CN114324682A - 分散固相萃取吸附剂测定海鱼罐头中生物胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种分散固相萃取吸附剂测定海鱼罐头中生物胺的方法，涉及食品分析及安全领域。所述方法主要包括以下步骤：S1、标准曲线方程的制备；S2、对鱼肉样品进行提取、除脂、酚醛树脂基碳球和N‑丙基乙二胺固相萃取、丹磺酰氯衍生等过程得到待测样品；S3、对待测样品进行HPLC的检测；S4、根据步骤S1得到的生物胺的标准曲线方程式和步骤S3得到的样品中生物胺的吸收峰值，可得到鱼肉样品中生物胺的含量。本发明提供的方法简单快速，样品只需经过简单分散固相萃取和柱前衍生化处理，即可实现7种生物胺的高通量多组分同时准确定量，其衍生化效率高、选择性好、检测结果精准高效，具备良好的实用性和基层推广性。

Description

分散固相萃取吸附剂测定海鱼罐头中生物胺的方法

技术领域

本发明属于食品分析及安全领域，具体涉及一种分散固相萃取吸附剂测定海鱼罐头中生物胺的方法。

背景技术

生物胺(Biogenic Amines，BAs)是由微生物中的酶对氨基酸进行脱羧或醛酮的转氨基作用而产生的一类含氮的脂肪族、芳香族或杂环类有机化合物的总称。它们具有极性或半极性特征且分子量较低，广泛存在于各种动植物组织及其食品制品中，尤其容易存在于蛋白质含量丰富的水产品如海洋鱼类及其罐头制品中。生物胺一方面作为激素或神经递质发挥着重要的生物功能，但是另一方面过量生物胺具有毒性、超过限量会损伤人体神经和心血管系统，比如组胺就是食品中最具毒性的生物胺之一，人体一次性摄入8-40mg即可产生中毒症状，其次为酪胺，口服剂量超过100mg会引起偏头痛(发酵食品中生物胺的检测与控制，2008年南京农业大学硕士毕业论文，陆永梅)。

如今，海鱼罐头由于美味、即食、便携，成为快销食品，常驻消费者餐桌。但是由于其制作工艺和存储技术受限等会导致内部反应生成生物胺，如不进行控制将会对其质量安全产生极大影响，因此对海鱼罐头中组胺、酪胺等多种生物胺的含量检测成为食品质量安全的重要指标。

目前，国内外关于海鱼罐头中生物胺的相关研究中，在前处理方法上，主要为溶剂萃取法和柱前衍生法，但是传统溶剂萃取法不仅需要大量有机溶剂，还需要经过反复提取、去脂、净化和浓缩等步骤，过程繁琐、费时费力且极不环保；柱前衍生法需要结合样品，进行提取净化和去脂除杂等一系列过程。在检测方法上，高效液相色谱法(HPLC)是测定生物胺的最常用方法，也是国内外研究的重点。由于大部分生物胺没有荧光和紫外发色基团，因此HPLC在测试前均需进行样品衍生化后进行测定，衍生步骤细致繁杂，衍生剂选择、衍生剂量、衍生温度和衍生时间等因素对衍生效果影响较大。

中国专利CN201611208727.4公开了一种鱼肉及其制品中生物胺的检测方法，其在前处理方法上使用的是丹磺酰氯柱前衍生法，但鱼肉制品基质复杂，单纯进行试剂衍生化效率无法保证，加上样品中的生物胺易分解、含量较低，因此最终检测到的生物胺含量可能和实际含量有所出入。

因此有必要开发简单易操作、可靠环保、衍生效率高的样品前处理方法。

发明内容

本发明针对现有技术中因海鱼罐头基质复杂，直接进行试剂衍生化效率低，样品前处理时间过长导致部分生物胺分解等问题，提供了一种新型分散固相萃取吸附剂测定海鱼罐头中生物胺的方法，其主要针对复杂基质样品的快速前处理，衍生化效率高、选择性好，可精准高效的实现不同海鱼罐头样品中多种生物胺同时定量测定。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明公开了一种新型分散固相萃取吸附剂测定海鱼罐头中生物胺的方法，包括以下步骤：

S1、标准曲线方程的制备：将组胺、酪胺、色胺、尸胺、腐胺、亚精胺和精胺的标准品溶液分别与1,7-二氨基庚烷混合，以丹磺酰氯柱前衍生法衍生处理后采用HPLC进行分析检测，得到所述生物胺的标准曲线方程式；

S2、提取：向鱼肉样品中加入1,7-二氨基庚烷和三氯乙酸，振荡，离心，收集上清液a；

S3、除脂：向步骤S2得到的上清液a加入氯化钠和正己烷，振荡，静置分层，取下层有机相b备用；

S4、萃取：向步骤S3得到的有机相b中加入表面氧化修饰的酚醛树脂基碳球(PFC/CS)和N-丙基乙二胺(PSA)，剧烈振荡，离心，收集上清液c；

S5、衍生：向步骤S4得到的上清液c中依次加入饱和碳酸氢钠溶液、氢氧化钠溶液和丹磺酰氯衍生试剂，混匀后置于55-60℃恒温水浴中衍生，冷却至室温后依次加入氨水、氯化钠和乙醚，振荡，取有机层在30-40℃水浴下氮吹近干，加入乙腈，混匀，过滤后采用HPLC进行分析检测，得到生物胺的吸收峰值；

