CN102053069A - 一种快速检测血液中百草枯浓度的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速检测血液中百草枯浓度的试剂盒，主要由除蛋白的试剂I、除核酸和防干扰的试剂II、试剂盒溶剂、百草枯标准品和百草枯校准品组成。本发明还涉及所述试剂盒的应用方法。本发明的试剂盒能够快速检测患者血液中百草枯的浓度，为百草枯中毒的临床诊断和治疗提供快速、简便、准确、可靠、有效的依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种快速检测血液中百草枯浓度的试剂盒。
背景技术
百草枯(paraquat，PQ)是农业生产中广泛应用的除草剂，其使用简便，除草效果好，价格便宜，深受广大农民喜爱。但如果使用不当就会造成百草枯中毒(paraquat poisoning)。百草枯中毒发病率高，对人体毒性强，损伤广泛，到目前为止无特效解毒药物，因此病人的预后差，死亡率高。
目前，关于百草枯中毒的研究大多集中在致病机制和临床治疗方面。而作为判定中毒程度、观察疗效和进行预后分析最客观、最关键的指标——血浆或血清中百草枯浓度的研究较少，更缺乏用于临床血液样本检测的实用方法和相关试剂盒。实时检测中毒患者血液百草枯浓度可以为百草枯中毒患者的临床诊断、治疗、病情检测和预后分析提供最直接和客观的依据，对于保证患者的生命财产安全、提高医疗质量具有十分重要的意义。
目前，百草枯浓度的检测主要应用于环境卫生、公共卫生和司法鉴定等方面，所用的方法大都是高度灵敏的分析化学方法，如高效液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、免疫测定法、毛细管电泳法等。这些方法不仅仪器昂贵，操作复杂，而且检测成本高，测定时间长。但百草枯中毒病人起病急，进展快，几乎全部来自于农村，绝大多数在县级或地市级医院就诊，上述方法在中小医院检验科不便开展，也不适用于中毒急诊病人，由于仪器、条件等多方面原因这些方法的应用范围明显受限。绝大多数医疗单位也没有开展，甚至关于这方面的研究也非常少。而且，目前还没有用于检测百草枯浓度的试剂盒。
其次，百草枯浓度的检测与血液样品的特殊性有关。用上述方法检测的样品大多为环境样品如水、土壤等，对生物样品中百草枯的检验研究较少。血浆或血清中百草枯浓度很低，在μg/ml水平，普通生化检测方法和检测试剂的灵敏度难以达到检测限。再者，血液样本基质成分复杂，影响因素多，测定时干扰因素多，结果准确性难以把握。虽然国内有学者试图建立简便的紫外测定法，但由于以上因素影响，具体实验条件没能细化，结果可靠性和稳定性较差，没能在临床上推广使用。此外，百草枯中毒组织损伤广泛，临床表现多样，个体差异性大，难以确定毒物浓度与临床表现和治疗效应的确切关系。而且，如果检测步骤多、试剂差异大，条件稳定性差，检测结果的性能就难以保证。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明人经过多年的研究与探索，开发出稳定、可靠、廉价、方便的百草枯浓度检测试剂盒，并对所研发的试剂盒进行系统的检测性能评价和临床诊断性能评价；同时规范测定方法步骤，稳定检测条件，便于室内质量控制和室间质量评价，使该试剂盒及其检测方法便于在基层医院开展和有效推广，为提高百草枯中毒的诊疗工作质量，保护患者的生命财产安全做出贡献。
本发明提供一种快速检测血液中百草枯浓度的试剂盒，该试剂盒主要由除蛋白的试剂I、除核酸和防干扰的试剂II以及试剂盒溶剂组成；
试剂I为冻干固体粉末，含有如下重量份的组分：三氯醋酸1.8-2.2份、无水醋酸钠0.23-0.27份、氯化钠0.11-0.13份；其中，三氯醋酸1.8-2.2份可以用磷钨酸0.89-1.21份替代；氯化钠0.11-0.13份可以用氯化镁0.09-0.11份替代；
试剂II含有如下组分：9-11％聚乙二醇(PEG)、19-21mmol/L氯化镁、0.22-0.26mol/L Tris缓冲液，pH为9.5-10.0；可以用NaOH溶液或KOH溶液调节pH，优选NaOH溶液；其中9-11％PEG可以用异丙醇或无水乙醇或95％乙醇替代，19-21mmol/L氯化镁可以用45-55mmol/L氯化锂替代；
试剂盒溶剂为双蒸水，pH 5.4-5.8。
本发明的试剂盒还可以包括百草枯血清标准品，浓度为10-20μg/ml，以健康人混合血清为基质配制；
本发明的试剂盒还可以包括百草枯血清校准品，浓度为2-4μg/ml，以健康人混合血清为基质配制；当检测系统或检测试剂发生改变时，用百草枯血清校准品来校准仪器，修订实验参数。
