CN109030673A - 干血片中免疫抑制剂的检测方法以及检测试剂盒 - Google Patents

干血片中免疫抑制剂的检测方法以及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种干血片中免疫抑制剂的检测方法，包括：将标准曲线干血片和待测干血片分别与提取液、内标溶液混合后提取，离心取上清液；上清液吹干后用复溶液复溶，采用串联质谱法进行检测；根据标准样本和内标物的出峰面积比值以及标准样本浓度，线性回归得到免疫抑制剂的标准曲线方程；将待测样本和内标物的出峰面积比值代入标准曲线方程，计算得出待测样本中免疫抑制剂含量；所述的提取液为甲醇和/或乙腈的水溶液；所述的免疫抑制剂为环孢菌素A、他克莫司、雷帕霉素和依维莫司中的至少一种。本发明还公开了干血片中免疫抑制剂的检测试剂盒。本发明的检测方法可同时有效地检测四种免疫抑制剂，提高了检测效率。

Description

干血片中免疫抑制剂的检测方法以及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及临床检测技术领域，尤其涉及一种干血片中免疫抑制剂的检测方法以及检测试剂盒。
背景技术
免疫抑制剂是对机体的免疫反应具有抑制作用的药物，能抑制与免疫反应有关细胞(T细胞和B细胞等巨噬细胞)的增殖和功能，能降低抗体免疫反应。免疫抑制剂主要用于器官移植抗排斥反应和自身免疫病如类风湿性关节炎、红斑狼疮、皮肤真菌病、膜肾球肾炎、炎性肠病和自身免疫性溶血贫血等。
当前，在器官移植术后的药物治疗中，免疫抑制状态的控制是一个棘手的问题。常用的免疫抑制剂主要有：糖皮质激素类(氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、地塞米松、可的松、强地松等)、微生物代谢产物(环孢菌素A、他克莫司、西罗莫司(雷帕霉素)、依维莫司等)、抗代谢物(硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤等)、霉酚酸酯等。环孢菌素A(CsA)与他克莫司(FK506)在临床应用中需要进行治疗药物监测已是大家的共识，其测定值作为临床评价疗效及毒性反应的指标。以雷帕霉素和依维莫司为代表的第二代免疫抑制剂，为细胞因子合成抑制剂，主要作用是阻断免疫活性细胞的白细胞介素2的效应环节，干扰细胞活化，绝大部分分布于红细胞，血浆药物浓度与全血药物浓度不相关，临床需监测全血样本，国内外已有多篇相关全血浓度监测方法的报道。
公开号为CN102368054A的中国专利文献公开了一种检测人全血中他克莫司药物浓度的化学发光酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括化学发光酶标板，酶标记物；化学发光酶标板上的包被原为抗他克莫司单克隆抗体、二抗或与载体蛋白偶联的他克莫司半抗原。
公开号为CN102141552A的中国专利文献公开了一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒，以子囊霉素为内标，先用硫酸锌溶液处理全血样本，然后用乙腈沉淀，采用C18键合相硅胶为固定相，以乙腈-1mM乙酸铵为流动相进行反相色谱梯度分离，运用质谱仪进行定量检测。
值得注意的是，在一个给药间期内多次采集全血增加了患者，尤其是特殊群体(如儿童、老年人)的生理负担，也增加了门诊患者的单次门诊留院时间。另外，移植患者具有各种不同的原发病，生理、病理状态特殊，常合并其他治疗药物，因此对血药浓度检测的要求是样本量少、便捷、准确、特异性高。
干血滤纸片样品收集技术具有全血样品无法比拟的优势包括样本的常温稳定性更好、微创、成本更低、易保存和运输、减少潜在的病原体感染风险，目前还没有干血片中免疫抑制剂的检测方法。
发明内容
本发明提供了一种干血片中免疫抑制剂的检测方法，可同时有效地检测环孢菌素A、他克莫司、雷帕霉素、依维莫司四种免疫抑制剂，不仅提高了检测效率，还适用于联合用药时多种免疫抑制剂的共同检测。
本发明提供了如下技术方案：
一种干血片中免疫抑制剂的检测方法，包括以下步骤：
(1)将标准曲线干血片和待测干血片分别与提取液、内标溶液混合后提取，离心取上清液I；
(2)将所述上清液I吹干后用复溶液复溶，离心后取上清液II；
(3)将所述上清液II采用串联质谱法进行检测；
(4)根据标准样本和内标物的出峰面积比值以及标准样本浓度，线性回归得到免疫抑制剂的标准曲线方程；
