CN105067548A - 一种快速定量检测病人血液中百草枯浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速定量检测血液中百草枯浓度方法，检测方法由除蛋白试剂I和试剂Ⅱ，溶剂Ⅲ和百草枯标准品Ⅳ组成。本发明还提出了各种试剂的配比，其最优化的除蛋白试剂I乙腈和试剂Ⅱ20%的三氯乙酸与血清的比例按照三者体积比1∶1.3∶6，即600μL的样品血清加100μL的乙腈和130μL的20%三氯乙酸溶液，才能达到最好的除蛋白效果，并且可以离心后直接用于紫外分光光度仪检测，之后根据标准品曲线得出的计算公式，求得样品血清中百草枯的准确浓度。本发明方法能够快速定量地检测患者血液中百草枯的浓度，为百草枯中毒的临床治疗提供最快速和有效的依据。

Description

一种快速定量检测病人血液中百草枯浓度的方法

技术领域

本发明涉及一种农药检测方法，具体涉及一种快速定量检测血液中百草枯浓度的方法。

背景技术

百草枯(1,1.-二甲基-4,4.-二氯二吡啶，PQ)在最近30年随着PQ成为广泛使用的除草剂，它所引起的急慢性中毒案例也为数不少。百草枯引起的中毒毒性强，损伤广泛，而且到目前为止无特效解毒药物，临床上病人的预后差，死亡率高，临床症状和损害程度不成比例，所以快速检测其血中浓度可以给医生很大参考价值。

目前，百草枯浓度的检测主要有高效液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、免疫测定法、毛细管电泳法等。这些方法优点是灵敏度高，但是也有仪器设备贵，普遍性不高，操作复杂，检测周期长和成本高。不适于临床急诊应用。专利CN201010197563.6《用于定性检测百草枯百草枯的试剂和尿液中百草枯的检测方法》，只给出了定性检测的方法，只适合于临床医生判断属于何种农药的中毒，而不能提供准确的含量检测，不能指导临床医生迅速地判断预后和给予及时的治疗措施。CN201110186707.2《一种测定百草枯血药含量的方法》，经过加入内标物水溶液和蛋白沉淀剂乙腈，混合离心后取上清然后进行HPLC检测，测定内标物和百草枯的峰面积后，以最小二乘法线形回归计算出百草枯的血药浓度。方法非常复杂，所采用的仪器设备也要求高，目前医院相关科室配备HPLC的还不多，操作人员素质也要求高。专利CN201010571822.7《一种快速检测血液中百草枯浓度的试剂盒》，主要由除蛋白的试剂I、除核酸和防干扰的试剂II、试剂盒溶剂、百草枯标准品和百草枯校准品组成。该试剂盒能够快速检测患者血液中百草枯的浓度，为百草枯中毒的临床诊断和治疗提供百草枯快速、简便、准确、可靠、有效的依据。但组成试剂比较复杂，该方法包含试剂I为冻干固体粉末，含有以重量份的组分有：三氯醋酸1.8-2.2份或磷钨酸0.89-1.21份、无水醋酸钠0.23-0.27份、氯化钠0.11-0.13份或氯化镁0.09-0.11份；试剂II含有的组分有：9-11％聚乙二醇或异丙醇或无水乙醇或95％乙醇、19-21mmol/L氯化镁或45-55mmol/L氯化锂、0.22-0.26mol/LTris缓冲液，pH为9.5-10.0，涉及的试剂繁杂，在追求精度和准确的基础上，反而没有突出简便的特点。

文献中检测百草枯中毒的方法也比较多，其中以高效液相色谱法（HPLC）最为常用。《中国法学杂志》2007年第22卷第6期第388-389页公开的<高效液相色谱法测定生物体液中百草枯>和《中国法学杂志》2004年第19卷第3期第160-161页公开的<高效液相色谱法测定人血液中的百草枯>，都是使用离子交换固相萃取法对百草枯血浆样本进行预处理，存在样本处理过程复杂且花费时间长的缺点；另外，虽然在流动相中加入了离子对试剂辛烷基磺酸钠来改善百草枯的峰形，但百草枯色谱峰的拖尾形象依然存在；采用外标法，操作误差会影响到检测结果的准确性；百草枯的保留时间为12min左右，超过了10min。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速定量简便测定百草枯血药浓度的方法。

为了实现以上目的，在兼顾灵敏度和准确性的前提下，本发明人经过比对和反复试验，研制出方法简单，稳定可靠，方便快速可定量检测百草枯浓度的方法。以利于在基层医院展开对百草枯浓度的测定工作，方便医生更好地抢救病人生命。

