CN115290806B - 一种亲水作用和阳离子交换的固相萃取生物胺的方法 - Google Patents
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Abstract
一种亲水作用和阳离子交换的固相萃取生物胺的方法，包括用聚乙烯二醇修饰埃洛石，用所述聚乙烯二醇修饰埃洛石装填亲水性和阳离子交换混合模式固相萃取柱，对鱼肉的生物胺提取物进行净化和富集，净化液经苯甲酰氯衍生化之后，形成的生物胺衍生物具有紫外吸收，以及进行液相色谱分离和紫外检测器检测。采用上述方法对鱼肉中生物胺进行分析检测。采用亲水性和阳离子交换混合模式吸附剂解决了传统分析方法中极性生物胺在疏水性吸附剂上保留弱和检测灵敏度低的问题，增加了吸附剂对极性生物胺的吸附容量，以此为基础建立的固相萃取方法具有检测灵敏度高，重现性好的优点。为鱼类产品的食品安全检测提供科学实用的方法。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，涉及食品中生物胺的检测方法。
背景技术
生物胺是指一类含氮的脂肪族，如1，4-丁二胺和精胺、芳香族（如苯乙胺）或杂环类（如组胺）低分子量有机碱，呈极性。组胺是生物胺中毒性最大的，过量的组胺会导致头疼、消化障碍及血压异常，甚至会引起神经性毒性。1，4-丁二胺的自身毒性较小，但是能抑制组胺相关代谢酶的活性，而增加组胺的数量，从而增强人体的不适症状。另外，1，4-丁二胺和精胺能够与亚硝酸盐反应产生致癌物质亚硝基胺。除了如上所述对人体的危害之外，生物胺还被视为食品质量的化学指标，包括食品新鲜程度和储存期间的卫生状况的标志，以及食品加工和储存条件不当的指标。因此，日常监测食物中生物胺的水平非常重要，尤其是在容易腐败的鱼类中。
鱼类生物胺典型的分析方法是：首先采用酸化的水溶液或者有机溶剂提取，随后用固相萃取技术净化，再用液相色谱-紫外检测器或液相色谱-质谱联用测定。其中，质谱作为检测器，价格昂贵，使用成本高。由于鱼类产品提取物组成复杂，而且生物胺的含量低，需要对其进行净化和富集，因此，固相萃取技术是该分析方法的关键。目前，生物胺和固相萃取吸附剂的作用机理主要基于疏水作用或者疏水作用/阳离子交换混合模式。吸附剂包括C18（Food Chem. 2015, 175, 143–50；J. Anal. Methods Chem. 2016, 2016, 8715287）和 Oasis MCX（Food Chem. 2018, 266, 275–83）等。由于极性生物胺在C18吸附剂上的保留较差，目前报道的方法对痕量生物胺的检测灵敏度仍然有限。例如，以液相色谱-紫外检测器作为分离和检测手段，最低检测限约在0.1 mg kg-1（Food Addit. Contam. Part A2015, 32(7), 1156–63）。虽然，在疏水作用模式基础上，增加阳离子交换机理可以降低最低检测限至0.09 mg kg-1（Food Addit. Contam. Part A 2017, 34(7), 1172–83），但是效果不明显。
发明内容
本发明的目的是克服传统的生物胺检测方法中存在极性生物胺在疏水性吸附剂上保留弱和检测灵敏度低的缺陷，提供一种基于亲水作用/阳离子交换混合模式的鱼肉中生物胺的检测方法，以提高对极性生物胺的吸附容量，降低检测限，提高方法的检测灵敏度，具体是以聚乙烯二醇修饰的埃洛石为固相萃取的吸附剂，对鱼肉的生物胺提取物进行净化和富集，净化液经苯甲酰氯衍生化之后，与液相色谱-紫外检测器联用检测鱼肉中生物胺含量的方法。
本发明采用以下技术方案实现上述目的：
一种亲水作用和阳离子交换的固相萃取生物胺的方法，其特征包括以下步骤：
A、聚乙烯二醇修饰埃洛石的方法如下：将5~25 g经六偏磷酸钠纯化的埃洛石加入到含有1~5 mL聚（乙烯二醇）4-壬苯基-3-硫代丙基醚钾盐的100 mL水中，在25~40 °C下，500~1200 rpm转速搅拌后，用水洗涤数次，离心后，60~105 °C干燥5~10 h，得到聚乙烯二醇修饰的埃洛石；