将待测样本和内标物的出峰面积比值代入标准曲线方程，计算得出待测样本中免疫抑制剂含量；
所述的提取液为甲醇和/或乙腈的水溶液；
所述的免疫抑制剂为环孢菌素A、他克莫司、雷帕霉素和依维莫司中的至少一种；
色谱条件为：洗脱液为甲醇和/或乙腈、甲酸铵或乙酸铵-甲酸或乙酸的水溶液、甲酸铵或乙酸铵-甲酸或乙酸的甲醇和/或乙腈溶液中的一种。
优选的，步骤(1)中，标准曲线干血片的制备方法包括：取健康全血与标准品溶液混匀，再用健康全血依次稀释成若干个标准品浓度呈梯度分布的混合液，分别将所述混合液点渍到滤纸上晾干即得；
所述的标准品包括环孢菌素A、他克莫司、雷帕霉素和依维莫司中的至少一种；
所述混合液中环孢菌素A的浓度为10～2000ng/ml；他克莫司、雷帕霉素、依维莫司的浓度均为0.5～100ng/ml。
优选的，所述的提取液为甲醇的水溶液；选择该提取液时，对干血片中的免疫抑制剂提取效果较好，使得检测信号值较强，检测结果较为准确。
最优选的，所述的提取液是体积百分比浓度为80％的甲醇水溶液。选择该提取液时，检测信号值最强。
优选的，所述的内标溶液中含有环孢菌素A-d4和雷帕霉素-d3。
环孢菌素A-d4作为环孢菌素A的内标物，雷帕霉素-d3作为他克莫司、雷帕霉素和依维莫司的内标物。
进一步优选的，所述内标溶液中，环孢菌素A-d4的浓度为5～1500μg/ml；雷帕霉素-d3的浓度为300～500ng/ml。
优选的，所述的复溶液为洗脱液A与洗脱液B的混合液。
在生化检查领域，各种试剂的配用需要精心筛选，往往细微地改变试剂用量都可能导致检查的失败或精密度和准确度的降低。
优选的，所述的洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B，洗脱液A为甲酸铵或乙酸铵-甲酸或乙酸的水溶液，洗脱液B为甲酸铵或乙酸铵-甲酸或乙酸的甲醇和/或乙腈溶液。
进一步优选的，所述的提取液是体积百分比浓度为80％的甲醇水溶液；所述的洗脱液A为2mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸水溶液；洗脱液B为2mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸甲醇溶液。
采用上述特定配用的提取液和洗脱液时，检测信号较强，检测结果的精密度和准确度较高。
进一步优选的，步骤(3)中，采用梯度洗脱，洗脱参数见表1。
表1：梯度洗脱参数
进一步优选的，步骤(3)中，色谱条件为：色谱柱为Waters ACQUITYUPLC BEHC182.1mm×50mm，1.7um；柱温55℃，检测时间为3min，进样量为10μl。
在该色谱条件下，环孢菌素A的保留时间为1.34min，他克莫司的保留时间为1.26min，雷帕霉素的保留时间为1.27min，依维莫司的保留时间为1.27min，分离效果较好。
优选的，质谱条件为：采用多反应监测MRM模式，多反应监测MRM参数见表2。
表2：多反应监测MRM质谱参数
化合物 离子对 锥孔电压(V) 碰撞能量(eV)
环孢菌素A 1219.6→1202.3 61 14
他克莫司 821.2→768.1 48 18
雷帕霉素 931.3→864.1 33 14
依维莫司 975.3→908.1 37 16
环孢菌素A-d4 1223.7→1206.4 15 16
雷帕霉素-d3 934.3→861.1 31 16
进一步优选的，质谱条件为：正离子模式下，采用ESI离子源，离子源电压为1.0kV，温度为150℃；去溶剂气流速为800L/h，去溶剂温度为450℃，锥孔气流速为150L/h，雾化气压7.0Bar。
本发明还公开了一种干血片中免疫抑制剂的检测试剂盒，包括：
(1)洗脱液：
洗脱液A：2mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸水溶液；
洗脱液B：2mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸甲醇溶液；
(2)标准曲线干血片：含有环孢菌素A、他克莫司、雷帕霉素和依维莫司中的至少一种；环孢菌素A浓度为10～2000ng/ml，他克莫司、雷帕霉素、依维莫司浓度为0.5～100ng/ml；
(3)内标溶液：含有环孢菌素A-d4和雷帕霉素-d3的甲醇溶液；
(4)提取液：甲醇和/或乙腈的水溶液；
(5)复溶液：洗脱液A和洗脱液B的混合液；
(6)质控品干血片：含有环孢菌素A、他克莫司、雷帕霉素和依维莫司中的至少一种。
