TWI459960B - 附加糖鏈胰高血糖素樣肽－１胜肽 - Google Patents

附加糖鏈胰高血糖素樣肽－１胜肽 Download PDF

Info

Publication number
TWI459960B
TWI459960B TW098120124A TW98120124A TWI459960B TW I459960 B TWI459960 B TW I459960B TW 098120124 A TW098120124 A TW 098120124A TW 98120124 A TW98120124 A TW 98120124A TW I459960 B TWI459960 B TW I459960B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
sugar chain
glp
peptide
amino acid
represented
Prior art date
Application number
TW098120124A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201004643A (en
Inventor
Yasuhiro Kajihara
Takashi Tsuji
Izumi Sakamoto
Yuri Nambu
Naohiro Hayashi
Kazuyuki Ishii
Kazuhiro Fukae
Katsunari Tezuka
Hiroaki Asai
Original Assignee
Glytech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Glytech Inc filed Critical Glytech Inc
Publication of TW201004643A publication Critical patent/TW201004643A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI459960B publication Critical patent/TWI459960B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/12—Antidiuretics, e.g. drugs for diabetes insipidus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

附加糖鏈胰高血糖素樣肽-1胜肽
本發明係有關附加糖鏈胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)胜肽。
GLP-1胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，下稱GLP-1)係為與控制糖之恆定狀態(HOMEOSTASIS)有極密切關係之腸源性胜肽，GLP-1為由胰高血糖素前趨體之胰高血糖素前原(preproglucagon)之組織特異性轉譯後之程序而在腸的L細胞被合成，在進食中反應而向循環中來排出。此等胜肽係腸胰島軸之主要媒介體、而由與特定受體結合來產生作用。
GLP-1主要係對胰臟來產生作用，由β細胞依賴血糖(葡萄糖)濃度來刺激促進胰島素之分泌排出為屬習知。又教示了抑制胰高血糖之分泌、抑制胃之排空提高末梢血糖(葡萄糖)處理之可能性。
由GLP-1之服用，在非胰島素依賴型病患，服用後之葡萄糖(血糖)水平值因可得到正常化，因此教示了GLP-1作為治療藥的可能性。又GLP-1在胰島素依賴值型糖尿患者具有改善血糖之控制的作用。而且因GLP-1之胰島素之分泌促進作用是依賴血漿葡萄糖濃度、在低血漿葡萄糖濃度(低血糖)時，GLP-1轉介性之胰島素分泌低，具有不致造成嚴重低血糖症狀之優點。因此因應必要時，由控制血中GLP-1之量，對糖尿病可高安全性地來治療，但是，GLP-1在血中之半衰期僅短短2-6分鐘，將其做為治療劑之可能性有被限制之問題。
做為解決此一問題之手段，正嘗試來改變GLP-1。例如在專利文獻1中揭示一種聚乙烯二醇化GLP-1化合物含有至少一個與聚乙二醇(PEG)分子共軛結合之GLP-1化合物之聚乙烯二醇化之GLP-1化合物，其中各PEG在GLP-1化合物中以Cys或Lys胺基酸或羧基末端之胺基酸來結合、聚乙烯二醇化GLP-1化合物至少有1小時分泌半衰期。
若依專利文獻1與非聚乙烯二醇化(unPEGlated)胜肽相比，可得到延長半衰期、清除率(clearance)延遲化之生物活性之胜肽。又這些聚乙烯二醇化(PEGylated)GLP-1化合物及組成物，揭示用為治療糖尿病、肥伴、過敏性腸症候群以及讓血糖降低、抑制胃及/或腸運動性及抑制胃及/或腸內物之排出，或抑制食物攝取等健康狀態之治療係有用的(例如非專利文獻1)。
但是，PEG是在活體內無法代謝之化合物，因此如果繼續服用聚乙烯二醇化GLP-1的話，PEG聚乙烯二醇會積存在活體內、會對活體造成藥物危害之危險性(非專利文獻1)。
又為了延長半衰期，已提出於GLP-1或其改變體上附加糖鏈之方法(例如專利文獻3及4)。在專利文獻3中，雖已記載在GLP-1之第26位置、34位置及/或37位置上導入附加糖鏈胺基酸之方法，但糖鏈之種類或附加糖鏈之位置不能說一定是最適化。另一方面，在專利文獻4中記載使分子量200KDa程度之透明質酸修飾物結合在GLP-1同系物上，但是在大量製造如此巨大之透明質酸分子之情況下，使長度或構造均一係為困難，實際上在各透明質酸之構造或長度需考慮到產生相當大之變動偏差。作為醫藥品使用之情況，附加糖鏈胜肽必須在長度或構造上均一。
又與GLP-1類似構造、具有同樣活性、且做為血中穩定性高之化合物(Heloderma)之由蜥蜴屬之唾液所發現的毒蜥外泌肽(exendin-4)(非專利文獻2)雖然在美國上市，但是exendin-4為非人源型系列，由長期服用會出現中和抗體或及其所伴隨藥效減弱之虞(非專利文獻3~5)。
另一方面，糖鏈顯然在活體內扮演主要之角色，雖然認識該研究之重要性，但由於構造複雜或多樣化，因此研究遲晚。雖然嘗試為了得到組成份一定之糖胜肽之方法(專利文獻2)，但由簡便性或大量生產之觀點觀之不能說是為一充分之好的製造方法，又有關特別在活體內所存在之長糖鏈尚不能說是為實用的製造方法。
【專利文獻1】日本特表2006-520818號公報
【專利文獻2】日本再表2005-095331號公報
【專利文獻3】日本再表2006-095775號公報
【專利文獻4】國際公開2007/063907號
【非專利文獻1】Toxicological Science,42,152-157(1998)
【非專利文獻2】J Biol Chem.267,402-5(1992)
【非專利文獻3】Vascular Health and Risk Management 2,69-77(2006)
【非專利文獻4】JAMA.298,194-206(2007)
【非專利文獻5】Endocrine Reviews 28,187&#8211；218(2007)
本發明之課題係提供一種與GLP-1相較之下，顯示出增大血中穩定性、且最好顯示出高血糖值抑制活性之糖鏈附加GLP-1胜肽。
為了解決以上之課題，本發明可具有以下特徵。亦即本發明係在：
(a)GLP-1；
(b)GLP-1中，係為被缺失、置換或附加1個或數個胺基酸之胜肽；或
(c)GLP-1之同系物；
之中，其特徵為以附加糖鏈胺基酸來置換至少2個之胺基酸，而可得到具有GLP-1活性之糖鏈附加GLP-1胜肽者。
本發明係在：
(a)GLP-1；或
(b)GLP-1中，係為被缺失、置換或附加1個或數個胺基酸之胜肽；
之中，其特徵為以附加糖鏈胺基酸來置換至少2個之胺基酸，而可得到具有GLP-1活性之糖鏈附加GLP-1胜肽者。
又，本發明係為：
(a)在GLP-1中，係為2個以上之胺基酸以附加糖鏈胺基酸來置換之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中至少1個之置換部位為第18、20、22、26、30、34或36位置之附加糖鏈GLP-1胜肽；或
(b)在(a)所定義之附加糖鏈GLP-1胜肽中，其中該附加糖鏈GLP-1胜肽係被缺失、置換或附加附加糖鏈胺基酸以外之胺基酸之1個或數個胺基酸；而具有GLP-1活性之附加糖鏈GLP-1胜肽。
又，本發明係為：
(a)在GLP-1中，係為2個以上之胺基酸以附加糖鏈胺基酸來置換之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中任何置換部位亦由第18、20、22、26、30、34或36位置所成之群中所選擇之附加糖鏈GLP-1胜肽；或
(b)在(a)所定義之附加糖鏈GLP-1胜肽中，其中該附加糖鏈GLP-1胜肽係被缺失、置換或附加附加糖鏈胺基酸以外之胺基酸之1個或數個胺基酸；而具有GLP-1活性之附加糖鏈胜肽。在本發明中，附加糖鏈胺基酸依實施態樣，較佳可得附加糖鏈Asn或附加糖鏈Cys，但不限於此等。
又在本發明中，結合於附加糖鏈GLP-1胜肽之多個附加糖鏈胺基酸，可相同於糖鏈或胺基酸之種類，相異亦可。
又，在本發明中，在附加糖鏈胺基酸中，可藉由結合子將糖鏈及胺基酸結合亦可不藉由結合子結合。依實施態樣，最好不藉由結合子而(直接)結合。
又，在本發明中，糖鏈係由4個以上之糖所形成的糖鏈，但以一般為佳，且依實施態樣，由5個~11個糖所形成之糖鏈為較佳之情況。
又，在本發明中，糖鏈依實施態樣，較佳為有2條鏈複合型糖鏈，又依實施態樣最好由雙唾液酸糖鏈、單唾液酸糖鏈、去唾液酸糖鏈、雙N-乙醯胺基葡萄糖鏈及雙甘露糖鏈之族群所選擇之糖鏈，但不限於這些。
又，在本發明中，糖鏈依實施態樣最好有以下式來表示之情況，但不限於這些。
【化1】
[式中，R1 及R2 為同一或相異，而以
來表示。乙醯基以Ac表示。]
又，本發明係至少1個之胺基酸以附加糖鏈胺基酸來置換而可得到該糖鏈為寡聚透明質酸之附加糖鏈GLP-1胜肽。作為寡聚透明質酸例如在由N-乙醯葡萄糖胺酸及葡萄糖醛酸所形成之單位為1單位之情況，可舉出2單位(4糖)以上8單位以下之糖鏈，可為2單位(4糖)或4單位(8糖)。
又本發明可得到在至少一個之胺基酸中藉由結合子結合糖鏈之附加糖鏈GLP-1胜肽。作為結合，結合子之GLP-1胜肽之胺基酸，例如可舉出Lys。在此情況結合子亦可在其糖鏈末端含有胺基酸。作為在結合子之糖鏈側末端含有胺酸，例如可舉出Asn。
在本發明中，糖鏈實質上最好均一，例如最好90%以上均一或99%以上均一。
本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽與GLP-1比較最好具有增大血中穩定性。
本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽與GLP-1比較在OGTT(Oral Glucose Tolerance Test)中最好可得到具有5倍以上，較佳10倍以上，更佳20倍以上之血糖值抑制活性。
本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽與GLP-1較之最好可具有20倍以上，較佳為30倍以上，更佳為50倍以上之DPP-IV抗性(耐受性)。
本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽可作為醫療用途使用之新穎有效成份。作為此一醫療用途含有有關GLP-1病患之治療或預防。其此一病患之代表例，例如可為糖尿病者。
可任意來組合上述本發明之特徵之一個或複數個，但本發明為附加糖鏈GLP-1胜肽則毋需庸言。
本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽與GLP-1較之，增大血中穩定性，又在本發明之一態樣中，與GLP-1較之，增大血糖值抑制活性。因此，本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽與GLP-1較之可減少其服用(使用)量及服用次數。
又，在本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽中所附加之糖鏈，因容易在活體內被分解，不會因積存在活體內而產生藥害。
又，本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽中所附加糖鏈之一部份或全部，係存在於含人之哺乳類、鳥類等活體內之糖鏈或其改變體，服用(使用)於體內其所顯示之副作用或抗原性低。產生過敏反應或抗體及因過敏反應及產生抗體而致無法得到藥效之顧慮是很少的。
且在本發明所使用之糖鏈，因多為較短者，故不必經複雜製造步驟，可得到均一構造者，因此可得到大規模穩定高品質之醫藥品水平之附加糖鏈GLP-1胜肽。
【發明實施之最佳型態】
在本說明書中所謂「GLP-1」係表示胰高血糖素樣肽-1(glucago-like peptide-1)，指GLP-1(7-37)。
GLP-1(7-37)具有下述之胺基酸序列。
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly(序列號2)。
在本發明中所謂「GLP-1之同系物」係為GLP-1構造類似胜肽及/或具有與GLP-1重複構造之胜肽，例如：可舉出GLP-1胺基酸中被缺失、置換或附加1個或數個胺基酸之胜肽；保存GLP-1之胺基酸之1個或數個胺基酸之狀態下所置換之胜肽；GLP-1改造體具有GLP-1活性之GLP-1之片段(fragment)；具有GLP-1活性之延長GLP-1；以及特異性持抗劑EXEDIN-4(以下有以「EX-4」記載之情況)及其同系物(Curr．Opin．Investig．Drugs 8，842-8(2007)，J.Pharmacol．Exp．Ther．307，490-496(2003)，Disbetes 50，2530-9(2001)等)。
在本說明書中，所謂胺基酸係用其最廣之涵義，不僅含天然的胺基酸，亦含胺基酸突變體及衍生物之類的非天然胺基酸。只要是該行業人士應暸解到，考量此廣泛的定義後可舉出例如，天然蛋白原特性L-胺基酸；D-胺基酸；胺基酸突變體及衍生物等化學改質胺基酸；正白胺酸、β-丙胺酸、鳥胺酸等天然非蛋白原特性胺基酸以及胺基酸之特徵之具有該行業所習知之特性之化學的合成化合物等。作為非天然胺基酸之例子，可舉出有α-甲胺基酸(α-甲丙胺酸等)、D-胺基酸、組胺酸類似胺基酸(2-胺基-組胺酸、β-羥基-組胺酸、同組胺酸、α-氟甲基-組胺酸及α-甲基-組胺酸等)，在側鏈上具有多出的亞甲基之胺基酸(「同」胺基酸)以及側鏈中之羧酸官能基胺基酸，以磺酸基來置換的胺基酸(半胱酸等)。具有GLP-1活性的GLP-1之同系物之幾個含有非天然之胺基酸係為習知，在較佳之態樣中，含於本發明中之化合物之胺基酸只由含有天然胺基酸所形成。
在本說明書中，在胺基酸之1個或數個胺基酸被缺失、置換或附加之場合，被置換等之胺基酸之個數，只要保持GLP-1活性並無特別限定之，但最好為1~9個、較佳為1~5個、更佳為1~3個之程度，或者是全體長度之20%以內，較佳為10%以內。被置換或附加之胺基酸可為天然之胺基酸、非天然之胺基酸或胺基酸之同系物，較佳為天然之胺基酸。作為胺基酸之1個或數個胺基酸之缺失、置換或附加之GLP-1胜肽例子，例如可舉出以天然之胺基酸之α-甲基丙胺酸(胺基異丁酸，也稱Aib)來置換第8位置之Ala及第35位置之Gly，使第37位置之Gly缺失，第36位置之Arg醯胺化之BIM51077(Curr．Opin．Investig．Drugs 8，842-8(2007))。
在本說明書中，所謂「胺基酸之1個或數個胺基酸以保存性地被置換」係指在胺基酸之置換中，原胺基酸與被置換胺基酸之親水性指數及/或疏水性指數為類似的置換，在其置換之前後，GLP-1活性不產生明顯的下降或消失的置換。
在本說明書中，所謂「GLP-1之改變體」係為GLP-1之天然或人為改變之化合物，作為此-改變。例如可舉出GLP-1之1個和數個胺基酸殘基之烷基化、醯基化(例如乙醯基化)、醯胺基化、羧基化、酯形成、二硫化物結合形成、糖基化、脂質化、磷酸化、氫氧化、標識物質成分之結合等。
在本說明書中，所謂具有GLP-1活性之GLP-1之片段，係指在GLP-1由N末端及/或C末端發生1個或其以上胺基酸之缺失，且維持GLP-1活性之胜肽。
在本發明書中所謂「具有GLP-1活性之延長GLP-1」係指由GLP-1之N末端及/或C末端產生1個或其以上之胺基酸之附加且維持GLP-1活性之胜肽【例如，參照Endocrinology,125,3109-14(1989)】本說明書中，在「GLP-1之C末端(第37位置)再附加1個或數個胺基酸之胜肽」之場合，從附加於GLP-1之C末端之胺基酸開始，依序稱之為第38位置之胺基酸、第39位置之胺基酸...等，又在「GLP-1之N末端(第7位置)再附加1個或數個胺基酸之胜肽」之場合，從附加於GLP-1之N末端之胺基酸開始，依序稱之為第6位置胺基酸、第5位置胺基酸...等。例如可舉出GLP-1之第37位置之Gly上結合Asn或Cys之胜肽以作為「GLP-1之C末端(第37位置)再附加1個胺基酸之胜肽」。
本發明之「附加糖鏈GLP-1胜肽」係至少1個胺基酸以附加糖鏈胺基酸置換為特徵者。
在本說明書中，在「附加糖鏈GLP-1胜肽」中，含有GLP-1之至少1個胺基酸以附加糖鏈胺基酸來置換之胜肽，在上述GLP-1同系物中至少1個胺基酸以附加糖鏈胺基酸來置換之胜肽，且各附加糖鏈胺基酸以外之胺基酸之1個或數個胺基酸被缺失、置換或附加亦含在附加糖鏈GLP-1胜肽中。這些胜肽之C末端被醯胺化之胜肽(例如具有His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2 (序列號3)之胺基酸序列之GLP-1(7-36)NH2 之至少1個胺基酸以附加糖鏈胺基酸來置換之胜肽)，也含在附加糖鏈GL-P-1胜肽中。而且這些胜肽之鹽也含在附加糖鏈GLP-1胜肽中。
在本說明書中所謂鹽，係可為酸附加鹽或鹼附加鹽之任何一種皆可。為了形成酸附加鹽一般所用之酸，係為鹽酸、氫溴酸(hydrobromic acid)、碘化氫酸、硫酸、磷酸等無機酸以及對-甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、對-溴苯磺酸、羧酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、醋酸等之有機酸，作為鹼附加塩可舉出由氫氧化銨或鹼或鹼土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽等無機鹼所衍生之鹽。特別較佳是藥學所容許之鹽。
在本說明書中，所謂「附加糖鏈胺基酸」係結合糖鏈之胺基酸，在此所謂糖鏈及胺基酸亦可藉由連結子來結合，糖鏈及胺基酸之結合部位並無限制但最好是在糖鏈之還原末端結合胺基酸。
糖鏈所結合之胺基酸之種類並無特別限定，亦可使用天然胺基酸、非天然胺基酸之任何一種。由與作為活體的糖胜肽(糖蛋白質)之附加糖鏈胺基酸同一或類似構造之觀點而言，附加糖鏈胺基酸較佳為如N-結合型糖鏈之類之附加糖鏈Asn，為如O-結合型糖鏈之類之附加糖鏈Ser及附加糖鏈Thr，特別是附加糖鏈Asn更佳。
又，糖鏈與胺基酸藉由連結子結合之場合，由與連結子結合之容易性觀之，附加糖鏈胺基酸之胺基酸較佳為在天門冬胺酸或麩胺酸等分子內具有2個以上之羧基之胺基酸、在離胺酸、精胺酸、組胺酸、色胺酸等分子內具有2個以上胺基之胺基酸，在絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸等分子內具有氫氧基的胺基酸、在半胱胺酸等分子中具有硫醇基之胺基酸，在天門冬醯胺、麩胺醯胺等分子內具有醯胺基之胺基酸。特別是從反應性觀點觀之，較佳為天門冬胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、天門冬醯胺、麩胺醯胺。
又，有關本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽，在糖鏈構造、糖鏈以外構造、糖鏈之附加部位及糖鏈之附加數量同一的場合中，附加糖鏈胺基酸在附加糖鏈Asn(不藉由連結子)之情況及附加糖鏈Cys(藉由連結子)之情況，並無看到本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽之抑制血糖值上升活性有很大差異。
在糖鏈與胺基酸藉由連結子結合之場合，作為連結子，在該領域中可廣泛使用，例如可舉出-NH-(CO)-(CH2 )a -CH2 -(式中a為整數，只要不阻礙作為目的之連結子機能則無限定，但較佳為以0~4之整數來表示。)、C1-10 聚亞甲基、-CH2 -R-(在此R為烷基、被置換之烷基、鏈烯基、被置換之鏈烯基、炔基、被置換之炔基、芳基、被置換之芳基、碳環基、被置換之碳環基、雜環基以及被置換之雜環基之族群中所選擇之官能基中脫離-個氫原子所產生之官能基)與-(CO)-(CH2 )a -(CO)-(式中a為整數，只要不阻礙作為目的之連結子機能則無限定，但較佳為以0~4之整數來表示。)等。
在附加糖鏈胺基酸中在糖鏈及骨架上之胺基酸藉由結合子結合之情況，結合子最好在糖鏈測之末端含有胺基酸，雖然胺基酸之種類並無特別限定，但作為較佳例可舉出Asn。
在附加糖鏈GLP-1胜肽之附加糖鏈胺基酸中，在糖鏈及胺基酸非藉由結合子結合之情況，與糖鏈及胺基酸藉由結合子結合之情況做比較，可得之附加糖鏈GLP-1胜肽之抗原性低。在附加糖鏈GLP-1胜肽之附加糖鏈胺基酸中，糖鏈及胺基酸藉由結合子結合之情況與糖鏈及胺基酸非藉由結合子結合相較之下，可得附加糖鏈GLP-1胜肽之血中穩定性高。
又，本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽，依其敘述(例如，所述之「胺基酸以附加糖鏈胺基酸來置換之附加糖鏈GLP-1胜肽」)並無限定何種製法，雖然以後述A法及B法之任何一種方法來製造附加糖鏈GLP-1胜肽，亦包含於「胺基酸以附加糖鏈胺基酸來置換之附加糖鏈GLP-1胜肽」中。又例如，將沒有結合胺基酸之糖鏈直接或藉由連接子來結合於胜肽上之胺基酸的附加糖鏈GLP-1胜肽、在附加糖鏈GLP-1胜肽中，在所附加糖鏈上再附加糖或糖鏈，而讓已附加之糖鏈延長之附加糖鏈GLP-1胜肽、讓在附加糖鏈胺基酸之胺基及/或羧基上結合1個或數個胺基酸，並將此與1個或數個之GLP-1片段連結之附加糖鏈GLP-1胜肽；藉由結合子將胺基酸所結合之糖鏈結合於胜肽上之胺基酸上等，只要最終構造一致，皆包含在本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽中。
以附加糖鏈胺基酸置換GLP-1之胺基酸之置換數目，可依血中穩定性或血糖值抑制活性等的生理活性，存在於最終的附加糖鏈GLP-1胜肽中之胺基酸之個數或附加糖鏈前後之附加糖鏈GLP-1胜肽之分子量等做適當調整。例如：可置換1~5個為佳，置換1~3個更佳。在本發明之一態樣中，最好為2個以上之置換，例如最好為2~5個之置換，更佳為2~3個之置換，從簡便性觀點觀之，如果能置換1個而得到所期望之活性的話，最好選擇1個之置換。一般而言，在GLP-1之1個胺基酸以附加糖鏈胺基酸來置換之附加糖鏈GLP-1胜肽中，在以附加糖鏈胺基酸置換附加糖鏈胺基酸以外之胺基酸之1個以上之情況，血中穩定性增大，有減少血糖抑制活性之傾向(但，因血中穩定性增大，故可補償所減少之血糖值抑制活性)。本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽中，以附加糖鏈胺基酸來置換胺基酸之部位，可由血中穩定性或血糖值抑制活性做適當調整。
本發明之一態樣中，以附加糖鏈胺基酸來置換GLP-1胺基酸的部位，可配合所期望之活性來選擇GLP-1之任何之部位，係為由GLP-1之第8、9、12、18、19、20、22、26、30、34、36及38位置(=37位置之胺基酸附加上附加糖鏈胺基酸)所選擇之1個以上之部位，較佳為第18、20、22、26、30、34、36及38位置選擇1個以上之部位，例如由第18、26、30、34及36位置選擇1個以上之部位，特別是由第30及36位置選擇1個以上之部位。
本發明之一態樣中，以附加糖鏈胺基酸來置換胺基酸之部位，由附加糖鏈GLP-1胜肽之血中穩定性觀點,係可選擇GLP-1之任何1個部位，例如由GLP-1之第9、10、11、12、14、16、18、19、20、22、24、25、26、27、28、30、32、34、36及38位置(=37位置之胺基酸附加上附加糖鏈胺基酸)所選擇之1個以上之部位，較佳為由第9、10、11、12、14及28位置是選擇之1個以上部位，特佳是由第9、10、11及12位置所選擇之1個以上部位。特別是GLP-1之N末端附近部位之胺基酸之置換亦佳，特別是將GLP-1之兩個胺基酸以附加糖鏈胺基酸來置換作為例子，例如可舉出GLP-1之第18位置及第36位置之置換、第26位置及第34位置之置換、第22位置及第30位置之置換、第22位置及第36位置之置換、第30位置及第36位置之置換等。
在本發明之一態樣中，以附加糖鏈胺基酸置換胺基酸之部位，由附加糖鏈GLP-1胜肽之血糖值抑制作用觀點，例如係由GLP-1之第18、20、22、26、30、34、36、38位置(=37位置之胺基酸附加上附加糖鏈胺基酸)所選擇1個以上部位，較佳是由第18、26、30、34及36位置所選擇1個以上之部位，特佳是由第30位置及第36位置所選擇之1個以上部位。特別是以GLP-1之兩個胺基酸由附加糖鏈胺基酸來置換之部位作為例子，由附加糖鏈GLP-1胜肽之血糖值抑制作用之觀點觀之，例如可舉出GLP-1之第18位置及第36位置之置換、第26位置及第34位置之置換、第22位置及第30位置之置換、第22位置及第36位置之置換、第30位置及第36位置之置換等。
