656)、霉酚酸同位素混合内标准品(Cer,M-137)，其含量依次为环孢霉素A同位素内标干粉200ng、依维莫司同位素内标干粉10ng、西罗莫司同位素内标干粉24ng、霉酚酸同位素内标干粉200ng。
所述标准曲线干血片是含有环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司和霉酚酸的人全血滤纸干血片；具体制备方法包括下述步骤：将标准品溶液与健康人全血混合均匀，再用所述健康人全血依次稀释成系列浓度的标准品混合液，再分别将所述混合液滴到滤纸上晾干即得。所述标准曲线干血片为1套，包括空白样品blank，梯度浓度样品cal1-cal7；
优选的，标准曲线干血片中各物质的浓度为：
cal1干血片样品中CsA的浓度为5ng/mL、Tac的浓度为0.5ng/mL、Sir的浓度为0.5ng/mL、Ever的浓度为0.5ng/mL、MPA的浓度为50ng/mL；
cal2干血片样品中CsA的浓度为25ng/mL、Tac的浓度为2.5ng/mL、Sir的浓度为2.5ng/mL、Ever的浓度为2.5ng/mL、MPA的浓度为250ng/mL；
cal3干血片样品中CsA的浓度为50ng/mL、Tac的浓度为5ng/mL、Sir的浓度为5ng/mL、Ever的浓度为5ng/mL、MPA的浓度为500ng/mL；
cal4干血片样品中CsA的浓度为100ng/mL、Tac的浓度为10ng/mL、Sir的浓度为10ng/mL、Ever的浓度为10ng/mL、MPA的浓度为1000ng/mL；
cal5干血片样品中CsA的浓度为250ng/mL、Tac的浓度为25ng/mL、Sir的浓度为25ng/mL、Ever的浓度为25ng/mL、MPA的浓度为2500ng/mL；
cal6干血片样品中CsA的浓度为500ng/mL、Tac的浓度为50ng/mL、Sir的浓度为50ng/mL、Ever的浓度为50ng/mL、MPA的浓度为5000ng/mL；
cal7干血片样品中CsA的浓度为1000ng/mL、Tac的浓度为100ng/mL、Sir的浓度为100ng/mL、Ever的浓度为100ng/mL、MPA的浓度为10000ng/mL。
通过检测标准曲线样本和未知样本，能够得出未知样本的浓度；同时在检测大批量未知样本的时候需要插入质控品样本，以考察检测的准确性以及仪器的稳定性。因此，本发明的试剂盒中还设置了质控品。
所述质控品是含有环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司和霉酚酸的人全血滤纸干血片；1套质控品总计包括人全血滤纸干血片3张；其中，高浓度质控品、中浓度质控品和低浓度质控品各1张。
高浓度质控品中环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司和霉酚酸的浓度依次为200ng/mL、20ng/mL、20ng/mL、20ng/mL、8000ng/mL。
中浓度质控品中环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司和霉酚酸的浓度依次为100ng/mL、10ng/mL、10ng/mL、10ng/mL、1000ng/mL。
低浓度质控品中环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司和霉酚酸的浓度依次为20ng/mL、2ng/mL、2ng/mL、2ng/mL、100ng/mL。
所述QA是含有环孢霉素A(Dr,CDCT-C11836300)、依维莫司(TRC,E945400)、西罗莫司(TRC,R124000)、他克莫司(ANPEL,CDAA-280438-20mg)、霉酚酸(Aladdin,M110918-50mg)纯标准品的干粉；各物质含量均为5ng。
进一步的，所述试剂盒中还可包括(e)流动相A和流动相B
所述流动相A由去离子水、乙酸铵和甲酸组成，其中，乙酸铵浓度为2mmol/，甲酸体积分数为0.1％；
所述流动相B由甲醇、乙酸铵和甲酸组成，其中，乙酸铵浓度为2mmol/，甲酸体积分数为0.1％。