本发明还提供所述试剂盒的应用方法，包括如下步骤：
1)向试剂I中加入3-10倍量的试剂盒溶剂，充分震荡，溶解；
2)取血清或血浆95-105μL，先加入试剂盒溶剂213-253μL，轻轻混匀后，加入步骤1)溶解的试剂I 147-187μL，震荡1-2min，混匀，再加入试剂II 480-520μL；
3)涡旋震荡1-3min，11000-13000g离心8-12min；
4)取上清液，以蒸馏水调零，在258nm波长下测定吸光度，按下式计算，得血清或血浆中百草枯浓度(μg/ml)：
百草枯(μg/ml)＝(A测-A基)×15.15-0.12，
其中，A测为血清或血浆的吸光度，A基为健康人混合血清基质的吸光度。
本发明的试剂盒的应用方法中，优选地，步骤1)试剂I溶解后，三氯醋酸的浓度为18-22％(w/v)或磷钨酸的浓度为8.9-12.1％(w/v)、无水醋酸钠的浓度为2.3-2.7％(w/v)、氯化钠的浓度为1.1-1.3％(w/v)或氯化镁的浓度为0.9-1.1％(w/v)。
优选地，步骤2)为取血清或血浆100μL，先加入溶剂233μL，轻轻混匀后，加入步骤1)溶解的试剂I 167μL，震荡1min，混匀，再加入试剂II 500μL。
优选地，步骤3)为涡旋震荡2min，12000g离心10min。
步骤4)还可以用百草枯血清标准品做标准管，与血清或血浆测定管同时在258nm波长下测定吸光度，按下式计算血清或血浆中百草枯浓度百草枯(μg/ml)：
百草枯(μg/ml)＝(A测-A基)/(A标-A基)×C标，
其中，A测为血清或血浆的吸光度，A基为健康人混合血清基质的吸光度，A标为百草枯血清标准品的吸光度，C标为百草枯血清标准品的浓度。
本发明还可以先用百草枯血清标准品制作工作曲线，得到回归方程，根据测定的血清或血浆样品的吸光度，求得血清或血浆中百草枯的浓度。
本发明中所述的血浆能以柠檬酸盐、EDTA、肝素或草酸盐作为抗凝剂。
本发明中所述的血清或血浆在2-8℃能够稳定24小时，4℃能够保存1周，-20。℃能够稳定3-6个月。
本发明人主要通过以下研究，优选得到本发明的试剂盒及其应用方法，这些研究包括试剂的种类和配方、试剂盒的系统检测性能评价和临床应用评价三部分：
(一)试剂的种类和配方
1.百草枯吸光度曲线的分析：根据百草枯的结构特征，选用紫外分光光度法检测。配制2μg/ml的百草枯标准品水溶液，用紫外分光光度计在200-400nm处扫描，寻找最大吸收波长。
2.百草枯水溶液浓度与吸光度的关系：以蒸馏水为基质，绘制百草枯浓度为0.2-10μg/ml的标准曲线，观察其线性关系。
3.百草枯血清溶液浓度与吸光度的关系：健康人混合血清为基质，绘制百草枯浓度为0.2-10μg/ml的标准曲线，观察其线性关系。
4.选择与优化：按照选定的实验条件和步骤(详见实施例)，利用已经获得的健康人血清基质和标准曲线，分别观察不同浓度牛血清白蛋白、血红蛋白、质粒DNA、葡萄糖、胆红素、三油酰甘油酯、肌酐、维生素C、地塞米松、血必净、ATP等对检测结果的影响，探索消除以上干扰的方法和因素，在相关指标的评价可接受的基础上，确定试剂的种类和配方。
(二)试剂盒的系统检测性能评价
1.对试剂盒进行系统的检测性能评价，根据应用试剂盒得到的紫外检测结果，建立评价试验，包括重复试验、回收试验、线性试验、特异性和干扰试验、方法比较试验等，确定检测方法的精密度、准确度、线性范围、特异性和稳定性等，最后确定实验的总误差，从而评价试剂盒的检测性能。
2.分别用本发明的试剂盒(紫外检测法)和高效液相色谱法对129例百草枯中毒患者的血清样本进行血药浓度检测，将检测结果进行比较，作相关性分析。
(三)试剂盒的临床应用评价
1.医学决定水平的确定：结合患者的临床表现、临床诊断、治疗效果和转归等资料，按照试剂盒的检测结果将中毒患者分为染毒、轻度、中度、重度和危重五个级别，分析各个级别的血清百草枯浓度范围，确定各自的医学决定水平值。
2.临床应用评价：以病人的临床症状和CT检查结果为百草枯中毒肺纤维化诊断的金标准，根据本发明的试剂盒对血清或血浆样本的检测结果，对血清百草枯浓度用于诊断肺纤维化的性能进行评价，分别计算其临床灵敏度、特异度、预告值和似然比，最后绘制ROC曲线(接受者操作特性曲线，receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线；也称为感受性曲线，sensitivity curve)，根据以上结果评价本发明试剂盒的临床应用效果。
本发明的优点在于：
