CN103105446B

CN103105446B - 一种富集液态乳中β-内酰胺类青霉素抗生素的方法

Info

Publication number: CN103105446B
Application number: CN201210316244.1A
Authority: CN
Inventors: 熊勇华; 郭亮; 吴科盛
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2011-11-15
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2032-08-31
Also published as: CN103105446A

Abstract

本发明公开了一种富集液态乳制品中β-内酰胺类青霉素抗生素的磁性分散固相萃取新方法，涉及食品安全分析领域中样品前处理的新方法。本发明仅需将液态乳进行冷冻离心脱脂处理，然后将微量的表面修饰有苯胺功能团的超顺磁纳米或亚微米磁球加入脱脂液态乳中吸附数分钟，磁力架分离磁球，磁球经25~50%的甲醇水溶液洗涤后采用微量洗脱液洗脱获得富集有β-内酰胺类抗生素的溶液。与常规固相萃取方法相比，具有操作流程简单、耗时少、无需旋转蒸发等步骤的特点。

Description

一种富集液态乳中β-内酰胺类青霉素抗生素的方法

技术领域

本发明涉及分析化学中样品前处理领域，具体是涉及一种以苯胺功能团的超顺磁纳米或亚微米磁球富集液态乳中青霉素抗生素的磁分散固相萃取方法。

背景技术

牛奶是大自然赐予人类最理想的天然食品，奶业及其由奶业衍生的乳制品行业的健康发展是衡量一个国家现代农业发展水平的重要标志之一。目前我国乳品行业正进入前所未有的高速发展期，乳制品的质量与安全问题日益受到人们的关注，其中严重滞后的产品质量检测监控手段，为乳业食品安全留下了诸多隐患，如2004年下半年发生的阜阳劣质奶粉事件，2008年9月曝光的“三聚氰胺”奶粉事件以及一直困恼液态奶健康发展的抗生素残留问题等。青霉素类抗生素是一类含有β-内酰胺基母核结构的抗生素总称，是当前医药和兽药行业治疗和预防因葡萄球菌、肺炎球菌、链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌引起的动物尿道、胃肠道和呼吸道以及乳房炎感染应用最多的一类抗生素。中国、日本、欧盟、美国、国际食品法典委员会都已经对液态乳制品中青霉素类药物残留规定了最大残留限量值。由于青霉素类抗生素良好的抗菌效果，仍广泛地应用于动物饲养，尤其是奶业养殖中。乳房炎疾病是奶业养殖中最为常见的疾病之一，而青霉素类抗生素是最为有效地治疗药物之一, 如果使用者使用不当或不遵守休药期规定 , 均可能造成此类抗生素在分泌的液态奶中残留量超出国家限量标准 , 从而给人类健康带来潜在的危害。

建立有效、合理、快速和经济的检测技术是解决奶业生产、流通及消费过程中食品安全评价、预警及监控体系的有效技术支撑。目前用于青霉素类抗生素残留检测的常用方法包括微生物培养法、免疫学检测方法（ELISA）以及仪器分析法等。微生物培养法是利用青霉素类抗生素能抑制微生物生长原理的基础上建立起来的简便测定方法，但由于液态乳中存在的抑菌物质较多，因此测定的结果往往容易存在假阳性，且检测灵敏度偏低。免疫学检测方法具有分析速度快, 能同时筛选大量样品的优势，但该方法仍存在假阳性高、不能同时对多残留组分进行分别定量检测的缺陷。同时以上方法仅能用于青霉素类抗生素残留的筛查分析。仪器分析法因具有检测灵敏度高，能同时进行多组分检测，因此仍是液态乳中青霉素类抗生素残留确证分析的最常用手段。

在青霉素类抗生素残留仪器分析方法中，样品前处理过程往往是最耗时，耗力的环节。在国标（农业部781号公告）-牛奶中青霉素类药物残留检测方法-高效液相色谱法中规定了牛奶中样品前处理流程。具体如下：取5 mL待测乳液，加入溴化四丁基铵乙腈溶液10 mL，摇匀。3000 rpm离心10 min，重复以上抽提步骤2次，合并上清液。加入10 mL正己烷，摇匀后静置10 min，除正己烷层，在45-50℃旋转蒸发至3-4 mL，过C₁₈固相萃取柱净化处理。最后采用3 mL乙腈洗脱，洗脱液氮气吹干后进行衍生化处理。叶能胜等在“固相萃取--高效液相色谱法检测牛奶和猪肉中5种青霉素类抗生素”一文中描述采用乙腈提取牛奶中青霉素类抗生素的相对简便方法，具体流程如下：2. 5 mL牛奶试样加入10 mL乙腈, 振荡混合1 min , 离心 15 min (4000 rpm)。取上层清液, 离心后的沉淀物再加入2 mL乙腈重复提取一次。合并上层清液, 40℃下用氮气吹至0. 5～1. 0 mL , 加水10 mL 振荡混匀, 然后过Waters Oasis HLB固相萃取柱提取纯化。常规方法需要过柱、旋蒸等，有工艺复杂，过柱耗时长、易堵塞、流速太快可造成的吸附效率下降，以及装柱时吸附剂填装不均匀密实产生的短路等问题。