进一步的，所述试剂盒还包括复溶液；所述复溶液是体积分数为40％～45％的甲醇水溶液。
进一步的，本发明所述的试剂盒中还包括96孔板(如V型底96孔板(350μl))、铝箔封口膜和操作说明书中的至少一种。
需要说明的是，96孔板和铝箔封口膜可以选择性的加入试剂盒中，以方便检测使用，也可以单独另行购置。
操作说明书实际上就是按照本发明记载的方法和实施例中记载的内容所编写的试验操作步骤。
本发明还保护上述试剂盒的应用。
所述应用为所述试剂盒在制备同时检测人全血滤纸干血片中环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司和霉酚酸的产品中的应用；
所述产品可为药物或装置。
本发明针对现有试剂盒的不足，提供了一种用于准确测定干血片中五种免疫抑制剂(环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司和霉酚酸)药物浓度的液相色谱串联质谱方法和试剂盒，具有高通量、精准定量，操作方便等特点。采用本发明试剂盒来处理干血片样本，仅使用有机溶液提取干血片中的目标分析物，无需复杂的前处理步骤，而且所需样本量小，可与液相色谱串联质谱仪配套使用，应用于临床样本的检测和治疗药物监测。同时，该产品能同时检测环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司和霉酚酸这5种免疫抑制剂，实现单样本多指标同步检测功能，适用于联合用药时多种免疫抑制剂的共同检测，具有高通量、高时效等特点。
本发明的检测方法用于液相色谱串联质谱检测，在检测人全血制备而成的干血片样本时，大约仅需6微升血液样本就可以一次性定量5种免疫抑制剂，且前处理方法简单快捷，节省了操作时间，根据这些指标能够有效的监测免疫抑制血药浓度，及时获得更为完整的治疗用药信息，便于调整个体化给药方案。
附图说明
图1为QA样品中5种免疫抑制剂的色谱图。
图2为环孢菌素A的标准曲线图。
图3为他克莫司的标准曲线图。
图4为雷帕霉素的标准曲线图。
图5为依维莫司的标准曲线图。
图6为霉酚酸的标准曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、干血片中免疫抑制剂快速检测试剂盒以及检测方法
本实施例提供的试剂盒的快速检测指标包括：环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司和霉酚酸。
本发明中提供的干血片中免疫抑制剂快速检测试剂盒内容包括：
表1试剂盒组成
该试剂盒于2～8℃避光保存。
说明：由于他克莫司在前处理制备和质谱检测过程中比较稳定，受干扰较小，使用外标法定量，其检测结果均满足要求。在满足检测要求的条件下，使用外标法定量他克莫司，能减少样本检测的成本。因此，上述混合内标准品中不包含他克莫司内标。
表1中，1瓶混合内标准品干粉包含4种分析物同位素内标，即环孢霉素A同位素内标干粉200ng、依维莫司同位素内标干粉10ng、西罗莫司同位素内标干粉24ng、霉酚酸同位素内标干粉200ng。
表1中，1套标准曲线样品包括不含CsA、Tac、Sir、Ever和MPA五种免疫抑制剂的干血片样品一张，即blank；以及七张同时含有五种免疫抑制剂的梯度浓度干血片样品，即cal1至cal7。其中，cal1干血片样品中CsA的浓度为5ng/mL、Tac的浓度为0.5ng/mL、Sir的浓度为0.5ng/mL、Ever的浓度为0.5ng/mL、MPA的浓度为50ng/mL；cal2干血片样品中CsA的浓度为25ng/mL、Tac的浓度为2.5ng/mL、Sir的浓度为2.5ng/mL、Ever的浓度为2.5ng/mL、MPA的浓度为250ng/mL；cal3干血片样品中CsA的浓度为50ng/mL、Tac的浓度为5ng/mL、Sir的浓度为5ng/mL、Ever的浓度为5ng/mL、MPA的浓度为500ng/mL；cal4干血片样品中CsA的浓度为100ng/mL、Tac的浓度为10ng/mL、Sir的浓度为10ng/mL、Ever的浓度为10