S6、根据步骤S1得到的生物胺的标准曲线方程式和步骤S5得到的鱼肉样品中生物胺的吸收峰值，可得到鱼肉样品中生物胺的含量。

优选地，步骤S2所述三氯乙酸质量百分比浓度为5％-10％，优选为5％；每毫升三氯乙酸溶液中添加0.20g-0.50g样品，优选为0.25g。

优选地，步骤S3所述正己烷和上清液a的体积比为1:1-2:1，优选为1:1；每毫升上清液a中加入0.05g-0.10g氯化钠，优选为加入0.05g氯化钠。

优选地，步骤S4所述表面氧化修饰的酚醛树脂基碳球(PFC/CS)和N-丙基乙二胺(PSA)的质量比为1:1-1:4，每毫升步骤S3得到的有机相b中加入0.01-0.04g表面氧化修饰的酚醛树脂基碳球(PFC/CS)。

优选地，步骤S4所述表面氧化修饰的酚醛树脂基碳球(PFC/CS)的制备方法包括以下步骤：

(1)按苯酚和间苯二酚的摩尔比1:1-1.5的配比，将氨水、无水乙醇、苯酚、间苯二酚和水混合，室温下混合搅拌均匀，加入甲醛，25-30℃恒温水浴，得到溶液a；

(2)将步骤(1)得到的溶液a置于水热反应釜中，升温至100-150℃后，保持2-4h，自然冷却至室温，得到产物b；

(3)将步骤(2)得到的产物b抽滤，水洗、醇洗后，离心，干燥，得到酚醛树脂微球(PFC)；

(4)将步骤(3)得到的酚醛树脂微球(PFC)150-200℃热处理，在氮气保护条件下，再置于高温管式炉中700-1000℃煅烧2-4h，得到酚醛树脂基碳球(PFC/CS)；

(5)称取2-5g步骤(4)得到的酚醛树脂基碳球(PFC/CS)，加入40-80mL硫酸，超声振荡，加入40-80mL硝酸，沸水浴回流0.5-1.0h，降温至50-60℃继续回流6-12h，冷却后除去上层酸液，用水洗涤沉淀物至中性，真空干燥，研磨过筛，即得表面氧化修饰的酚醛树脂基碳球(PFC/CS)。

优选地，步骤S5所述氢氧化钠溶液的浓度为5mol/L，丹磺酰氯衍生试剂浓度为10mg/mL；

其中，上述上清液c和饱和碳酸氢钠溶液的体积比为1:1-1:1.2，优选为1:1；上清液c和氢氧化钠溶液的体积比为50:1-25:1，优选为50:1；上清液c和丹磺酰氯衍生试剂的体积比为1:1-1:1.2，优选为1:1；

上清液c和氨水的体积比为10:1-5:1，优选为10:1；上清液c和乙醚的体积比为1:5-2:5，优选为1:5；每毫升上清液c中加入0.5g-1.0g氯化钠，优选为加入0.5g氯化钠。

优选地，步骤S5所述HPLC采用的色谱柱为C₁₈色谱柱；柱温为30℃；进样量为10μL；流速为0.8mL/min。

优选地，上述HPLC采用乙酸/乙酸铵/乙腈作为流动相进行梯度洗脱；其中，乙酸铵的浓度为0.01mol/L，乙腈为色谱纯；

其中，以体积百分数计，上述乙酸0.1％，乙酸铵和乙腈的体积比为1:9，作为流动相A；以体积百分数计，上述乙酸0.1％，乙酸铵和乙腈的体积比为9:1，作为流动相B。

优选地，上述梯度洗脱的程序设置为：0-22min为60％流动相A，22-25min为85％流动相A到100％流动相A，25-32min为100％流动相A到60％流动相A；32-37min为60％流动相A，37-40min为60％流动相A到20％流动相A。

优选地，步骤S5所述HPLC采用的紫外检测波长为254nm。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明以7种常见生物胺作为检测对象，提供一种全新的复杂基质样品快速前处理的方法，样品只需经过简单分散固相萃取和柱前衍生化处理，即可实现海鱼罐头样品的7种生物胺的高通量多组分同时准确定量。其衍生化效率高、选择性好、检测结果精准高效，具备良好的实用性和基层推广性。

附图说明

图1为本发明实施例1中酚醛树脂基碳球(PFC/CS)的高分辨率扫描电镜图。

图2为本发明实施例1中质量浓度为50.0μg/mL的7种生物胺标准品溶液及其内标衍生物的高效液相色谱图。其中，标号及其组分分别为：1.色胺；2.腐胺；3.尸胺；4.组胺；5.酪胺；6.亚精胺；7.精胺；8.1,7-二氨基庚烷。