优选的，标准曲线干血片中，环孢菌素A的浓度为2000ng/ml、1500ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、100ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml；他克莫司、雷帕霉素和依维莫司的浓度均为100ng/ml、75ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml。
优选的，内标溶液中，环孢菌素A-d4的浓度为10μg/ml；雷帕霉素-d3的浓度为400ng/ml。
优选的，质控品干血片中，QC1中环孢菌素A浓度为20ng/ml，他克莫司、雷帕霉素、依维莫司浓度均为1ng/ml；QC2中环孢菌素A浓度为1000ng/ml，他克莫司、雷帕霉素、依维莫司浓度均为50ng/ml；QC3中环孢菌素A浓度为1500ng/ml，他克莫司、雷帕霉素、依维莫司浓度均为75ng/ml。
优选的，提取液为体积百分比浓度为80％的甲醇水溶液。
优选的，所述的复溶剂中，洗脱液A与洗脱液B的体积比为1：1。
使用所述的试剂盒检测干血片中免疫抑制剂的方法，包括以下步骤：
(1)将标准曲线干血片和待测干血片分别与提取液、内标溶液混合后提取，离心取上清液I；
(2)将所述上清液I吹干后用复溶液复溶，离心后取上清液II；
(3)将所述上清液II采用串联质谱法进行检测；
(4)根据标准样本和内标物的出峰面积比值以及标准样本浓度，线性回归得到免疫抑制剂的标准曲线方程；
将待测样本和内标物的出峰面积比值代入标准曲线方程，计算得出待测样本中免疫抑制剂含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的检测方法可同时有效的检测四种免疫抑制剂，不仅提高了检测效率还适用于联合用药检测；
(2)干血滤纸片样品收集技术具有全血样品无法比拟的优势包括样本的常温稳定性更好、微创、成本更低、易保存和运输、减少潜在的病原体感染风险，本发明的检测方法在干血滤纸片的基础上结合了液质联用技术的灵敏度高、专属性强的特点。
附图说明
图1为四种免疫抑制剂的色谱图，其中：(a)为他克莫司，(b)为雷帕霉素，(c)为依维莫司，(d)为环孢菌素A。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
实施例1
干血片中四种免疫抑制剂的同时检测方法，包括以下步骤：
(1)干血片标准曲线样本的制备：取495uL健康志愿者全血与5uL混合标准溶液(200ug/ml环孢菌素A、1ug/ml他克莫司、1ug/ml雷帕霉素、1ug/ml依维莫司)混匀，再用健康志愿者全血依次稀释成环孢菌素A浓度为10、20、100、200、500、1000、1500、2000ng/ml；他克莫司、雷帕霉素、依维莫司浓度均为0.5、1、5、10、20、50、75、100ng/ml，分别取40μl制备好的上述样本点渍到whatman903滤纸上晾干即得。
(2)待测样本的制备：取新鲜全血点渍到whatman903滤纸上晾干即得。
(3)分析过程：(a)用6mm打孔器打一个血斑样本到含内标溶液(内标溶液中含有环孢菌素A-d4浓度为1μg/ml，雷帕霉素-d3(他克莫司、雷帕霉素、依维莫司以雷帕霉素-d3为标准品)浓度为100ng/ml)10μl的第一个1.5mL离心管中，加入300μl的提取液(80％甲醇水溶液)中，超声提取30min后，15000g离心5min得到提取液；(b)氮气吹干：将提取液转移到第二个1.5mL离心管中，40℃氮气吹干；(c)复溶：50μl洗脱液A和洗脱液B混合溶液加入到吹干后的残渣中，涡旋1min后15000g离心5min，取上层清液转移到内插管中，进样分析；
检测方法为液相色谱串联质谱法，其中采用的是多反应监测MRM扫描方式，所述色谱条件如下：洗脱液A为2mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸水溶液，洗脱液B为2mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸甲醇溶液；色谱柱为WatersACQUITY UPLC BEH C182.1mm×50mm，1.7um；柱温55℃，检测时间为3min，进样量为10μl；采用梯度洗脱方式，洗脱参数见表1。