B、称取50~300 mg聚乙烯二醇修饰的埃洛石，转移到装有5 μm下筛板和20 μm上筛板的3~10 mL柱管中压实；
C、将已装好聚乙烯二醇修饰的埃洛石的固相萃取柱，分别以5 mL甲醇和5 mL水活化，98%乙腈水溶液平衡柱子；1~100 mL生物胺的混合溶液以0.5~2 mL min-1的流速通过固相萃取柱完成上样；随后，用4~10 mL含有60%乙腈的2.4 mol L-1氨水溶液洗脱；
D、取1 mL洗脱溶液，采用苯甲酰氯衍生化，使生物胺的胺基与酰氯基团反应生成酰胺基，衍生化后的生物胺具有紫外吸收作用；
E、取经衍生化后的生物胺混合液10~20 μL注入液相色谱仪进行分离，紫外检测器检测。
所述的六偏磷酸钠纯化埃洛石的处理步骤如下：取10~50 g埃洛石，加入到100~500 mL含有六偏磷酸钠质量浓度为0.05%~0.25%的水溶液中，搅拌30~60 min后，静止20min，弃去沉淀部分，分散的埃洛石经过数次水洗，离心后，60~105 °C干燥5~10 h，得到六偏磷酸钠纯化的埃洛石。
所述的生物胺的混合溶液为组胺、1，4-丁二胺、苯乙胺和精胺的标准品混合溶液，溶于80%~98%乙腈中，浓度范围分别为组胺31.3~1000 μg L -1、1，4-丁二胺6.3~200 μg L-1、苯乙胺1.6~200 μg L -1和精胺3.1~200 μg L-1（参照表1的加标浓度为换算数据），该生物胺的混合溶液用于固相萃取条件的优化。
所述的生物胺的混合溶液也可为鱼类样品的提取溶液，用于鱼类样品中生物胺的测定。
所述的苯甲酰氯衍生化步骤如下：取1 mL洗脱溶液于5 mL塑料离心管中，加入1mL 2 mol L-1 NaOH溶液和60 μL苯甲酰氯，振荡30 s混合后，放入30 °C水浴反应40 min；反应完成后，加入1 g NaCl，振荡30 s，加入1 mL乙酸乙酯，混合后，3000 r min-1离心10 min，取上层有机相转入5 mL带刻度的玻璃离心管中，40 °C氮气吹干；采用0.5~1 mL甲醇重溶，过滤后，取10~20 μL注入液相色谱仪进行分离，采用紫外检测器检测。
所述的液相色谱分离和紫外检测器检测步骤如下：色谱柱为安捷伦Poroshell120 EC-C18柱，4.6 mm×150 mm，4 μm；紫外检测波长230~254 nm；进样量10~20 μL；流速0.8~1 mL min-1；流动相为甲醇和水，梯度洗脱如下：0.0~20.0 min，5%~75%甲醇；20.0~25.0min，75%甲醇；25.1~30.0 min，100%甲醇。
所述的鱼类样品的生物胺提取液，选择不同品种样品鱼，去除鱼皮、鱼骨和内脏的鱼肉，经匀浆之后，取10~20 g加入到100 mL容量瓶中，加入50~80 mL乙腈，振荡混匀之后超声提取30~60 min，冷却后加入2 mL水，随后，用乙腈定容至刻度，超声提取30~60 min后，4500~8000 r min-1离心10~20 min，过滤后待用。
所述的色谱柱，可以是与安捷伦Poroshell 120 EC-C18柱性能相当者。
本发明的优点和积极效果是：
1、首次将聚乙烯二醇修饰的埃洛石作为固相萃取的吸附剂，具有独创性。在国内外的期刊专刊中，均未报道聚乙烯二醇修饰的埃洛石作为固相萃取的吸附剂的案例，并且该方案应用到鱼类样品中生物胺的样品前处理，也属于首例。
2、本发明采用的聚乙烯二醇修饰的埃洛石与极性生物胺的作用机理主要是亲水作用和阳离子交换混合模式。埃洛石外表面存在硅氧基团，而铝羟基主要位于管内部和管端位置，因此，埃洛石外表面带负电荷，内表面带正电荷。本发明利用带负电的聚（乙烯二醇）4-壬苯基-3-硫代丙基醚钾盐通过静电作用被吸入埃洛石官腔内部，制备聚乙烯二醇修饰的埃洛石。聚乙烯二醇的引入不仅增加了埃洛石的亲水性，而且中和了内表面的正电荷。因此，聚乙烯二醇修饰的埃洛石的内表面具有亲水性基团，外表面带有负电荷，即体现出亲水性和阳离子交换性。与目前报道的基于疏水作用或者疏水作用/阳离子交换混合模式的生物胺分析方法相比，解决了极性生物胺在疏水性吸附剂上保留弱的难题，增加了吸附剂对极性生物胺的吸附容量，显著降低了检测限至0.004 mg kg-1。