图3为本发明实施例1、实施例2和实施例3待测沙丁鱼样品溶液的HPLC色谱图，其中，a为实施例1的色谱图，b为实施例2的色谱图，c为实施例3的色谱图。

图4为本发明实施例1、实施例2和实施例3待测鲅鱼样品溶液的HPLC色谱图，其中，a为实施例1的色谱图，b为实施例2的色谱图，c为实施例3的色谱图。

图5为本发明实施例1、实施例2和实施例3待测青鳞鱼样品溶液的HPLC色谱图，其中，a为实施例1的色谱图，b为实施例2的色谱图，c为实施例3的色谱图。

图6为本发明对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5待测沙丁鱼样品溶液的HPLC色谱图，其中，a为对比例1的色谱图，b为对比例2的色谱图，c为对比例3的色谱图，d为对比例4的色谱图，e为对比例5的色谱图。

图7为本发明对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5待测鲅鱼样品溶液的HPLC色谱图，其中，a为对比例1的色谱图，b为对比例2的色谱图，c为对比例3的色谱图，d为对比例4的色谱图，e为对比例5的色谱图。

图8为本发明对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5待测青鳞鱼样品溶液的HPLC色谱图，其中，a为对比例1的色谱图，b为对比例2的色谱图，c为对比例3的色谱图，d为对比例4的色谱图，e为对比例5的色谱图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，对其来源不做具体限定，其中标准品组胺盐酸盐、酪胺盐酸盐、色胺盐酸盐、尸胺盐酸盐、腐胺盐酸盐、亚精胺盐酸盐和精胺盐酸盐标准品(纯度均>98.0％)，内标1,7-二氨基庚烷和衍生剂丹磺酰氯(纯度均>99.0％)均购自上海安谱试剂有限公司；丙酮、乙醚、正丁醇、三氯甲烷、乙酸、乙腈(色谱纯)；盐酸、氨水、硫酸、硝酸(分析纯)；苯酚、间苯二酚；氢氧化钠、碳酸氢钠，乙酸铵；实验室用水为Milli-Q超纯水。沙丁鱼罐头、鲅鱼罐头和青鳞鱼罐头等海鱼罐头均为市售。

实施例1

1.表面氧化修饰酚醛树脂基碳球(PFC/CS)的制备

将0.1mL氨水(体积百分数为25％)与8.0mL无水乙醇溶于20mL纯水中，室温条件下混合并搅拌30min；加入0.2g苯酚和0.2g间苯二酚，室温条件下混合、溶解并搅拌30min，加入0.5mL甲醛(体积百分数为37％)，25℃恒温水浴24h。将上述溶液放入水热反应釜中150℃保持3h并自然冷却至室温；反应产物用G3玻璃砂芯漏斗抽滤后，反复水洗和醇洗，离心分离，100℃干燥，即得酚醛树脂微球。

将酚醛树脂微球150℃热处理交联固化，在氮气保护下，进一步置于高温管式炉中800℃高温煅烧3h，即得酚醛树脂基碳球(PFC/CS)，粒径400nm左右。

称取2.0g PFC/CS粉末于250mL平底烧瓶，加入50mL硫酸，超声波振荡分散10min后加入50mL硝酸，沸水浴中100℃回流1h，降温至50℃继续回流10h，冷却至室温后，除去上层酸液，反复用水洗涤沉淀物至中性，真空干燥后研磨成均匀细粉过筛，即得表面氧化修饰的酚醛树脂基碳球(PFC/CS)。

2.生物胺标准品溶液的配制

精确称取组胺、酪胺、色胺、尸胺、腐胺、亚精胺和精胺等7种生物胺标准品各0.0100g，分别置于5个10mL规格的容量瓶中，然后加入0.1mol/L盐酸溶液溶解并定容至10mL，混匀，配制成质量浓度均为1000mg/L的单一生物胺标准品。然后分别吸取1.00mL的单一生物胺标准品，置于同一个容量瓶中，加入0.1mol/L的盐酸稀释，混匀，配制终质量浓度为100mg/L的混合生物胺标准品使用液。

精确称取1,7-二氨基庚烷内标标准品0.100g，加入0.1mol/L盐酸溶液溶解并定容至10mL，配制成质量浓度为10mg/mL的内标标准储备液，然后准确吸取200μL内标标准储备液，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并定容至10mL，配制成终质量浓度为200mg/L的内标标准使用液。

用移液器分别移取100mg/L的混合生物胺标准品使用液10μL、25μL、50μL、100μL、150μL和250μL，各加250μL内标标准使用液(质量浓度为200mg/L)后，分别补加740μL、725μL、700μL、650μL、600μL和500μL 0.1mol/L盐酸溶液，得到质量浓度分别为1.0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、15.0mg/L、25.0mg/L和50.0mg/L含内标的生物胺标准品系列溶液。

准确移取上述生物胺标准品系列溶液各1.0mL，依次加入1.0mL饱和碳酸氢钠溶液、20μL氢氧化钠溶液(浓度为5.0mol/L)和1.0mL丹磺酰氯衍生试剂(质量浓度为10mg/mL)，涡旋混匀后置于60℃恒温水浴中衍生45min，待冷却到室温后依次加入100μL氨水、0.5g氯化钠和5mL乙醚，充分振荡10min，取上层有机层在35℃水浴下氮吹近干，加入1mL乙腈涡旋混匀后，再用0.22μM有机膜过滤后待测。

