CN104888740B - 一种乌洛托品分子印迹固相萃取柱的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种乌洛托品分子印迹固相萃取柱的制备方法及应用，采用乌洛托品为模板分子、2‑甲基丙烯酸为功能单体、2‑甲基‑2‑丙烯酸‑1,2‑乙二醇酯为交联剂、2,2'‑偶氮二异丁腈为引发剂，经过分散混匀、引发聚合与干燥，合成乌洛托品分子印迹聚合物；将所得的聚合物作为固相萃取柱的填料，制备得到乌洛托品固相萃取柱，同时将其应用于实际食品样品中乌洛托品的检测；本发明实现了食品中乌洛托品的高效分离、富集与纯化，所得的固相萃取柱可重复使用，可降低检测成本。
Description
技术领域：本发明属于食品安全检测技术领域，特别涉及一种乌洛托品分子印迹固相萃取柱的制备方法及应用。
背景技术：
乌洛托品化学名称为六亚甲基四胺，纯品为白色细粒状结晶，分子式为C6H12N4，工业上可用作酚醛塑料的固化剂、氨基塑料的催化剂等，由于其在酸性溶液中能分解放出甲醛和氨而具有杀菌作用，医学上常用于泌尿系统的消毒剂。有研究表明乌洛托品具有中等毒性，刺激皮肤，能引起皮炎及皮肤湿疹。由于乌洛托品具有杀菌作用，近年来，在执法过程中发现部分食品生产商，将其应用于食品的生产，添加到米线和腐竹等食品中，促使其色泽光亮，保质期长。2010年3月乌洛托品被全国食品安全整顿工作办公室列入食品中可能违法添加的非食用物质名单(第四批)。
在食品安全检测技术领域中，样品前处理的效果直接关系到分析结果的确准性，固相萃取技术是近年发展起来的一种新型样品前处理技术，主要用于样品的分离、纯化和富集，能更有效地将待测组分与样品基体或干扰物质分离，简化样品前处理的步骤，避免了使用大量有机溶剂，具有操作简便、快速、分离效率高等优点。在食品安全检测技术领域中已被广泛应用，成为样品分离纯化的重要技术。
目前常用的固相萃取柱通常为硅胶基质的填料、离子交换型填料、有机基质的填料和无机吸附型的填料等。这些填料的特异性不强，分离度较低，分子印迹固相萃取技术，利用分子印迹聚合物的特异性吸附机理制备固相萃取填料，由于分子印迹聚合物对模板分子具有特异选择性和亲合性，可以克服食品基质的复杂性，实现低浓度目标物的分离与富集，提高固相萃取的净化效果及分析检测技术的准确度。
发明内容：
为了解决传统的固相萃取柱分离富集乌洛托品效果不佳的缺陷，本发明提供了一种新的乌洛托品分子印迹固相萃取柱的制备方法，并优化确定了该发明固相萃取柱的使用条件。
技术方案：
乌洛托品分子印迹固相萃取柱的制备方法，该方法的步骤如下：
（1）将模板分子乌洛托品、功能单体2-甲基丙烯酸、交联剂2-甲基-2-丙烯酸-1,2-乙二醇酯，充分溶解于致孔剂中，再加入引发剂2,2'-偶氮二异丁腈。模板与功能单体的摩尔比为1:6，功能单体与交联剂的摩尔比为1:10，引发剂与功能单体的摩尔比为1:20，致孔剂为比例为1:1的甲醇/乙腈；
（2）向混合溶液中充入氮气除氧，密闭后于50℃水浴条件下振荡反应8小时，取出块状聚合物研磨，过100~200目筛，收集聚合物颗粒，采用比例为1:4的乙酸/甲醇混合溶剂对聚合物颗粒抽提18小时，除去多余的模板分子，再用纯甲醇抽提6小时，60℃真空干燥得到乌洛托品分子印迹固相萃取填料；