3、本发明建立的一种亲水作用和阳离子交换的固相萃取生物胺的方法，与传统的生物胺检测方法相比，极大地增加了对极性生物胺的吸附容量，使上样体积高达100 mL，显著地降低了方法的检测限，提高了方法的检测灵敏度，该方法具有回收率高、重现性好和灵敏度高的优点。
附图说明
图1为（a）埃洛石和（b）聚乙烯二醇修饰的埃洛石的扫描电镜图（10,000×）。
图2为六偏磷酸钠处理的埃洛石和聚乙烯二醇修饰的埃洛石的TGA曲线。
图3为（A）埃洛石和聚乙烯二醇修饰的埃洛石的红外光谱图和（B）局部放大图。
图4为四个生物胺在聚乙烯二醇修饰的埃洛石上的吸附等温线。
图5为不同上样乙腈浓度对吸附率的影响。
图6为洗脱溶液中不同乙腈浓度对回收率的影响。
图7为洗脱溶液中不同甲酸铵浓度对回收率的影响。
图8为洗脱液中不同pH值对回收率的影响。
图9为不同洗脱体积对回收率的影响。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明。
埃洛石（Halloysite）是一种无机天然硅铝酸盐类矿物，是高岭石的变种。具有中空管状结构，管长一般在100～1500 nm，管径约15～50 nm。其通用分子式为：Al2Si2O5(OH)·nH2O，其中n=0或者2，当n=0时，表示此时的埃洛石层间不含结晶水；当n=2时，表示此时的埃洛石层间含有结晶水。埃洛石具有典型的晶体结构，管层内部为铝氧八面体，外层为硅氧四面体，二者交错排列。基于埃洛石的结构性质，埃洛石具有良好的结构稳定性、基于其无定型硅铝结构，使得其具有优异的热稳定性、良好的耐酸碱性、大比表面积及纳米尺寸效应。
按照以下步骤建立一种亲水作用和阳离子交换的固相萃取生物胺的方法。
（1）鱼类样品的制备
鱼样品去除鱼皮、鱼骨和内脏的鱼肉，经匀浆之后，取10~20 g加入到100 mL容量瓶中，加入50~80 mL乙腈，振荡混匀之后超声提取30~60 min，冷却后加入2 mL水，随后，用乙腈定容至刻度，超声提取30~60 min后，4500~8000 r min-1离心10~20 min，过滤后待用。
（2）六偏磷酸钠处理埃洛石的制备
取10~50 g埃洛石，加入到100~500 mL含有六偏磷酸钠质量浓度为0.05%~0.25%的水溶液中，搅拌30~60 min后，静止20 min，弃去沉淀部分，分散的埃洛石经过数次水洗，离心后，60~105 °C干燥5~10 h，得到六偏磷酸钠纯化的埃洛石。
（3）聚乙烯二醇修饰的埃洛石的制备
将5~25 g经步骤（2）制备的六偏磷酸钠纯化的埃洛石加入到含有1~5 mL聚（乙烯二醇）4-壬苯基-3-硫代丙基醚钾盐的100 mL水中，在25~40 °C下，500~1200 rpm转速搅拌后，用水洗涤数次，离心后，60~105 °C干燥5~10 h，得到聚乙烯二醇修饰的埃洛石。
图1分别为埃洛石和聚乙烯二醇修饰的埃洛石的扫描电镜图。如图1所示，杂乱分布的纤维状埃洛石团聚成块状，而埃洛石经过聚乙烯二醇修饰后，原埃洛石的管状结构得以保留，但纤维管的排列更加清晰有序。为了说明聚乙烯二醇的修饰效率，我们采用TGA对六偏磷酸钠处理的埃洛石和聚乙烯二醇修饰的埃洛石进行了分析。如图2所示，聚乙烯二醇修饰的埃洛石在30至800 °C范围内的质量损失率为16.00%，但经六偏磷酸钠处理的埃洛石的质量损失率仅为11.94%，即聚乙烯二醇对埃洛石的改性率为4.06%。
同时，我们采用zeta电位仪对埃洛石和聚乙烯二醇修饰的埃洛石的表面电荷进行了测定。结果所示，埃洛石表面带负电，zeta电位为−14.16 mV，聚乙烯二醇修饰的埃洛石的zeta电位−25.11 mV。从zeta电位值可以清楚地证明，埃洛石的净负电荷通过聚（乙烯二醇）4-壬苯基-3-硫代丙基醚钾盐的吸附而升高，说明其中和了内表面正电荷，即其成功地被吸附在埃洛石内表面。