3.沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼提取液的制备及其生物胺柱前衍生化

取沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼罐头中的可食用部分500g左右，搅碎匀浆，保鲜袋密封储于-20℃冰箱，准确称取均质沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼样品10g于100mL具塞锥形瓶中，加入250μL内标标准使用液(质量浓度为200mg/L)与样品充分混匀，加入40mL 5％三氯乙酸溶液，振荡提取25min，转移至50mL具塞离心管中，5000r/min离心20min后，将上清液转移至另一50mL离心管中待用。

移取上述上清液10mL，加入0.5g氯化钠和10mL正己烷，涡旋振荡10min，静置分层后留下层有机相待用。如乳化严重，则采用5000r/min离心20min进行离心破乳。

准确移取有机相1mL，加入0.02g酚醛树脂基碳球(PFC/CS)和0.04g N-丙基乙二胺(PSA)混合固相吸附剂于带盖微型离心管中，剧烈涡旋2min，充分分散净化，5000r/min离心15min后，吸取上清液待衍生。

准确移取上述待衍生的上清液1.0mL，依次加入1.0mL饱和碳酸氢钠溶液、20μL氢氧化钠溶液(浓度为5.0mol/L)和1.0mL丹磺酰氯衍生试剂(质量浓度为10mg/mL，用丙酮配制)，涡旋混匀后置于60℃恒温水浴中衍生45min，待冷却到室温后依次加入100μL氨水、0.5g氯化钠和5mL乙醚，充分振荡10min，取有机层在35℃水浴下氮吹近干，加入1mL乙腈涡旋混匀后，再用0.22μM有机膜过滤后待测。

4.HPLC分析检测条件

色谱柱选择ZORBAX Eclipse XDB C₁₈柱(4.6×250mm，内径5μm)，紫外检测波长设为254nm，进样量10μL，柱温30℃，流速0.8mL/min，流动相为乙酸/0.1mol/L乙酸铵/乙腈；其中，流动相A：含0.1％乙酸的0.01mol/L乙酸铵溶液/乙腈(体积比1:9)，流动相B：含0.1％乙酸的0.01mol/L乙酸铵溶液/乙腈(体积比9:1)；梯度洗脱条件设置如表1。

表1

图1为酚醛树脂基碳球(PFC/CS)的高分辨率扫描电镜图。

图2为质量浓度为50.0μg/mL生物胺标准品溶液HPLC色谱图。

图3(a)、图4(a)和图5(a)分别为实施例1得到的待测沙丁鱼样品、鲅鱼样品和青鳞鱼样品溶液的HPLC色谱图。

5.7种生物胺的标准曲线、相关系数、检出限、定量限、平均回收率和精密度

将乙腈空白溶液和1.0-50.0μg/mL生物胺标准品系列溶液分别进行HPLC检测，测得不同生物胺浓度下对应的峰面积，以生物胺标准品系列溶液中生物胺的质量浓度为横坐标、以相对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。同时分别添加10.0mg/kg、50.0mg/kg和100.0mg/kg三个添加量进行加标回收试验。按照最佳试验条件进行提取和检测，每个加标浓度平行测定6次，计算平均加标回收率(％)和相对标准偏差(％)。

结果表明，7种生物胺进行了分析检测的曲线范围为1.0-50.0μg/mL，检出限(LOD)范围为7.2-10.8mg/kg，定量限(LOQ)范围为24-36mg/kg，相关系数(R²)为0.9996-1。在代表性样品中添加组胺混合标准溶液，低、中、高三种添加量的平均回收率在92.3-97.7％之间，相对标准偏差RSD(％)在1.9-4.8％之间。

具体结果见表2。

表2.7种组胺的标准曲线、相关系数、检出限、定量限、方法回收率和精密度

6.试样溶液的测定

将前处理后的待测试样溶液在最佳液相色谱条件下分别进样，以保留时间定性，经测试得到的相应峰面积，根据标准曲线计算得到不同品种样品的生物胺质量浓度。

7.空白试验

在进行样品前处理与仪器测定的同时，进行了空白试验。即不加待测试样，其余步骤均与含试样时的分析步骤完全相同的试验。

8.结果计算

计算公式：

其中，X为试样中生物胺的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)，C为代入标准曲线获得的待测试液中某一种生物胺组分的浓度，单位为毫克每升(mg/L)，V为试样待测液定容体积,单位为毫升(mL)，1000为单位转换倍数，m为试样质量，单位为克(g)，n为稀释倍数。

经计算，实施例1中的3种海鱼罐头阳性样品检测到的组分及其质量浓度分别为：沙丁鱼中腐胺78.8mg/kg、组胺173.5mg/kg、精胺38.7mg/kg、总生物胺291.3mg/kg，鲅鱼中腐胺31.4mg/kg、尸胺29.2mg/kg、组胺775.2mg/kg、酪胺13.9mg/kg、亚精胺10.9mg/kg、精胺13.8mg/kg、总生物胺874.4mg/kg；青鳞鱼中腐胺63.2mg/kg、尸胺41.8mg/kg、组胺24.6mg/kg、酪胺19.2mg/kg、亚精胺16.7mg/kg、精胺29.5mg/kg、总生物胺153.2mg/kg。