如图1所示，环孢菌素A的保留时间为1.34min；他克莫司的保留时间为1.26min；雷帕霉素的保留时间为1.27min；依维莫司的保留时间为1.28min。
所述多反应监测MRM质谱参数见表2。质谱条件如下：正离子模式下，采用ESI离子源，离子源电压为1.0kV，温度为150℃；去溶剂气流速为800L/h，去溶剂温度为450℃，锥孔气流速为150L/h，雾化气压7.0Bar。
表1：梯度洗脱参数
表2：多反应监测MRM质谱参数
化合物 离子对 锥孔电压(V) 碰撞能量(eV)
环孢菌素A 1219.6→1202.3 61 14
他克莫司 821.2→768.1 48 18
雷帕霉素 931.3→864.1 33 14
依维莫司 975.3→908.1 37 16
环孢菌素A-d4 1223.7→1206.4 15 16
雷帕霉素-d3 934.3→861.1 31 16
(4)结果计算：将标准品出峰面积同内标出峰面积的比值作为纵坐标，标准品溶液浓度作为横坐标，线性回归得到四种免疫抑制剂(环孢菌素A、他克莫司、雷帕霉素、依维莫司)标准曲线方程，如下：
环孢菌素A的线性方程：Y＝0.000115X+8.29e-5，R2＝0.995；
他克莫司的线性方程：Y＝0.265X+0.101，R2＝0.992；
雷帕霉素的线性方程：Y＝0.0592X+0.106，R2＝0.995；
依维莫司的线性方程：Y＝0.0637+0.00284，R2＝0.998；
环孢菌素A的可报告范围为10～2000ng/ml；他克莫司、雷帕霉素、依维莫司的可报告范围为0.5～100ng/ml。
实施例2～5
与实施例1相比，将提取液由80％甲醇水溶液分别替换为纯水、20％甲醇、50％甲醇、纯甲醇。
取同一浓度质控样本，按照实施例1所述的过程进行萃取干血片中免疫抑制剂，超声提取30min后，15000g离心5min得到提取液。经过吹干复溶后上机，均能得到较好的信号响应值。其中，实施例1(提取液为80％甲醇水溶液)中的信号响应值最强。
实施例6～10
分别将实施例1中的洗脱液替换为如表3所示的成分，其他同实施例1。
表3：洗脱液配方
实施例 洗脱液A 洗脱液B
实施例1 2mM乙酸铵0.1％甲酸水溶液 2mM乙酸铵0.1％甲酸甲醇溶液
实施例6 乙腈 10mmol/L醋酸铵，0.1％乙酸
实施例7 甲醇 10mmol/L醋酸铵，0.1％甲酸
实施例8 甲醇 5mmol/L甲酸铵，0.1％甲酸
实施例9 甲醇 2mmol/L醋酸铵，0.1％甲酸
实施例10 甲醇∶乙腈＝1∶1 2mmol/L醋酸铵，0.1％甲酸
取同一浓度质控样本，分别采用表3所示配方的洗脱液，按照实施例1所述的液相串联质谱法检测免疫抑制剂的含量，实施例6～10均可获得较为理想的检测效果，各待测物的回收率均能达到美国食品药品监督管理局规定的检测要求。
实施例11～14
在标准曲线干血片样本提取过程中，实施例11～14分别加入10uL内标2(环孢菌素A-d4浓度为5μg/ml，雷帕霉素-d3浓度为500ng/ml)，内标3(环孢菌素A-d4浓度为10μg/ml，雷帕霉素-d3浓度为1000ng/ml)，内标4(环孢菌素A-d4浓度为10μg/ml，雷帕霉素-d3浓度为100ng/ml)，内标5(环孢菌素A-d4浓度为1μg/ml，雷帕霉素-d3浓度为1000ng/ml)，其他同实施例1，得到所有标准曲线相关性系数符合要求。
实施例15
干血片中四种免疫抑制剂的同时检测试剂盒，试剂盒的组成如表4所示。
表4试剂盒的组成
(1)洗脱液：洗脱液A和B的选择有5中配方，如表3所示，这5中不同配方对最后的检测结果的准确性和精密度没有影响。
(2)标准曲线干血片样本：环孢菌素A的浓度分别为10、20、100、200、500、1000、1500、2000ng/ml；他克莫司、雷帕霉素、依维莫司的浓度均分别为0.5、1、5、10、20、50、75、100ng/ml。
标准曲线干血片样本的制备：取健康志愿者全血样本进行单标制备，配制成2000ng/ml环孢菌素A全血样本，用健康志愿者全血逐级稀释成1500ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、100ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml；取健康志愿者全血，样本配制成100ng/ml他克莫司全血样本，用健康志愿者全血逐级稀释成75ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml；取健康志愿者全血，样本配制成100ng/ml雷帕霉素全血样本，用健康志愿者全血逐级稀释成75ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml；取健康志愿者全血，样本配制成100ng/ml依维莫司全血样本，用健康志愿者全血逐级稀释成75ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml。将四种免疫抑制剂标准全血样本点渍至whatman903滤纸片上，通风干燥。