本发明在综合分析现有检测方法的基础上，选择紫外分光光度法为合适的候选方法，深入探讨了多种干扰因素及其消除的方法，逐步进行了实验条件选择和方法的优化，最终确定了快速检测血液中百草枯浓度的试剂盒的试剂种类和配方，明确了试剂处理和保存条件，确定了应用方法和说明书。经过系统的检测性能和临床诊断性能评价，证明该试剂盒能够快速、简便、准确、可靠、稳定、有效、廉价地检测血液中百草枯的浓度，可行性强、应用范围广，所需的仪器设备简单、普及范围广，能够为百草枯中毒患者的临床诊断、治疗、病情检测和预后分析提供最直接和客观的依据。
附图说明
图1为百草枯的紫外吸光谱图；
图2为蒸馏水为基质时百草枯的吸收曲线；
图3为健康人混合血清为基质时百草枯的吸收曲线；
图4为健康人空白血清HPLC色谱图；
图5为百草枯和内标的HPLC色谱图；
图6为健康人血清中加入百草枯和内标的HPLC色谱图；
图7为紫外检测结果与高效液相色谱法检测结果的相关性；
图8为试剂盒诊断性能评价的ROC曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实验例1试剂盒及其应用方法
试剂盒的说明书
【适用范围及临床意义】本试剂盒用于人血清、肝素/EDTA抗凝血浆中百草枯含量的体外定量分析。百草枯是常用的除草剂，百草枯中毒在临床上十分常见。血清(浆)百草枯浓度检测能够为中毒患者的临床诊断、治疗、病情检测和预后分析提供最直接和客观的依据。
【测定原理】百草枯分子中含有共轭双键，对258nm的紫外线有稳定的吸收特性。在样本除蛋白、除核酸、对抗还原性物质影响的基础上，用258nm进行检测，其吸光度大小与百草枯含量成正比。测定结果与溶于正常健康人混合血清的百草枯纯品相比较，即可得出待测样本的浓度。
【试剂组成】
本发明的试剂盒主要包括试剂I、试剂II和试剂盒溶剂三个部分，每盒试剂按60人份试剂量配制。还可以根据实际应用，按比例适当增加或减少各组分的重量份，以适用于不同的需求。
试剂I为冻干固体粉末，含有：三氯醋酸2.0g、无水醋酸钠0.25g、氯化钠0.12g；
试剂II含有如下组分：10％PEG，20mmol/L氯化镁，0.24mol/LTris缓冲液，用氢氧化钠溶液调节pH为9.5；试剂II为50ml；
试剂盒溶剂：双蒸水50ml；
此外还有百草枯血清标准品和百草枯血清校准品：用健康人混合血清为基质，分别配制成终浓度为15μg/ml和3μg/ml的应用液。
【样本收集】
样本应为血清或血浆，血浆能以柠檬酸盐、EDTA、肝素、草酸盐作为抗凝剂。血清应尽快分离。分离后的血清或加入抗凝剂的血浆在2-8℃可稳定24小时，4℃可保存1周，-20℃可稳定3-6个月。
【应用方法】
1.试剂I溶解：向试剂I中加入试剂盒溶剂10ml，充分震荡，溶解。
2.取血清或血浆样本100μL，先加入双蒸水233μL，轻轻混匀后，加入试剂I 167μL，震荡混匀1min，再加入试剂II 500μL。
3.涡旋振荡器震荡2min，12000g离心10min。
4.取上清液，用蒸馏水调零，比色杯体积0.1ml，光径1cm，在波长258nm测定吸光度。
【结果计算】
百草枯(μg/ml)＝(A测-A基)×15.15-0.12。
其中，A测为血清或血浆的吸光度，A基为健康人混合血清基质的吸光度。
步骤4)还可以用百草枯血清标准品做标准管，与血清或血浆测定管同时在258nm波长下测定吸光度，按下式计算血清或血浆中百草枯浓度百草枯(μg/ml)：
百草枯(μg/ml)＝(A测-A基)/(A标-A基)×C标，
其中，A测为血清或血浆的吸光度，A基为健康人混合血清基质的吸光度，A标为百草枯血清标准品的吸光度，C标为百草枯血清标准品的浓度。
步骤4)还可以先用百草枯血清标准品制作工作曲线，得到回归方程，根据测定的血清或血浆样品的吸光度，求得血清或血浆中百草枯的浓度。
当检测系统或检测试剂发生改变时，用百草枯血清校准品来校准仪器，修订实验参数。
【注意事项】
1.样品的处理：是试验的关键，应严格按照说明书进行。
2.健康人混合血清基质的百草枯浓度：正常人血清百草枯浓度应为0μg/ml。不同地区，不同人群有差异，由于基质差异的影响，百草枯浓度的测定值小于0.1μg/ml也视为阴性。
3.影响因素：血清葡萄糖浓度(3.89-61.1mmol/L)、总胆红素浓度(3.4-171μmol/L)、尿素(0.2-4.3mmol/L)、肌酐(0.06-1.15mmol/L)在参考区间上限10倍范围内无明显干扰，常用药物地塞米松、B族维生素、青霉素在常规治疗浓度无明显干扰，溶血、脂血、黄疸样本均对测定结果干扰影响较小。
实施例2
【试剂组成】
本发明的试剂盒主要包括试剂I、试剂II和试剂盒溶剂三个部分，每盒试剂按60人份试剂量配制。还可以根据实际应用，按比例适当增加或减少各组分的重量份，以满足不同的需求。