图3分别为埃洛石和聚乙烯二醇修饰的埃洛石的红外光谱图。3694和3620 cm-1处是羟基的伸缩振动。吸收峰1629 cm-1归属于吸附水的羟基弯曲振动。吸收峰1092和1031cm-1分别归属于Si-O振动和Si-O- Si振动。910、540和471 cm-1处的谱带分别归因于与铝相连的羟基的振动、Al-O-Si的弯曲变形振动和Si-O-Si的弯曲变形振动。经聚乙烯二醇修饰后的埃洛石，在2920和2851 cm-1处观察到新的谱带，这是由C-H伸缩振动引起的。与埃洛石相比，除了增加了2920和2851 cm-1处的峰，聚乙烯二醇修饰的埃洛石其余特征峰变化不大，这表明埃洛石的结构没有发生变化，聚乙烯二醇改性发生在埃洛石表面。
此外，我们考查了聚乙烯二醇修饰的埃洛石对1，4-丁二胺、精胺、苯乙胺和组胺的吸附容量。如图4所示，1，4-丁二胺、精胺、苯乙胺和组胺的最大吸附容量分别为9.3、8.5、5.7和5.6 mg g-1。从结果可以看出，聚乙烯二醇修饰的埃洛石对极性生物胺的吸附容量大，适合于极性分子的样品前处理。此外，含有两个胺基的1，4-丁二胺、精胺的吸附容量比含有一个胺基的苯乙胺和组胺的吸附容量大，说明阳离子交换也起着非常重要的作用，即聚乙烯二醇修饰的埃洛石对四个生物胺的作用机理不仅包括亲水作用也包含阳离子交换作用。
（4）固相萃取柱装填
称取200 mg的按照步骤（3）制备的聚乙烯二醇修饰的埃洛石，转移到装有5 μm下筛板和20 μm上筛板的6 mL柱管中，压实。
（5）固相分散萃取步骤
实施例1：取步骤（4）装填的固相萃取柱，分别以5 mL甲醇和5 mL水活化，98%乙腈-水溶液（v/v）平衡柱子；取1 mL浓度分别为500、100、100和100 μg L-1的组胺、1，4-丁二胺、苯乙胺和精胺的标准品混合溶液，混合溶液分别溶于80%、90%、95%和98%的乙腈-水溶液（v/v）中，以0.5 mL min-1的流速通过按照步骤（4）装填的固相萃取柱，收集流出液，待衍生。
实施例2：取步骤（4）装填的固相萃取柱，分别以5 mL甲醇和5 mL水活化，98%乙腈-水溶液（v/v）平衡柱子；取2 mL浓度分别为500、100、100和100 μg L-1的组胺、1，4-丁二胺、苯乙胺和精胺的标准品混合溶液，混合溶液溶于98%乙腈-水溶液（v/v）中，以0.5 mL min-1的流速通过按照步骤（4）装填的固相萃取柱，完成上样；随后，用2 mL分别含有10%、20%、40%、60%、70%和80%乙腈-水溶液（v/v）洗脱，收集洗脱液，待衍生。
实施例3：取步骤（4）装填的固相萃取柱，分别以5 mL甲醇和5 mL水活化，98%乙腈-水溶液（v/v）平衡柱子；取2 mL浓度分别为500、100、100和100 μg L-1的组胺、1，4-丁二胺、苯乙胺和精胺的标准品混合溶液，混合溶液溶于98%乙腈-水溶液（v/v）中，以0.5 mL min-1的流速通过按照步骤（4）装填的固相萃取柱，完成上样；随后，用2 mL含有60%乙腈（v/v），浓度分别为0、5、25、50、100和200 mmol L-1的甲酸铵溶液洗脱，收集洗脱液，待衍生。
实施例4：取步骤（4）装填的固相萃取柱，分别以5 mL甲醇和5 mL水活化，98%乙腈-水溶液（v/v）平衡柱子；取2 mL浓度分别为500、100、100和100 μg L-1的组胺、1，4-丁二胺、苯乙胺和精胺的标准品混合溶液，混合溶液溶于98%乙腈-水溶液（v/v）中，以0.5 mL min-1的流速通过按照步骤（4）装填的固相萃取柱，完成上样；随后，用2 mL含有60%乙腈（v/v），且将100 mmol L-1甲酸铵溶液调节pH值分别为6、7、8、9和11，另加pH值为12的2.4 mol L-1氨水溶液，洗脱，收集洗脱液，待衍生。