另一种制备方法为：取健康志愿者全血样本进行混标制备，配制成环孢菌素A2000ng/ml、他克莫司100ng/ml、雷帕霉素100ng/ml、依维莫司100ng/ml全血混合标准样本，用健康志愿者全血样本逐级稀释成表4浓度。
表4混合标准样本浓度
(3)质控干血片样本：质控干血片样本含有四种免疫抑制剂低、中、高三个浓度的干血片样本：
低浓度干血片样本QC1-1：环孢菌素A浓度为10ng/ml，他克莫司、雷帕霉素、依维莫司浓度均为0.5ng/ml；QC1-2：环孢菌素A浓度为20ng/ml，他克莫司、雷帕霉素、依维莫司浓度均为1ng/ml；QC1-3：环孢菌素A浓度为100ng/ml，他克莫司、雷帕霉素、依维莫司浓度均为5ng/ml。
中浓度干血片样本QC2-1：环孢菌素A浓度为500ng/ml，他克莫司、雷帕霉素、依维莫司浓度均为20ng/ml；QC2-2：环孢菌素A浓度为800ng/ml，他克莫司、雷帕霉素、依维莫司浓度均为25ng/ml；QC2-3：环孢菌素A浓度为1000ng/ml，他克莫司、雷帕霉素、依维莫司浓度均为50ng/ml。
高浓度干血片样本QC3-1：环孢菌素A浓度为1500ng/ml，他克莫司、雷帕霉素、依维莫司浓度均为75ng/ml；QC3-2：环孢菌素A浓度为1800ng/ml，他克莫司、雷帕霉素、依维莫司浓度均为80ng/ml；QC3-3：环孢菌素A浓度为2000ng/ml，他克莫司、雷帕霉素、依维莫司浓度均为100ng/ml。
(4)内标溶液：含有环孢菌素A-d4和雷帕霉素-d3的甲醇溶液，环孢菌素A-d4浓度为10μg/ml，雷帕霉素-d3浓度为400ng/ml。
(5)提取液：80％甲醇水溶液。
(6)复溶液：洗脱液A和洗脱液B的混合液，洗脱液A与洗脱液B的体积比为1：1。
实施例16
试剂盒的使用方法：
(1)标准曲线的制备：
取试剂盒中的标准曲线干血片和质控干血片，分别用滤纸片打孔器打取6mm直径的血斑，分别置于1.5mL离心管中，每管加入300uL提取液和10uL内标溶液，超声提取30min后，15000g离心5min。
取上清液置于另一1.5mL离心管中，经过氮气吹干后，加入50uL复溶液，涡旋1min后15000g离心，取上清液。
将上清液置于自动进样器中供质谱检测，进样5uL，采用串联质谱仪电喷雾正离子模式，色谱柱C18柱，洗脱液为2mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸甲醇溶液和2mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸水溶液，采用梯度洗脱。
质谱条件为：ESI+，去溶剂温度：450℃，毛细管电压：1kV。
记录标准样本峰面积与内标峰面积比值作为标准曲线纵坐标，标准样本浓度为横坐标进行最小二乘法线性拟合，得到标准曲线。质控样本峰面积与内标峰面积比值代入标准曲线计算的实际浓度与理论值比较进行质控。
(2)待测样本检测
收集临床上免疫抑制剂检测样本50例来进行相关性研究，其中环孢菌素A 20例，他克莫司12例，雷帕霉素10例，依维莫司8例。将待测样本点渍whatman903滤纸上干燥，并运用于本发明所述检测方法及试剂盒进行检测。
检测结果中环孢菌素A 20例浓度范围在100～400ng/ml，他克莫司12例浓度范围在5～20ng/ml，雷帕霉素10例浓度范围在5～15ng/ml，依维莫司8例浓度范围在5～15ng/ml，所有样本检测结果均在治疗窗以内，且所有检测结果与临床检测结果偏差均小于15％。
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种干血片中免疫抑制剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将标准曲线干血片和待测干血片分别与提取液、内标溶液混合后提取，离心取上清液I；