对比例1

本对比例除以下步骤3样品提取液的制备及其生物胺柱前衍生化步骤与实施例1不同，其余均与实施例1相同。

3.沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼提取液的制备及其生物胺柱前衍生化

取沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼罐头中的可食用部分500g左右，搅碎匀浆，保鲜袋密封储于-20℃冰箱，准确称取均质沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼样品10g于100mL具塞锥形瓶中，加入250L内标标准使用液(质量浓度为200mg/L)与样品充分混匀，加入40mL 5％三氯乙酸溶液，振荡提取25min，转移至50mL具塞离心管中，5000r/min离心20min后，将上清液转移至另一50mL离心管中待用。

移取上述上清液10mL，加入0.5g氯化钠和10mL正己烷，涡旋振荡10min，静置分层后留下层有机相待用。如乳化严重，则采用5000r/min离心20min进行离心破乳。

准确移取上述待衍生的有机相1.0mL，依次加入1.0mL饱和碳酸氢钠溶液、20μL氢氧化钠溶液(浓度为5.0mol/L)和1.0mL丹磺酰氯衍生试剂(质量浓度为10mg/mL，用丙酮配制)，涡旋混匀后置于60℃恒温水浴中衍生45min，待冷却到室温后依次加入100L氨水、0.5g氯化钠和5mL乙醚，充分振荡10min，取有机层在35℃水浴下氮吹近干，加入1mL乙腈涡旋混匀后，再用0.22μM有机膜过滤后待测。

图6(a)、图7(a)和图8(a)分别为对比例1得到的待测沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼样品溶液的HPLC色谱图。

经计算，对比例1中的3种海鱼罐头阳性样品检测到的组分及其质量浓度分别为：沙丁鱼中腐胺102.2mg/kg、组胺47.8mg/kg、亚精胺10.9mg/kg、精胺20.2mg/kg、总生物胺181.1mg/kg，鲅鱼中腐胺99.5mg/kg、组胺72.9mg/kg、亚精胺12.5mg/kg、精胺13.0mg/kg、总生物胺197.9mg/kg；青鳞鱼中腐胺92.8mg/kg、组胺49.1mg/kg、亚精胺17.7mg/kg、精胺13.1mg/kg、总生物胺172.7mg/kg。

实施例2

本实施例除以下步骤3样品提取液的制备及其生物胺柱前衍生化步骤与实施例1不同，其余均与实施例1相同。3.沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼提取液的制备及其生物胺柱前衍生化

取沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼罐头中的可食用部分500g左右，搅碎匀浆，保鲜袋密封储于-20℃冰箱，准确称取均质沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼样品10g于100mL具塞锥形瓶中，加入250μL内标标准使用液(质量浓度为200mg/L)与样品充分混匀，加入40mL 5％三氯乙酸溶液，振荡提取25min，转移至50mL具塞离心管中，4000r/min离心20min后，将上清液转移至另一50mL离心管中待用。

移取上述上清液10mL，加入0.5g氯化钠和10mL正己烷，涡旋振荡8min，静置分层后留下层有机相待用。如乳化严重，则采用5000r/min离心20min进行离心破乳。

准确移取有机相1mL，加入0.04g PFC/CS和0.04g PSA混合固相吸附剂于带盖微型离心管中，剧烈涡旋2min，充分分散净化，6000r/min离心5min后，吸取上清液待衍生。

准确移取上述待衍生的上清液1.0mL，依次加入1.0mL饱和碳酸氢钠溶液、20μL氢氧化钠溶液(浓度为5.0mol/L)和1.0mL丹磺酰氯衍生试剂(质量浓度为10mg/mL，用丙酮配制)，涡旋混匀后置于60℃恒温水浴中衍生45min，待冷却到室温后依次加入100μL氨水、0.5g氯化钠和5mL乙醚，充分振荡10min，取有机层在35℃水浴下氮吹近干，加入1mL乙腈涡旋混匀后，再用0.22μM有机膜过滤后待测。

图3(b)、图4(b)和图5(b)分别为实施例2得到的待测沙丁鱼样品、鲅鱼样品和青鳞鱼样品溶液的HPLC色谱图。

经计算，实施例2中的3种海鱼罐头阳性样品检测到的组分及其质量浓度分别为：沙丁鱼中腐胺81.8mg/kg、组胺177.1mg/kg、精胺40.0mg/kg、总生物胺298.9mg/kg；鲅鱼中腐胺31.2mg/kg、尸胺34.4mg/kg、组胺783.3mg/kg、酪胺10.9mg/kg、亚精胺13.6mg/kg、精胺14.6mg/kg、总生物胺888.0mg/kg；青鳞鱼中腐胺62.6mg/kg、尸胺39.0mg/kg、组胺25.3mg/kg、酪胺18.7mg/kg、亚精胺15.4mg/kg、精胺30.3mg/kg、总生物胺152.3mg/kg。

对比例2

本对比例除以下步骤3样品提取液的制备及其生物胺柱前衍生化步骤与实施例2不同，其余均与实施例2相同。

3.沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼提取液的制备及其生物胺柱前衍生化

取沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼罐头中的可食用部分500g左右，搅碎匀浆，保鲜袋密封储于-20℃冰箱，准确称取均质沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼样品10g于100mL具塞锥形瓶中，加入250μL内标标准使用液(质量浓度为200mg/L)与样品充分混匀，加入40mL 5％三氯乙酸溶液，振荡提取20min，转移至50mL具塞离心管中，4000r/min离心20min后，将上清液转移至另一50mL离心管中待用。