实施例5：取步骤（4）装填的固相萃取柱，分别以5 mL甲醇和5 mL水活化，98%乙腈-水溶液（v/v）平衡柱子；取2 mL浓度分别为500、100、100和100 μg L-1的组胺、1，4-丁二胺、苯乙胺和精胺的标准品混合溶液，混合溶液溶于98%乙腈-水溶液（v/v）中，以0.5 mL min-1的流速通过按照步骤（4）装填的固相萃取柱，完成上样；随后，分别用1、2、4、6和10 mL含有60%乙腈（v/v）的2.4 mol L-1氨水溶液洗脱，收集洗脱液，待衍生。
实施例6：取步骤（4）装填的固相萃取柱，分别以5 mL甲醇和5 mL水活化，98%乙腈-水溶液（v/v）平衡柱子；取1~100 mL分别为1、0.2、0.2和0.2 μg的组胺、1，4-丁二胺、苯乙胺和精胺的标准品混合溶液，混合溶液溶于98%乙腈-水溶液中，以0.5~2 mL min-1的流速通过按照步骤（4）装填的固相萃取柱，完成上样；随后，分别用4 mL含有60%乙腈（v/v）的2.4 molL-1氨水溶液洗脱，收集洗脱液，待衍生。
（6）苯甲酰氯衍生化步骤
取1 mL步骤（5）流出液或者洗脱溶液于5 mL塑料离心管中，加入1 mL 2 mol L-1NaOH溶液和60 μL苯甲酰氯，振荡30 s混合后，放入30 °C水浴反应40 min；反应完成后，加入1 g NaCl，振荡30 s，加入1 mL乙酸乙酯，混合后，3000 r min-1离心10 min，取上层有机相转入5 mL带刻度的玻璃离心管中，40 °C氮气吹干；采用0.5~1 mL甲醇重溶，过滤后，取10~20 μL注入液相色谱仪进行分离，采用紫外检测器检测。
（7）液相色谱分离和紫外检测器检测
色谱柱为安捷伦Poroshell 120 EC-C18柱，4.6 mm×150 mm，4 μm；紫外检测波长230~254 nm；进样量10~20 μL；流速 0.8~1 mL min-1；流动相为甲醇和水，梯度洗脱如下：0.0~20.0 min，5%~75%甲醇；20.0~25.0 min，75%甲醇；25.1~30.0 min，100%甲醇。
图5为实施例1中样品溶液中不同乙腈浓度对吸附率的影响。吸附率随着上样乙腈浓度的增加而增加，当乙腈浓度为98%时，吸附率达到最大，即目标化合物最大程度的保留在聚乙烯二醇修饰的埃洛石上。该结果说明当生物胺溶解在高浓度乙腈时，主要以亲水作用机理吸附在聚乙烯二醇修饰的埃洛石上。因此，98%乙腈-水溶液（v/v）为最佳的上样浓度。
图6为实施例2中洗脱溶液中不同乙腈浓度对回收率的影响。随着乙腈浓度的增加，回收率先增加后降低，当乙腈浓度为40%时，组胺、苯乙胺和1，4-丁二胺的回收率达到最大值，为了兼顾精胺的回收率，我们选择了60%乙腈-水溶液（v/v）为最佳的洗脱浓度。
图7为实施例3中洗脱溶液中不同甲酸铵浓度对回收率的影响。甲酸铵浓度从0增加到5 mmol L-1，回收率降低，原因归结于亲水分配作用机理。甲酸铵浓度持续从5增加至200 mmol L-1，回收率也随之增加，当甲酸铵的浓度>100 mmol L-1时，回收率几乎保持不变，原因归结于阳离子交换机理，即离子交换相中的反离子取代了聚乙烯二醇修饰的埃洛石中带正电的四种生物胺，从而提高了回收率。因此，洗脱溶液选为100 mmol L-1甲酸铵溶液中含有60%（v/v）乙腈。
图8为实施例4中洗脱溶液中不同pH值对回收率的影响。如图所示，随着pH值得增加，回收率也随之增加明显。当pH为12时，回收率达到最大值。因此，洗脱溶液的pH值选用12，即2.4 mol L-1氨水溶液中含有60%（v/v）乙腈。
图9为实施例5中不同洗脱体积对回收率的影响。随着洗脱体积的增加，四个生物胺的回收率也随之增加，当洗脱体积大于4 mL时，回收率达到最大值并保持不变。因此，选用4 mL作为最佳洗脱体积。
实施例6的结果显示，当上样体积范围为1~100 mL时，回收率基本在80%以上，即该方法最大上样体积可达到100 mL，可以对痕量生物胺进行富集，大大降低方法的检测限。