本发明所述方法主要由以下试剂组成：主要由除蛋白试剂I和试剂Ⅱ，溶剂Ⅲ和百草枯标准品Ⅳ组成。

所述试剂I为乙腈，试剂II为20%的三氯醋酸溶液，溶剂Ⅲ为双蒸水和试剂Ⅳ为百草枯标准品。

本发明所述检测方法，包括如下步骤：

1)标准曲线绘制配制500μg/mL的百草枯标准溶液，将其用健康人血清逐级稀释为10、5、2.5、1、0.2、0.08、0.005μg/mL的百草枯溶液，与乙腈和20%三氯乙酸溶液按照三者体积比6∶1∶1.3混匀，以12000r/min离心10min，取100μL上清液，加1900μL蒸馏水稀释，12000r/min离心10min取上清，以蒸馏水为空白对照，采用紫外分光光度法进行测定，在257nm测定吸光度值(y)并对质量浓度(x)进行回归，得线性回归方程y=0.0935x+0.2964，其相关系数为R²=0.9955，如图1所示。

2)样品的检测

①取离心好的样品血清600μL，先加入除蛋白试剂溶剂I100μL，再加入配好的试剂Ⅱ130μL，轻轻混匀；12000r/min离心10min；

②取上清液，以蒸馏水调零，在257nm波长下用紫外分光光度仪（或全自动/半自动生化分析仪、酶标仪等）测定吸光度，代入上述方程y=0.0935x+0.2964，得样品血清中百草枯浓度(μg/mL)。

本发明检测方法评价

对本发明检测方法进行评价，包括重复试验、回收试验、线性考查、特异性和干扰试验等，确定检测方法的精密度、准确度、线性范围、特异性和稳定性等，最后运用该方法对第四军医大学附属西京医院300余例百草枯中毒患者的血清标本进行血药浓度检测，结果显示该方法稳定性好，结果准确性和精密度高。

本发明的优点在于：

本发明在综合分析现有检测方法的基础上，选择紫外分光光度法为合适的候选方法，综合了文献中的方法，在兼顾灵敏性和精确性的前提下，我们采用一步双试剂法（乙腈和三氯乙酸）去除蛋白的方法（其中双试剂的比例尤为此方法的独到之处，我们试验了多种试剂和多种比例，均不能很好地实现对样品的处理和达到测试的理想状况，此比例为我们得到的最优结果），最大程度地实现了实验条件优化和简化，最终确定了快速定量检测血液中百草枯浓度的方法。

附图说明

图1健康人血清百草枯的标准曲线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实验例1PQ血清检测方法的临床应用

病人李某某，女，15岁，某日因和家人发生口角口服除草剂百草枯溶液约20mL，送医院急诊经对症给予洗胃、药物治疗以及血液灌流抢救。分别取患者入院后、第1次血液灌流后1h、第2次血液灌流后1h的血样品按上述方法（各试剂的最优配比即血清∶乙腈∶20%三氯乙酸溶液三者体积比6∶1∶1.3）混匀，12000r/min离心10min，取上清液，以蒸馏水调零，在257nm波长下用紫外分光光度仪测定吸光度，代入方程y=0.0935x+0.2964，得样品血清中百草枯浓度分别为10.22、8.89、3.56μg·mL^-1。

Claims (4)

1.一种快速定量检测血液中百草枯浓度的方法，其特征在于，由除蛋白试剂I和试剂Ⅱ，溶剂Ⅲ和百草枯标准品Ⅳ组成，所述试剂I为乙腈，试剂II为20%三氯醋酸溶液，溶剂Ⅲ为双蒸水。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，除蛋白试剂I乙腈和试剂Ⅱ20%的三氯乙酸与血清的比例按照三者体积比1∶1.3∶6，即600μL的样品血清加100μL的乙腈和130μL的20%三氯乙酸溶液，才能达到最好的除蛋白效果。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，还包括百草枯血清校准品，浓度为2-4μg/mL，以健康人血清为基质配制；当检测系统或检测试剂发生改变时，用百草枯血清校准品来校准仪器。

4.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)标准曲线绘制配制500μg/mL的百草枯标准溶液，将其用健康人血清逐级稀释为10、5、2.5、1、0.2、0.08、0.005μg/mL的百草枯溶液，与乙腈和20%三氯乙酸溶液按照三者体积比6∶1∶1.3混匀，以12000r/min离心10min，取100μL上清液，加1900μL蒸馏水稀释，12000r/min离心10min取上清，以蒸馏水为空白对照，采用紫外分光光度法进行测定，在257nm测定吸光度值(y)并对质量浓度(x)进行回归，得线性回归方程y=0.0935x+0.2964，其相关系数为R²=0.9955；

2)样品的检测

①取离心好的样品血清600μL，先加入除蛋白试剂溶剂I100μL，再加入配好的试剂Ⅱ130μL，轻轻混匀；12000r/min离心10min；

②取上清液，以蒸馏水调零，在257nm波长下用紫外分光光度仪（或全自动/半自动生化分析仪、酶标仪等）测定吸光度，代入上述方程y=0.0935x+0.2964，得样品血清中百草枯浓度(μg/mL)。