在本發明之一態樣，以附加糖鏈胺基酸來置換胺基酸之部位，在附加糖鏈GLP-1胜肽之GLP-1活性中，由cAMP合成能之觀點觀之，較佳係由第22、26、27、30、34、36及38位置(=37位置胺基酸附加上附加糖鏈胺基酸)所選擇1個以上部位，更佳是由第22、26、30、34、36及38位置所選擇1個以上之部位。
在本發明之一態樣中，以附加糖鏈胺基酸來置換胺基酸之部位，係由GLP-1之第8、9及12位置以外之部位所選擇之1個以上之部位。
在本發明之一態樣中，以附加糖鏈胺基酸來置換胺基酸之部位，係由GLP-1之第7、10、13、15、19、21、28及29位置以外之部位所選擇1個以上之部位，特別是由第7、10、15及28位置以外之部位所選擇之1個以上之部位。
在本發明之一態樣中，以附加糖鏈胺基酸置換胺基酸之部位，亦可由對GLP-1之GLP-1受體之結合部位來決定。
在本發明之一態樣中，在以附加糖鏈胺基酸來置換2個以上胺基酸之場合，以附加糖鏈胺基酸來置換胺基酸之部位，雖可採用上述之任何組合，但並非限於此。例如：第1之部位由上述之較佳部位來選擇，其他部位由GLP-1之任意之部位來選擇組合；第1之部位由上述較佳部位來選擇，其他之部位由在GLP-1之C末端(第37位置)再附加1個或多數個之胺基酸之任意部位所選擇組合等，也包含在本發明較佳之一態樣中。
在本發明的一態樣中，附加糖鏈胺基酸以外的胺基酸的1個的或數個的胺基酸之缺失，置換或附加，於GLP-1中：第8位置之Ala係以Gly,Ser,Thr,Leu,Ile,Val,Glu,Asp或Lys之族群中任何1個的胺基酸來置換；第9位置之Glu係以Asp或Lys之族群中任何1個的胺基酸來置換；第11位置之Thr係以Ala,Gly,Ser,Leu,Ile,Val,Glu,Asp或Lys之族群中任何1個的胺基酸來置換；第12位置之Phe係以Trp或Tyr之族群中任何1個胺基酸來置換；第13位置之Thr係以Ser來置換；第14位置之Ser係以Ala,Gly,Thr,Leu,Ile,Val,Glu,Asp或Lys之族群中任何1個胺基酸來置換；第15位置之Asp係以Glu來置換；第16位置之Val係以Phe,Ala,Gly,Ser,Thr,Leu,Ile,Tyr,Glu,Asp或Lys之族群中任何1個胺基酸來置換；第17位置之Ser係以Ala,Gly,Thr,Leu,Ile,Val,Glu,Asp或Lys之族群中任何1個胺基酸來置換；第18位置之Ser係以Ala,Gly,Thr,Leu,Ile,Val,Glu,Asp或Lys之族群中任何1個胺基酸來置換；第19位置之Tyr係以Phe,Trp,Glu,Asp或Lys之族群中任何1個胺基酸來置換；第20位置之Leu係以Ala,Gly,Ser,Thr,Leu,Ile,Val,Glu,Asp或Lys之族群中任何1個胺基酸來置換；第21位置之Glu係以Asp或Lys之族群中任何1個胺基酸來置換；第22位置之Gly係以Ala,Ser,Thr,Leu,Ile,Val,Glu,Asp或Lys之族群中任何1個胺基酸來置換；第23位置之Gln係以Asn,Arg,Glu,Asp或Lys之族群中任何1個胺基酸來置換；第24位置之Ala係以Gly,Ser,Thr,Leu,Ile,Val,Arg,Glu,Asp或Lys之族群中任何1個胺基酸來置換；第25位置之Ala係以Gly,Ser,Thr,Leu,Ile,Val,Glu,Asp或Lys之族群中任何1個胺基酸來置換；第26位置之Lys係以Arg,Gln,Glu,Asp或His之族群中任何1個胺基酸來置換；第27位置之Glu係以Asp,Ile或Lys之族群中任何1個胺基酸來置換；第28位置之Phe係以Trp來置換；第29位置之Ile係以Leu,Val或Ala之族群中任何1個胺基酸來置換；第30位置之Ala係以Gly,Ser,Thr,Leu,Ile,Val,Glu,Asp或Lys之族群中任何1個胺基酸來置換；第31位置之Trp係以Phe,Tyr,Glu,Asp或Lys之族群中任何1個胺基酸來置換；第32位置之Leu係以Gly,Ala,Ser,Thr,Ile,Val,Glu,Asp或Lys之族群中任何1個胺基酸來置換；第33位置之Val係以Gly,Ala,Ser,Thr,Leu,Ile,Glu,Asp或Lys之族群中任何1個胺基酸來置換；第34位置之Lys係以Arg,Glu,Asp或His之族群中任何1個胺基酸來置換；第35位置之Gly係以Ala,Ser,Thr,Leu,Ile,Val,Glu,Asp或Lys之族群中任何1個胺基酸來置換；第36位置之Arg係以Lys,Glu,Asp或His之族群中任何1個胺基酸來置換；及/或第37位置之Gly係以Ala,Ser,Thr,Leu,Ile,Val,Glu,Asp或Lys之族群中任何1個胺基酸來置換；為佳，但並不限定於這些。
在本發明之一態樣中，附加糖鏈胺基酸以外之胺基酸之缺失、置換或附加產生之部位，係由GLP-1之第7、10、13、15、19、21、28及29位置以外之部位所選擇1個以上之部位，例如：較佳由第7、10、15及28位置以外之部位所選擇1個以上之部位(Structure-Activity Studies of Glucagon-like Peptide-1,THE JOUFNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.269,No.9,Issue of March 4,pp.6276-6278.1994)。
作為本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽，例如可舉出以通式(1)His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18 -Xaa19 -Leu-Glu-Xaa22 -Gln-Ala-Ala-Xaa26 -Glu-Phe-Ile-Xaa30 -Trp-Leu-Val-Xaa34 -Gly-Xaa36 -Xaa37
[式中，Xaa18 以Ser、附加糖鏈Cys或附加糖鏈Asn表示。
Xaa19 以Tyr、附加糖鏈Cys或附加糖鏈Asn表示。
Xaa22 以Gly、附加糖鏈Cys或附加糖鏈ASn表示。
Xaa26 以Lys、附加糖鏈Cys、附加糖鏈Asn或附加糖鏈Lys表示。
Xaa30 以Ala、附加糖鏈Cys或附加糖鏈Asn表示。
Xaa34 以Lys、附加糖鏈Cys、附加糖鏈Asn或附加糖鏈Lys表示。
Xaa36 以Arg、附加糖鏈Cys或附加糖鏈Asn表示。
Xaa37 以Gly、NH2 、Gly-附加糖鏈Cys或Gly-附加糖鏈Asn表示。
Xaa18 為Ser、Xaa19 為Tyr、Xaa22 為Gly、Xaa26 為Lys、Xaa30 為Ala、Xaa34 為Lys、且Xaa36 為Arg的場合時，Xaa37 以Gly-附加糖鏈Cys或Gly-附加糖鏈Asn表示。]
來表示之附加糖鏈GLP-1胜肽：可舉出2個以上之胺基酸以附加糖鏈胺基酸來置換之附加糖鏈GLP-1胜肽；糖鏈為低聚透明質酸之附加糖鏈GLP-1胜肽；糖鏈為高甘露糖型糖鏈之GLP-1胜肽。又附加糖鏈Cys、附加糖鏈Asn及附加糖鏈Lys之任何一個在糖鏈和胺基酸間含有結合子亦可。
具體上，作為本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽，例如可舉出
(a1)在前述通式(1)中，Xaa18 以附加糖鏈Cys表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號4)；
(a2)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以附加糖鏈Cys表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號5)；
(a3)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以附加糖鏈Cys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號6)；
(a4)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以附加糖鏈Cys表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號7)；
(a5)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以附加糖鏈Cys表示，Xaa36 以以Arg表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號8)；
(a6)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以附加糖鏈Cys表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號9)；
(a7)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以以Arg表示，且Xaa37 以Gly-附加糖鏈Cys表示之胜肽(序列號10)；
(a8)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以附加糖鏈Cys表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號11)；
(a9)在前述通式(1)中，Xaa18 以附加糖鏈Asn表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號12)；
(a10)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以附加糖鏈Asn表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號13)；
(a11)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以附加糖鏈Asn表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號14)；
(a12)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以附加糖鏈Asn表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號15)；
(a13)在前述通式(1)中，Xaa18 以附加糖鏈Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以附加糖鏈Asn表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號16)；
(a14)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以附加糖鏈Asn表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號17)；
(a15)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以Gly-附加糖鏈Asn表示之胜肽(序列號18)；
(a16)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以附加糖鏈Asn表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號19)；
(a17)在前述通式(1)中，Xaa18 以附加糖鏈Cys表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以NH2 表示之胜肽(序列號20)；
(a18)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以附加糖鏈Cys表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以NH2 表示之化合物(序列號21)；
(a19)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以附加糖鏈Cys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以NH2 表示之化合物(序列號22)；
(a20)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以附加糖鏈Cys表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以NH2 表示之化合物(序列號23)；
(a21)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以附加糖鏈Cys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以NH2 表示之化合物(序列號24)；
(a22)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以附加糖鏈Cys表示，且Xaa37 以NH2 表示之胜肽(序列號25)；
(a23)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以附加糖鏈Cys表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以NH2 表示之胜肽(序列號26)；
(a24)在前述通式(1)中，Xaa18 以附加糖鏈Asn表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以NH2 表示之胜肽(序列號27)；
(a25)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以附加糖鏈Asn表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以NH2 表示之胜肽(序列號28)；
(a26)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以附加糖鏈Asn表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以NH2 表示之胜肽(序列號29)；
(a27)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以附加糖鏈Asn表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以NH2 表示之胜肽(序列號30)；
(a28)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以附加糖鏈Asn表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以NH2 表示之胜肽(序列號31)；
(a29)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以附加糖鏈Asn表示，且Xaa37 以NH2 表示之胜肽(序列號32)；或
(a30)在前述通式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以附加糖鏈Asn，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以NH2 表示之胜肽(序列號33)等。
在以上之附加糖鏈GLP-1胜肽的例子中，例如糖鏈為寡聚透明質酸或高甘露型糖鏈較佳。
又，作為本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽可舉出有，
(a31)在該一般式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以附加糖鏈Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號34)；或
(a32)在該一般式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以附加糖鏈Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號35)等。
在以上之附加糖鏈GLP-1胜肽之例中，例如最好在附加糖鏈Lys糖鏈與Lys藉由結合子結合。
又，作為本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽可舉出有，
(a33)在該一般式(1)中，Xaa18 以附加糖鏈Cys表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以附加糖鏈Cys表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號36)；
(a34)在該一般式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以附加糖鏈Cys表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以附加糖鏈Cys表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號37)；
(a35)在該一般式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以附加糖鏈Cys表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以附加糖鏈Cys表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號38)；
(a36)在該一般式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以附加糖鏈Cys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以附加糖鏈Cys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號39)；
(a37)在該一般式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以附加糖鏈Cys表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以附加糖鏈Cys表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號40)；
(a38)在該一般式(1)中，Xaa18 以附加糖鏈Asn表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以附加糖鏈Asn表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號41)；
(a39)在該一般式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以附加糖鏈Asn表示，Xaa26 以Lys表示’Xaa30 以附加糖鏈Asn表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號42)；
(a40)在該一般式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以附加糖鏈Asn表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以附加糖鏈Asn表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號43)；
(a41)在該一般式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以附加糖鏈Asn表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以附加糖鏈Asn表示，Xaa36 以Arg，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號44)；
(a42)在該一般式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以附加糖鏈Asn表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以附加糖鏈Asn表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號45)等。
在以上之附加糖鏈GLP-1胜肽之例之糖鏈中，例如，以2條鏈複合型糖鏈為佳。
又，作為本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽可舉出有，
(a43)在該一般式(1)中，Xaa18 以附加糖鏈Cys表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以附加糖鏈Cys表示，Xaa26 以Lys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以Gly-附加糖鏈Cys表示之胜肽(序列號46)；
(a44)在該一般式(1)中，Xaa18 以附加糖鏈Cys表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以附加糖鏈Cys表示，Xaa26 以附加糖鏈Cys表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以Gly表示之胜肽(序列號47)；
(a45)在該一般式(1)中，Xaa18 以Ser表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以Gly表示，Xaa26 以附加糖鏈Asn表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以附加糖鏈Asn表示，且Xaa37 以Gly-附加糖鏈Asn表示之胜肽(序列號48)；
(a46)在該一般式(1)中，Xaa18 以附加糖鏈Asn表示，Xaa19 以Tyr表示，Xaa22 以附加糖鏈Asn表示，Xaa26 以附加糖鏈Asn表示，Xaa30 以Ala表示，Xaa34 以Lys表示，Xaa36 以Arg表示，且Xaa37 以NH2 表示之胜肽(序列號49)等。
在以上之附加糖鏈GLP-1胜肽之例之糖鏈中，例如，以2條鏈複合型糖鏈為佳。
又，作為本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽同系物，例如，可舉出附加在具有以下之胺基酸系列之毒蜥外泌肽-4上之糖鏈者。
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 (序列號50)。
附加糖鏈毒蜥外泌肽-4，例如，以以下之-般式(2)表示。一般式(2)
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Xaa12 -Gln-Xaa14 -Glu-Xaa16 -Glu-Ala-Val-Xaa20 -Leu-Phe-Ile-Xaa24 -Trp-Leu-Lys-Xaa28 -Gly-Xaa30 -Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
〔式中Xaa12 以Lys、附加糖鏈Cys或附加糖鏈Asn表示。
Xaa14 以Met、附加糖鏈Cys、或附加糖鏈Asn表示。
Xaa16 以Glu、附加糖鏈Cys、或附加糖鏈Asn表示。
Xaa20 以Arg、附加糖鏈Cys、或附加糖鏈Asn表示。
Xaa24 以Glu、附加糖鏈Cys、或附加糖鏈Asn表示。
Xaa28 以Asn、附加糖鏈Cys、或附加糖鏈Asn表示。
Xaa30 以Gly、附加糖鏈Cys、或附加糖鏈Asn表示。
Xaa12 、Xaa14 、Xaa16 、Xaa20 、Xaa24 、Xaa28 及Xaa30 之至少一個為附加糖鏈Cys或附加糖鏈Asn。〕(序列號51)其中，例如，Xaa24 及/或Xaa30 最好為附加糖鏈Cys或附加糖鏈Asn，特別最好是Xaa30 為附加糖鏈Cys。
又，本發明之附加糖鏈GLP-1中，作為一例，一個或數個之胺基酸缺失、置換或附加一個或數個之GLP-1上附加糖鏈，例如可舉出在具有以下胺基酸序列之BIM51077上附加糖鏈。
His-R2-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-R2-Arg-NH2
〔式中R2表示α-甲基丙胺酸。〕(序列號52)
附加糖鏈BIM51077例如以下之一般式(3)表示。
一般式(3)
His-R2-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18 -Tyr-Xaa20 -Glu-Xaa22 -Gln-Ala-Ala-Xaa26 -Glu-Phe-Ile-Xaa30 -Trp-Leu-Val-Xaa34 -R2-Xaa36 -NH2
〔式中R2表示α-甲基丙胺酸，
Xaa18 以Ser、附加糖鏈Cys、或附加糖鏈Asn表示。