移取上述上清液10mL，加入0.5g氯化钠和10mL正己烷，涡旋振荡10min，静置分层后留下层有机相待用。如乳化严重，则采用5000r/min离心20min进行离心破乳。

准确移取有机相1mL，加入0.04g PSA固相吸附剂于带盖微型离心管中，剧烈涡旋2min，充分分散净化，6000r/min离心5min后，吸取上清液待衍生。

准确移取上述待衍生的上清液1.0mL，依次加入1.0mL饱和碳酸氢钠溶液、20μL氢氧化钠溶液(浓度为5.0mol/L)和1.0mL丹磺酰氯衍生试剂(质量浓度为10mg/mL，用丙酮配制)，涡旋混匀后置于60℃恒温水浴中衍生45min，待冷却到室温后依次加入100μL氨水、0.5g氯化钠和5mL乙醚，充分振荡10min，取有机层在35℃水浴下氮吹近干，加入1mL乙腈涡旋混匀后，再用0.22μM有机膜过滤后待测。

图6(b)、图7(b)和图8(b)分别为对比例2得到的待测沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼样品溶液的HPLC色谱图。

经计算，对比例2中的3种海鱼罐头阳性样品检测到的组分及其质量浓度分别为：沙丁鱼中腐胺59.9mg/kg、精胺27.4mg/kg、总生物胺87.3mg/kg；鲅鱼中腐胺78.5mg/kg、亚精胺17.6mg/kg、精胺19.8mg/kg、总生物胺115.8mg/kg；青鳞鱼中腐胺46.9mg/kg、亚精胺25.3mg/kg、精胺24.0mg/kg、总生物胺96.2mg/kg。

实施例3

本实施例除以下步骤3样品提取液的制备及其生物胺柱前衍生化步骤与实施例1不同，其余均与实施例1相同。

3.沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼提取液的制备及其生物胺柱前衍生化

取沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼罐头中的可食用部分500g左右，搅碎匀浆，保鲜袋密封储于-20℃冰箱，准确称取均质沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼样品10g于100mL具塞锥形瓶中，加入250μL内标标准使用液(质量浓度为200mg/L)与样品充分混匀，加入40mL 5％三氯乙酸溶液，振荡提取30min，转移至50mL具塞离心管中，6000r/min离心10min后，将上清液转移至另一50mL离心管中待用。

移取上述上清液10mL，加入0.5g氯化钠和10mL正己烷，涡旋振荡5min，静置分层后留下层有机相待用。如乳化严重，则采用6000r/min离心10min进行离心破乳。

准确移取有机相1mL，加入0.02g PFC/CS和0.08g PSA混合固相吸附剂于带盖微型离心管中，剧烈涡旋2min，充分分散净化，4000r/min离心10min后，吸取上清液待衍生。

准确移取上述待衍生的上清液1.0mL，依次加入1.0mL饱和碳酸氢钠溶液、20μL氢氧化钠溶液(浓度为5.0mol/L)和1.0mL丹磺酰氯衍生试剂(质量浓度为10mg/mL，用丙酮配制)，涡旋混匀后置于60℃恒温水浴中衍生45min，待冷却到室温后依次加入100μL氨水、0.5g氯化钠和5mL乙醚，充分振荡5min，取有机层在40℃水浴下氮吹近干，加入1mL乙腈涡旋混匀后，再用0.22μM有机膜过滤后待测。

图3(c)、图4(c)和图5(c)分别为实施例3得到的待测沙丁鱼样品、鲅鱼样品和青鳞鱼样品溶液的HPLC色谱图。

经计算，实施例3中的3种海鱼罐头阳性样品检测到的组分及其质量浓度分别为：沙丁鱼中腐胺84.4mg/kg、组胺174.0mg/kg、精胺43.4mg/kg、总生物胺301.8mg/kg，鲅鱼中腐胺32.2mg/kg、尸胺34.9mg/kg、组胺790.4mg/kg、酪胺11.0mg/kg、亚精胺11.1mg/kg、精胺15.0mg/kg、总生物胺894.7mg/kg；青鳞鱼中腐胺71.0mg/kg、尸胺34.3mg/kg、组胺20.5mg/kg、酪胺18.0mg/kg、亚精胺11.4mg/kg、精胺35.4mg/kg、总生物胺156.3mg/kg。

对比例3

本对比例除以下步骤3样品提取液的制备及其生物胺柱前衍生化步骤与实施例3不同，其余均与实施例3相同。

3.沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼提取液的制备及其生物胺柱前衍生化

取沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼罐头中的可食用部分500g左右，搅碎匀浆，保鲜袋密封储于-20℃冰箱，准确称取均质沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼样品10g于100mL具塞锥形瓶中，加入250μL内标标准使用液(质量浓度为200mg/L)与样品充分混匀，加入40mL 5％高氯酸溶液，振荡提取30min，转移至50mL具塞离心管中，6000r/min离心10min后，将上清液转移至另一50mL离心管中待用。