试剂I为冻干固体粉末，含有：三氯醋酸1.8g、无水醋酸钠0.23g、氯化钠0.11g；
试剂II含有如下组分：9％PEG，19mmol/L氯化镁，0.22mol/L Tris缓冲液，用氢氧化钠溶液调节pH为9.8；试剂II为45ml；
试剂盒溶剂：双蒸水45ml；
此外还有百草枯血清标准品和百草枯血清校准品：用健康人混合血清为基质，分别配制成终浓度为10μg/ml和2μg/ml的应用液。
【应用方法】
1.试剂I溶解：向试剂I中加入试剂盒溶剂10ml，充分震荡，溶解。
2.取血清或血浆样本95μL，先加入双蒸水213μL，轻轻混匀后，加入试剂I 187μL，震荡混匀1min，再加入试剂II 505μL。
3.涡旋振荡器震荡1min，11000g离心12min。
4.取上清液，用蒸馏水调零，比色杯体积0.1ml，光径1cm，在波长258nm测定吸光度。
其他事项同实施例1的试剂盒说明书。
实施例3
【试剂组成】
本发明的试剂盒主要包括试剂I、试剂II和试剂盒溶剂三个部分，每盒试剂按60人份试剂量配制。还可以根据实际应用，按比例适当增加或减少各组分的重量份，以满足不同的需求。
试剂I为冻干固体粉末，含：三氯醋酸2.2g、无水醋酸钠0.27g、氯化钠0.13g；
试剂II含有如下组分：11％PEG，21mmol/L氯化镁，0.26mol/LTris缓冲液，pH为10.0；
试剂盒溶剂：双蒸水55ml；
此外还有百草枯血清标准品和百草枯血清校准品：用健康人混合血清为基质，分别配制成终浓度为20μg/ml和4μg/ml的应用液。
【应用方法】
1.试剂I溶解：向试剂I中加入试剂盒溶剂10ml，充分震荡，溶解。
2.取血清或血浆样本105μL，先加入双蒸水253μL，轻轻混匀后，加入试剂I 147μL，震荡混匀2min，再加入试剂II 495μL。
3.涡旋振荡器震荡3min，13000g离心8min。
4.取上清液，用蒸馏水调零，比色杯体积0.1ml，光径1cm，在波长258nm测定吸光度。
其他事项同实施例1的试剂盒说明书。
实施例4
【试剂组成】
本发明的试剂盒主要包括试剂I、试剂II和试剂盒溶剂三个部分，每盒试剂按60人份试剂量配制。还可以根据实际应用，按比例适当增加或减少各组分的重量份，以满足不同的需求。
试剂I为冻干固体粉末，含有：磷钨酸1.0g、无水醋酸钠0.25g、氯化镁0.10g；
试剂II含有如下组分：95％乙醇，50mmol/L氯化锂，0.24mol/LTris缓冲液，pH为9.5；试剂II为50ml；
试剂盒溶剂：双蒸水50ml；
此外还有百草枯血清标准品和百草枯血清校准品：用健康人混合血清为基质，分别配制成终浓度为15μg/ml和3μg/ml的应用液。
其他事项同实施例1的试剂盒说明书。
实施例5
【试剂组成】
本发明的试剂盒包括试剂I、试剂II和试剂盒溶剂三个部分，每盒试剂按60人份试剂量配制。还可以根据实际应用，按比例适当增加或减少各组分的重量份，以满足不同的需求。
试剂I为冻干固体粉末，含有：磷钨酸1.2g、无水醋酸钠0.26g、氯化镁0.09g；
试剂II含有如下组分：异丙醇，50mmol/L氯化锂，0.24mol/L Tris缓冲液，pH为9.5；试剂II为50ml；
试剂盒溶剂：双蒸水50ml。
其他事项同实施例1的试剂盒说明书。
实验例1 试剂种类和配方的筛选
1.溶液的配制：
(1)百草枯标准品水溶液：准确称取10mg百草枯标准品(sigma公司产品)，用双蒸水(ddH2O)配制成100μg/ml的储备液，4℃冰箱避光保存。使用时，用ddH2O稀释。
(2)百草枯标准品血清溶液：以60例不同年龄段健康人的混合血清为基质，配制浓度为20μg/ml的百草枯标准品血清溶液，使用时，用ddH2O稀释。
(3)百草枯校准品血清溶液：以60例不同年龄段健康人的混合血清为基质，配制浓度为10μg/ml的百草枯校准品血清溶液，使用时，用ddH2O稀释。
(4)百草枯对照品水溶液：以乙基紫精二溴化物(1，1′-二乙基-4，4′-联吡啶鎓二溴化物Ethyl Viologen Dibromide)为内标，其化学结构与百草枯(1，1′-二甲基-4，4′-联吡啶阳离子盐)极为相似，但波谱不同。取对照品乙基紫精二溴化物2mg，用双蒸水(ddH2O)配制成100μg/ml的储备液，4℃冰箱避光保存。使用时，用ddH2O稀释。
2.百草枯吸光度曲线和最佳检测波长：
取2μg/ml百草枯标准品水溶液，在200～400nm之间扫描，当波长为258nm时，其吸光度值最高，而且稳定性最好，不同波长的紫外吸光谱图见图1。
3.用蒸馏水为基质，测定百草枯标准品浓度在0.2-10μg/ml时的吸光度，见表1，数据采用SPSS12.0统计软件进行直线回归分析，直线回归方程为Y＝0.067X-0.002，R＝1(P＜0.05)，标准曲线见图2。