Xaa20 以Leu、附加糖鏈Cys、或附加糖鏈Asn表示。
Xaa22 以Gly、附加糖鏈Cys、或附加糖鏈Asn表示。
Xaa26 以Lys、附加糖鏈Cys、附加糖鏈Asn、或附加糖鏈Lys表示。
Xaa30 以Ala、附加糖鏈Cys、或附加糖鏈Asn表示。
Xaa34 以Lys、附加糖鏈Cys、附加糖鏈Asn、或附加糖鏈Lys表示。
Xaa36 以Arg、附加糖鏈Cys、或附加糖鏈Asn表示。
Xaa18 、Xaa20 、Xaa22 、Xaa26 、Xaa30 、Xaa34 及Xaa36 中之至少一個為附加糖鏈Cys或附加糖鏈Asn。〕(序列號53)
又，如毒蜥外泌肽-4或BIM51077，有關原來之C末端醯胺化之胜肽，在合成該C末端胺基酸上附加糖鏈之附加糖鏈胺基酸之情況，亦有C末端未醯胺化之情況。
在本說明書中，所謂「糖鏈」是指連接1個以上之單位糖(單糖及/或其衍生物)所形成之化合物。連接2個以上單位糖之場合，各個單位糖彼此間由葡萄糖苷結合由脫水縮合而結合。作為此一糖鏈，例如可舉出活體內含有單糖類及多糖類(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、木糖、N-乙醯基葡萄糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、唾液酸以及這些的複合體及衍生物)之外，被分解之多糖、糖蛋白質、蛋白聚糖、葡萄胺基聚糖、糖脂等，由被複合活體分子分解或衍生之糖鏈等範圍廣者，但不限於此，糖鏈係可為直鏈型、分歧型皆可。
又在本說明書中，在「糖鏈」中亦含糖鏈之衍生物，作為糖鏈之衍生物例如構成糖鏈之糖，雖然如可舉出有具有羧基之糖(例如：C-1位置酸化成羧酸之糖醛酸(aldonic acid)(例如：D-葡萄糖酸化之D-葡萄糖酸)，末端之C原子變成羧酸之糖醛酸(uronic acid)(D-葡萄糖所酸化之D-葡萄糖醛酸)，具有胺基或胺基之衍生物(例如：乙醯化胺基)之糖(例如：N-乙醯基-D-葡萄糖胺、N-乙醯基-D-半乳糖胺等)，具有胺基及羧基兩者之糖(例如：N-乙醯神經胺酸(唾液酸)、N-乙醯胞壁酸等)、去氧化糖(例如：2-去氧-D-核糖)、含有硫酸基之硫酸化糖，含有磷酸基之磷酸化糖等糖鏈，但並非僅限於此等。
在本發明中，在較佳之糖鏈附加於GLP-1之場合(以附加糖鏈胺基酸的形式來與GLP-1之胺基酸置換之場合)可讓血中穩定性增大，且更佳為，可不使血糖抑制活性消失之糖鏈。在本發明具有之態樣中，在較佳之糖鏈在被附加GLP-1之場合(以附加糖鏈胺基酸的形式與GLP-1胺基酸置換之場合)讓GLP-1之血糖值抑制活性增大之糖鏈。
本發明之附加糖鏈GLP-1中的糖鏈並無特別限定，可為在活體內以複合糖質(糖胜肽(或糖蛋白質)、軟骨素硫酸鹽、糖脂質等)存在之糖鏈，亦可為在活體內不以複合糖質存在之糖鏈。
在活體內以複合糖質存在之糖鏈，以本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽服用於活體為觀點較佳。有關作為糖鏈可舉出在活體內作為糖胜肽(或糖蛋白質)之結合於胜肽(或蛋白質)之糖鏈N-結合型糖鏈、O-結合型糖鏈等。最好為使用N-結合型糖鏈。作為N結合型糖鏈例如可舉出高甘露糖(high甘露糖)型、複合(complex)型、混成(hybrid)型，特佳為複合型。
作為在本發明所使用之糖鏈，例如可舉出以下述通式
[式中R1 及R2 係同一或相異，以
來表示。Ac為表示乙醯基]來表示之糖鏈。
又，在有關本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽中，即使存在糖鏈作為在活體內之複合糖質之糖鏈，亦可在附加糖鏈GLP-1胜肽上以O-結合型及N-結合型以外之方法來結合。例如如上所述，糖鏈藉由結合子結合於Cys或Lys亦包含於本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽中。
在本發明較佳之一態樣中，糖鏈包含透明質酸、軟骨素、軟骨素硫酸A~C、肝素、肝素硫酸、角蛋白硫酸、較低分子量的葡萄胺基聚醣。這些糖鏈由胺基糖(N-乙醯葡萄糖胺或N-乙醯半乳糖胺)及糖醛酸(葡萄糖醛酸或L-艾杜糖醛酸)所形成重複二糖單位連接成直鏈狀。又在本說明書中所謂比較低分子的葡萄胺基聚醣，例如分子量約10kDa以下，較佳為6kDA以下，且更佳約4kDA以下，或糖之數約50個以下，較佳30個以下，更佳20個以下者。
在本發明之一態樣中，在本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽之糖鏈，最好為由4個以上，例如由5個以上、7個以上、特別是9個以上、11個以上之糖所形成之糖鏈為佳。
在本發明之較佳一態樣中，在本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽之糖鏈係由5~11個、9~11個或11個所形成。
在本發明之較佳一態樣中，在本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽中糖鏈係為2條鏈之複合糖鏈。所謂複合糖鏈包含2種類以上之單糖，具有以下述基本構造及Galβ1-4GlcNAc來表示之乳糖胺為特徵。
所謂2條鏈複合型糖鏈，係在基本構造之末端之2個甘露糖上，各由0~3糖所形成之1條鏈之糖鏈來結合者，作為2條複合型糖鏈，例如，以下述所示之雙唾液酸，
單唾液酸糖鏈、
去唾液酸糖鏈，
雙N-乙醯胺基葡萄糖糖鏈、
雙甘霖糖糖鏈、
等為佳，更佳為雙唾液酸。
又，在本說明書中，「雙唾液酸糖鏈」、「單唾液酸糖鏈」、「去唾液酸糖鏈」、「雙N-Z醯胺基葡萄糖糖鏈」、「雙甘露糖糖鏈」中，除以上述化學式表示外，亦含有與以化學式來表示之例子有不同之結合樣式，有關糖鏈最好使用作為本發明之糖鏈。作為有關之糖鏈，例如可舉出在雙唾液酸糖鏈或去唾液酸糖鏈中，以去唾液酸和半乳糖以(α2→3)結合來結合者等。
又，在本發明使用之高甘露糖型糖鏈，在上述複合型糖鏈之基本構造上，甘露糖更為係2個以上結合之糖鏈。高甘露糖型糖鏈因為係容積大，故由使胜肽結合高甘露糖型糖鏈中得到較高之血中穩定性。如哺乳類之高甘露糖，雖含有5~9個之甘露糖為佳，但如酵母之高甘露糖，有含有更多之甘露糖之糖鏈較佳。最為本發明較佳所使用之高甘露糖型糖鏈，例如，可舉出高甘露-5(M-5)
高甘露糖-9(M-9)
等。
在本發明中，作為較佳之糖鏈，例如，為在人體內，作為與蛋白質結合之糖蛋白質存在之糖鏈(例如，「FEBSLETTERS Vol.50，No.3,Feb.1975」所記載之糖鏈)，以及具有同一構造之糖鏈(構成糖之種類及此等之結合樣式為同一之糖鏈)或由此非還原末端失去一個或多數個糖之糖鏈，可舉出下述表1~4所記載之糖鏈。
【表1】
又，在本發明之一態樣中，較佳之糖鏈為具有直鏈構造之糖鏈。作為有相關之糖鏈，例如，可舉出寡聚透明質酸。在本說明書中，所謂寡聚透明質酸為N-乙醯葡萄糖胺與葡萄糖醛酸在直鏈上交互結合2~32糖，較佳為2~16糖，更佳為4~8糖之糖鏈。
在本發明使用之寡聚透明質酸中，作為特佳者，再由N-乙醯葡萄糖胺及葡萄糖醛酸形成之單位為1單位之情況，可舉出2單位(4糖)以上8單位(16糖)以下之糖鏈，甚且較佳者為2單位(4糖)~4單位(8糖)，最佳為2單位(4糖)。
作為本發明較佳使用之透明質酸，例如，可舉出4糖之寡聚透明質酸，
8糖之寡聚透明質酸
等。
在本發明較佳之一態樣中，在本發明之糖胜肽糖鏈之構造，為均一。在本說明書中，所謂在糖胜肽糖鏈之構造為均一，係在糖胜肽間之比較之情況，指胜肽中附加糖鏈之部位，構成糖鏈之各糖之種類，結合順序，以及糖間之結合樣式為同一，至少90%以上，較佳為95%以上，更佳為99%以上之糖鏈構造為均一。糖鏈均一之糖胜肽，品質一定，特別適用於醫藥品之製造，或化驗(assay)之領域上。均一之糖鏈之比例可採使用，例如，HPLC、毛細管電泳、NMR、質量分析之方法來測定。
在本發明，較佳之附加糖鏈GLP-1胜肽，例如，為在後述之實施例1~15所製造之附加糖鏈GLP-1胜肽(列序號54~66)。亦即，以下之GLP-1之序列：在His7 -Ala8 -Glu9 -Gly10 -Thr11 -Phe12 -Thr13 -Ser14 -Asp15 -Val16 -Ser17 -Ser18 -Tyr19 -Leu20 -Glu21 -Gly22 -Gln23 -Ala24 -Ala25 -Lys26 -Glu27 -Phe28 -Ile29 -Ala30 -Trp31 -Leu32 -Val33 -Lys34 -Gly35 -Arg36 -Gly37 (序列號2)中：
(b1)第26位置之Lys及34位置之Lys被雙唾液酸附加糖鏈Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例1)(序列號54)；
(b2)第18位置之Ser及36位置之Arg被雙唾液酸附加糖鏈Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例2)(序列號55)；
(b3)第22位置之Gly及30位置之Ala被雙唾液酸附加糖鏈Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例3)(序列號56)；
(b4)第22位置之Gly及36位置之Arg被雙唾液酸附加糖鏈Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例4)(序列號57)；
(b5)第30位置之Ala及36位置之Arg被雙唾液酸附加糖鏈Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例5)(序列號58)；
(b6)第30位置之Ala被寡聚透明質酸附加4糖(HA-4)Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例6)(序列號59)；
(b7)第30位置之Ala被寡聚透明質酸附加8糖(HA-8)Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例7)(序列號60)；
(b8)第36位置之Arg被寡聚透明質酸附加4糖(HA-4)Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例8)(序列號61)；
(b9)第36位置之Arg被寡聚透明質酸附加8糖(HA-8)Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例9)(序列號62)；
(b10)第30位置之Ala被寡聚透明質酸附加16糖(HA-16)Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例10)(序列號63)；
(b11)第36位置之Arg被寡聚透明質酸附加16糖(HA-16)Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例11)(序列號64)；
(b12)第36位置之Arg被高甘露糖附加糖鏈(M5)Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例12)(序列號65)；
(b13)第26位置之Lys透過結合子結合去唾液酸Asn之附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例13)(序列號66)。
又，(b14)以下之毒蜥外泌肽-4之序列：在H-His1 -Gly2 -Glu3 -Gly4 -Thr5 -Phe6 -Thr7 -Ser8 -Asp9 -Leu10 -Ser11 -Lys12 -Gln13 -Met14 -Glu15 -Glu16 -Glu17 -Ala18 -Val19 -Arg20 -Leu21 -Phe22 -Ile23 -Glu24 -Trp25 -Leu26 -Lys27 -Asn28 -Gly29 -Gly30 -Pro31 -Ser32 -Ser33 -Gly34 -Ala35 -Pro36 -Pro37 -Pro38 -Ser39 -NH2 (序列號50)中：第30位置之Gly被雙唾液酸附加糖鏈Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例14)(序列號67)。
又，(b15)以下之BIM51077之序列：在His7 -R28 -Glu9 -Gly10 -Thr11 -Phe12 -Thr13 -Ser14 -Asp15 -Val16 -Ser17 -Ser18 -Tyr19 -Leu20 -Glu21 -Gly22 -Gln23 -Ala24 -Ala25 -Lys26 -Glu27 -Phe28 -Ile29 -Ala30 -Trp31 -Leu32 -Val33 -Lys34 -R235 -Arg36 -NH2 〔式中，R2為α-甲基丙胺酸。〕(序列號52)中：第26位置之Lys被雙唾液酸附加糖鏈Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例15)(序列號68)。
又，(b16)在上述之毒蜥外泌肽-4之序列(序列號50)中，第30位置之Gly被高甘露糖型附加糖鏈(M5)Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例16)。
本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽，可在該行業者皆知胜肽合成方法上組入附加步驟來製造。在附加糖鏈時，可使用利用被轉穀氨醯胺代表，酵素之逆反應之方法，但此情況，因為有需大量之附加糖鏈，最後步驟變複雜，糖鏈之附加位置及可能附加之糖鏈被限制等問題，雖可用於少量實驗用，但不能說為在大規模製造醫藥品製造之實用方法。
本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽為簡便製造方法，且作為糖鏈之構造為均一之附加糖鏈GLP-1胜肽之穩定製造方法之具體例，以下範例表示出A法及B法，即由適用，作為附加糖鏈胺基酸係使用附加糖鏈Asn、固相合成、液相合成等習知之胜肽合成方法來製造附加糖鏈胜肽(A法)以及依習知之胜肽合成法來製造GLP-1之任意胺基酸以Cys置換之胜肽，其後在Cys上由化學合成來附加，以製造附加糖鏈GLP-1胜肽之方法(B法)。又，在附加糖鏈胺基酸中，糖鏈與胺基酸藉由結合子結合，且做為結合子在糖鏈側末端含有胺基酸之附加糖鏈GLP-1胜肽之製造例，首先在附加糖鏈Asn上結合結合子之一端後，在結合子之另一端結合N-羥基琥珀酸醯亞胺基，使N-羥基琥珀酸醯亞胺基與GLP-1胜肽之Lys殘基之側鏈胺基反應，表示製造附加糖鏈GLP-1胜肽之製造方法(C法)。參考這些製造方法，只要是該行業人士可製造各種附加糖鏈GLP-1胜肽，而可得到附加糖鏈GLP-1胜肽及其製造方法，特別是在醫藥製造領域是非常有用。又此類A法~C法，係可組合2個以上來進行。若是用於化驗等少量合成中，則進一步在上述方法中可由轉移酵素來組合糖鏈延長反應。又有關A法，可參照國際公開號WO2004/005330(US2005222382(A1))，有關B法可參照國際公開號WO2005/010053號(US2007060543(A1))分別記載，由整體參照這些文獻組合併入本案說明書。又有關在A法至C法所使用糖鏈構造為均一之糖鏈，可參照國際公開號W003/008431(US2004181054(A1))、WO2004/058984(US2006228784(A1))、WO2004/058824(US2006009421(A1))、WO2004/070046(US2006205039(A1))、WO2007/011055等，由整體參照這些文獻組合併入本案說明書。
製造附加糖鏈GLP-1胜肽之方法(A法)：首先(1)使具有氫氧基之樹脂(樹脂Resin)之氫氧基與胺基氮以脂溶性保護基來保護之胺基酸之羧基來酯化反應。在此場合因為以脂溶性保護基來保護胺基酸之胺基氮，所以可防止胺基酸彼此間之自縮合。樹脂的氫氧基及胺基酸之羧基產生反應而酯化。其次(2)脫離上述所得到之酯之脂溶性保護基而形成游離胺基，(3)讓此游離胺基及胺基氮以脂溶性保護基來保護之任意之胺基酸之羧基產生醯胺化反應，(4)脫離上述脂溶性保護基而形成游離胺基，(5)由反覆上述(3)及(4)之步驟一次以上，而可得到連結有任意數量之任意之胺基酸，在末端結合有樹脂，在另端具有游離胺基之胜肽。(6)其次，讓以脂溶性保護基保護胺基氮之糖鏈天門冬醯胺(附加糖鏈天門冬醯胺)之天門冬醯胺部份之羧基與上述游離胺基酸來產生醯胺化反應，(7)再者，脫離上述脂溶性保護基而形成游離胺基，(8)讓此游離胺基與以脂溶性保護基來保護胺基氮之任意之胺基酸之羧基產生醯胺化反應，(9)重覆上述(7)及(8)之步驟一次以上，(10)由脫離上述脂溶性保護基而形成游離胺基，而可得到連結有任意數之任意胺基酸，在末端結合樹脂，在另端具有游離胺基，中間具有糖鏈天門冬醯胺之糖胜肽。(11)並且，由以酸切斷樹脂(Resin)而可製造在胜肽鏈之任意位置具有糖鏈天門冬醯胺之糖胜肽。
又亦可導入此糖鏈天門冬醯胺至胜肽鏈之端部。
作為具有氫氧基之樹脂(Resin)，通常若具有在固相合成所使用之氫氧基樹脂為佳，例如亦可使用Amino-PEGA樹脂(Merck公司製)、Wang樹脂(Merck公司製)、HMPA-PEGA樹脂(Merck公司製)等。
可以使用所有胺基酸作為胺基酸，例如可舉出為天然之胺基酸、絲胺酸(Ser)、天門冬醯胺(Asn)、纈胺酸(Val)、白胺酸(Leu)、異白胺酸(Ile)、丙胺酸(Ala)、酪胺酸(Tyr)、甘胺酸(Gly)、離安酸(Lys)、精胺酸(Arg)、組胺酸(His)、天門冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、麩胺醯胺(Gln)、蘇胺酸(Thr)、半胱胺酸(Cys)、蛋胺酸(Met)、苯丙胺酸(Phe)、色胺基酸(Trp)、脯胺酸(Pro)。
作為脂溶性保護基，可舉出例如9-芴甲氧羰基(Fmoc基,9-fluorenyl methoxy carbonyl group)，t-丁基羥基羰基(Boc)基、苯偶醯基、烯丙基、烯丙氧基羰基、乙醯基等之碳酸酯系或醯胺基系之保護基等。在導入脂溶性(lipid-soluble)保護基，例如在Fomc基導入之場合，可加入9-芴甲基-N-琥珀醯亞胺碳酸酯及碳酸氫鈉來進行反應。反應溫度為0~50℃，較佳為在室溫，約進行1~5小時為佳。
作為以脂溶性保護基所保護之胺基酸，可藉由上述方法來製造上述之胺基酸，又也可使用市販物，例如可舉出Fmoc-Ser、Fmoc-Asn、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Ile、Fmoc-AIa、Fmoc-Tyr、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys、Fmoc-Arg、Fmoc-His、Fmoc-Asp、Fmoc-Glu、Fmoc-Gln、Fmoc-Thr、Fmoc-Cys、Fmoc-Met、Fmoc-Phe、Fmoc-Trp、Fmoc-Pro。
作為酯化觸媒，例如可使用1-(均三甲苯基-2-碸基)-3-硝基-1，2，4-三唑(MSNT)，二環已基碳二亞胺(DCC)、二異丙基碳二亞胺(DIPCI)等習知之脫水縮合劑。胺基酸及脫水縮合劑之使用比率，相對於前者使用1重量部，後者通常使用1~10重量部，較佳為2~5重量部。
酯化反應，例如將樹脂放入固相管柱容器內後，將此樹脂以溶劑清洗，其後最好加上胺基酸之溶液來進行之。最為清淨用溶劑，例如可舉出二甲基甲醯胺(DMF)、2-丙醇、亞甲基氯等。作為溶解胺基酸之溶媒可舉出例如三甲基亞碸(DMSO)、DMF、亞甲基氯等。酯化反應為0~50℃，較佳為室溫，約10分鐘~30小時之程度，較佳為15分鐘~24小時程度之程度為佳。
較佳也可使用醋酸酐來乙醯化此時固相上未反應之氫氧基來密封(capping)。
脂溶性保護基之脫離，例如可進行以鹼來處理。作為鹼，可舉出哌啶(piperidine)，碼啉(morpholine)等。此時，在有溶媒狀態下進行為佳。作為溶媒可舉出例如DMSO、DMF、甲醇等。
游離胺基與以脂溶性保護基保護之胺基氮素之任意胺基酸之羧基之醯胺化反應，最好在活性化劑及溶媒之存在下進行。
作為活化劑例如可舉出有二環己基碳二亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺、鹽酸鹽(WSC/HCl)、疊氮磷酸二酯苯(DPPA)、羰二咪唑(CDI)、氰基膦酸二乙酯(DEPC)、二異丙基碳二亞胺(DIPCI)、六氟磷酸苯並三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、1-羥基苯並三唑(HOBt)、羥基丁二醯亞胺(HOSu)、二甲胺基吡啶(DMAP)、1-羥基-7-偶氮苯並三氮唑(HOAt)、羥基鄰苯二甲醯亞胺(HOPht)、五氟苯酚(Pfp-OH)、2-(1H-苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、0-(7-偶氮苯並三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)O-苯並三氮唑-1-基-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、3，4-二氫-3-羥基-4-羰基-1，2，3-苯並三嗪(Dhbt)。
活性化劑之使用量，對於以脂溶性之保護基來保護胺基之任意胺基酸，為1~20當量、較佳為1~10當量、更佳為1~5當量。
作為溶媒，可舉出例如DMSO、DMF、亞甲基氯等，反應係在0~50℃，較佳為在室溫下約10~30小時程度，較佳為15分鐘~24小時程度為宜。脂溶性保護基之脫離，如上述相同來進行。
較佳係在由樹脂切斷胜肽鏈中，以酸處理。作為酸例如可舉出有三氟醋酸(TFA)氟化氫(HF)等。
由適當的追加上述(6)讓以脂溶性保護基來保護胺基氮之糖鏈天門冬醯胺之天門冬醯胺部份之羧基和胜肽之游離基產生醯胺化反應、(7)之脫離上述脂溶性保護基讓游離基形成步驟，而可製造在胜肽鏈之任意之位置具有至少2個以上之糖鏈天門冬醯胺之糖胜肽。又此時，由使用不同之糖鏈天門冬醯胺可製造在胜肽鏈之任意位置上具有2種以上之糖鏈之天門冬醯胺之糖胜肽。
又由上述(6)之以脂溶性保護基保護胺基之糖鏈天門冬醯胺之天門冬醯胺部分之羧基與游離胺基產生醯胺化反應，(7)之脫離上述脂溶性保護基而形成游離胺基之步驟來取代最後步驟，即步驟(9)及(10)可製造至少一個天門冬醯胺具有胜肽鏈之糖胜肽。
又，進行上述步驟(1)時，取代以脂溶性保護基保護胺基氮之胺基酸而將以脂溶性保護基保護之胺基氮之糖鏈天門冬醯胺部分之羧基藉由使與樹脂之氫氧基產生酯化反應可製造在C末端上具有糖鏈冬醯胺之糖胜肽。此時，可再進行(6)，亦可不進行。
經由如此之進行，可得到在期望位置上以附加糖鏈Asn置換之附加糖鏈GLP-1胜肽。
製造附加糖鏈GLP-1胜肽之方法(B法)：首先，由固相合成法、液相合成法、細胞之合成，抽出分離天然所存在之物之方法等來製造含有Cys之胜肽。可依Cys之位置改變在所要之位置附加糖鏈。
其次讓鹵乙醯胺化複合型糖鏈衍生物和含有Cys之胜肽反應來製造。上述反應通常為0~80℃，較佳為10~60℃，更佳為15~35℃。反應時間較佳一般為30分鐘~5小時之程度，反應終了後以適當習知之方法「例如，高速液體高效液相層析儀(HPLC)來精製為佳」。
鹵乙醯胺化複合型糖鏈衍生物，係為例如，以-NH-(CO)-(CH2 )a -CH2 X(X為鹵素原子，a為整數，雖然不僅限定不阻礙連結子為機能為目的，但較佳為0~4之整數)來置換結合在複合型天門冬醯胺第1位置碳之氫氧基之化合物。
具體而言將鹵乙醯胺化複合型糖鏈衍生物與含有Cys之胜肽在磷酸緩衝液中於室溫反應，反應終了後，由以高效液相層析儀HPLC精製，而得到以附加糖鏈Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽。
製造附加糖鏈GLP-1胜肽之方法(C法)：首先由將含Lys之胜肽以固相合成法、液相合成法、細胞之合成、分離抽出天然物所存在之物之方法來製造。
其次在附加糖鏈胺基酸結合戊二酸。例如使附加糖鏈胺溶解於DMSO溶液中，在此溶液加上戊二酸-EDC混合之DMSO溶液，在室溫攪拌一天。適當稀釋反應混合物後由分子量排除凝膠層析法等差示(differentiate)可得到α-胺基結合戊二酸之附加糖鏈胺基酸。
其次，在戊二酸結合附加糖鏈胺基酸之DMSO溶液中加上N-羥基琥珀酸醯胺之DMSO溶液及EDC之DMSO溶液在室溫下攪拌6小時後由去活化EDC可合成戊二酸結合附加糖鏈胺基酸之N-羥基琥珀酸醯胺酯。
繼之，在GLP-1胜肽之DMSO溶液中加上DIPEA及戊二酸結合附加糖鏈胺基酸之N-羥基琥珀酸醯胺酯，在室溫下攪拌2小時後，加上甘胺酸水溶液停止反應，由適當精製，可在GLP-1胜肽之Cys殘基上藉由戊二酸結合子結合附加糖鏈胺基酸。如此地，在附加糖鏈胺基酸上，糖鏈及胺基酸(Cys)可藉由結合子結合，可得到該結合子在糖鏈側之末端上含有胺基酸(Asn)之附加糖鏈GLP-1。
由GLP-1胜肽之所要部位之胺基酸以Lys置換，含在GLP-1胜肽之野生型之Lys殘基以其他之胺基酸置換，可得到在所要之部位上結合附加糖鏈胺基酸之附加糖鏈GLP-1胜肽。又由C法，在野生型GLP-1上含有Lys上附加糖鏈之情況，可得到胜肽骨架與野生型同一之附加糖鏈GLP-1胜肽。
在本發明中之附加糖鏈GLP-1胜肽具有GLP-1活性。本說明書中，所謂「GLP-1活性」係指有關GLP-1習知之生理活性之一部份或全部。GLP-1除血糖值抑制作用之外，例如，具有作為胰島作用有伴隨cAMP合成衍生之胰島素分泌，胰島保護(抑制凋亡)，胰島素增殖(Proliferation)作為胰臟外分泌作用，有抑制食慾，抑制消化管運動，促進降鈣素分泌，局部缺血時心臟保護等為習知。因此所謂GLP-1活性，指的是與這些有關聯之生理活性的全部或一部分其各個該行業者可用習知之手法來測定。