实施例7：
在实施例1~6选择最佳的固相萃取方法的基础之上，为了验证本发明建立的一种亲水作用和阳离子交换的固相萃取生物胺的方法的效果，对鱼肉样品添加了四个生物胺三种不同浓度的标准溶液，进行回收率试验，步骤如下：
去除鱼皮、鱼骨和内脏的鱼肉，经匀浆之后，取12 g加入到100 mL容量瓶中，加入80 mL乙腈，同时加入四个生物胺标准溶液，使最终的添加浓度如表1所示，振荡混匀之后超声提取30 min，冷却后加入2 mL水，随后，用乙腈定容至刻度，超声提取30 min后，8000 rmin-1离心10 min，过滤后待用。
取步骤（4）装填的固相萃取柱，分别以5 mL甲醇和5 mL水活化，98%乙腈水溶液平衡柱子；取10 mL加入不同浓度生物胺标准品的鱼肉提取液，以0.5 mL min-1的流速通过按照步骤（4）装填的固相萃取柱，完成上样；随后，用4 mL含有60%乙腈（v/v）的2.4 mol L-1氨水溶液洗脱，收集洗脱液，采用步骤（6）衍生之后，用步骤（7）进行液相色谱分离和紫外检测器检测。结果如表1所示：
表1 不同加标浓度的回收率
。
从表1可见，建立的方法具有较高的回收率和较好的重现性，完全适合于鱼肉中生物胺的日常检测。当上样体积为10 mL时，组胺、1，4-丁二胺、苯乙胺和精胺的最低定量限分别达到0.26、0.05、0.01和0.03 mg kg-1，以μg L-1为单位时，组胺、1，4-丁二胺、苯乙胺和精胺的最低定量限分别为31.3、6.3、1.6和3.1 μg L-1；组胺、1，4-丁二胺、苯乙胺和精胺的最低检测限分别达到0.078、0.016、0.004和 0.008 mg kg-1，以μg L-1为单位时，组胺、1，4-丁二胺、苯乙胺和精胺的最低定量限分别为9.4、1.9、0.5和0.9 μg L-1。
实施例8：
为了进一步验证建立的一种亲水作用和阳离子交换的固相萃取生物胺的方法的效果，选取黑鱼1、黑鱼2、大黄鱼和巴沙鱼，这四种鱼为市场上新鲜采购，对四种生物胺的含量进行了测定，步骤如下：
取步骤（4）装填的固相萃取柱，分别以5 mL甲醇和5 mL水活化，98%乙腈水溶液平衡柱子；取10 mL步骤（1）的鱼肉提取液，以0.5 mL min-1的流速通过按照步骤（4）装填的固相萃取柱，完成上样；随后，用4 mL含有60%乙腈（v/v）的2.4 mol L-1氨水溶液洗脱，收集洗脱液，采用步骤（6）衍生之后，用步骤（7）液相色谱分离和紫外检测器检测。结果如表2所示：
表2 实际样品测定
。
注：a浓度小于最低定量限， b平均浓度±标准偏差，n = 3。
结果表明，采用本发明的方法在四种新鲜鱼肉中未检测到组胺，在巴沙鱼中检测到1，4-丁二胺为0.160 mg kg-1，在黑鱼1、黑鱼2和大黄鱼中检测到苯乙胺的浓度分别为0.084、0.095和0.099 mg kg-1，在四种鱼肉中均检测到精胺，即黑鱼1、黑鱼2、大黄鱼和巴沙鱼中精胺的含量分别为0.091、0.418、0.268和0.231 mg kg-1。
实施例9：
为了进一步验证建立的一种亲水作用和阳离子交换的固相萃取生物胺的方法的效果，选取黑鱼1、黑鱼2、大黄鱼和巴沙鱼，这四种鱼为0 °C冰藏一周，对四种生物胺的含量进行了测定，步骤如下：
取步骤（4）装填的固相萃取柱，分别以5 mL甲醇和5 mL水活化，98%乙腈水溶液平衡柱子；取10 mL步骤（1）的鱼肉提取液，以1.0 mL min-1的流速通过按照步骤（4）装填的固相萃取柱，完成上样；随后，用4 mL含有60%乙腈（v/v）的2.4 mol L-1氨水溶液洗脱，收集洗脱液，采用步骤（6）衍生之后，用步骤（7）液相色谱分离和紫外检测器检测。结果如表3所示：
表3 实际样品测定
。