（3）将上述的乌洛托品分子印迹固相萃取填料应用于制备固相萃取柱，将100~500mg的乌洛托品分子印迹聚合物，填充于固相萃取空柱内，两端分别装上聚乙烯筛板，该萃取柱的体积为3~6mL。
将上述的乌洛托品分子印迹固相萃取柱应用于食品检测中，分离富集食品中的乌洛托品，具体的应用包括以下步骤：
（1）固相萃取柱装填好后，依次用1个柱体积的甲醇和1个柱体积的乙醇活化柱体；
（2）称取食品样品5~10g，加入50mL提取溶剂甲醇、乙醇、乙腈、水中的一种或两种的混合溶剂，振荡混匀，快速定性滤纸过滤，收集滤液用于净化；
（3）取1~2个柱体积的样品提取液上样注入固相萃取柱；
（4）用1个柱体积的乙醚清洗柱体，以除去食品基质中的杂质；
（5）最后用2~3个柱体积的甲醇、乙醇、乙腈、水中的一种或两种的混合溶剂为洗脱溶剂，洗脱乌洛托品，收集洗脱液，采用液相色谱仪或液质联用仪进行测定。
进一步地，一种乌洛托品分子印迹固相萃取柱在食品检测中的应用，操作步骤如下：
（1）向已使用过的乌洛托品分子印迹固相萃取柱中，注入3~5个柱体积的比例为1:4的乙酸/甲醇混合溶剂，清洗柱体内残留的乌洛托品分子与杂质；
（2）用2~3个柱体积的甲醇清洗柱体，以除去残留的乙酸；
（3）按上述方法处理后的分子印迹固相萃取柱，可再次应用于食品中乌洛托品的分离、富集与纯化。
本发明制备的乌洛托品分子印迹固相萃取柱与传统的固相萃取柱相比具有如下优势：制备的时间快速，过程简单易行，得到的聚合物容易研磨，填料粒径大小均匀，适用于制备固相萃取柱，柱效稳定，采用的上样溶液能使乌洛托品较好地吸附于分子印迹聚合物填料上，清洗溶剂能将样品基质中的干扰物洗净，但不会将乌洛托品分子从填料中洗出，采用的洗脱溶剂能较好地将乌洛托品分子从填料中洗脱下来。对含乌洛托品的食品样品实现了高选择性的检测，回收率较高，相对标准偏差小，具有操作更为简单和准确等特点，且所得的分子印迹固相萃取柱可重复使用，可降低检测成本。
具体实施方式：
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的以下典型实施例但非限制性的实施例如下：
实施例1：乌洛托品分子印迹固相萃取柱的制备
称取1mmol的乌洛托品，放入100mL的磨口圆底烧瓶中，再加入6mmol的2-甲基丙烯酸和60mmol的2-甲基-2-丙烯酸-1,2-乙二醇酯，加入40mL的1:1甲醇/乙腈混合溶剂，充分混匀溶解，再加入0.3mmol的2,2'-偶氮二异丁腈。充入氮气5分钟，盖上磨口玻璃塞，再用封口膜将瓶口密封，混合溶液在50℃水浴条件下振荡反应8小时，取出块状聚合物研磨，过100~200目筛，将收集的聚合物颗粒用快速定性滤纸包好，放入索氏抽提器中，用500mL比例为1:4的乙酸/甲醇混合溶剂抽提18小时，除去多余的模板分子，再用500mL甲醇抽提6小时，60℃真空干燥得到乌洛托品分子印迹固相萃取填料。
先将一个聚乙烯筛板加入到容量为3mL的聚丙烯固相萃取空柱的底部，再加入200mg的乌洛托品分子印迹固相萃取填料，加入填料后在柱的上端再加一个聚乙烯筛板，用筛板插入工具压紧。
实施例2：乌洛托品分子印迹固相萃取柱的应用
依次用3mL的甲醇和3mL的乙醇活化实施例1中制备好的乌洛托品分子印迹固相萃取柱，称取米线样品10g，放入三角烧瓶中，加入50mL提取溶剂，振荡混匀，快速定性滤纸过滤，收集滤液用于净化，取6mL的样品提取液上样注入固相萃取柱，用3mL的乙醚清洗柱体，最后采用6mL的洗脱溶剂，洗脱乌洛托品，收集洗脱液，采用液相色谱串联质谱仪进行测定。