4.用健康人混合血清为基质，测定百草枯标准品浓度在0.2-10μg/ml时的吸光度，见表1，数据采用SPSS12.0统计软件进行直线回归分析，直线回归方程为Y＝0.066X+0.008，R＝0.9999(P＜0.05)，标准曲线见图3。
表1 百草枯浓度范围在0.2μg/ml-10μg/ml的吸光度值
5.干扰因素的考察：利用已经获得的健康人血清基质和标准曲线，分别观察不同浓度牛血清白蛋白、血红蛋白、质粒DNA、葡萄糖、胆红素、三油酰甘油酯、肌酐、维生素C、地塞米松等对检测结果的影响，从而确定消除以上干扰的方法和试剂。
结果：经实验研究发现，在各干扰因素中，蛋白质、核酸、芳香族氨基酸、维生素C、地塞米松等对血清百草枯测定有明显干扰。干扰因素的实验结果见表2。
表2 干扰因素的干扰率
结果表明：脂血(TC、TG)、溶血、黄疸对百草枯检测有干扰，但干扰影响较小，干扰率均小于3％，可以不予考虑。地塞米松常规治疗剂量(5-20μg/ml)的干扰率不超过4％，但高剂量(25-100μg/ml)会出现正干扰，干扰率在4.8％以上；核酸、蛋白、维生素C对本实验干扰明显。
另外，血清葡萄糖(3.89-61.1mmol/L)、总胆红素(3.4-171μmol/L)、尿素(0.2-4.3mmol/L)、肌酐(0.06-1.15mmol/L)在各参考区间上限10倍范围内无明显干扰；常用药物B族维生素、青霉素在各自的药品说明书给出的常规治疗浓度均无明显干扰。
针对这些干扰因素，本发明人通过筛选研究发现，采用适当浓度的除蛋白试剂，包括三氯乙酸、磷钨酸镁、异丙醇和苦味酸等对血液样品进行处理，可有效消除有机大分子的干扰；采用氢氧化钠或氢氧化钾溶液通过调节pH值可消除维生素C干扰，在试剂盒中通过Tris碱缓冲液来稳定pH以达到该目的。
6.除蛋白试剂的选择与配制：选用三氯醋酸、磷钨酸镁、异丙醇和苦味酸(均为国产优级纯)等去蛋白试剂，探讨不同浓度、不同条件溶解时的去蛋白效果，最后确定用其浓度和比例。
(1)用健康人混合血清为基质，分别按照20％(w/v)AcCl3占稀释后血清溶液总体积的1/4、1/5、1/6、1/7进行实验，每个AcCl3浓度5管，加入100μg/ml的百草枯标准品血清溶液，使百草枯浓度分别为0、1、2、4、6μg/ml。
20％三氯乙酸占稀释后血清溶液总体积的1/5的具体用量见表3：
表3 三氯乙酸占稀释后血清溶液总体积的1/5
(2)参考表3，按上述方法分别处理20％三氯乙酸占稀释后血清溶液总量的1/4、1/6、1/7的样本。
(3)用ddH2O调零，以258nm为入射波长，对上述样本进行检测。以吸光度值为X轴，以百草枯浓度为Y轴绘制标准曲线，观察不同浓度AcCl3各自的线性，以及除蛋白效果，见表4。
表4 不同量的三氯乙酸除蛋白所得的结果
(4)同样方法观察异丙醇、苦味酸和磷钨酸镁的除蛋白效果。
结果：当一个总量为1ml的测定管中加入20％三氯乙酸的量与稀释后血清溶液总体积的比例为1∶5时，即20％三氯乙酸的加入量为167μl时，线性好。这说明此时除蛋白效果最好。
同样方法实验发现，磷钨酸镁、异丙醇和苦味酸也有类似的除蛋白效果，相关系数依次为0.9872、0.9748和0.9581。上述除蛋白试剂中，三氯醋酸的相关系数最高，因此本发明试剂盒中除蛋白试剂优选三氯乙酸，应用时，其终浓度范围为3.1％-3.7％(w/v)。
7.除核酸试剂的选择与配制：选用聚乙二醇、无水乙醇、三氯甲烷等不同的核酸沉淀剂，探讨不同浓度、不同条件溶解时的去核酸效果，最后确定用其浓度和比例。
(1)用健康人混合血清为基质(该血清为采用上述除蛋白方法去除蛋白的血清)，分别按照10％(w/v)PEG-MgCl2(重量比为7∶1)占稀释后血清溶液总体积的1/3、1/2、2/3进行实验，加入100μg/ml的百草枯标准品血清溶液，使百草枯浓度分别为0、2、4、6、8μg/ml。
10％ PEG-MgCl2占稀释后血清溶液总体积的1/2的具体用量见表5：
表5 PEG-MgCl2占稀释后血清溶液总体积的1/2
(2)参考表5，按上述方法分别处理10％PEG-MgCl2占稀释后血清溶液总量的1/3、2/3的样本。
(3)用ddH2O调零，用258nm为入射波长，对上述样本进行检测。以吸光度值为X轴，以百草枯浓度为Y轴绘制标准曲线，观察不同浓度PEG-MgCl2各自的线性，以及除核酸效果，见表6。
表6 不同量的PEG-MgCl2除核酸所得的结果
结果：当一个总量为1ml的测定管中加入10％PEG-MgCl2的量与稀释后血清溶液总体积的比例为1∶2时，即10％PEG-MgCl2的加入量为500μl时，线性好。这说明此时除核酸效果最好。