例如，在GLP-1活性中血糖值抑制活性可使用在糖尿病小鼠(db/db mouse)之降低血糖值作用之測定或在口服葡萄糖耐受實驗(OGTT：Oral Glucose Tolerance Test)之血糖值上昇抑制作用之測定等來測定。又在本說明書中所謂「抑制血糖值」係包含抑制血糖值上升及讓血糖值降低之任何概念。特別是在本說明書中於db/db小鼠之抑制血糖值作用有稱為「降低血糖值作用」，在OGTT中之血糖值抑制作用有稱為「抑制血糖值上升作用」之情事。
依OGTT之抑制血糖值活性係可依讓小鼠強制飲用糖時之抑制血糖值上升之測定來判斷。例如在使用後述之實驗例2之手法之場合，讓禁食一晚後之小鼠服用被驗化合物其30分鐘後給予口服葡萄糖溶液。由服用葡萄糖而葡萄糖值上升，服用後約30分鐘成為最大值其後漸漸減少。測定服用葡萄糖後30分鐘之血糖值，與服用GLP-1時之血糖值作比較，而可測定附加糖鏈GLP-1胜肽之血糖值抑制作用。與服用GLP-1 30分鐘後之血糖值作比較之場合，本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽，表示較佳為80%以下，更佳為60%以下，再更佳為40%以下，特佳為30%以下之血糖值。又在OGTT以比較所確認同程度之抑制血糖值上升作用時之服用量，可來判斷本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽之抑制血糖值活性之強度。例如服用GLP-1 10與服用附加糖鏈GLP-1胜肽1之場合，若可得到相同之抑制血糖值之作用，則該附加糖鏈GLP-1胜肽之血糖抑制活性為GLP-1之10倍。本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽與GLP-1比較具有較佳為5倍以上，更佳為10倍以上，或這些更高之血糖抑制活性。
又，附加糖鏈GLP-1胜肽，在GLP-1於1個或數個胺基酸缺失，置換或附加胜肽上附加糖鏈之情況，在GLP-1同系物上附加糖鏈之情況，作為比較GLP-1活性之對象，亦可使用GLP-1同系物或其附加糖鏈GLP-1胜肽及附加糖鏈胺基酸以外之胺基酸序列為同一之GLP-1胜肽。
使用db/db小鼠之抑制血糖值活性，可依糖尿病小鼠服用被驗化合物後之血糖值之測定來判斷。例如，使用例如以依經過時間來測定服用被驗化合物後之血糖值，例如，服用120分鐘後之血糖值比服用時低時，可確認降低血糖值之作用。又例如測定服用300分鐘後之血糖值、可判斷降低血糖值作用之持續性，例如，服用後120分鐘之血糖值與服用GLP-1時比較之場合，本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽表示較佳為80%以下，更佳為70%以下，特佳為60%以下之血糖值。又服用係120分鐘之血糖值與服用時血糖值作比較時，本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽表示較佳為70%以下，更佳為60%以下，特佳為50%以下(例如45%以下)之血糖值。服用後300分鐘之血糖值與服用GLP-1時作比較之場合，本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽表示較佳為70%以下，更佳為50%以下之血糖值。又服用後300分鐘之血糖值與服用時之血糖值作比較之場合，本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽較佳為70%以下，更佳為50%以下之血糖值。
又，即使血糖值抑制活性與GLP-1比較為低之場合，因血中穩定性增大，故可抵銷(補償)該活性之降低。
例如，在GLP-1活性中，胰島素分泌活性可使用以體外(invitro)cAMP合成能實驗來測定。GLP-1係由與GLP-1受體結合使細胞內cAMP濃度上升，而促進胰島素分泌。因此，例如以附加糖鏈GLP-1胜肽刺激小鼠GLP-1受體表達CHO-K1細胞(Expression CHO-K1 Cell)，測定在細胞合成之cAMP量，以EC50值與GLP-1比較而可測定附加糖鏈GLP-1胜肽之胰島素分泌活性。
本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽，具有比GLP-1增大之血中穩定性。血中穩定性係指該行業者可使用習知方式手法來測定，例如測定在血漿中之穩定性或對DPP-IV(二肽基肽酶IV)之耐受性可判斷半衰期、AUC(藥物血中濃度一時間曲線下面積)等為指標。又腎清除功能(Clearance)的增加亦對血中穩定性的增大係有助益。
本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽與GLP-1比較在血漿中安定性增大。
對DPP-IV之耐受性，例如如後述之實驗例1，可由在DPP-IV溶液中之半衰期的測定來判斷。本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽與GLP-1相較之下，對DPP-IV之耐受性增大，例如使用後述之實驗例1之手法，測定對DPP-IV之耐受性之場合，其半衰期與GLP-1作比較為增大1.2倍以上(例如2倍以上)，較佳為5倍以上，更佳為10倍以上，特佳為20倍以上(例如100倍以上)。
又本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽，較佳為具有至少1小時，更佳為至少3、5、7、10、15、20小時，再更佳為至少24小時之血中半衰期。
其次有關於作為本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽之有效成分所含有之醫藥組成物作說明。
作為本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽之有效成份所含有之醫藥成份，用於關聯於GLP-1之病患的治療或預防係為有效。依上述在GLP-1之各種作用為習知，關聯於此等作用之病患係屬各式各樣。例如GLP-1由刺激胰島素排出，發現會引起細胞吸收葡萄糖而引起血糖降低。又發現可抑制胃及/或腸之運動性，並抑制胃及/或腸內物之排空(排出)以及抑制食物之攝取。因此，關聯於GLP-1之疾病患者，例如含有非胰島素依類型糖尿病(NIDDM)、胰島素依賴型糖尿病、腦中風(参照Efendic之WO00/16797)、心肌梗塞(參照Efendic之WO98/08531)、肥胖(參照Efendic之WO98/19698)、功能性消化不良、過敏性腸症候群(參照Efendic之WO99/64060)、胰島移植。作為本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽之有效成份所含有之醫藥組成物，尤其是對糖尿病之治療或預防有效，對1型糖尿病的預防與2型糖尿病的治療更是特別有效。
上述醫藥組成物，係使用一般所用之填充劑、增量劑、結合劑、賦濕劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑等之稀釋劑或賦形劑，為在一般醫藥組成物之形態所製造成製劑者。
作為此類醫藥組成份，可舉出有顆粒劑、藥丸劑、粉狀劑、液狀劑、懸浮劑、乳劑、粒狀劑、膠囊劑、栓劑、注射劑等。
在醫藥組成物中所含有本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽之量，並無特別限定而可適當選擇，但是在醫藥組成物中之本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽含有1~70重量%為佳。
作為本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽之有效成分所含有的醫藥組成物，再者，可含有其他之有效成份，也可以與含有其他之有效成份組合來使用。又作為本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽之有效成份所含有之醫藥組成份，係更可含有不同之1種以上之本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽，而亦可與含有不同之一種以上之本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽作為有效成份之醫藥組成份來組合使用。
作為有關本發明之醫藥組成物之服用方法並無特別限制，可利用依各種製劑型態、患者年齡、性別、病患狀態及其他條件之方法來服用。作為服用顆粒劑、藥丸劑、液狀劑、懸浮劑、乳劑、粒狀劑及膠囊劑時之服用方法，例如可舉出用口服。又在注射劑之場合，可單獨使用，或與葡萄糖、胺基酸等之一般補充液混合，而注射至靜脈內、肌肉內、皮內、皮下或腹腔內。在栓劑之場合可服用到直腸內。
上述醫藥組成物之注射、服用量，可配合用法、患者之年齡、性別、病患病況程度，或其他條件做適當選擇，一般注射、服用量為對體重1 kg服用0.1~900nmol、較佳為1~90nmol之本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽。本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽與GLP-1相比，血中穩定性非常高，又在一態樣中，本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽與GLP-1相比，因血糖值抑制活性非常高，具有可減少注射、服用量之優點。
上述醫藥組成物之服用次數，可配合用法、患者年齡、性別、病患之病況程度及其他之條件做適當選擇，例如1日3次、1日2次、1日1次，再者可配合其血中穩定性，可選擇更少注射服用頻率(例如每週1次、每月一次等)。較佳之上述該醫藥組成物之服用次數，為每日1次以下(含1次)。本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽與GLP-1相比，因血中穩定性非常高，具有可減少注射服用次數之優點。
附加在本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽之糖鏈，在體內容易被代謝系統分解。又在本發明之一態樣，該糖鏈作為在活體內之糖胜肽(或糖蛋白質)具有結合存在之構造。因此，作為含有本發明之附加糖鏈GLP-1胜肽及該胜肽之有效成份之醫藥組成物，即使服用在活體內，亦無顯示出副作用或是抗原性，具有不用擔心因過敏反應或產生抗體而無法得到藥效之優點。
再者，本發明附加糖鏈GLP-1胜肽可穩定簡便大量地供給，從提供品質穩定，高品質之醫藥品觀點觀之，為非常有用。
又本發明之服用附加糖鏈GLP-1胜肽之有效劑量為特徵，也提供與GLP-1有關聯之病患之治療或預防方法。
又，本說明書中所用之用語，係用來說明特定之實施態樣者，並不用來限定本發明。
又，本說明書中所用「包含」之用語，除了在文意上顯然應予不同之理解之情況外，係欲表示所記載事項(文件、步驟、要素、數字等)存在者，其以外之事項(文件、步驟、要素、數字等)並不排除其存在。
只要沒有不同之定義，此說明書中所有用語(含技術用語及科學用語)具有與本發明所屬技術之該行業者能廣泛理解之相同涵義。此處所用之用語只要未明示有不同之定義，應予被解釋為具有在本說明書及相關聯技術領域中之意思及整合之意思者，不應被解釋為有理想化或過度之形式的意思。
本發明之實施態樣係參照著模式圖來說明，但為模式圖之情況，為了明確說明，有誇張的表現之情況。
雖使用為了表現第一、第二等之用語的種種要素，但可理解此等要素依該等用語不應被限定。這些用語僅為了區別一個要素和其他要素而使用，例如，將第一要素記述為第二要素，同樣地第二要素記述為第一要素，為不脫離本發明範圍係為可能。
以下參照實施例詳細說明本發明。但是，本發明由各態樣可具體實現化，但本發明不限於此所記載之實施例來解釋。
以下本發明基於實施例來具體說明，但對這些並未做任何限制。
實施例1 第26位置、第34位置Cys-雙唾液酸附加糖鏈GLP-1胜肽之合成法：
在固相合成用管柱容器中加入胺基-丙烯酸聚乙二醇酯(A-mino-PEGA樹脂)(Merck公司製)(100μmol)以亞甲基氯(DCM)、DMF溶劑充分洗淨後，以DMF溶劑使其充分膨潤。將4-羥甲基-3-甲氧基苯氧酪酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基嗎啡啉(0.25mmol)放入DMF(2ml)中使其溶解、放入管柱容器內，在室溫攪拌4小時。將樹脂以DMF及DCM來充分洗淨而得到HMPB-PEGA樹脂作為固相合成的固相來使用。
將Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)放置入DCM(2ml)中讓其溶解、放入固相合成用管柱容器內在25℃中攪拌3小時。【化15】
攪拌後，將樹脂用DCM、DMF洗淨。將Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2ml)15分鐘進行去保護。再以DMF洗淨後，其後之胜肽鏈之延長係用以下方法逐次讓胺基酸縮合。
將以Fmoc基所保護之胺基酸溶解於N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，再加上0.45M HCTU．HOBT/NMP(0.4mmol)後，添加於固相合成用管柱容器中，繼而將0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加到固相合成用管柱容器中。於室溫攪拌20分鐘後，將樹脂用DCM、DMF洗浄，將Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2ml)15分鐘進行去保護。重複此操作，使用以Fmoc基所保護之胺基酸(0.5mmol)來讓胺基酸逐次縮合。
以Fmoc基所保護之胺基酸，係使用Fmoc-Gly，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Gly，Fmoc-Cys(Trt)，Fmoc-Val，Fmoc-Leu，Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ile，Fmoc-Phe，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Cys(Trt)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ala，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Ala，Fmoc-His(Trt)而在固相樹脂中得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Cys(Trt)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)之31殘基胜肽(序列號69)。
將形成所得胜肽的樹脂之一部分放入固相合成管柱容器內，將三氟醋酸：水：三異丙基奈磺酸鈉TIPS(=95：2.5：2.5)加入至可充分浸滿樹脂之程度，在室溫攪拌3小時。將樹脂過濾去除，次將反應溶液在減壓下濃縮。將所得殘渣以高效液相層析儀HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)、ψ20×250mm、梯度(gradient)：A液：0.1%三氟乙酸(TFA)水、B液：0.09% TFA/10%水/90%乙腈(AN)8.0ml/分；B液35→60% 20分 線性梯度]來精製，而得到GLP-1之第26位置及第34位置之Lys絲胺酸以Cys來置換之胜肽。
將以下所示之溴乙醯化之雙唾液酸糖鏈(a)(大塚化學股份有限公司製)10.5mg及上述所合成之胜肽鏈2.1mg溶於100mM磷酸緩衝液pH7.5、210μl中，在37℃使之反應4小時。
以HPLC確認原料消失後，如此地以HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)，ψ4.6×250mm，梯度：A液：0.1%TFA水，B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 0.7ml/分；B液35→60% 20分 線性梯度]來精製，可得到GLP-1之第26位置及第34位置之Lys以附加糖鏈Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(26，34Cys GLP-1-disialo)0.1mg。
實施例2 第18位置、第36位置Cys-雙唾液酸附加糖鏈GLP-1之合成法：
在固相合成用管柱容器中加入Amino-PEGA樹脂(Merck公司製)(100μmol)，在DCM、DMF下中充分洗淨後，以DMF充分膨潤，將羥甲基-3-甲氧基苯氧酪酸(HMPB)(0.25mmol)，TBTU(0.25mmol)及N-乙基嗎啡啉(0.25mmol)放入DMF(2ml)中使之溶解係放入管柱容器內，在室溫攪拌4小時。將樹脂放入DMF及DCM中充分洗淨而得到，HMPB-PEGA樹脂作為固相合成的固相來使用。
將Fmoc-Gly(0.50mmol)及MSNT(0.50mmol)、正-甲基咪唑(0.375mmol)放置於DCM(2ml)中讓其溶解、放入固相合成用管柱容器中、在25℃中攪拌3小時。
攪拌後，將樹脂用DCM、DMF洗淨。將Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2ml)15分鐘進行去保護。再以DMF洗淨後，其後之胜肽鏈之延長係用以下之方法逐次讓胺基酸縮合。
讓以Fmco基保護之胺基酸溶解於N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)中，加上0.45M HCTU．HOBT/NMP(0.4mmol)後，加到固相合成用管柱容器中，繼之將0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加到固相合成用管柱容器中，在室溫攪拌20分鐘後用DCM及DMF將樹脂洗淨，將Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2ml)15分鐘進行去保護。重複此操作，並使用以Fmoc基保護之胺基酸(0.5mmol)使胺基酸逐漸縮合。
以Fmoc基所保護之胺基酸，係使用Fmoc-Gly，Fmoc-Cys(Trt)，Fmoc-Gly，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Val，Fmoc-Leu，Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ile，Fmoc-Phe，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ala，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Cys(Trt)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Ala，Fmoc-His(Trt)而在固相樹脂中得到Gly-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)之31殘基胜肽(序列號70)。
將形成所得之胜肽之樹脂一部分放入固相合成管柱容器內，將三氟醋酸：水：三異丙基奈磺酸鈉TIPS(=95：2.5：2.5)加入至可充分浸滿樹脂之程度，在室溫攪拌3小時。將樹脂過濾去除，次將反應溶液在減壓下濃縮。將所得殘渣以HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)、ψ20×250mm、梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 8.0ml/分；B液35→60% 20分、線性梯度]來精製，而得到GLP-1之第18位置之Ser及第36位置之Arg以Cys置換之胜肽。
將溴乙醯化之雙唾液酸糖鏈(a)(大塚化學股份有限公司製)10.5mg及上述合成之胜肽鏈2.1mg溶於100mM磷酸緩衝液pH7.5、210μl而於37℃讓其反應4小時。以HPLC確認原料消失後，將這些原樣地以HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)、ψ4.6×250mm、梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 0.7ml/分；B液35→60% 20分 線性梯度]來精製，而得到0.8mg之在GLP-1第18位置之Ser及第36位置之Arg以附加糖鏈Cys來置換附加糖鏈GLP-1胜肽(18、36Cys GLP-1-disialo)。
實施例3 第22位置、第30位置Cys-雙唾液酸附加糖鏈之GLP-1胜肽之合成法：
在固相合成用管柱容器中加入胺基-丙烯酸聚乙二醇(Amino-PEGA樹脂)(Merck公司製)(100μmol)以DCM、DMF溶劑充分洗淨後，以DMF溶劑使其充分膨潤。將4-羥甲基-3-甲氧基苯氧酪酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基嗎啡啉(0.25mmol)放入DMF 2ml使其溶解後放入管柱容器內，在室溫攪拌4小時。將樹脂以DMF及DCM來充分洗淨而得到HMPB-PEGA樹脂作為固相合成的固相來使用。
將Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)放置入DCM(2ml)中讓其溶解、放入固相合成用管柱容器內在25℃中攪拌3小時。
攪拌後，將樹脂用DCM、DMF洗淨。將Fmoc基用20%%哌啶/DMF溶液(2ml)15分鐘進行去保護。再以DMF洗淨後，其後之胜肽鏈之延長係用以下方法逐次讓胺基酸縮合。
將以Fmoc基所保護之胺基酸溶解於N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，再加上0.45M HCTU．HOBT/NMP(0.4mmol)後，添加於固相合成用管柱容器中，繼之加0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)到固相合成用管柱容器中。於室溫攪拌20分鐘後，將樹脂用DCM、DMF洗浄，將Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2ml)15分鐘進行去保護。重複此操作，使用以Fmoc基所保護之胺基酸(0.5mmol)來讓胺基酸逐次縮合。
以Fmoc基所保護之胺基酸，係使用Fmoc-Gly，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Gly，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Val，Fmoc-Leu，Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Cys(Trt)，Fmoc-Ile，Fmoc-Phe，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ala，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Cys(Trt)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Ser(Trt)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Ala，Fmoc-His(Trt)而在固相樹脂中得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)之31殘基胜肽(序列號71)。
將形成所得胜肽的樹脂之一部分放入固相合成管柱容器內，將三氟醋酸：水：三異丙基奈磺酸鈉TIPS(=95：2.5：2.5)加入至可充分浸滿樹脂之程度，在室溫攪拌3小時。將樹脂過濾去除，次將反應溶液在減壓下濃縮。將所得殘渣以高效液相層析儀HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)、ψ20×250mm、梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 8.0ml/分；B液35→60%20分 線性梯度]來精製，而得到GLP-1之第22位置之Gly及第30位置之Ala以Cys來置換之胜肽。
將溴乙醯化之雙唾液酸糖鏈(a)(大塚化學股份有限公司製)7.9mg及上述合成之胜肽鏈1.3mg溶於100mM磷酸緩衝液pH7.4、200μl而於37℃讓其反應4小時。以HPLC確認原料消失後，將這些原樣地以HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)、ψ4.6×250mm、梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 0.7ml/分；B液35→60% 20分 線性梯度]來精製，而得到1.0mg之在GLP-1之第22位置之Gly及第30位置之Ala以附加糖鏈Cys來置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(22、30Cys GLP-1-disialo)。