发明内容

本发明目的是提供一种更为简便、实效的液态奶中β-内酰胺类抗生素高效富集的新方法。

具体来说本发明的技术方案包含下列步骤：

（1）样品处理：取8-10 mL液态奶，离心至明显分层，取5 mL中间层用于吸附；离心有效地除去液态奶中过多的脂肪以及部分不溶解物。

（2）吸附：加入5-20 mg苯胺功能团修饰的超顺磁磁球（结构见图1）至液态乳中，混匀吸附3-10分钟，磁力架分离磁球，弃去乳液；吸附后的磁球进一步采用25~50%的甲醇水溶液洗涤。25~50%的甲醇水溶液洗涤其目的旨在进一步除去磁球表面结合的非极性物质，减少液态乳的基质效应对液相色谱的干扰。当然，为了达到更好的效果，也可以多次洗涤。

（3）洗脱收集：加200-500 μL含氨水的乙腈溶液洗脱磁球上的青霉素抗生素，分离磁球，收集洗脱液。

本发明方法具有意想不到的高吸收效率，这可能与表面修饰了苯胺功能团的磁性纳米材料为吸附剂，利用磁性材料表面的氨基以及疏水苯环与待测物中青霉素抗生素中羧基以及β-内酰胺环形成亲水与疏水结合方式有关；该方法与常规固相萃取方法相比，操作步骤更为简便，柱材料（吸附剂）使用量仅为固相萃取法的1/10左右，富集系数更高。

分离磁球的过程可以采用常规的磁力架分离或者通过离心分离磁球等方法。

为了达到更好的离心分离效果，步骤（1）中液态奶5000~6000 rpm冷冻离心10分钟去除乳脂肪，取中间层脱脂乳部分用于吸附。

为了达到更好的富集效果，步骤（2）中超顺磁磁球粒径范围为70~300 nm，磁球表面富含苯胺功能团。粒径小，利于分散，效率高。

为了达到更好的洗脱效果，洗脱液中乙腈含量介于60-99%，氨水浓度为1%。洗脱时，采用氨化乙腈进行洗脱，利用洗脱溶液中高浓度乙腈的疏水性，适当的氨水浓度使溶液pH值大于磁性材料吸附剂的氨基解离pKa值。

苯胺功能团修饰的超顺磁磁球可按如下步骤制备：化学共沉淀法合成超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒，再将Fe₃O₄纳米颗粒表面油酸化，无水乙醇洗涤后氮气吹干；取5 g表面油酸化的Fe₃O₄纳米颗粒，用体积比15:1的苯乙烯-十六烷混合液5 mL悬浮Fe₃O₄纳米颗粒，超声5~10 min形成磁流体，将磁流体转入500 mL，0.01M含0.3~0.8%的十六烷基三甲基溴化铵的磷酸盐缓冲液中（pH 7.0），，超声波频率为25KHz ，超声功率为200-300 W条件下继续超声乳化30 min，形成细乳液；在上述细乳液中加入0.1g K₂S₂O₈于70℃反应10~20 min后再加入0.3 g 4-氨基苯乙烯，继续反应12h。磁架吸附磁球，即获得内含超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒，表面修饰有苯胺功能团的的功能化磁球。磁球粒径大小与溶液中十六烷基三甲基溴化铵含量以及超声功率成反比（具体见实施例1，2）。磁架回收磁球，1 mol/L NaOH 以及1mol/L HCl 浸泡洗涤磁球各1 h，最后以0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤磁球至中性，并将磁球重悬于0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中于4 ℃保存备用。磁球粒径大小与溶液中十六烷基三甲基溴化铵含量以及超声功率成反比。