因此，本发明试剂盒中除核酸试剂优选10％PEG-MgCl2，应用时，其浓度范围为9％-11(w/v)％。
8.最佳检测波长的验证：
分别测定百草枯水溶液、百草枯去蛋白血清溶液、百草枯去蛋白去核酸血清溶液的吸光度曲线，结果表明，三氯醋酸和聚乙二醇会改变百草枯的吸光度大小，但对最大吸收峰没有影响。百草枯的最大吸收波长为258nm，此时两种物质的影响也最小。故选用该波长为检测波长。
9.溶液pH的确定：用0.5mol/L的NaOH调节除蛋白项下和除核酸项下所选择的方案所得溶液的pH值，以0.5为单位，调节范围为pH 3-12，用ddH2O调零，用258nm下检测。观察不同pH时各自的吸光度变化，根据pH变化对试剂作用和稳定性的影响，确定最佳pH为9.5-10.0。
10.健康人混合血清基质吸光度值的确定：随机选择60例健康人血清，按上述方法去蛋白、去核酸，调节到最适pH，用258nm为入射波长，以ddH2O调零，测定其吸光度，求均值及标准差，观察其变异情况，为百草枯中毒样本提供一个稳定的基质。
结果：测定的吸光度A的平均值为1.021，相对标准差为0.047，变异系数4.6％，变异系数小于5％，在可接受范围内。因此按上述方法可以将基质的吸光度值(A基)确定为1.021。
不同地区，不同人群有差异，因此应用本发明的试剂盒时，可以选用1.021作为A基的测定值，还可以按照上述方法测定当地健康人群的混合血清基质的吸光度，确定A基的值。
实验例2 试剂盒的系统检测性能评价
1.精密度实验结果
采用本发明的试剂盒对百草枯标准品水溶液进行检测(258nm)，日内和日间精密度实验结果见表7。
表7 精密度实验结果(n＝5)
结果表明：日内变异系数范围是2.1％-3.7％，日间变异系数范围是2.4％-5.0％。均在可接受范围之内(RSD＜10％)，这说明此方法精密度良好。
2.回收率实验结果
回收率实验结果见表8，结果表明回收率范围在95.3％-103.3％之间，在可接受范围95％-105％之内，这说明此方法的准确性良好。
表8 回收实验结果(n＝5)
3.稳定性实验结果
(1)试剂的冻干与复溶实验：取浓度分别为0.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的百草枯标准品血清样本，每个浓度的样本4份，放置-20℃冰箱中，于0天、1天、4天、7天、10天后，测定样本的吸光度值，根据标准曲线法计算百草枯浓度，观察反复冻融放置后稳定性变化。结果表明，经反复冻融后，百草枯标准品血清样本稳定。
(2)样本在室温和冻存状态下稳定性结果见表9，结果表明百草枯样品稳定性良好。
表9 稳定性试验结果(n＝5)
4.高效液相色谱法对百草枯浓度的检测
(1)配制百草枯标准品和百草枯对照品的储备液，浓度均为100μg/ml；
(2)用蒸馏水将百草枯标准品储备液稀释至浓度为0.5、1、2.5、5、10、25、50μg/ml的百草枯系列工作液；
(3)用蒸馏水将百草枯对照品储备液稀释至60μg/ml的内标工作液；
(4)180μl健康人混合血清中加入20μl百草枯工作液，充分混匀，制备成百草枯血清样品；
(5)百草枯血清样品中加入15μl内标工作液和45μl体积分数为6％的高氯酸甲醇，混匀，置-20℃冰箱中10分钟，13000r/m离心5min，取上清液20μl进行HPLC分析；
(6)精密配制百草枯标准品浓度0.1-10μg/ml范围内的7个不同浓度的血清样品，按(5)中的方法进行处理后，测其峰面积，由百草枯和内标峰面积之比(y)对百草枯质量浓度(x)进行线性回归，得到百草枯样品的线性回归方程；
(7)根据所测样品的峰面积和上述的回归方程计算血清样品中百草枯的浓度。
5.紫外法和高效法相关性比较结果
采用实施例1的试剂盒检测129例中毒患者血清百草枯浓度，随机选取其中的50例同时采用高效液相色谱法进行检测，做比较试验。结果见表10。
表10 50名百草枯中毒患者进行紫外分光光度法与高校液相色谱法检测结果
| 编号 | 高效液相法(μg/ml) | 紫外法(μg/ml) |
| 1 | 3.253 | 3.665 |
| 2 | 0.313 | 0.354 |
| 3 | 0.207 | 0.235 |
| 4 | 0.491 | 0.555 |
| 5 | 0.813 | 0.918 |
| 6 | 0.512 | 0.584 |
| 7 | 2.863 | 3.225 |
| 8 | 0.019 | 0.023 |
| 9 | 2.329 | 2.624 |
| 10 | 0.566 | 0.639 |