ng/mL、MPA的浓度为1000ng/mL；cal5干血片样品中CsA的浓度为250ng/mL、Tac的浓度为25ng/mL、Sir的浓度为25ng/mL、Ever的浓度为25ng/mL、MPA的浓度为2500ng/mL；cal6干血片样品中CsA的浓度为500ng/mL、Tac的浓度为50ng/mL、Sir的浓度为50ng/mL、Ever的浓度为50ng/mL、MPA的浓度为5000ng/mL；cal7干血片样品中CsA的浓度为1000ng/mL、Tac的浓度为100ng/mL、Sir的浓度为100ng/mL、Ever的浓度为100ng/mL、MPA的浓度为10000ng/mL。
表1中，1套质控样品包括低浓度干血片样品一张、中浓度干血片样品一张和高浓度干血片样品一张。其中，低浓度干血片样品中CsA的浓度为20ng/mL、Tac的浓度为2ng/mL、Sir的浓度为2ng/mL、Ever的浓度为2ng/mL、MPA的浓度为100ng/mL；中浓度干血片样品中CsA的浓度为100ng/mL、Tac的浓度为10ng/mL、Sir的浓度为10ng/mL、Ever的浓度为10ng/mL、MPA的浓度为1000ng/mL；高浓度干血片样品中CsA的浓度为200ng/mL、Tac的浓度为20ng/mL、Sir的浓度为20ng/mL、Ever的浓度为20ng/mL、MPA的浓度为8000ng/mL。
表1中，1瓶流动相添加剂A的体积为0.5mL，1瓶流动相添加剂B的体积为1.5mL。QA为包含五种免疫抑制剂纯标准品的干粉；其中CsA的含量为5ng、Tac的含量为5ng、Sir的含量为5ng、Ever的含量为5ng、MPA的含量为5ng。
利用上述试剂盒检测干血片中五种免疫抑制剂的主要步骤如下：
1)准备内标工作液：取0.5mL甲醇加入到内标准品小瓶中进行复溶，制成环孢霉素同位素内标400ng/mL、依维莫司同位素内标20ng/mL、西罗莫司同位素内标48ng/mL、霉酚酸同位素内标400ng/mL的内标准品溶液；
2)提取液的配制：将内标工作液与有机溶剂按1:39的体积比例混合均匀，配制成提取液；
3)样本处理：避光，用3mm打孔器，在每个待测样本血斑上打2个血点，放到96孔板的1个孔内；加入200μl步骤(1)制备的提取液，铝膜热封，600rpm，涡旋混匀30分钟，4000rpm离心30分钟。将150μl上清液I转移到新的96孔板中，氮气吹干。然后用75μl 40％甲醇溶液(复溶液)复溶成溶液II，铝膜热封，600rpm，涡旋混匀5分钟，4000rpm离心5分钟，待测。
质控品(低、中、高)的处理方法如下：对质控品的处理方法同待测样本处理方法，只需将待测样本替换为质控品即可。
标准曲线干血片的处理方法同样参照待测样本。
(3)质谱上机检测：
配制流动相A：500ml去离子水中加入200μL流动相添加剂A和0.5ml流动相添加剂B；
配制流动相B：500ml甲醇中加入200μL流动相添加剂A和0.5ml流动相添加剂B；
用50％甲醇水溶液500μl将QA复溶，采用QA检测系统的适配性，检查5种免疫抑制剂的响应以及保留时间等方面是否满足检测要求。复溶后QA样本中5种免疫抑制剂的浓度均为10ng/mL。
(4)色谱条件：
超高效液相色谱：Waters ACQUITY i-class UPLC液相系统
色谱柱：ACE Excel 2 C18-PFP 2μm色谱柱(2.1×50mm)
柱温：50℃
样品池温度：8℃
进样体积：10.0μL
洗脱梯度表：
(5)质谱条件(Waters Xevo TQ-S)：
离子对信息：*为定量离子对
(6)定量结果报告：根据仪器设定程序自动得到各个分析物的浓度。
标准曲线结果：将各标准品出峰面积同对应的内标出峰面积的比值作为纵坐标，各标准品溶液浓度作为横坐标，线性回归得到五种免疫抑制剂(环孢菌素A、他克莫司、雷帕霉素、依维莫司、霉酚酸)标准曲线方程，见图2-6。
根据本发明，只要使用本发明的试剂盒进行检测即可实现本发明的目的，上述步骤的具体操作应全部都在避光条件下进行，尽可能避免分析物在光照下的降解。
