CN108535385A - 一种l-亮氨酸的高效液相色谱检测方法 - Google Patents

一种l-亮氨酸的高效液相色谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种L‑亮氨酸的高效液相色谱检测方法，涉及柱色谱法技术领域。色谱条件：色谱柱：氨基键合硅胶柱；流动相：磷酸二氢钾水溶液和乙腈的体积百分比为37％:63％‑42％:58％；其中，磷酸二氢钾水溶液浓度为0.1‑0.2mol/L，磷酸二氢钾水溶液中含有氨水，氨水占磷酸二氢钾水溶液的0.5vt％,磷酸二氢钾水溶液pH值为4.2±0.02；流动相流速：0.7‑1.0mL/min；检测波长：210nm；色谱柱柱温：30℃；进行高效液相色谱分析，测定转化液中L‑亮氨酸含量。本发明方法可快速、准确测定出L‑亮氨酸含量，确保其质量可控，减小误差，节约成本，操作简单，检测时间短，准确度高，提高了效率。

Description

一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法
技术领域
本发明涉及柱色谱法技术领域，尤其涉及一种L-亮氨酸的高效液相检测方法。
背景技术
酮亮氨酸钙在体内利用非必需氨基酸的氮转化为亮氨酸而发挥作用。亮氨酸为人体8种必需氨基酸之一，属于支链氨基酸。L-亮氨酸是复合氨基酸静脉注射液不可缺少的原料，对于维持危重病人的营养需要，抢救患者的生命起着积极的作用。同时作为支链氨基酸，因其氧化速率较快，在体内分解产生ATP的效率高于其它氨基酸，从而用来补充大运动量引起的能量消耗，减轻由此引起的中枢神经系统的疲劳反应，减少高强度运动造成的蛋白分解。
L-亮氨酸是制备酮亮氨酸钙的起始原料，由于生产前需对原料药进行质量检测。现有技术中公开了采用C18色谱柱，0.01mmol/L磷酸二氢钾：乙腈、甲醇混合的流动相，在线衍生的方法，但该方法检测时间长，一个样品需35min，且需梯度洗脱，对高效液相色谱仪、配制流动相的试剂要求较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法，该方法可快速，准确测定出L-亮氨酸的含量，确保其质量可控，减小误差，节约成本，操作简单，检测时间短，准确度高，提高了效率。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法：
色谱条件为：
色谱柱：氨基键合硅胶柱；
流动相：磷酸二氢钾水溶液和乙腈；流动相中磷酸二氢钾水溶液和乙腈的体积百分比为37％:63％-42％:58％；
其中，所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.1mol/L，磷酸二氢钾水溶液中含有氨水，氨水占磷酸二氢钾水溶液的0.5vt％,磷酸二氢钾水溶液的pH值为4.2±0.02；
流动相流速：0.7-1.0mL/min；
检测波长：210nm；
色谱柱柱温：30℃；
检测步骤为：
(1)配制流动相，过滤，脱气；
(2)调节高效液相色谱仪条件，平衡色谱柱；
(3)对照品溶液和供试品溶液的配制：称取L-亮氨酸对照品和L-亮氨酸供试品，分别用流动相溶解定容，即得；
(4)将对照品溶液、供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪，记录色谱图及峰面积，采用外标法计算L-亮氨酸的含量。
优选的，流动相流速为0.7mL/min。
优选的，流动相中磷酸二氢钾水溶液和乙腈的体积百分比为40％:60％；磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.1mol/L。
优选的，步骤(3)中，对照品溶液的浓度为0.4mg/mL。
优选的，步骤(3)中，供试品溶液的配制为：含有L-亮氨酸的生物转化液0.5ml，用流动相溶解并稀释至50ml。
优选的，色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm，其填料粒径为5μm。
优选的，步骤(4)中，对照品溶液和供试品溶液的色谱柱进样体积均为20μl。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
(1)本发明方法可快速，准确测定出L-亮氨酸的含量，确保其质量可控，减小误差，节约成本，操作简单，出峰时间快，缩短生产过程中的检测时间，9min即可检测完成(现有方法需35min)，准确度高，大大提高了生产效率。
(2)本发明方法可通过一次高效液相检测，准确测定出转化液中L-亮氨酸的含量，且与其他杂质峰达到很好的分离效果，节省了人工、时间和溶剂等成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图；
图1是本发明实施例中L-亮氨酸对照品溶液的色谱图；
图2是本发明实施例2中L-亮氨酸供试品溶液的色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法，步骤如下：
步骤1、L-亮氨酸对照品溶于流动相中，按比例稀释，分别相当于每1ml中含300μg、400μg、500μg、600μg、700μg的标准溶液；
步骤2、采用液相色谱仪分别对不同浓度的标准溶液进行液相色谱分析，记录分析得到的峰面积，并采用外标法绘制L-亮氨酸含量-峰面积的标准曲线，得出标准曲线回归方程为y＝22804x-184098，R2＝0.9997；
步骤3、将含有L-亮氨酸的生物转化液0.5ml，用流动相稀释至50ml，利用液相色谱仪进行液相色谱分析，采用与标准溶液完全相同的测定条件，并记录峰面积，根据步骤2的标准曲线回归方程y＝22804x-184098，R2＝0.9997计算得出所述L-亮氨酸的含量为53.5g/L(外标法测得含量为52.9g/L)。
检测方法的检测参数为：
色谱柱：氨基键合硅胶柱；
流动相：磷酸二氢钾水溶液和乙腈；流动相中磷酸二氢钾水溶液和乙腈的体积百分比为37％:63％-42％:58％；
其中，所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.1-0.2mol/L，磷酸二氢钾水溶液中含有氨水，氨水占磷酸二氢钾水溶液的0.5vt％,磷酸二氢钾水溶液的pH值为4.2±0.02；
流动相流速：0.7-1.0mL/min；
检测波长：210nm；
色谱柱柱温：30℃。
本发明实施例提供的一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法，可通过一次高效液相检测，准确测定出转化液中L-亮氨酸的含量，且与其他杂质峰达到很好的分离效果，节省了人工、时间和溶剂等成本。
以下实施例中，采用的高效液相色谱仪为安捷伦1260和沃特斯2489；色谱柱为岛津氨基键合硅胶柱5μm 4.6*250mm；进样体积为20μl(定量环)。也可以采用其他厂家和型号的高效液相色谱仪、其他粒径和长度的氨基键合硅胶柱以及其他进样体积，都能达到本发明的目的。
实施例1-3
1.色谱条件：
色谱柱：氨基键合硅胶柱；
流动相：磷酸二氢钾水溶液与乙腈的体积比为40:60；(其中，磷酸二氢钾水溶液的配制为：取磷酸二氢钾13.61g，加水500ml溶解后加入25～28％的氨水5ml，加水稀释至1000ml，混合均匀后用磷酸调pH值至4.2±0.02)；
流动相流速：0.7mL/min；
检测波长：210nm；
色谱柱柱温：30℃。
2.实验步骤
(1)配制流动相，过滤，脱气；
(2)调节高效液相色谱仪，平衡色谱柱；
(3)对照品溶液和供试品溶液的配制，称取L-亮氨酸对照品20.0mg于50ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度；实施例1-3分别吸取不同生产批次含有L-亮氨酸的生物转化液供试品0.5ml至50ml容量瓶，用流动相溶解并稀释至刻度。
(4)将对照品溶液、供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪，记录色谱图及峰面积，采用外标法计算结果。
外标法计算L-亮氨酸生物转化液中L-亮氨酸的含量：
X＝C供试品×对照品的稀释倍数＝(C对照品×A供试品/A对照品)×待测样品的稀释倍数；
式中：C对照品为对照品溶液中L-亮氨酸的浓度，单位为mg/ml；
A对照品为对照品溶液色谱图的峰面积或峰高；
A供试品为供试品溶液色谱图的峰面积或峰高；
C供试品为供试品溶液中L-亮氨酸的浓度，单位为mg/ml。
具体数值见下表所示：
3.实施例2供试品溶液色谱图见图2所示：8.177min为L-亮氨酸的峰，其余的为杂峰，L-亮氨酸峰的出峰时间适宜、理论塔板数大于5000，且与杂峰分离度良好。对照品溶液色谱图见图1所示，8.122min为L-亮氨酸的峰。
4.本发明的方法学考察
(1)线性关系实验
标准溶液的稀释步骤、浓度、峰面积见下表：
由标准浓度及其对应的峰面积得出标准曲线回归方程为：y＝22804x-184098，R2＝0.9997。
(2)重复性试验
取标准溶液20μl注入高效液相色谱仪，重复6针，峰面积分别为11758494.5、11756432、11757322、11758032、11756832、11780432，平均值为11761257.42，RSD为0.07％。
(3)转化液稳定性试验
取一份L-亮氨酸转化液，于配制后4h、8h、12h、24h进样，其峰面积分别为11728395、11758850、11748450、11787890，平均值为11755896.3，RSD为0.18％。