| 11 | 1.325 | 1.494 |
| 12 | 0.163 | 0.185 |
| 13 | 2.607 | 2.937 |
| 14 | 0.723 | 0.814 |
| 15 | 0.985 | 1.111 |
| 16 | 3.733 | 4.205 |
| 17 | 0.528 | 0.596 |
| 18 | 0.134 | 0.153 |
| 19 | 0.542 | 0.617 |
| 20 | 0.422 | 0.477 |
| 21 | 1.713 | 1.931 |
| 22 | 0.521 | 0.589 |
| 23 | 2.812 | 3.169 |
| 24 | 0.436 | 0.492 |
| 25 | 0.519 | 0.574 |
| 26 | 0.527 | 0.586 |
| 27 | 0.234 | 0.265 |
| 28 | 3.997 | 4.463 |
| 29 | 0.532 | 0.596 |
| 30 | 0.489 | 0.552 |
| 31 | 0.513 | 0.574 |
| 32 | 0.518 | 0.585 |
| 33 | 0.423 | 0.478 |
| 34 | 2.962 | 3.215 |
| 35 | 2.034 | 2.771 |
| 36 | 9.586 | 11.029 |
| 37 | 5.754 | 5.983 |
| 38 | 0.536 | 0.606 |
| 39 | 2.307 | 2.599 |
| 40 | 0.349 | 0.392 |
| 41 | 5.192 | 5.701 |
| 42 | 0.279 | 0.309 |
| 43 | 0.272 | 0.303 |
| 44 | 6.126 | 6.459 |
| 45 | 1.263 | 1.424 |
| 46 | 1.936 | 2.182 |
| 47 | 1.327 | 1.432 |
| 48 | 1.116 | 1.258 |
| 49 | 0.781 | 0.823 |
| 50 | 0.938 | 1.053 |
高效液相色谱法对血清中百草枯浓度的检测色谱图见图4、图5、图6；紫外法和高效法相关性分析结果见图7，统计学计算直线回归方程为：Y＝1.776X-0.003，R＝0.9999，然后对相关系数R进行t检验，P＜0.05，直线回归方程成立，两者相关性好，说明本发明的试剂盒能够用于检测血液中百草枯浓度，其结果准确、可靠。
实验例3 试剂盒的临床应用评价
根据以上实验结果确定本发明的检测试剂盒的最佳组成和配比以及操作步骤，即实施例1的试剂盒。用该试剂盒检测129例中毒患者血清百草枯浓度，结合患者的临床资料，根据本发明的试剂盒所检测的中毒12-24h之间的血清百草枯浓度值，可将中毒患者分为染毒I(＜0.5μg/ml)、轻度中毒II(0.5-2.0μg/ml)、中度中毒III(2.0-3.0μg/ml)、重度中毒IV(3.0-5.0μg/ml)和危重V(＞5.0μg/ml)五个级别。
本发明的试剂盒对129例患者血清百草枯浓度的检测结果及临床应用指标评价如下：
表11 129例百草枯中毒的患者检测结果
如表11所示，百草枯中毒患者随着血清中百草枯浓度的升高，肺纤维化的发生率越来越高。
表12 本发明的检测结果在4个临界值时的分类评价指标
如表12所示，本组病人中有55例没有发生肺纤维化，有74例出现不同程度的肺纤维化。用≥0.5(μg/ml)作为判定临界值时，其临床灵敏度达98.6％(73/74)，但其临床特异度较低，仅为49.1％(44/55)。而用≥5.0(μg/ml)作为判定临界值时，其临床灵敏度降为59.5％(44/74)，但其临床特异度很高，可达100(55/55)。但是，当选用2.0g/ml或3.0μg/ml作为判定值时，其灵敏度和特异度均较好，因此，前者可用于预警，后者可用于初步诊断。
由此可见，采用本发明的试剂盒检测百草枯中毒患者血清中百草枯浓度，根据检测结果可以预测肺纤维化发生，其临床灵敏度高，特异度好。
根据表12绘制ROC曲线，见图8。由图8可知，受试患者的ROC工作曲线下的面积可达95％，AUC 95％的置信区间为：AUC±1.96×SE＝0.9636±1.96×0.0147＝[0.9348，0.9924]，该区间大于0.9，表明采用本发明的试剂盒对百草枯中毒肺纤维化诊断的价值较高。
由以上结果可以看出，血清中百草枯的浓度直接影响着患者的预后。一般来说，血清中百草枯的浓度超过3.0μg/ml时，患者症状很严重，脏器出现明显损伤，预后很差，有大部分会死于呼吸衰竭；当血清中百草枯的浓度在1.0-2.0μg/ml时，患者有明显症状，但是死亡的几率较低；当体内百草枯的浓度在1.0μg/ml以下时，患者除了有口腔灼伤外，其他症状不太明显，预后较好。