(2)将所述上清液I吹干后用复溶液复溶，离心后取上清液II；
(3)将所述上清液II采用串联质谱法进行检测；
(4)根据标准样本和内标物的出峰面积比值以及标准样本浓度，线性回归得到免疫抑制剂的标准曲线方程；
将待测样本和内标物的出峰面积比值代入标准曲线方程，计算得出待测样本中免疫抑制剂含量；
所述的提取液为甲醇和/或乙腈的水溶液；
所述的免疫抑制剂为环孢菌素A、他克莫司、雷帕霉素和依维莫司中的至少一种；
色谱条件为：洗脱液为甲醇和/或乙腈、甲酸铵或乙酸铵-甲酸或乙酸的水溶液、甲酸铵或乙酸铵-甲酸或乙酸的甲醇和/或乙腈溶液中的一种。
2.根据权利要求1所述的干血片中免疫抑制剂的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，标准曲线干血片的制备方法包括：取健康全血与标准品溶液混匀，再用健康全血依次稀释成若干个标准品浓度呈梯度分布的混合液，分别将所述混合液点渍到滤纸上晾干即得；
所述的标准品包括环孢菌素A、他克莫司、雷帕霉素和依维莫司中的至少一种；
所述混合液中环孢菌素A的浓度为10～2000ng/ml；他克莫司、雷帕霉素、依维莫司的浓度均为0.5～100ng/ml。
3.根据权利要求1所述的干血片中免疫抑制剂的检测方法，其特征在于，所述的提取液为甲醇水溶液。
4.根据权利要求1所述的干血片中免疫抑制剂的检测方法，其特征在于，所述的内标溶液中含有环孢菌素A-d4和雷帕霉素-d3。
5.根据权利要求1所述的干血片中免疫抑制剂的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，色谱条件为：所述的洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B，洗脱液A为2mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸水溶液；洗脱液B为2mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸甲醇溶液。
6.根据权利要求5所述的干血片中免疫抑制剂的检测方法，其特征在于，采用梯度洗脱，洗脱参数见表1。
表1：梯度洗脱参数
7.根据权利要求1、5或6任一项所述的干血片中免疫抑制剂的检测方法，其特征在于，色谱条件为：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C182.1mm×50mm，1.7um；柱温55℃，检测时间为3min，进样量为10μl。
8.根据权利要求1所述的干血片中免疫抑制剂的检测方法，其特征在于，质谱条件为：采用多反应监测MRM模式，多反应监测MRM参数见表2。
表2：多反应监测MRM质谱参数
化合物 离子对 锥孔电压(V) 碰撞能量(eV) 环孢菌素A 1219.6→1202.3 61 14 他克莫司 821.2→768.1 48 18 雷帕霉素 931.3→864.1 33 14 依维莫司 975.3→908.1 37 16 环孢菌素A-d4 1223.7→1206.4 15 16 雷帕霉素-d3 934.3→861.1 31 16
9.根据权利要求1或8所述的干血片中免疫抑制剂的检测方法，其特征在于，质谱条件为：正离子模式下，采用ESI离子源，离子源电压为1.0kV，温度为150℃；去溶剂气流速为800L/h，去溶剂温度为450℃，锥孔气流速为150L/h，雾化气压7.0Bar。
10.一种干血片中免疫抑制剂的检测试剂盒，包括：
(1)洗脱液：
洗脱液A：2mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸水溶液；
洗脱液B：2mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸甲醇溶液；
(2)标准曲线干血片：含有环孢菌素A、他克莫司、雷帕霉素和依维莫司中的至少一种；环孢菌素A浓度为10～2000ng/ml，他克莫司、雷帕霉素、依维莫司浓度为0.5～100ng/ml；
(3)内标溶液：含有环孢菌素A-d4和雷帕霉素-d3的甲醇溶液；
(4)提取液：甲醇和/或乙腈的水溶液；
(5)复溶液：洗脱液A和洗脱液B的混合液；
(6)质控品干血片：含有环孢菌素A、他克莫司、雷帕霉素和依维莫司中的至少一种。
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