结果：分子印迹固相萃取柱对米线中的乌洛托品具有专一选择性的富集和纯化能力，对米线样品中加标回收率为92.4%。
实施例3：乌洛托品分子印迹固相萃取柱的重复使用
将实例2中使用过的3mL的乌洛托品分子印迹固相萃取柱取出，注入15mL的比例为1:4的乙酸/甲醇混合溶剂，清洗柱体内残留的乌洛托品分子与杂质，再用9mL的甲醇清洗柱体，以除去残留的乙酸，再按照实例2中的方法，取相同的样品进行处理，最后收集洗脱液，采用液相色谱串联质谱仪进行测定。
结果：重复使用同一支乌洛托品分子印迹固相萃取柱进行6次试验，米线样品中的加标回收率为90.8%，相对标准偏差为4.1%，重复使用效果良好，柱效没有发生明显变化。
Claims (3)
1.一种乌洛托品分子印迹固相萃取柱的制备方法，其特征在于，以乌洛托品为模板分子、2-甲基丙烯酸为功能单体、2-甲基-2-丙烯酸-1,2-乙二醇酯为交联剂、2,2'-偶氮二异丁腈为引发剂，通过如下步骤制备：
（1）将模板分子乌洛托品、功能单体2-甲基丙烯酸、交联剂2-甲基-2-丙烯酸-1,2-乙二醇酯，充分溶解于致孔剂中，再加入引发剂2,2'-偶氮二异丁腈，得到混合溶液；其中，模板分子与功能单体的摩尔比为1:6，功能单体与交联剂的摩尔比为1:10，引发剂与功能单体的摩尔比为1:20，致孔剂为比例1:1的甲醇/乙腈；
（2）向混合溶液中充入氮气除氧，密闭后于50℃水浴条件下振荡反应8小时，取出块状聚合物研磨，过100~200目筛，收集聚合物颗粒，采用比例为1:4的乙酸/甲醇混合溶剂对聚合物颗粒抽提18小时，除去多余的模板分子，再用纯甲醇抽提6小时，60℃真空干燥得到乌洛托品分子印迹固相萃取填料；
（3）将100~500mg的乌洛托品分子印迹固相萃取填料，填充于固相萃取空柱内，两端分别装上聚乙烯筛板，该萃取柱的体积为3~6mL。
2.如权利要求1所述的制备方法制备的乌洛托品分子印迹固相萃取柱在食品检测中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）固相萃取柱装填好后，依次用1个柱体积的甲醇和1个柱体积的乙醇活化柱体；
（2）称取食品样品5~10g，加入50mL提取溶剂甲醇、乙醇、乙腈或水中的一种或两种的混合溶剂，振荡混匀，快速定性滤纸过滤，收集滤液用于净化；
（3）取1~2个柱体积的样品提取液上样注入固相萃取柱；
（4）用1个柱体积的乙醚清洗柱体，以除去食品基质中的杂质；
（5）最后用2~3个柱体积的甲醇、乙醇、乙腈、水中的一种或两种的混合溶剂为洗脱溶剂，洗脱乌洛托品，收集洗脱液，采用液相色谱仪或液质联用仪进行测定。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）向已使用过的乌洛托品分子印迹固相萃取柱中，注入3~5个柱体积的比例为1:4的乙酸/甲醇混合溶剂，清洗柱体内残留的乌洛托品分子与杂质；
（2）用2~3个柱体积的甲醇清洗柱体，以除去残留的乙酸；
（3）按上述处理后的分子印迹固相萃取柱，再次应用于食品中乌洛托品的分离、富集与纯化。
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