實施例4 第22位置、第36位置Cys-雙唾液酸附加糖鏈之GLP-1胜肽之合成法：
在固相合成用管柱容器中加入胺基-丙烯酸聚乙二醇酯(Amino-PEGA樹脂)(Merck公司製)(100μmol)、以DCM、DMF溶劑充分洗淨後，以DMF使其充分膨潤。將4-羥甲基-3-甲氧基苯氧酪酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基嗎啡啉(0.25mmol)放入DMF 2ml中使其溶解後放入管柱容器，在室溫攪拌4小時。將樹脂以DMF及DCM充分洗淨而得到HMPB-PEGA樹脂作為固相合成的固相來使用。
將Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)放置入DCM(2ml)中讓其溶解、放入固相合成用管柱容器內在25℃中攪拌3小時。
攪拌後，將樹脂用DCM、DMF洗淨。將Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2ml)15分鐘進行去保護。再以DMF洗淨後，其後之胜肽鏈之延長係用以下方法逐次讓胺基酸縮合。
將以Fmoc基所保護之胺基酸使溶解於N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，再加上0.45M HCTU．HOBT/NMP(0.4mmol)後，添加於固相合成用管柱容器中，繼而將0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加到固相合成用管柱容器中。於室溫攪拌20分鐘後，將樹脂用DCM、DMF洗淨，將Fmoc基用20%%哌啶/DMF溶液(2ml)15分鐘進行去保護。重複此操作，使用以Fmoc基所保護之胺基酸(0.5mmol)來讓胺基酸逐次縮合。
以Fmoc基所保護之胺基酸，係使用Fmoc-Gly，Fmoc-Cys(Trt)，Fmoc-Gly，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Val，Fmoc-Leu，Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ile，Fmoc-Phe，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ala，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Cys(Trt)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Ala，Fmoc-His(Trt)而在固相樹脂中所得到Gly-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Cys(Trt)一Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)之31殘基胜肽(序列號72)。
將形成所得胜肽的樹脂之一部分放入固相合成管柱容器內，將三氟醋酸：水：三異丙基奈磺酸鈉TIPS(=95：2.5：2.5)加入至可充分浸滿樹脂之程度，在室溫攪拌3小時。將樹脂過濾去除，次將反應溶液在減壓下濃縮。將所得殘渣以高效液相層析儀HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)、ψ20×250mm、梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 8.0ml/分；B液35→60%20分 線性梯度]來精製，而得到GLP-1之第22位置之Gly及第36位置之Arg以Cys來置換之胜肽。
將溴乙醯化之雙唾液酸糖鏈(a)(大塚化學股份有限公司製)11.9mg及上述合成之胜肽鏈2.0mg溶於100mM磷酸緩衝液pH7.4、400μl而於37℃使其反應1小時。以HPLC確認原料消失後，將這些原樣地以HPLC[圓柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)、ψ4.6×250mm、梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 0.7ml/分；B液35→60% 20分 線性梯度]來精製，而得到2.9mg之在GLP-1之第22位置之Gly及第36位置之Arg以附加糖鏈Cys來置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(22、36Cys GLP-1-disialo)。
實施例5 第30位置、第36位置Cys-雙唾液酸附加糖鏈之GLP-1胜肽之合成法：
在固相合成用管柱容器中加入胺基-丙烯酸聚乙二醇酯(Amino-PEGA樹脂)(Merck公司製)(100μmol)、以DCM、DMF溶劑充分洗淨後，以DMF使其充分膨潤。將4-羥甲基-3-甲氧基苯氧酪酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基嗎啡啉(0.25mmol)放入DMF(2ml)中讓其溶解、放入管柱容器中，在室溫攪拌4小時。將樹脂以DMF及DCM來充分洗淨而得到HMPB-PEGA樹脂作為固相合成的固相來使用。
將Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)放置入DCM(2ml)中讓其溶解，放置入固相合成用管柱容器中，在25℃中攪拌3小時。
攪拌後，將樹脂用DCM、DMF洗淨。將Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2ml)15分鐘進行去保護。再以DMF洗淨後，其後之胜肽鏈之延長係用以下方法逐次讓胺基酸縮合。
將以Fmoc基所保護之胺基酸使其溶解於N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，再加上0.45M HCTU．HOBT/NMP(0.4mmol)後，添加於固相合成用管柱容器中，繼而將0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加到固相合成用管柱容器中。於室溫攪拌20分鐘後，將樹脂用DCM、DMF洗淨，將Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2ml)15分鐘進行去保護。重複此操作，使用以Fmoc基所保護之胺基酸(0.5mmol)來讓胺基酸逐次縮合。
以Fmoc基所保護之胺基酸，係使用Fmoc-Gly，Cys(Trt)，Fmoc-Gly，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Val，Fmoc-Leu，Fmoc-Trp(Boc)，CyS(Trt)，Fmoc-Ile，Fmoc-Phe，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ala，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Ala，Fmoc-His(Trt)而在固相樹脂中得到Gly-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)之31殘基胜肽(序列號73)。
將形成所得胜肽的樹脂之一部分放入固相合成管柱容器內，將三氟醋酸：水：三異丙基奈磺酸鈉TIPS(=95：2.5：2.5)加入至可充分浸滿樹脂之程度，在室溫攪拌3小時。將樹脂過濾去除，次將反應溶液在減壓下濃縮。將所得殘渣以高效液相層析儀HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)、ψ20×250mm、梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 8.0ml/分；B液35→60%20分 線性梯度]來精製，而得到GLP-1之第30位置之Ala及第36位置之Arg以Cys來置換之胜肽。
將溴乙醯化之雙唾液酸糖鏈(a)(大塚化學股份有限公司製)11.4mg及上述合成之胜肽鏈2.1mg溶於100mM磷酸緩衝液pH7.4、400μl而於37℃讓其反應1小時。以HPLC確認原料消失後，將這些原樣地以HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)、ψ4.6×250mm、梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 0.7ml/分；B液35→60% 20分 線性梯度]來精製，而得到1.6mg之在GLP-1之第30位置Ala及第36位置之Arg以附加糖鏈Cys來置換附加糖鏈GLP-1胜肽(30、36Cys GLP-1-disialo)。
實施例6 第30位置Cys-透明質酸4糖(HA-4)附加GLP-1胜肽之合成法：
在合成例1中所得到之透明質酸4糖(以下，在實施例1中有時也將低聚透明質酸僅稱為透明質酸)12.7mg中，加上水25.4μl及二甲基亞碸(DMSO)483ml使之溶解。在此溶液中加上碳酸氫銨200mg於37℃經30小時處理後凍結乾燥之。將所得之凍結乾燥品中加入22.4mg碳酸氫鈉、300μl水，再加上預先溶解於17μl之N,N-二甲基甲酸胺(DMF)之溴代醋酸酐(Aldrich公司製)34.9mg，一邊冰冷使反應1小時。1小時後使反應系回復到室溫再使其反應1小時後以凝膠過濾進行精製，而得到以下所示溴乙醯化透明質酸4糖(I)11.5mg。
將所得溴乙醯化透明質酸4糖(I)2.4mg與在合成例2所合成的GLP-1之第30位置之Ala以Cys來置換之胜肽(序列號76)1.3mg溶入100mM磷酸緩衝液pH7.5、130μl中，在37℃使之反應1.5小時。在HPLC中確認原料消失後，就這樣以HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)，ψ4.6×250mm，梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 0.7ml/分；B液35→60 20分，線性梯度]來精製，而得到第30位置之Ala以透明質酸附加4糖Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(30Cys GLP-1-HA-4)1.0mg。
實施例7 第30位置Cys-透明質酸8糖(HA-8)附加GLP-1胜肽之合成法：
在合成例1中所得到之透明質酸8糖8.7mg中，加上水17.4μl及二甲基亞碸(DMSO)314μl使之溶解。在此溶液中加上碳酸氫銨100mg於37℃經45小時處理後凍結乾燥之。將所得之凍結乾燥品中加入7.6mg碳酸氫鈉、180μl水，再加上預先溶解於7μl之N,N-二甲基甲酸胺(DMF)之溴代醋酸酐(Aldrich公司製)13.8mg，一邊冰冷使反應1小時。1小時後使反應系回復到室溫再使其反應1小時後以凝膠過濾進行精製，而得到以下所示溴乙醯化透明質酸8糖(II)7.3mg。
將所得溴乙醯化透明質酸8糖(II)2.9mg與在合成例2所合成的GLP-1之第30位置之Ala以Cys來置換之胜肽(序列號76)1.5mg溶入100mM磷酸緩衝液pH7.5、150μl中，在37℃使之反應1.5小時。在HPLC中確認原料消失後，就這樣以HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)，ψ4.6×250mm，梯度：A液：0.1%TFA、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 0.7ml/分；B液35→60 20分，線性梯度]來精製，而得到第30位置之Ala以透明質酸附加8糖Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(30Cys GLP-1-HA-8)0.5mg。
實施例8 第36位置Cys-透明質酸4糖(HA-4)附加GLP-1胜肽之合成法：
在合成例1中所得到之透明質酸4糖12.7mg中，加上水25.4μl及二甲基亞碸(DMSO)483μl使之溶解。在此溶液中加上碳酸氫銨200mg於37℃經30小時處理後凍結乾燥之。將所得之凍結乾燥品中加入22.4mg碳酸氫鈉、300μl水，再加上預先溶解於17μl之N,N-二甲基甲酸胺(DMF)之溴代醋酸酐(Aldrich公司製)34.9mg，一邊冰冷使反應1小時。1小時後使反應系回復到室溫再使其反應1小時後以凝膠過濾進行精製，而得到以下所示溴乙醯化透明質酸4糖(I)11.5mg。
將所得溴乙醯化透明質酸4糖(I)1.1mg與在合成例3所合成的GLP-1之第36位置之Arg以Cys來置換之GLP-1胜肽〈序列號78〉1.5mg溶於100mM磷酸緩衝液pH7.5、130μl中，在37℃使之反應1.5小時。在HPLC中確認原料消失後，就這樣以HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)，ψ4.6×250mm，梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 0.7ml/分；B液35→60 20分，線性梯度)來精製，而得到第36位置之Arg以透明質酸附加4糖Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(36Cys GLP-1-HA-4)0.9mg。
實施例9 第36位置Cys-透明質酸8糖(HA-8)附加GLP-1胜肽之合成法：
在合成例1中所得到之透明質酸8糖8.7mg中，加上水17.4μl及二甲基亞碸(DMSO)314μl使之溶解。在此溶液中加上碳酸氫銨100mg於37℃經45小時處理後凍結乾燥之。將所得之凍結乾燥品中加入7.6mg碳酸氫鈉、180μl水，再加上預先溶解於7μl之N,N-二甲基甲酸胺(DMF)之溴代醋酸酐(Aldrich公司製)13.8mg，一邊冰冷使反應1小時。1小時後使反應系回復到室溫再使其反應1小時後以凝膠過濾進行精製，而得到以下所示溴乙醯化透明質酸8糖(II)7.3mg。
將所得溴乙醯化透明質酸8糖(II)2.4mg與在合成例3所合成的GLP-1之第36位置之Arg以Cys來置換之GLP-1胜肽(序列號78)1.5mg溶入100mM磷酸緩衝液PH7.5、130μl中，在37℃使之反應2小時。在HPLC中確認原料消失後，就這樣以HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)，ψ4.6×250mm，梯度：A液：0.1%THA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 0.7ml/分；B液35→60 20分，線性梯度]來精製，而得到第36位置之Arg以透明質酸附加8糖Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(36Cys GLP-1-HA-8)0.5mg。
實施例10 第30位置Cys-透明質酸16糖〈HA-16〉附加GLP-1胜肽之合成法：
在合成例1中所得到之透明質酸16糖11.6mg中，加上水35μl及二甲基亞碸(DMSO)680ml使之溶解。在此溶液中加上碳酸氫銨260mg於37℃經75小時處理後凍結乾燥之。將所得之凍結乾燥品中加入5.5mg碳酸氫鈉、230μl水，再加上預先溶解於5.1μl之N,N-二甲基甲酸胺(DMF)之溴代醋酸酐(Aldrich公司製)10.2mg，一邊冰冷使反應1小時。1小時後使反應系回復到室溫再使其反應1小時後以凝膠過濾進行精製，而得到以下所示溴乙醯化透明質酸16糖(III)8.7mg。
將溴乙醯化透明質酸(III)16糖3.1mg與在合成例2所合成之胜肽鏈(序列號碼76)1.0mg溶入於100mM磷酸緩衝液pH7.5、190μl中，加上10mM三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽水溶液10μl，在37℃使之反應8小時。因在HPLC未見減少，就保持原樣如此地以HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)、ψ4.6×250mm、梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 0.7ml/分；B液35→60% 20分 線性梯度]來精製，而得到GLP-1第30位置之Ala以透明質酸附加16糖Cys來置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(30Cys GLP-1-HA-16)0.4mg。
實施例11 第36位置Cys-透明質酸附加16糖(HA-6)GLP-1胜肽之合成法：
將在實施例10中所調製之溴乙醯化透明質酸16糖(III)4.9mg與在合成例3合成之第36位置Cys GLP-1胜肽鏈(序列號78)1.2mg溶於100mM磷酸緩衝液pH7.5、190μl中，加上10mM三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽水液36μl，在37℃使之反應4小時。以HPLC確認原料消失後，就如此地以HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)、ψ4.6×250mm、梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 0.7ml/分；B液35→60% 20分 線性梯度]來精製，而得到GLP-1第36位置之Arg以透明質酸附加16糖Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(36Cys GLP-1-HA-16)0.3mg。
實施例12 第36位置Cys高甘露糖型附加糖鏈〈M5〉GLP-1胜肽之合成法：
將大豆粉100g以500ml之丙酮2次，500ml之甲醇2次來洗淨而得到61.4g脫脂大豆粉。
在所得之脫脂大豆粉43.0g中加上水430ml、液化酵素T(HBI公司製)4.3g，一邊攪拌在70℃使之反應19小時。用離心分離〈1000G、10分〉反應液將上清液和沉澱物分離，而得上清液800ml。再者於沉澱物中加上水430ml、液化酵素T 4.3g再度於70℃下使之反應19小時，將反應液離心分離(1000G、10分)將上清液和沉澱物分開，得到600ml上清液。配合所得到上清液(計1400ml)，加入500mM磷酸緩衝液pH7.0 100ml、Olientase ONS(HBI公司製)3.0g，一邊攪拌於50℃進行反應19小時。將反應後之液過濾去除不溶物，以旋轉蒸發濃縮儀(rotary evaporator)濃縮到液量400ml為止。將所得液用分劃分子量1K之限外過濾膜(Minimate TFF Capsule 1K membrane POL公司製)進行限外過濾。
經6小時之處理後，回收未透過膜之液230ml。在回收液中加上1M三-鹽酸緩衝液pH8.0 20ml，疊氮化鈉250mg、ActinaseE(科研製藥公司製)423.5mg在37℃反應82小時。將反應液過濾去除不溶物後，以旋轉蒸發濃縮儀濃縮到至液量100ml為止。將濃縮液各一半分兩次以Sephadex-G25(ψ25mm×100mm)管柱容器差示，僅收集含有糖鏈之區分(fraction)，濃縮後得到2.2g。
在將所得區分之含有糖鏈中加上蒸餾水21.0ml、乙醇14.9ml使之溶化，加上碳酸氫鈉1.13g、Fmoc-OSu 2.02g在室溫使之反應16小時。反應後加上250ml丙酮將沉澱物以膜濾器(ψ47mm、保持粒子徑0.5μm ADOBANTECH東洋公司製)來過濾。將膜上殘留之不溶物溶於蒸餾水中而回收，以旋轉蒸發濃縮儀濃縮液量到10ml以下。將濃縮液以Sephadex-G25(ψ25 mm×100mm)管柱容器來差示，僅收集含有糖鏈之區分，濃縮後得到1.37g。
將此更進一步溶於蒸餾水4ml中以ODS管柱容器(Wakogel 100C18、ψ25mm×150mm)來差示，僅收集含有糖鏈之區分，濃縮後得到粗精製糖鏈48.6mg。將粗精製糖鏈以HPLC[管柱容器：YMC-PackODS-AM ψ20 x 250mm、溶離液：乙腈/25mM醋酸銨緩衝液=82/18、流速：8.0ml/分]精製，得到高甘露糖型Man5GlcNAc2 糖鏈(M5糖鏈)13.0mg。
將所得M5糖鏈11.0mg中加水165μl使之溶解。在這溶液中加入碳酸氫銨200mg在室溫處理41小時後，凍結乾燥。將所得凍結乾燥品中加上碳酸氫鈉12.5mg、水110μl，再加入預先溶解於N-N-二甲基甲醯胺(DMF)之溴代醋酸酐(Aldrich公司製)19.9mg，一邊冰冷使之反應1小時。1小時後使反應系統回復到室溫再反應1小時後以凝膠過濾進行精製得到下示之溴乙醯化M5糖鏈(b)7.9mg。
將所得溴乙醯化M5糖鎖(b)4.1mg與在合成例3所合成的之第36位置之Arg以Cys來置換之胜肽(序列號78)1.2mg溶入100mM磷酸緩衝液pH7.5、190μl中，加上100mM三(2-羧乙基)膦酸鹽酸鹽水溶液24μl在37℃使之反應10小時。反應後以HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)，ψ4.6×250mm，梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 0.7ml/分；B液35→60 20分，線性梯度]來精製，而得到GLP-1第36位置之Arg以高甘露糖型M5附加M5糖鏈Cys來置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(36Cys GLP-1-M5)0.3mg。
實施例13 第26位置Lys-去唾液酵糖鏈Asn連結子修飾Arg34GLP-1(7-37)胜肽之合成法：
(1)天門冬醯胺結合去唾液酸糖鏈戊二酸之合成
在10mL之茄型燒杯中，使天門冬醯胺結合去唾液酸糖鏈(50.6mg、28.7μmol)溶解於DMSO-水(4：1、v/v、1.5mL)中。在此溶液中加入0.52M之戊二酸-EDC混合(1：1、mol/mol)之DMSO溶液(100μL、51.7μmol)，在溫室攪拌一天。將反應物以蒸餾水(1.5mL)稀釋後，以分子量排除凝膠層析法(Sephadex G-25、ψ1.5 x 45cm、蒸餾水)反復三次差示。將凍結乾造後，得到下示之天門冬醯胺結合去唾液酸糖鏈戊二酸(c)(51.4mg)。(MALDI TOF Mass calculated for[M+Na]+ 1891.66,found 1891.78)
(2)天門冬醯胺結合去唾液酸糖鏈戊二酸N-羥基琥珀酸亞醯胺酯之合成
在1.5mL之微離心管(eppendorf tube)中，只在天門冬醯胺結合去唾液酸糖鏈戊二酸(c)(17.2mg、9.2μmol)之DMOS(200μL)溶液中加上0.44M之N-羥基琥珀酸醯亞胺之DMSO溶液(25μL、27.6μmol)，在室溫下攪拌6小時後，加上DTT(5.7mg、36.8μmol)，將EDC鈍化(Grabarek,Z.,Gergely,J.Anal.Biochem.1990,185,131-135)。保持如此地，作為含有下示之天門冬醯胺結合去唾液酸N-羥基琥珀酸醯亞胺酯之此混合液之糖結合子試藥(0.03M溶液)用來與胜肽來縮合。
(3)第26位置Lys-唾液酵糖鏈Asn連結子修飾Arg34GLP-1(7-37)之合成
1.5mL之微離心管(eppendorf tube)中，於合成例4所合成之Lys26 Arg34 GLP-1(7-37)(序列號80)(2.8mg、0.83μmol)之DMSO(300μL)溶液中，加上DIPEA(4.8μL、27.6μmol)及上述所調製之0.03M之糖結合子試藥(150μL、4.5μmol)。在溫室攪拌2小時後，加上甘胺酸(2mg、26.6μmol)之水溶液(200μL)，停止反應，保持原樣地在HPLC[管柱容器：Zorbax 300SB-CN、ψ4.6×250mm，梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 1.0ml/分；B液10→40%(0-8分)40-50%(8-20分)線性梯度]收集保持15.5分之峰值區分，凍結乾燥後，得到下示之第26位置Lys-去唾液酸糖鏈Asn結合子修飾Arg34 GLP-1(7-37)(0.7mg)。(MALDI TOF Mass calculated for[M(average)+H]+ 5236.35,found 5236.1)
【化22】
實施例14 第30位置-Cys-雙唾液酸附加糖鏈毒蜥外泌肽-4之合成法：
在合成例5所合成之Ex-4之第30位置之Gly以Cys置換之第39殘基之胜肽12.0mg與溴乙醯化雙唾液酸糖鏈(a)(大塚化學股份有限公司製)36mg於100mM磷酸鈉緩衝液pH7.4，5mM三羧乙基膦1mL中，在37℃使之反應1小時。保持原樣如此地於HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120〈C18 5μm〉，ψ20×250mm，梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 8ml/分；B液35→50% 20分 線性梯度]來精製，而得到Ex-4之第30位置之Gly以雙唾液酸附加糖鏈Cys來置換之附加糖鏈附加Ex-4胜肽(30Cys Ex-4-disialo)10.6mg。(M：C271H422N58O123S MALDI TOF Mass calculated for[M+H]+ 6493.63,found 6494.33)