通过上述回收实验、干扰实验、方法比较试验、稳定性试验等对试剂盒的检测性能进行系统评价的结果，以及临床病例检测分析、ROC曲线的应用性能评价，并经高效液相色谱验证，说明本发明的试剂盒检测血清百草枯浓度结果准确、可靠，该试剂盒具有科学性、稳定性和实用性。
本发明的试剂盒适用于对百草枯中毒患者的快速检测，为百草枯中毒患者尤其是急诊患者争取黄金治疗时间；本发明的试剂盒便于在医疗单位开展，尤其是中小医院的检验科或液相、气相、电泳等昂贵仪器设备应用受限的地区。
Claims (10)
1.一种快速检测血液中百草枯浓度的试剂盒，其特征在于，主要由除蛋白的试剂I、除核酸和防干扰的试剂II以及试剂盒溶剂组成；
所述试剂I为冻干固体粉末，含有如下重量份的组分：三氯醋酸1.8-2.2份或磷钨酸0.89-1.21份、无水醋酸钠0.23-0.27份、氯化钠0.11-0.13份或氯化镁0.09-0.11份；
所述试剂II含有如下组分：9-11％聚乙二醇或异丙醇或无水乙醇或95％乙醇、19-21mmol/L氯化镁或45-55mmol/L氯化锂、0.22-0.26mol/L Tris缓冲液，pH为9.5-10.0；
所述试剂盒溶剂为双蒸水，pH 5.4-5.8。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括百草枯血清标准品，浓度为10-20μg/ml，以健康人混合血清为基质配制。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，还包括百草枯血清校准品，浓度为2-4μg/ml，以健康人混合血清为基质配制；当检测系统或检测试剂发生改变时，用百草枯血清校准品来校准仪器。
4.权利要求1-3任一项所述的试剂盒的应用方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)向所述试剂I中加入3-10倍量的试剂盒溶剂，充分震荡，溶解；
2)取血清或血浆95-105μL，先加入试剂盒溶剂213-253μL，轻轻混匀后，加入步骤1)溶解的试剂I 147-187μL，震荡1-2min，混匀，再加入试剂II 450-550μL；
3)涡旋震荡1-3min，11000-13000g离心8-12min；
4)取上清液，以蒸馏水调零，在258nm波长下测定吸光度，按下式计算，得血清或血浆中百草枯浓度百草枯(μg/ml)：
百草枯(μg/ml)＝(A测-A基)×15.15-0.12，
其中，A测为血清或血浆的吸光度，A基为健康人混合血清基质的吸光度。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)试剂I溶解后，三氯醋酸的浓度为18-22％(w/v)或磷钨酸的浓度为8.9-12.1％(w/v)、无水醋酸钠的浓度为2.3-2.7％(w/v)、氯化钠的浓度为1.1-1.3％(w/v)或氯化镁的浓度为0.9-1.1％(w/v)。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)为取血清或血浆100μL，先加入溶剂233μL，轻轻混匀，加入试剂I 167μL，震荡1min，混匀，加入试剂II 500μL。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)为涡旋震荡2min，12000g离心10min。
8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，步骤4)用百草枯血清标准品做标准管，与血清或血浆测定管同时在258nm波长下测定吸光度，按下式计算血清或血浆中百草枯浓度(μg/ml)：
百草枯(μg/ml)＝(A测-A基)/(A标-A基)×C标，
其中，A测为血清或血浆的吸光度，A基为健康人混合血清基质的吸光度，A标为百草枯血清标准品的吸光度，C标为百草枯血清标准品的浓度。
9.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，所述血浆能以柠檬酸盐、EDTA、肝素或草酸盐作为抗凝剂。
10.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，所述血清或血浆在2-8℃能够稳定24小时，4℃能够保存1周，-20℃能够稳定3-6个月。
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