本发明还涉及上述富集方法在检测液态乳中β-内酰胺类青霉素抗生素中的应用，收集洗脱液，过滤，直接上液相或液质联用检测。过滤可以直接采取常规液相或液质联用进样所需的0.45 μm或0.22μm滤膜过滤，液相色谱或液相色谱-质谱联用的条件可以直接采取隐色孔雀石绿和隐色结晶紫分析条件，此为常规实验技术，不再赘言。

本发明的有益效果：

1、本发明采用磁固相萃取方法（具体原理见图2），有效的富集液态乳中β-内酰胺类青霉素抗生素（包括阿莫西林、青霉素G、青霉素V、乙氧奈青霉素、苯唑西林、双氯青霉素、氨苄西林等），且吸附效率高，样品提取回收率高。此外，本方法的样品预处理非常简单，只需要通过离心分层即可吸附，大大提高了富集的速度，缩短了分析检测的时间。

2、本方案为磁球吸附，富集速度快。本磁球的溶液单分散性好，在溶液中可均匀分布，比表面积大，提高了萃取过程中吸附剂吸附待分离物的速率，缩短了吸附时间。

3、吸附容量大，所用的有机溶剂少，节约材料，减少了环境污染。

5、磁球粒径小，比表面积远大于固相萃取材料，吸附容量大，吸附剂用量少，可实现微量洗脱液洗脱，富集倍数高，且可省去常规前处理流程中的旋转蒸发等浓缩步骤，对分析物破坏少，减少了检测误差。

附图说明

图1 苯胺功能团修饰的超顺磁磁球结构示意图。

图2 本发明所涉及的磁分散固相萃取技术的操作流程图。

具体实施方式

为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1 70 nm苯胺功能团修饰的超顺磁磁球的制备

参照文献（Yan F, Li J, Zhang J, Liu F, Yang W. J. Nanopart. Res.,2009,11(2):289～296）方法，采用化学共沉淀法合成超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒。将250 mL含0.015 moL的Fe₃O₄纳米颗粒在氮气保护条件下，加热至70℃，然后加2.0 mL油酸反应3小时。磁分离油酸化磁球，无水乙醇洗涤油酸化磁球3-4次，氮气吹干。取5 g表面油酸化的Fe₃O₄纳米颗粒，用体积比15:1的苯乙烯-十六烷混合液5 mL悬浮Fe₃O₄纳米颗粒，超声5~10 min形成磁流体，将磁流体转入500 mL，0.01M含0.8%的十六烷基三甲基溴化铵的磷酸盐缓冲液中（pH 7.0），300 W（25KHz）功率继续超声乳化30 min，形成细乳液；在上述细乳液中加0.1g K₂S₂O₈于70℃反应10 min后加入0.3 g 4-氨基苯乙烯，继续反应12h。磁架吸附磁球，即获得粒径约为70 nm的内含超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒，表面修饰有苯胺的功能化磁球。磁架回收磁球，1 mol/L NaOH 以及1mol/L HCl 浸泡洗涤磁球各1 h，最后以0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤磁球至中性，并将磁球重悬于0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中于4 ℃保存备用。

实施例2 200 nm苯胺功能团修饰的超顺磁磁球的制备

取5 g表面油酸化的Fe₃O₄纳米颗粒，用体积比15:1的苯乙烯-十六烷混合液5 mL悬浮Fe₃O₄纳米颗粒，超声5~10 min形成磁流体，将磁流体转入500 mL，0.01M含0.5%的十六烷基三甲基溴化铵的磷酸盐缓冲液中（pH 7.0），200 W（25KHz）功率继续超声乳化30 min，形成细乳液；在上述细乳液中加0.1g K₂S₂O₈于70℃反应20 min后加入0.3 g 4-氨基苯乙烯，继续反应12h。磁架吸附磁球，即获得粒径约为200 nm的内含超顺磁性Fe₃O₄纳米单颗粒，表面修饰有苯胺的功能化磁球。磁架回收磁球，1 mol/L NaOH 以及1mol/L HCl 浸泡洗涤磁球各1 h，最后以0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤磁球至中性，并将磁球重悬于0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中于4 ℃保存备用。其余同实施例1。