實施例15 第26位置-Cys-雙唾液酸附加糖鏈BIM51077之合成法：
在合成例6所合成之BIM51077之第26位置之Lys以-Cys來置換之30殘基之胜肽(2.4mg、0.72μmol)及胍(216mg)溶於蒸餾水(240μL)中，依序加上TCEP水溶液(100mM、100μL)，溴乙醯化雙唾液酸糖鏈(a)(10mg/mL，100μL、4.26μmol)及500mM之磷酸鈉緩衝液(pH7.4、100μL)。在37℃使之反應2小時，如此原樣地在HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)，ψ4.6×250mm，梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 0.7ml/分；B液35→60% 20分，線性梯度]來精製，而得到BIM51077之第26位置之Lys以雙唾液酸附加糖鏈Cys來置換之附加BIM51077胜肽(26Cys BIM51077-disialo)1.9mg。(MALDI TOF Mass calculated for[M(average)+H]+ 5578.72,found 5578.74)
實施例16 第30位置-Cys-雙唾液酸附加糖鏈-4之合成法：
在合成例5所合成之Ex-4之第30位置之Gly以Cys置換之第39殘基之胜肽1.2mg與在實施例12所合成之M5溴乙醯化糖鏈(b)3.9mg於35mM磷酸鈉緩衝液pH7.4，1mM三羧乙基膦0.17mL中，在37℃使之反應3小時。保持原樣如此地於HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C185μm)，ψ4.6×250mm，梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 0.7ml/分；B液35→50% 20分 線性梯度]來精製，而得到Ex-4之第30位置之Gly以高甘露糖型M5附加糖鏈Cys來置換之附加糖鏈Ex-4之胜肽(30Cys Ex-4-M5)0.5mg。(M：C233H362N54O97S MASLITOF Mass calculated for[M(average)+H]+ 5504．74，found 5506．85)
以下之表5，係在實施例1~16中所得附加糖鏈GLP-1胜肽之MS光譜數據(MALDI-TOF mass)。
比較例1：
在固相合成用管柱容器中加入胺基-丙烯酸聚乙二醇酯(Amino-PEGA樹脂)(Merck公司製)(100μmol)、以DCM、DMF溶劑充分洗淨後，以DMF使其充分膨潤。將4-羥甲基-3-甲氧基苯氧酪酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基嗎啡啉(0.25mmol)放入DMF(2ml)中讓其溶解後放入管柱容器中，在室溫攪拌4小時。將樹脂以DMF及DCM來充分洗淨而得到HMPB-PEGA樹脂作為固相合成的固相來使用。
將Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)放置入DCM(2ml)中讓其溶解，放置入固相合成用管柱容器中，在25℃中攪拌3小時。
攪拌後，將樹脂用DCM、DMF洗淨。將Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2ml)15分鐘進行去保護。再以DMF洗淨後，其後之胜肽鏈之延長係用以下方法逐次讓胺基酸縮合。
將以Fmoc基所保護之胺基酸使其溶解於N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，再加上0.45M HCTU．HOBT/NMP(0.4mmol)後，添加於固相合成用管柱容器中，繼而將0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加到固相合成用管柱容器中。於室溫攪拌20分鐘後，將樹脂用DCM、DMF洗浄，將Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2ml)15分鐘進行去保護。重複此操作，使用以Fmoc基所保護之胺基酸(0.5mmol)來讓胺基酸逐次縮合。
以Fmoc基所保護之胺基酸，係使用Fmoc-Gly，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Gly，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Val，Fmoc-Leu，Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ile，Fmoc-Phe，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ala，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Ala，Fmoc-His(Trt)而在固相樹脂中得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)之31殘基胜肽(序列號74)。
用DCM及DMF洗淨後，將5μmol31殘基相當之樹脂移到離心管(eppen tube)。
將形成所得胜肽的樹脂之一部分放入固相合成管柱容器內，將三氟醋酸：水：三異丙基奈磺酸鈉TIPS(=95：2.5：2.5)加入至可充分浸滿樹脂之程度，在室溫攪拌3小時。將樹脂過濾去除，次將反應溶液在減壓下濃縮。將所得殘渣以高效液相層析儀HPLC(Cadenza column C18 100×10mm展開溶媒A：0.1%TFA水溶液B：0.1%TFA乙腈：水=90：10梯度A：B=95：5&#10141；5：95 15分 流速3.0ml/分)來精製，而得到GLP-1。
合成例1 寡聚透明質酸糖鏈之合成：
在透明質酸(資生堂公司製，平均分子量120萬)500mg中加入pH值4之醋酸緩衝液100ml攪拌至溶解。加上透明質酸酶(CALBIOCHEM公司製，來自Bovine Testes)2.5kU，在37℃反應2天。將此溶液濃縮後，再次溶於45ml醋酸緩衝液中(pH值4)，加上透明質酸酶(CALBIOCHEM公司製，來自Bovine Tester)4.5kU在37℃再予以反應2天。使用分子量差示3kDa、1kDa超濾過濾膜(Milipore公司製)來差示反應液，凍結乾燥而得到1~3kDa之透明質酸差示268.4mg。
因為在所得之分子量1~3kDa透明質酸之差示中，含有複數種之寡聚透明質酸，為了將這些來分離以HPLC進行分取。讓分子量1~3kDa之寡聚透明質酸差示溶解於少量之水中，以HPLC[管柱容器：Shodex Asahipak NH2P-90 20F 9μm，ψ20.0×300mm、移動相：180mM NaH2PO4 aq]分數次來精製，將每個沖提峰(eluent peak)差示。將得到之差示以凝膠過濾來脫鹽，凍結乾燥得到寡聚透明質酸(4糖~18糖)。以下顯示各寡聚透明質酸之收取量。
寡聚透明質酸4糖22.5mg(tR =10.0min)
寡聚透明質酸6糖51.1mg(tR =11.8min)
寡聚透明質酸8糖52.7mg(tR =14.0min)
寡聚透明質酸10糖27.0mg(tR =17.0min)
寡聚透明質酸12糖9.6mg(tR =21.4min)
寡聚透明質酸14糖7.8mg(tR =27.6min)
寡聚透明質酸16糖4.1mg(tR =36.0min)
寡聚透明質酸18糖2.0mg(tR =47.4min)
合成例2 GLP-1之第30位置以Cys置換之胜肽合成法：
在固相合成用管柱容器中加入胺基-丙烯酸聚乙二醇酯(Amino-PEGA樹脂)(Merck公司製)(100μmol)、以DCM、DMF溶劑充分洗淨後，以DMF使其充分膨潤。將4-羥甲基-3-甲氧基苯氧酪酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基嗎啡啉(0.25mmol)放入DMF(2ml)中讓其溶解、放入管柱容器中，在室溫攪拌4小時。將樹脂以DMF及DCM來充分洗淨而得到HMPB-PEGA樹脂作為固相合成的固相來使用。
將Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)放置入DCM(2ml)中讓其溶解，放置入固相合成用管柱容器中，在25℃中攪拌3小時。
攪拌後，將樹脂用DCM、DMF洗淨。將Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2ml)15分鐘進行去保護。再以DMF洗淨後，其後之胜肽鏈之延長係用以下方法逐次讓胺基酸縮合。
將以Fmoc基所保護之胺基酸使其溶解於N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，再加上0.45M HCTU．HOBT/NMP(0.4mmol)後，添加於固相合成用管柱容器中，繼而將0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加到固相合成用管柱容器中。於室溫攪拌20分鐘後，將樹脂用DCM、DMF洗淨，將Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2ml)15分鐘進行去保護。重複此操作，使用以Fmoc基所保護之胺基酸(0.5mmol)來讓胺基酸逐次縮合。
以Fmoc基所保護之胺基酸，係使用Fmoc-Gly，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Gly，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Val，Fmoc-Leu，Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Cys(Trt)，Fmoc-Ile，Fmoc-Phe，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ala，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Ala，Fmoc-His(Trt)而在固相樹脂中得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)之31殘基胜肽(序列號75)。
將形成所得胜肽的樹脂之一部分放入固相合成管柱容器內，將三氟醋酸：水：三異丙基奈磺酸鈉TIPS(=95：2.5：2.5)加入至可充分浸滿樹脂之程度，在室溫攪拌3小時。將樹脂過濾去除，次將反應溶液在減壓下濃縮。將所得殘渣以高效液相層析儀HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)、ψ20×250mm、梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 8.0ml/分；B液35→60% 20分 線性梯度]來精製，而得到GLP-1之第30位置之Ala以Cys來置換之31殘基胜肽(序列號76)。
合成例3 GLP-1之第36位置以Cys置換之胜肽合成法：
在固相合成用管柱容器中加入胺基-丙烯酸聚乙二醇酯(Amino-PEGA樹脂)(Merck公司製)(100μmol)、以DCM、DMF溶劑充分洗淨後，以DMF使其充分膨潤。將4-羥甲基-3-甲氧基苯氧酪酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基嗎啡啉(0.25mmol)放入DMF(2ml)中讓其溶解、放入管柱容器中，在室溫攪拌4小時。將樹脂以DMF及DCM來充分洗淨而得到HMPB-PEGA樹脂作為固相合成的固相來使用。
將Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)放置入DCM(2ml)中讓其溶解，放置入固相合成用管柱容器中，在25℃中攪拌3小時。
攪拌後，將樹脂用DCM、DMF F洗淨。將Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2ml)15分鐘進行去保護。再以DMF洗淨後，其後之胜肽鏈之延長係用以下方法逐次讓胺基酸縮合。
將以Fmoc基所保護之胺基酸使其溶解於N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，再加上0.45M HCTU．HOBT/NMP(0.4mmol)後，添加於固相合成用管柱容器中，繼而將0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加到固相合成用管柱容器中。於室溫攪拌20分鐘後，將樹脂用DCM、DMF洗浄，將Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2ml)15分鐘進行去保護。重複此操作，使用以Fmoc基所保護之胺基酸(0.5mmol)來讓胺基酸逐次縮合。
以Fmoc基所保護之胺基酸，係使用Fmoc-Gly，Fmoc-Cys(Trt)，Fmoc-Gly，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Val，Fmoc-Leu，Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ile，Fmoc-Phe，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ala，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Ala，Fmoc-His(Trt)而在固相樹脂中得到Gly-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)之31殘基胜肽(序列號77)。
將形成所得胜肽的樹脂之一部分放入固相合成管柱容器內，將三氟醋酸：水：三異丙基奈磺酸鈉TIPS(=95：2.5：2.5)加入至可充分浸滿樹脂之程度，在室溫攪拌3小時。將樹脂過濾去除，次將反應溶液在減壓下濃縮。將所得殘渣以高效液相層析儀HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)、ψ20 x 250mm、梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 8.0ml/分；B液35→60% 20分 線性梯度]來精製，而得到GLP-1之第36位置之Ala以Cys來置換之31殘基胜肽(序列號78)。
合成例4 GLP-1之第34位置以Arg置換之胜肽合成法：
在固相合成用管柱容器中加入胺基-丙烯酸聚乙二醇酯(Amino-PEGA樹脂)(Merck公司製)(100μmol)、以DCM、DMF溶劑充分洗淨後，以DMF使其充分膨潤。將4-羥甲基-3-甲氧基苯氧酪酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基嗎啡啉(0.25mmol)放入DMF(2ml)中讓其溶解、放入管柱容器中，在室溫攪拌4小時。將樹脂以DMF及DCM來充分洗淨而得到HMPB-PEGA樹脂作為固相合成的固相來使用。
將Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)放置入DCM(2ml)中讓其溶解，放置入固相合成用管柱容器中，在25℃中攪拌3小時。
攪拌後，將樹脂用DCM、DMF洗淨。將Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2ml)15分鐘進行去保護。再以DMF洗淨後，其後之胜肽鏈之延長係用以下方法逐次讓胺基酸縮合。
將以Fmoc基所保護之胺基酸使其溶解於N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，再加上0.45M HCTU．HOBT/NMP(0.4mmol)後，添加於固相合成用管柱容器中，繼而將0.9M DIPE A/NMP(0.8mmol)加到固相合成用管柱容器中。於室溫攪拌20分鐘後，將樹脂用DCM、DMF洗淨，將Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2ml)15分鐘進行去保護。重複此操作，使用以Fmoc基所保護之胺基酸(0.5mmol)來讓胺基酸逐次縮合。
以Fmoc基所保護之胺基酸，係使用Fmoc-Gly，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Gly，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Val，Fmoc-Leu，Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ile，Fmoc-Phe，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ala，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Ala，Fmoc-His(Trt)而在固相樹脂中得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)之31殘基胜肽(序列號79)。
將形成所得胜肽的樹脂之一部分放入固相合成管柱容器內，將三氟醋酸：水：三異丙基奈磺酸鈉TlPS(=95：2.5：2.5)加入至可充分浸滿樹脂之程度，在室溫攪拌3小時。將樹脂過濾去除，次將反應溶液在減壓下濃縮。將所得殘渣以高效液相層析儀HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)、ψ20×250mm、梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 8.0ml/分；B液35→60% 20分 線性梯度]來精製，而得到GLP-1之第34位置之Ly以Arg來置換之31殘基胜肽(序列號80)。
合成例5 毒蜥外泌肽-4之第30位置以Cys置換之胜肽合成法：
在固相合成用管柱容器中以DMF洗淨Rink-Amido-PEGA樹脂(Merck公司製)後，胜肽鏈之延長使用下示方法逐次縮合胺基酸。
以Fmoc基保護胺基酸之胺基酸(0.5mmol)使溶入0.45M HCTU．HOBT/NMP(2.5mmol)中，加入固相管柱容器，繼之加上0.9M DIPEA/NMP(2.5mmol)。在室溫攪拌20分鐘後，用DCM及DMF洗淨樹脂，將Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2ml)15分鐘進行去保護。重複此操作而逐次使胺基酸縮合。
以Fmoc基保護之胺基酸中，使用Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Pro，Fmoc-Pro，Fmoc-Pro，Fmoc-Ala，Fmoc-Gly，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Pro，Fmoc-Cys(Trt)，Fmoc-Gly，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Leu，Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Ile，Fmoc-Phe，Fomc-Leu，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Val，Fmoc-Ala，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Met，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Ser(tBu)Fmoc-Leu，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Gly，Fmoc-His(Trt)而在固相樹脂中得到Ser(tBu)-Pro-Pro-Pro-Ala-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Pro-Cys(Trt)-Gly-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Ile-Phe-Leu-Arg(Pbf)-Val-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-His(Trt)之39殘基胜肽(序列號81)。
將形成所得胜肽的樹脂之一部分放入固相合成管柱容器內，將三氟醋酸：水：三異丙基奈磺酸鈉TIPS(=95：2.5：2.5)加入至可充分浸滿樹脂之程度，在室溫攪拌3小時。將樹脂過濾去除，次將反應溶液在減壓下濃縮。將所得殘渣以高效液相層析儀HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)、ψ20×250mm、梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 8.0ml/分；B液35→60% 20分 線性梯度]來精製，而得到EX-4之第30位置Gly以Cys置換之39殘基胜肽。(MALDI TOF Mass calculated for〔M+H)+ 4230.60，found 4231.27)(序列號82)。
合成例6 BIM51077之第26位置以Cys置換之胜肽合成法：
在固相合成用管柱中將Rink-Amido-PEGA樹脂(Merck公司製)(100μmol)以DMF洗淨後，使用以下方法表示胜肽鏈之延長，使胺基酸逐次縮合。
以Fmoc基保護胺基酸之胺基酸(0.5mmol)使溶入0.45M HCTU．HOBT/NMP(2.5mmol)中，加入固相管柱容器，繼之加上O.9M DIPEA/NMP(2.5mmol)。在室溫攪拌20分鐘後，用DCM及DMF洗淨樹脂，將Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2ml)15進行去保護。重複此操作而逐次使胺基酸縮合。
在以Fmoc基保護之胺基酸中，使用Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Aminoisobutyric Acid(Aib)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Val，Fmoc-Leu，Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ile，Fmoc-Phe，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Cys(Trt)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ala，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Aib，Fmoc-His(Trt)而在固相樹脂上得到Arg(Pbf)-Aib-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Aib-His(Trt)之30殘基胜肽(序列號83)。
將形成所得胜肽的樹脂之一部分放入固相合成管柱容器內，將三氟醋酸：水：三異丙基奈磺酸鈉TIPS(=95：2.5：2.5)加入至可充分浸滿樹脂之程度，在室溫攪拌3小時。將樹脂過濾去除，次將反應溶液在減壓下濃縮。將所得殘渣以高效液相層析儀HPLC[管柱容器：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)、ψ20×250mm、梯度：A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN 8.0ml/分；B液35→60% 20分 線性梯度]來精製，而得到BIM51077之第26位置之Lys以Cys置換30残基之胜肽12mg。(MALDI TOF Mass calculated for[M(average)+H〕+ 3315.69，found 3314.72)(序列號84)。
在以上之各實施例中所製造之附加糖鏈GLP-1胜肽，係以下之GLP-1之序列：His7 -Ala8 -Glu9 -Gly10 -Thr11 -Phe12 -Thr13 -Ser14 -Asp15 -Val16 -Ser17 -Ser18 -Tyr19 -Leu20 -Glu21 -Gly22 -Gln23 -Ala24 -Ala25 -Lys26 -Glu27 -Phe28 -Ile29 -Ala30 -Trp31 -Leu32 -Val33 -Lys34 -Gly35 -Arg36 -Gly37 (序列號2)中：
係(b1)第26位置之Lys及34位置之Lys以雙唾液酸附加糖鏈Cys置換附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例1)(序列號54)；
(b2)第18位置之Ser及36位置之Arg以雙唾液酸附加糖鏈Cys置換附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例2)(序列號55)；