本发明提供的试剂盒中，还可以进一步包含甲醇、水和色谱柱等，本领域技术人员会对此类耗材进行选择，在此不再多加赘述。
实施中的质控品可用于评估方法的稳定性，CV％≤15％表示方法稳定，数据采集可靠，下表为低、中、高浓度质控品的检测结果。图1为QA样品中5种免疫抑制剂的色谱图。
Claims (10)
1.一种同时检测干血片中五种免疫抑制剂的液相色谱串联质谱方法，所述五种免疫抑制剂包括环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司和霉酚酸，包括下述步骤：
1)提取液的配制：将内标工作液与有机溶剂混合均匀，配制成提取液；
2)样本处理：用所述提取液对待测样本干血片进行提取，提取结束后离心取上清液I，然后将所述上清液I氮吹干并用复溶液复溶成溶液II，涡旋，离心，待测；
3)采用液相色谱串联质谱法对所述溶液II进行检测；
所述内标工作液含有环孢霉素A同位素内标准品、依维莫司同位素内标准品、西罗莫司同位素内标准品、霉酚酸同位素混合内标准品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述内标工作液中所述环孢霉素同位素内标浓度为400ng/mL、依维莫司同位素内标浓度为20ng/mL、西罗莫司同位素内标浓度为48ng/mL、霉酚酸同位素内标浓度为400ng/mL；
所述有机溶剂为甲醇；所述内标工作液与有机溶剂的体积配比为1:39；
所述步骤2)中，所述样本处理在避光条件下进行；
所述提取结束后离心的条件为：4000rpm离心30分钟；所述离心之前还需要进行涡旋，所述涡旋的条件为：600rpm，涡旋混匀30分钟；
所述复溶后的涡旋、离心条件为：600rpm涡旋5分钟，4000rpm离心5分钟；
所述复溶液是体积分数为40％～45％的甲醇水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法步骤3)中，所述液相色谱串联质谱的条件如下：
色谱条件：
流动相，包括流动相A和流动相B；
所述流动相A由去离子水、乙酸铵和甲酸组成，其中，乙酸铵浓度为2mmol/，甲酸体积分数为0.1％；
所述流动相B由甲醇、乙酸铵和甲酸组成，其中，乙酸铵浓度为2mmol/，甲酸体积分数为0.1％；
超高效液相色谱：Waters ACQUITYi-class UPLC液相系统
洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的洗脱程序按照下表进行：
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：质谱条件：采用多反应监测MRM模式；
所述MRM的参数如下，*为定量离子对：
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述液相色谱条件中，所述色谱柱为ACE Excel 2 C18-PFP 2μm色谱柱，规格：2.1×50mm；柱温：50℃；样品池温度：8℃；进样体积：10.0μL；
所述质谱条件为：正离子模式下，采用ESI离子源，毛细管电压1.2kV；离子源补偿电为50V，脱溶剂温度为400℃，脱溶剂气流量为900L/h，锥孔气流速为150L/h。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括制备环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司和霉酚酸的标准曲线的步骤，具体如下：
a)将含不同浓度的环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司和霉酚酸的标准曲线干血片按照所述步骤1)中的方法进行处理，然后对得到的上清液按照所述步骤3)中所述的液相色谱串联质谱法进行检测，并分别记录每个浓度的环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司和霉酚酸以及对应的内标物的峰面积，以上述各免疫抑制剂与对应的内标峰面积比值为纵坐标，以各免疫抑制剂对应的浓度为横坐标，线性回归得到各免疫抑制剂的标准曲线方程；