Claims (7)

1.一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于：
色谱条件为：
色谱柱：氨基键合硅胶柱；
流动相：磷酸二氢钾水溶液和乙腈；流动相中磷酸二氢钾水溶液和乙腈的体积百分比为37％:63％-42％:58％；
其中，所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.1-0.2mol/L，磷酸二氢钾水溶液中含有氨水，氨水占磷酸二氢钾水溶液的0.5vt％,磷酸二氢钾水溶液的pH值为4.2±0.02；
流动相流速：0.7-1.0mL/min；
检测波长：210nm；
色谱柱柱温：30℃；
检测步骤为：
(1)配制流动相，过滤，脱气；
(2)调节高效液相色谱仪条件，平衡色谱柱；
(3)对照品溶液和供试品溶液的配制：称取L-亮氨酸对照品和L-亮氨酸供试品，分别用流动相溶解定容，即得；
(4)将对照品溶液、供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪，记录色谱图及峰面积，采用外标法计算L-亮氨酸的含量。
2.根据权利要求1所述的一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于：流动相流速为0.7mL/min。
3.根据权利要求1所述的一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于：流动相中磷酸二氢钾水溶液和乙腈的体积百分比为40％:60％；磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.1mol/L。
4.根据权利要求1所述的一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于：步骤(3)中，对照品溶液的浓度为0.4mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于：步骤(3)中，供试品溶液的配制为：含有L-亮氨酸的生物转化液0.5ml，用流动相溶解并稀释至50ml。
6.根据权利要求1所述的一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于：色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm，其填料粒径为5μm。
7.根据权利要求1所述的一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于：步骤(4)中，对照品溶液和供试品溶液的色谱柱进样体积均为20μl。
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