(b3)第22位置之Gly及30位置之Ala以雙唾液酸附加糖鏈Cys置換附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例3)(序列號56)；
(b4)第22位置之Gly及36位置之Arg以雙唾液酸附加糖鏈Cys置換附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例4)(序列號57)；
(b5)第30位置之Ala及36位置之Arg以雙唾液酸附加糖鏈Cys置換附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例5)(序列號58)；
(b6)第30位置之Ala以透明質酸4糖(HA-4)附加Cys置換附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例6)(序列號59)；
(b7)第30位置之Ala以透明質酸8糖(HA-8)附加Cys置換附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例7)(序列號60)；
(b8)第36位置之Arg以透明質酸4糖(HA-4)附加Cys置換附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例8)(序列號61)；
(b9)第36位置之Arg以透明質酸8糖(HA-8)附加Cys置換附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例9)(序列號62)；
(b10)第30位置之Ala以透明質酸16糖(HA-16)附加Cys置換附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例10)(序列號63)；
(b11)第36位置之Arg以透明質酸16糖(HA-16)附加Cys置換附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例11)(序列號64)；
(b12)第36位置之Arg以高甘露糖鏈(M5)附加Cys置換附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例12)(序列號65)；
(b13)在第26位置之Lys上，藉由結合子結合去唾液酸附加糖鏈Asn之附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例13)(序列號66)。
又、(b14)以下之毒蜥外泌肽-4之序列：在H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 (序列號50)中：第30位置之Gly以雙唾液酸附加糖鏈Cys置換之GLP-1胜肽(實施例14)(序列號67)。
尚且(b15)以下之BIM51077之序列：His-R2-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-R2-Arg-NH2 〔式中，R2表示α-甲基丙胺酸。〕(序列號52)中：第26位置之Lys被雙唾液酸附加糖鏈Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例15)(序列號68)。
又、(b16)在上述毒蜥外泌肽-4之序列(序列號50)中，為第30位置之Gly被高甘露糖型附加糖鏈(M5)Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽(實施例16)。
實施例1~15中有關幾個例以以下實施例1及/或2進行。
實驗例1(對二肽基酞酶IV(DPP-IV)之耐受性(抗性)實驗)：
在0.5ml之微離心管(eppen tube)中將在實施例所製造之附加糖鏈GLP-1胜肽或比較例1所製造GLP-1以17.7nmol加上DPP-IV(Dipeptidyl PeptidaseIV from porcine kidney、SIGMA公司製)2.2mU各以100mM磷酸鈉緩衝液加到全量之100μl來調製，在37度使其反應。將反應液10μl與預先在微離心管(eppen tube)內所準備之10%三氟醋酸15μl使之混合，在HPLC中注入20μl，監測原料之消失(HPLC條件：管柱容器：SHISEIDO CAPCELPAK C18 UG120、ψ4.6×250mm、展開溶媒A:0.1%TFA水、展開溶媒B:0.09%TFA乙腈/水=90/10、線性梯度A/B=65/30→30/60 20分 流速0.7ml/分)。以未附加糖鏈之比較例之GLP-1半衰期(t1/2)作為基準(=1)，將對DPP-IV耐受性之指標所形成之半衰期(t1/2)在有關實施例之附加糖鏈GLP-1胜肽所評價之代表值以表6來表示。
各實施例之附加糖鏈GLP-1胜肽，表示了比較例1之GLP-1之2.1倍~128倍之DPP-IV耐受性。
實驗例2 口服葡萄糖耐受實驗(OGTT：Oral Glucose Tolerance Test)：
將實施例所製造之附加糖鏈GLP-1胜肽或在比較例1所製造之GLP-1之PBS溶液以10ml/kg之服用量服用至使其絕食一晚C57BL/6JJcl小鼠(10週大、雄性)之腹腔內。30分鐘後經口服用葡萄糖溶液1mg/g之服用量。葡萄糖服用前、葡萄糖服用30分鐘後、60分鐘後、120分鐘後進行眼窩採血，使用ACCU-CHEK Aviva(Roche Diagnostics公司)來測定血糖值。以圖1~4表示代表的結果，以下圖中，例如必要時將GLP-1之第26位置及34位置之胺基酸以雙唾液酸附加糖鏈Cys置換之附加糖鏈GLP-1胜肽「26、34Cys GLP-1-disialo」以「C26、C34」來記載，其他有關糖鏈及胺基酸部位亦相同。
其次有關18、36Cys GLP-1-disialo服用量為1/10(0.9nmol/kg)，有關GLP-1服用量為9nmol/kg，來進行OGTT，比較後，將結果顯示在圖5中。
服用量0.9nmol/kg之18、36Cys GLP-1-disialo之血糖值上抑制作用與服用量9nmol/kg之GLP-1幾乎相同。18、36Cys GLP-1-disialo之血糖值上升抑制作用與GLP-1較之為增大10倍之程度。
配列表ftee text：
序列號1是以通式(1)來表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號2是GLP-1(7-37)。
序列號3是GLP-1(7-36)NH2 。
序列號4是以(a1)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號5是以(a2)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號6是以(a3)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號7是以(a4)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號8是以(a5)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號9是以(a6)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號10是以(a7)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號11是以(a8)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號12是以(a9)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號13是以(a10)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號14是以(a11)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號15是以(a12)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號16是以(a13)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號17是以(a14)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號18是以(a15)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號19是以(a16)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號20是以(a17)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號21是以(a18)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號22是以(a19)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號23是以(a20)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號24是以(a21)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號25是以(a22)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號26是以(a23)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號27是以(a24)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號28是以(a25)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號29是以(a26)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號30是以(a27)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號31是以(a28)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號32是以(a29)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號33是以(a30)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號34是以(a31)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號35是以(a32)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號36是以(a33)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號37是以(a34)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號38是以(a35)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列識別號39是以(a36)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號40是以(a37)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號41是以(a38)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號42是以(a39)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號43是以(a40)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號44是以(a41)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號45是以(a42)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號46是以(a43)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號47是以(a44)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號48是以(a45)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號49是以(a46)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號50是以毒蜥外泌肽-4。
序列號51是以一般式(2)表示之附加糖鏈毒蜥外泌肽-4。
序列號52是以BIM51077。
序列號53是以一般式(3)表示之附加糖鏈BIM51077。
序列號54是以(b1)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號55是以(b2)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號56是以(b3)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號57是以(b4)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號58是以(b5)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號59是以(b6)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號60是以(b7)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號61是以(b8)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號62是以(b9)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號63是以(b10)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號64是以(b11)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號65是以(b12)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號66是以(b13)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號67是以(b14)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號68是以(b15)表示之附加糖鏈GLP-1胜肽。
序列號69是以在實施例1中具有所合成保護基31殘基胜肽。
序列號70是以在實施例2中具有所合成保護基31殘基胜肽。
序列號71是以在實施例3中具有所合成保護基31殘基胜肽。
序列號72是以在實施例4中具有所合成保護基31殘基胜肽。
序列號73是以在實施例5中具有所合成保護基31殘基胜肽。
序列號74是以在比較例1中具有所合成保護基31殘基胜肽。
序列號75是以在合成例2中具有所合成保護基31殘基胜肽。
序列號76是以在合成例2中具有所合成保護基31殘基胜肽。
序列號77是以在合成例3中具有所合成保護基31殘基胜肽。
序列號78是以在合成例3中具有所合成保護基31殘基胜肽。
序列號79是以在合成例4中具有所合成保護基31殘基胜肽。
序列號80是以在合成例4中具有所合成保護基31殘基胜肽。
序列號81是以在合成例5中具有所合成保護基39殘基胜肽。
序列號82是以在合成例5中具有所合成保護基39殘基胜肽。
序列號83是以在合成例6中具有所合成保護基30殘基胜肽。
序列號84是以在合成例6中具有所合成保護基30殘基胜肽。
【產業上之利用可能性】
在本發明與GLP-1相比，係提供附加糖鏈GLP-1胜肽可增大血中穩定性，較佳為增大血糖值抑制活性，本發明為特別在醫學藥品之領域係有用的。
【圖1】係表示依照由附加糖鏈GLP-1胜肽(第26位置、第34位置Cys雙唾液酸附加糖鏈GLP-1或第18位置、第36位置Cys雙唾液酸附加糖鏈GLP-1)或GLP-1之使用抑制血糖值上升作用之口服葡萄糖而授驗(OGTT)而測定之結果。第26位置、第34位置Cys雙唾液酸附加糖鏈GLP-1，第18位置、第36位置Cys雙唾液酸附加糖鏈GLP-1係投入使用0.9nmol/kg，GLP-1投入使用9nmol/kg；【圖2】係表示依照由附加糖鏈GLP-1胜肽(第22位置、第30位置Cys雙唾液酸附加糖鏈GLP-1，第22位置、第36位置Cys雙唾液酸附加糖鏈GLP-1或第30位置、第36位置Cys雙唾液酸附加糖鏈GLP-1)或GLP-1使用抑制血糖值上升作用之口服葡萄糖耐受實驗(OGTT)而測定之結果。第22位置、第30位置Cys雙唾液酸附加糖鏈GLP-1，第22位置、第36位置Cys雙唾液酸附加糖鏈GLP-1，第30位置、第36位置Cys雙唾液酸附加糖鏈GLP-1係服用0.9nmol/kg，GLP-1服用9nmol/kg；【圖3】係表示依照由附加糖鏈GLP-1胜肽(第36位置Cys-透明質酸4糖附加GLP-1或第36位置Cys-透明質酸8糖附加GLP-1)或GLP-1之使用抑制血糖值上升作用之口服葡萄糖耐受實驗(OGTT)而測定之結果，第36位置Cys-透明質酸4糖附加GLP-1，第36位置Cys-透明質酸8糖附加GLP-1及GLP-1服用(使用)9nmol/kg；【圖4】係表示依照由附加糖鏈GLP-1胜肽(第26位置Lys-去唾液酸糖鏈Asn結合子修飾GLP-1)或GLP-1之使用抑制血糖值上升作用之口服葡萄糖耐受實驗(OGTT)而測定之結果，第26位置Lys-去唾液酸糖鏈Asn結合子修飾GLP-1及GLP-1使用9nmol/kg；以及【圖5】係表示為了調查附加糖鏈GLP-1胜肽之服用(使用)量對抑制血糖值上升之作用所實施口服葡萄糖耐受實驗之結果。第18位置、第36位置是Cys雙唾液酸附加糖鏈GLP-1服用0.9nmol/kg，GLP-1服用9nmol/kg。
 SEQUENCE LISTING
<110> 公立大學法人橫濱市立大學 大塚股份有限公司 <120> glycosylated CLP-1 peptide <130> OCKP0806P1 <150> JP2008-157583 <151> 2008-06-17 <160> 84 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> glycosylated GLP-1 peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa18：Ser,glycosylated Cys or glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa19：Tyr,glycosylated Cys or glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa22：Gly,glycosylated Cys or glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa26：Lys,glycosylated Cys or glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa30：Ala,glycosylated Cys or glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa34：Lys,glycosylated Cys or glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa36：Arg,glycosylated Cys or glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa37：Gly,-NH2,Gly-glycosylated Cys or Gly-glycosylated Asn. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> When Xaa18 is Ser,Xaa19 is Tyr,Xaa22 is Gly,Xaa26 is Lys,Xaa30 is Ala,Xaa34 is Lys and Xaa36 is Arg,Xaa37 is Gly-glycosylated Cys or Gly-glycosylated Asn. <400> 1 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> human <220> <223> GLP-1(7-37)OH <400> 2<210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> GLP-1(7-36)NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 3<210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a1) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <400> 4<210> 5 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a2) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <400> 5<210> 6 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a3) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <400> 6<210> 7 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a4) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> <400> 7<210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a5) <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> <400> 8<210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a6) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <400> 9<210> 10 <211> 32 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a7) <220> <221> CARBOHYD <222> (32)..(32) <223> <400> 10<210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a8) <220> <221> CARBOHYD <222> (13)..(13) <223> <400> 11<210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a9) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <400> 12<210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a11) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <400> 13<210> 14 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a11) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <400> 14<210> 15 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a12) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> <400> 15 <210> 16 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a13) <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> <400> 16<210> 17 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a14) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <400> 17<210> 18 <211> 32 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a15) <220> <221> CARBOHYD <222> (32)..