b)将待测样本测定的各免疫抑制剂和对应的内标物的峰面积比值代入标准曲线方程，计算得出待测干血片中各免疫抑制剂含量。
7.一种快速定量检测干血片中五种免疫抑制剂的试剂盒，所述五种免疫抑制剂包括环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司和霉酚酸，包括独立包装的下述组分：
a)内标准品干粉；
b)标准曲线样品干血片；
c)质控样品干血片；
d)QA干粉；
其中，所述内标准品干粉含有环孢霉素A同位素内标准品、依维莫司同位素内标准品、西罗莫司同位素内标准品、霉酚酸同位素混合内标准品；
优选地，所述环孢霉素A同位素内标干粉含量为200ng、依维莫司同位素内标干粉含量为10ng、西罗莫司同位素内标干粉含量为24ng、霉酚酸同位素内标干粉含量为200ng；
所述标准曲线干血片是含有环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司和霉酚酸的人全血滤纸干血片；所述标准曲线干血片为1套，包括空白样品blank，梯度浓度样品cal1-cal7；
优选地，标准曲线干血片中各物质的浓度为：
cal1干血片样品中CsA的浓度为5ng/mL、Tac的浓度为0.5ng/mL、Sir的浓度为0.5ng/mL、Ever的浓度为0.5ng/mL、MPA的浓度为50ng/mL；
cal2干血片样品中CsA的浓度为25ng/mL、Tac的浓度为2.5ng/mL、Sir的浓度为2.5ng/mL、Ever的浓度为2.5ng/mL、MPA的浓度为250ng/mL；
cal3干血片样品中CsA的浓度为50ng/mL、Tac的浓度为5ng/mL、Sir的浓度为5ng/mL、Ever的浓度为5ng/mL、MPA的浓度为500ng/mL；
cal4干血片样品中CsA的浓度为100ng/mL、Tac的浓度为10ng/mL、Sir的浓度为10ng/mL、Ever的浓度为10ng/mL、MPA的浓度为1000ng/mL；
cal5干血片样品中CsA的浓度为250ng/mL、Tac的浓度为25ng/mL、Sir的浓度为25ng/mL、Ever的浓度为25ng/mL、MPA的浓度为2500ng/mL；
cal6干血片样品中CsA的浓度为500ng/mL、Tac的浓度为50ng/mL、Sir的浓度为50ng/mL、Ever的浓度为50ng/mL、MPA的浓度为5000ng/mL；
cal7干血片样品中CsA的浓度为1000ng/mL、Tac的浓度为100ng/mL、Sir的浓度为100ng/mL、Ever的浓度为100ng/mL、MPA的浓度为10000ng/mL；
所述质控品是含有环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司和霉酚酸的人全血滤纸干血片；1套质控品总计包括人全血滤纸干血片3张；其中，高浓度质控品、中浓度质控品和低浓度质控品各1张；
所述QA是含有环孢霉素A、依维莫司、西罗莫司、他克莫司、霉酚酸纯标准品的干粉；各物质含量均为5ng。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括(e)流动相A和流动相B；
所述流动相A由去离子水、乙酸铵和甲酸组成，其中，乙酸铵浓度为2mmol/，甲酸体积分数为0.1％；
所述流动相B由甲醇、乙酸铵和甲酸组成，其中，乙酸铵浓度为2mmol/，甲酸体积分数为0.1％；
所述试剂盒还包括复溶液；所述复溶液是体积分数为40％～45％的甲醇水溶液。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括96孔板、铝箔封口膜和操作说明书中的至少一种。
10.权利要求7-9中任一项所述的试剂盒在制备同时检测人全血滤纸干血片中环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司和霉酚酸的产品中的应用。
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