实施例3 300 nm苯胺功能团修饰的超顺磁磁球的制备

取5 g表面油酸化的Fe₃O₄纳米颗粒，用体积比15:1的苯乙烯-十六烷混合液5 mL悬浮Fe₃O₄纳米颗粒，超声5~10 min形成磁流体，将磁流体转入500 mL，0.01M含0.3%的十六烷基三甲基溴化铵的磷酸盐缓冲液中（pH 7.0），200 W（25KHz）功率继续超声乳化30 min，形成细乳液；在上述细乳液中加0.1g K₂S₂O₈于70℃反应20 min后加入0.3 g 4-氨基苯乙烯，继续反应12h。磁架吸附磁球，即获得粒径约为300 nm内含超顺磁性Fe₃O₄纳米单颗粒，表面修饰有苯胺的功能化磁球。磁架回收磁球，1 mol/L NaOH 以及1mol/L HCl 浸泡洗涤磁球各1 h，最后以0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤磁球至中性，并将磁球重悬于0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中于4 ℃保存备用。其余同实施例1。

实施例4 以粒径为70 nm的苯胺功能团修饰的超顺磁磁球为吸附剂富集新鲜原料乳中7种β-内酰胺类抗生素（包括阿莫西林、青霉素G、青霉素V、乙氧奈青霉素、苯唑西林、双氯青霉素、氨苄西林等）

1）添加青霉素类抗生素的新鲜原料乳样品的制备：取4×7份10 mL用农业部781号公告-11-2006方法验证不含青霉素类抗生素的液态奶，向每份奶样中添加等量的阿莫西林、青霉素G、青霉素V、乙氧奈青霉素、苯唑西林、双氯青霉素、氨苄西林，添加量分别为10、25、50和100 ng。

2）用粒径为70 nm的苯胺功能团修饰的超顺磁磁球为吸附剂共同富集、净化加标新鲜原料乳中上述7种青霉素类抗生素：将加标液态奶以5000 rpm冷冻离心10分钟，取中间层乳液5 mL；将8 mg苯胺功能团修饰的超顺磁磁球加入上述乳液中，混匀吸附5分钟；将乳液磁球混合液移至磁力架上分离磁球10 min，弃去乳液；残留磁球采用2 mL 50%甲醇水溶液洗涤两次，磁力架分离磁球。将200 μL含1%氨化的乙腈溶液（乙腈含量80%）浸泡磁球2 min，磁力架分离磁球，洗脱液加入600 μL超纯水稀释，过0.22 μm滤膜后直接上串联四级杆液质联用仪检测。

3）用液相色谱-质谱联用法测定所得富集液中青霉素类抗生素的含量。

液相色谱条件：色谱柱: Agilent Eclipse plus C18 ( 100 mm×2.1 mm，1.8 μm) ; 流动相: 0.1%氨水溶液( A) －乙腈( B)，流速为0.5 mL /min; 进行梯度洗脱，梯度条件为0-6 min为95% A和5% B; 6-10 min为70% A 和30% B; 10-15min为 40% A和60% B。

质谱条件：离子源为电喷雾离子源; 扫描方式为正离子扫描;检测方式为MRM多重反应检测;气体温度为350℃;气体流速为10 mL /min; 雾化器压力为310 kPa ( 45 psi)。

4）回收率的计算：将由液相色谱-串联质谱法测定得到的富集净化液中青霉素类抗生素的含量，除以加标量得到加标样品中青霉素类抗生素的回收率。

5）不同添加量时本专利提取富集方法的加标回收率见表1。由表可知，本实验方法提取回收率较高，可达到国标要求。

表1 加标回收实验结果

。

实施例5 以粒径为200 nm苯胺功能团修饰的超顺磁磁球为吸附剂富集新鲜原料乳中青霉素G

取4份8mL用农业部781号公告-11-2006方法验证不含青霉素类抗生素的液态奶，分别添加10、25、50和100 ng的青霉素G。6000 rpm冷冻离心10分钟，取中间层乳液5 mL加入15 mg苯胺功能团修饰的超顺磁磁球，混匀吸附5分钟，将乳液磁球混合液移至磁力架上分离磁球5 min，弃去乳液；残留磁球采用2 mL 50%甲醇水溶液洗涤两次，磁力架分离磁球。将400 μL氨化乙腈（乙腈含量60%）浸泡磁球2 min，磁力架分离磁球，洗脱液加入600μL超纯水稀释，过0.22 μm滤膜后直接上液相色谱仪检测。液相色谱条件为：色谱柱: Agilent extend C₁₈色谱柱 (250 mm×4.16 mm , 5μm) ; 流动相: 0.1%氨水乙腈溶液(乙腈含量为30%)；紫外检测器波长为210 nm。结果表明，在四种浓度下回收率为93.1~101%。