移取上述上清液10mL，加入0.5g氯化钠和10mL正己烷，涡旋振荡5min，静置分层后留下层有机相待用。如乳化严重，则采用6000r/min离心10min进行离心破乳。

准确移取有机相1mL，加入0.02g PFC/CS和0.08g PSA混合固相吸附剂于带盖微型离心管中，剧烈涡旋2min，充分分散净化，4000r/min离心10min后，吸取上清液待衍生。

准确移取上述待衍生的上清液1.0mL，依次加入1.0mL饱和碳酸氢钠溶液、20μL氢氧化钠溶液(浓度为5.0mol/L)和1.0mL丹磺酰氯衍生试剂(质量浓度为10mg/mL，用丙酮配制)，涡旋混匀后置于60℃恒温水浴中衍生45min，待冷却到室温后依次加入100μL氨水、0.5g氯化钠和5mL乙醚，充分振荡5min，取有机层在40℃水浴下氮吹近干，加入1mL乙腈涡旋混匀后，再用0.22μM有机膜过滤后待测。

图6(c)、图7(c)和图8(c)分别为对比例3得到的待测沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼样品溶液的HPLC色谱图。

经计算，对比例3中的3种海鱼罐头阳性样品检测到的组分及其质量浓度分别为：沙丁鱼中腐胺49.8mg/kg、精胺24.7mg/kg、总生物胺74.5mg/kg；鲅鱼中腐胺12.5mg/kg、精胺19.0mg/kg、总生物胺31.5mg/kg；青鳞鱼中腐胺41.2mg/kg、精胺20.5mg/kg、总生物胺61.7mg/kg。

对比例4

本对比例除以下步骤3样品提取液的制备及其生物胺柱前衍生化步骤与实施例3不同，其余均与实施例3相同。

3.沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼提取液的制备及其生物胺柱前衍生化

取沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼罐头中的可食用部分500g左右，搅碎匀浆，保鲜袋密封储于-20℃冰箱，准确称取均质沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼样品10g于100mL具塞锥形瓶中，加入250μL内标标准使用液(质量浓度为200mg/L)与样品充分混匀，加入40mL 5％高氯酸溶液，振荡提取30min，转移至50mL具塞离心管中，6000r/min离心10min后，将上清液转移至另一50mL离心管中待用。

移取上述上清液10mL，加入0.5g氯化钠和10mL正己烷，涡旋振荡5min，静置分层后留下层有机相待用。如乳化严重，则采用6000r/min离心10min进行离心破乳。

准确移取有机相1mL，加入0.06g PFC/CS和0.02g PSA混合固相吸附剂于带盖微型离心管中，剧烈涡旋2min，充分分散净化，4000r/min离心10min后，吸取上清液待衍生。

准确移取上述待衍生的上清液1.0mL，依次加入1.0mL饱和碳酸氢钠溶液、20μL氢氧化钠溶液(浓度为5.0mol/L)和1.0mL丹磺酰氯衍生试剂(质量浓度为10mg/mL，用丙酮配制)，涡旋混匀后置于60℃恒温水浴中衍生45min，待冷却到室温后依次加入100μL氨水、0.5g氯化钠和5mL乙醚，充分振荡5min，取有机层在40℃水浴下氮吹近干，加入1mL乙腈涡旋混匀后，再用0.22μM有机膜过滤后待测。

图6(d)、图7(d)和图8(d)分别为对比例4得到的待测沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼样品溶液的HPLC色谱图。

经计算，对比例4中的3种海鱼罐头阳性样品检测到的组分及其质量浓度分别为：沙丁鱼中腐胺21.2mg/kg、组胺16.6mg/kg、总生物胺37.8mg/kg，鲅鱼中腐胺14.1mg/kg、组胺10.9mg/kg、总生物胺25.0mg/kg；青鳞鱼中组胺21.9mg/kg、酪胺16.7mg/kg、总生物胺38.6mg/kg。

对比例5

本对比例除以下步骤3样品提取液的制备及其生物胺柱前衍生化步骤与实施例3不同，其余均与实施例3相同。

3.沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼提取液的制备及其生物胺柱前衍生化

取沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼罐头中的可食用部分500g左右，搅碎匀浆，保鲜袋密封储于-20℃冰箱，准确称取均质沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼样品10g于100mL具塞锥形瓶中，加入250μL内标标准使用液(质量浓度为200mg/L)与样品充分混匀，加入40mL 5％三氯乙酸溶液，振荡提取30min，转移至50mL具塞离心管中，6000r/min离心10min后，将上清液转移至另一50mL离心管中待用。

移取上述上清液10mL，加入0.5g氯化钠和10mL正己烷，涡旋振荡5min，静置分层后留下层有机相待用。如乳化严重，则采用6000r/min离心10min进行离心破乳。

准确移取有机相1mL，加入0.02g PFC/CS和0.08g PSA混合固相吸附剂于带盖微型离心管中，剧烈涡旋2min，充分分散净化，4000r/min离心10min后，吸取上清液待衍生。