结果表明，采用本发明的方法在0 °C冰藏一周的四种鱼肉中未检测到组胺，在巴沙鱼中检测到1，4-丁二胺为0.204 mg kg-1，在黑鱼1、黑鱼2和大黄鱼中检测到苯乙胺的浓度分别为0.892、0.902和0.985 mg kg-1，在四种鱼肉中均检测到精胺，即黑鱼1、黑鱼2、大黄鱼和巴沙鱼中精胺的含量分别为1.258、1.512、1.365和1.352 mg kg-1。
实施例10：
为了进一步验证建立的一种亲水作用和阳离子交换的固相萃取生物胺的方法的效果，选取黑鱼1、黑鱼2、大黄鱼和巴沙鱼，这四种鱼为4 °C冷藏一周，对四种生物胺的含量进行了测定，步骤如下：
取步骤（4）装填的固相萃取柱，分别以5 mL甲醇和5 mL水活化，98%乙腈水溶液平衡柱子。对于组胺和1，4-丁二胺的测定，步骤（1）的鱼肉提取液先用98%乙腈稀释10倍，再取稀释后1 mL上样。对于苯乙胺和精胺的测定步骤（1）的鱼肉提取液，取1 mL；以0.5 mL min-1的流速通过按照步骤（4）装填的固相萃取柱，完成上样；随后，用4 mL含有60%乙腈（v/v）的2.4 mol L-1氨水溶液洗脱，收集洗脱液，采用步骤（6）衍生之后，用步骤（7）液相色谱分离和紫外检测器检测。结果如表4所示：
表4 实际样品测定
。
结果表明，采用本发明的方法在4 °C冷藏一周的四种鱼肉中检测到组胺和1，4-丁二胺，且含量明显增加，即黑鱼1、黑鱼2、大黄鱼和巴沙鱼中组胺的含量分别为23.182、30.264、25.342和26.846 mg kg-1，1，4-丁二胺的含量分别为49.650、51.368、42.538和38.682 mg kg-1。在黑鱼1、黑鱼2、大黄鱼和巴沙鱼中检测到苯乙胺的浓度分别为3.212、2.658、2.874和1.954 mg kg-1，在四种鱼肉中均检测到精胺，即黑鱼1、黑鱼2、大黄鱼和巴沙鱼中精胺的含量分别为2.352、2.864、2.537和2.462 mg kg-1。
实施例11：
为了进一步验证建立的一种亲水作用和阳离子交换的固相萃取生物胺的方法的效果，选取黑鱼1、黑鱼2、大黄鱼和巴沙鱼，这四种鱼为25 °C保存一周，对四种生物胺的含量进行了测定，步骤如下：
取步骤（4）装填的固相萃取柱，分别以5 mL甲醇和5 mL水活化，98%乙腈水溶液平衡柱子。对于组胺和1，4-丁二胺的测定，步骤（1）的鱼肉提取液先用98%乙腈稀释50倍，再取稀释液1 mL上样。对于苯乙胺和精胺的测定，步骤（1）的鱼肉提取液，取1 mL；以0.5 mLmin-1的流速通过按照步骤（4）装填的固相萃取柱，完成上样；随后，用4 mL含有60%乙腈（v/v）的2.4 mol L-1氨水溶液洗脱，收集洗脱液，采用步骤（6）衍生之后，用步骤（7）液相色谱分离和紫外检测器检测。结果如表5所示：
表5 实际样品测定
。
结果表明，采用本发明的方法在25 °C保存一周的四种鱼肉中均检测到四种生物胺，且组胺和1，4-丁二胺的含量大大增加，苯乙胺和精胺的含量增加幅度不大，即黑鱼1、黑鱼2、大黄鱼和巴沙鱼中组胺的含量分别为523.642、589.725、546.948和562.684 mg kg-1，1，4-丁二胺的含量分别为610.826、642.574、598.246和576.241 mg kg-1，苯乙胺的含量分别为4.682、4.246、4.548和3.857 mg kg-1，精胺的含量分别为6.563、6.942、6.723和6.652mg kg-1。
Claims (9)
1.一种亲水作用和阳离子交换的固相萃取鱼体内生物胺的方法，其特征包括以下步骤：
A、聚乙烯二醇修饰埃洛石的方法如下：将5~25 g经六偏磷酸钠纯化的埃洛石加入到含有1~5 mL聚乙烯二醇-4-壬苯基-3-硫代丙基醚钾盐的100 mL水中，在25~40 °C下，500~1200 rpm转速搅拌后，用水洗涤数次，离心后，60~105 °C干燥5~10 h，得到聚乙烯二醇修饰的埃洛石；
B、称取50~300 mg聚乙烯二醇修饰的埃洛石，转移到装有5 μm下筛板和20 μm上筛板的3~10 mL柱管中压实；