实施例6以粒径为300 nm苯胺功能团修饰的超顺磁磁球为吸附剂富集加工牛奶中阿莫西林

取4份10 mL用农业部781号公告-11-2006方法验证不含阿莫西林的商品化袋装甜牛奶、可可味奶、花生奶，分别添加10、25、50和100 ng的阿莫西林。6000 rpm冷冻离心10分钟，取中间层乳液5 mL加入20 mg苯胺功能团修饰的超顺磁磁球，混匀吸附5分钟，将乳液磁球混合液移至磁力架上分离磁球2 min，弃去乳液；残留磁球采用2 mL 50%甲醇水溶液洗涤两次，磁力架分离磁球。将500 μL氨化乙腈（乙腈含量99%）浸泡磁球2 min，磁力架分离磁球，衍生化以及其他步骤按国家标准（农业部781号公告）-牛奶中青霉素类药物残留的检测方法-高效液相色谱法操作条件执行。其中色谱条中色谱柱为 C₈色谱柱 (150 mm×3.9 mm , 5μm)，紫外检测器波长为325 nm。结果表明，不同加工奶阿莫西林四种浓度下加标回收率为94.1~103.1%。

实施例7

取4份8 mL用农业部781号公告-11-2006方法验证不含阿莫西林的商品化袋装草莓味鲜奶，分别添加10、25、50和100 ng的阿莫西林。6000 rpm冷冻离心10分钟，取中间层乳液5 mL加入5 mg粒径70 nm苯胺功能团修饰的超顺磁磁球，混匀吸附10分钟，将乳液磁球混合液移至磁力架上分离磁球2 min，弃去乳液；残留磁球采用2 mL 25%甲醇水溶液洗涤两次，磁力架分离磁球。将200 μL氨化乙腈（乙腈含量99%）浸泡磁球2 min，磁力架分离磁球，衍生化以及其他步骤按国家标准（农业部781号公告）-牛奶中青霉素类药物残留的检测方法-高效液相色谱法操作条件执行。其中色谱条中色谱柱为 C₈色谱柱 (150 mm×3.9 mm , 5μm)，紫外检测器波长为325 nm。结果表明，阿莫西林四种浓度下加标回收率为94.1~99.6%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种富集液态乳中β-内酰胺类青霉素抗生素的方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）样品处理：取8-10 mL液态奶，离心至明显分层，取5 mL中间层用于吸附；

（2）吸附：加入5-20 mg苯胺功能团修饰的超顺磁磁球至液态乳中，混匀吸附3-10分钟，磁力架分离磁球，弃去乳液；磁球采用25~50%的甲醇水溶液洗涤；

2.根据权利要求1所述的富集液态乳中β-内酰胺类青霉素抗生素方法，其特征在于：步骤（1）中液态奶需5000~6000 rpm冷冻离心10分钟去除乳脂肪，取中间层脱脂乳部分用于吸附。

3.根据权利要求1所述的富集液态乳中β-内酰胺类青霉素抗生素方法，其特征在于步骤（2）中超顺磁磁球粒径范围为70~300 nm，磁球表面富含苯胺功能团。

4.根据权利要求1所述的富集液态乳中青霉素抗生素方法，其特征在于步骤（3）洗脱液为含1%氨水的乙腈溶液，其中乙腈含量介于60-99%。

5.根据权利要求1所述的富集液态乳中β-内酰胺类青霉素抗生素方法，其特征在于所述苯胺功能团修饰的超顺磁磁球按如下步骤制备：化学共沉淀法合成超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒，再将Fe₃O₄纳米颗粒表面油酸化，无水乙醇洗涤后氮气吹干；取5 g表面油酸化的Fe₃O₄纳米颗粒，用体积比15:1的苯乙烯-十六烷混合液5 mL悬浮Fe₃O₄纳米颗粒，超声5~10 min形成磁流体，将磁流体转入500 mL，0.01M含0.3~0.8%的十六烷基三甲基溴化铵的pH 7.0磷酸盐缓冲液中，超声波频率为25KHz ，超声功率为200-300 W条件下继续超声乳化30 min，形成细乳液；在上述细乳液中加入0.1g K₂S₂O₈于70℃反应10~20 min后加入0.3 g 4-氨基苯乙烯，继续反应12h；磁架吸附磁球，即获得内含超顺磁性Fe₃O₄纳米单颗粒，表面修饰有苯胺的功能化磁球。

6.权利要求1所述的富集方法在检测液态乳中β-内酰胺类青霉素抗生素中的应用，其特征在于收集洗脱液，过滤，直接上液相检测。