准确移取上述待衍生的上清液1.0mL，依次加入1.0mL饱和碳酸氢钠溶液、20μL氢氧化钠溶液(浓度为5.0mol/L)和1.0mL苯磺酰氯衍生试剂(质量浓度为10mg/mL，用丙酮配制)，涡旋混匀后置于60℃恒温水浴中衍生45min，待冷却到室温后依次加入100μL氨水、0.5g氯化钠和5mL乙醚，充分振荡5min，取有机层在40℃水浴下氮吹近干，加入1mL乙腈涡旋混匀后，再用0.22μM有机膜过滤后待测。

图6(e)、图7(e)和图8(e)分别为对比例5得到的待测沙丁鱼、鲅鱼和青鳞鱼样品溶液的HPLC色谱图。

测试结果表明，采用对比例5的前处理方法所有组分均未检出，证明苯磺酰氯不适于生物胺衍生。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种新型分散固相萃取吸附剂测定海鱼罐头中生物胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、标准曲线方程的制备：将组胺、酪胺、色胺、尸胺、腐胺、亚精胺和精胺的标准品溶液分别与1,7-二氨基庚烷混合，以丹磺酰氯柱前衍生法衍生处理后采用HPLC进行分析检测，得到所述生物胺的标准曲线方程式；

S2、提取：向鱼肉样品中加入1,7-二氨基庚烷和三氯乙酸，振荡，离心，收集上清液a；

S3、除脂：向步骤S2得到的上清液a加入氯化钠和正己烷，振荡，静置分层，取下层有机相b备用；

S4、萃取：向步骤S3得到的有机相b中加入表面氧化修饰的酚醛树脂基碳球和N-丙基乙二胺，剧烈振荡，离心，收集上清液c；

S5、衍生后检测：向步骤S4得到的上清液c中依次加入饱和碳酸氢钠溶液、氢氧化钠溶液和丹磺酰氯衍生试剂，混匀后置于55-60℃恒温水浴中衍生，冷却至室温后依次加入氨水、氯化钠和乙醚，振荡，取有机层在30-40℃水浴下氮吹近干，加入乙腈，混匀，过滤后采用HPLC进行分析检测，得到生物胺的吸收峰值；

S6、根据步骤S1得到的生物胺的标准曲线方程式和步骤S5得到的鱼肉样品中生物胺的吸收峰值，可得到鱼肉样品中生物胺的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述三氯乙酸质量百分比浓度为5％-10％；每毫升所述三氯乙酸溶液中添加0.20g-0.50g所述鱼肉样品。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3所述正己烷和上清液a的体积比为1:1-2:1，每毫升上清液a中加入0.05g-0.10g氯化钠。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4所述表面氧化修饰的酚醛树脂基碳球和N-丙基乙二胺的质量比为1:1-1:4，每毫升步骤S3得到的有机相b中加入0.01-0.04g表面氧化修饰的酚醛树脂基碳球。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4所述表面氧化修饰的酚醛树脂基碳球的制备方法包括以下步骤：

(1)按苯酚和间苯二酚的摩尔比1:1-1.5的配比，将氨水、无水乙醇、苯酚、间苯二酚和水混合，室温下混合搅拌均匀，加入甲醛，25-30℃恒温水浴，得到溶液a；

(2)将步骤(1)得到的溶液a置于水热反应釜中，升温至100-150℃后，保持2-4h，自然冷却至室温，得到产物b；

(3)将步骤(2)得到的产物b抽滤，水洗、醇洗后，离心，干燥，得到酚醛树脂微球；

(4)将步骤(3)得到的酚醛树脂微球150-200℃热处理，在氮气保护条件下，再置于高温管式炉中700-1000℃煅烧2-4h，得到酚醛树脂基碳球；

(5)称取2-5g步骤S4得到的酚醛树脂基碳球，加入40-80mL硫酸，超声振荡，加入40-80mL硝酸，沸水浴回流0.5-1.0h，降温至50-60℃继续回流6-12h，冷却后除去上层酸液，用水洗涤沉淀物至中性，真空干燥，研磨过筛，即得表面氧化修饰的酚醛树脂基碳球。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S5所述氢氧化钠溶液的浓度为5mol/L，所述丹磺酰氯衍生试剂浓度为10mg/mL；

其中，所述上清液c和饱和碳酸氢钠溶液的体积比为1:1-1:1.2，上清液c和氢氧化钠溶液的体积比为50:1-25:1，上清液c和丹磺酰氯衍生试剂的体积比为1:1-1:1.2；

上清液c和氨水的体积比为10:1-5:1，上清液c和乙醚的体积比为1:5-2:5，每毫升上清液c中加入0.5g-1.0g氯化钠。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S5所述HPLC采用的色谱柱为C₁₈色谱柱；柱温为30℃；进样量为10μL；流速为0.8mL/min。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述HPLC采用含体积百分数0.1％乙酸的乙酸铵/乙腈作为流动相进行梯度洗脱；所述乙酸铵的浓度为0.01mol/L，所述乙腈为色谱纯；

其中，流动相A中所述乙酸铵和乙腈的体积比为1:9；流动相B中所述乙酸铵和乙腈的体积比为9:1。

9.根据权利要求7-8任一项所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序设置为：0-22min为60％流动相A，22-25min为85％流动相A到100％流动相A，25-32min为100％流动相A到60％流动相A；32-37min为60％流动相A，37-40min为60％流动相A到20％流动相A。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤S5所述HPLC采用的紫外检测波长为254nm。

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