C、将已装好聚乙烯二醇修饰的埃洛石的固相萃取柱，分别以5 mL甲醇和5 mL水活化，98%乙腈水溶液平衡柱子，1~100 mL鱼体内生物胺的混合溶液以0.5~2 mL min-1的流速通过固相萃取柱完成上样，随后用4~10 mL含有60%乙腈的2.4 mol L-1氨水溶液洗脱；
D、取1 mL洗脱溶液，采用苯甲酰氯衍生化，使生物胺的胺基与酰氯基团反应生成的酰胺基，衍生化后的生物胺具有紫外吸收作用；
E、取经衍生化后的生物胺混合液10~20 μL注入液相色谱仪进行分离，紫外检测器检测。
2.根据权利要求1所述的一种亲水作用和阳离子交换的固相萃取鱼体内生物胺的方法，其特征是所述的六偏磷酸钠纯化的埃洛石的步骤如下：取10~50 g埃洛石，加入到100~500 mL含有六偏磷酸钠质量浓度为0.05%~0.25%的水溶液中，搅拌30~60 min后，静止20min，弃去沉淀部分，分散的埃洛石经过数次水洗，离心后，60~105 °C干燥5~10 h，得到六偏磷酸钠纯化的埃洛石。
3.根据权利要求1所述的一种亲水作用和阳离子交换的固相萃取鱼体内生物胺的方法，其特征是所述的生物胺的混合溶液为组胺、1，4-丁二胺、苯乙胺和精胺的标准品混合溶液，溶于80%~98%乙腈中，浓度范围分别为组胺31.3~1000 μg L -1、1，4-丁二胺6.3~200 μgL -1、苯乙胺1.6~200 μg L -1和精胺3.1~200 μg L-1，该生物胺的混合溶液用于固相萃取条件的优化。
4.根据权利要求1所述的一种亲水作用和阳离子交换的固相萃取鱼体内生物胺的方法，其特征是所述的苯甲酰氯衍生化步骤如下：取1 mL洗脱溶液于5 mL塑料离心管中，加入1 mL 2 mol L-1 NaOH溶液和60 μL苯甲酰氯，振荡30 s混合后，放入30 °C水浴反应40 min；反应完成后，加入1 g NaCl，振荡30 s，加入1 mL乙酸乙酯，混合后，3000 r min-1离心10min，取上层有机相转入5 mL带刻度的玻璃离心管中，40 °C氮气吹干；采用0.5~1 mL甲醇重溶，过滤后，取10~20 μL注入液相色谱仪进行分离，采用紫外检测器检测。
5.根据权利要求1所述的一种亲水作用和阳离子交换的固相萃取鱼体内生物胺的方法，其特征是所述的液相色谱分离和紫外检测器检测步骤如下：色谱柱为安捷伦Poroshell120 EC-C18柱，4.6 mm×150 mm，4 μm；紫外检测波长230~254 nm；进样量10~20 μL；流速0.8~1 mL min-1；流动相为甲醇和水，梯度洗脱如下：0.0~20.0 min，5%~75%甲醇；20.0~25.0min，75%甲醇；25.1~30.0 min，100%甲醇。
6.根据权利要求1所述的一种亲水作用和阳离子交换的固相萃取鱼体内生物胺的方法，其特征是鱼体内生物胺提取方法如下：将鱼样品去除鱼皮、鱼骨和内脏的鱼肉，经匀浆之后，取10~20 g加入到100 mL容量瓶中，加入50~80 mL乙腈，振荡混匀之后超声提取30~60min，冷却后加入2 mL水，随后，用乙腈定容至刻度，超声提取30~60 min后，4500~8000 rmin-1离心10~20 min，过滤后待用。
7.根据权利要求6所述的一种亲水作用和阳离子交换的固相萃取鱼体内生物胺的方法，其特征是所述鱼体内生物胺提取溶液为不同品种新鲜鱼肉的提取溶液，用于新鲜鱼类样品中生物胺的检测。
8.根据权利要求6所述的一种亲水作用和阳离子交换的固相萃取鱼体内生物胺的方法，其特征是所述鱼体内生物胺提取溶液为不同品种鱼在0~4 °C冷藏保存7日鱼肉的提取溶液，用于冷藏鱼类生物胺的检测。
9.根据权利要求6所述的一种亲水作用和阳离子交换的固相萃取鱼体内生物胺的方法，其特征是所述鱼体内生物胺提取溶液为不同品种鱼在25 °C常温保存7日鱼肉的提取溶液，可用于常温保存的鱼类食品安全检测。
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