(32) <223> <400> 18<210> 19 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a16) <220> <221> CARBOHYD <222> (13)..(13) <223> <400> 19<210> 20 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a17) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 20<210> 21 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a18) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> MDO_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 21<210> 22 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a19) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 22<210> 23 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a20) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 23<210> 24 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a21) <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 24<210> 25 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a22) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 25<210> 26 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a23) <220> <221> CARBOHYD <222> (13)..(13) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 26<210> 27 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a24) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 27 <210> 28 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a25) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 28<210> 29 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a26) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <220> <221> MDO_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 29<210> 30 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a27) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 30<210> 31 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a28) <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 31<210> 32 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a29) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 32<210> 33 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a30) <220> <221> CARBOHYD <222> (13)..(13) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 33<210> 34 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a31) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <400> 34<210> 35 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a32) <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> <400> 35<210> 36 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a33) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <400> 36<210> 37 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a34) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> <400> 37<210> 38 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a35) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <400> 38<210> 39 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a36) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> <400> 39<210> 40 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a37) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <400> 40<210> 41 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a38) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <400> 41<210> 42 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a39) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> <400> 42<210> 43 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a40) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <400> 43<210> 44 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a41) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> <400> 44<210> 45 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a42) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <400> 45<210> 46 <211> 32 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a43) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (32)..(32) <223> <400> 46<210> 47 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a44) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <400> 47<210> 48 <211> 32 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a45) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (32)..(32) <223> <400> 48<210> 49 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(a46) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 49 <210> 50 <211> 39 <212> PRT <213> Heloderma <220> <223> Exendin-4 <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 50<210> 51 <211> 39 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> glycosylated Exendin-4 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa12：Lys,glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa14：Met,glycosylatea Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa16：Glu,glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa20：Arg,glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa24：Glu,glycosylatea Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa28：Asn,glycosylatea Cys or glycosylatea Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa30：Gly,glycosylatea Cys or glycosylated Asn <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <220> <223> At least one of Xaa12,Xaa14,Xaa16,Xaa20,Xaa24,Xaa28 and Xaa30 is glycosylated Cys or glycosylated Asn. <400> 51<210> 52 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> BIM51077 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa8：Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa35：Aib <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 52<210> 53 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> glycosylated BIM51077 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa8：Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa18：Ser,glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa20：Leu,glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa22：Gly,glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa26：Lys,glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa30：Ala,glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa34：Lys,glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa35：Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa36：Arg,glycosylated Cys or glycosylated Asn <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <220> <223> At least one of Xaa18,Xaa20,Xaa22,Xaa26,Xaa30,Xaa34 and Xaa36 is glycosylated Cys or glycosylated Asn. <400> 53<210> 54 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(b1)(Example 1) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (28)..(28) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <400> 54 <210> 55 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(b2)(Example 2) <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <400> 55<210> 56 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(b3)(Example 3) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <400> 56<210> 57 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(b4)(Example 4) <220> <221> CARBOHYD <222> (16)..(16) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <400> 57<210> 58 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(b5)(Example 5) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <400> 58<210> 59 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(b6)(Example 6) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> Cys glycosylated by hyaluronan tetra saccharides <400> 59<210> 60 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(b7)(Example 7) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> Cys glycosylated by hyaluronan octa saccharides <400> 60<210> 61 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(b8)(Example 8) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Cys glycosylated by hyaluronan tetra saccharides <400> 61<210> 62 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(b9)(Example 9) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Cys glycosylated by hyaluronan octa saccharides <400> 62<210> 63 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(b10)(Example 10) <220> <221> CARBOHYD <222> (24)..(24) <223> Cys glycosylated by hyaluronan hexa-deca saccharides <400> 63<210> 64 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(b11)(Example 11) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Cys glycosylated by hyaluronan hexa-deca saccharides <400> 64<210> 65 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(b12)(Example 12) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Cys glycosylated by high mannose-type heptaoligosaccharide <400> 65<210> 66 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(b13)(Example 13) <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> Lys glycosylated by asialo oligosaccharide <400> 66<210> 67 <211> 39 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(b14)(Example 14) <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 67<210> 68 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胺基酸序列(b15)(Example 15) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Aib <220> <221> CARBOHYD <222> (20)..(20) <223> Cys glycosylated by disialo oligosaccharide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 68<210> 69 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> amino acid sequence having blocking groups(Example 1) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Gluhaving blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 69<210> 70 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> amino acid sequence having blocking groups(Example 2) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Cys having blocking groupTrt <400> 70<210> 71 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> amino acid sequence having blocking groups(Example 3) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group otBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys baving blocking group Boc <220> <221> MlSC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MlSC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 71<210> 72 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> amino acid sequence having blocking groups(Example 4) <220> <221> MISC-FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC-FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC-FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC-FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC-FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222>(17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Cys having blocking group Trt <400> 72<210> 73 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (Example 5) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MlSC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Cys having blocking group Trt <400> 73<210> 74 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> amino acid sequence having blocking groups(Comparative Example 1) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 74<210> 75 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> amino acid sequence having blocking groups(Synthetic Example 2) <220> <221> MISC_FEATURE<222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 75<210> 76 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> amino acid sequence(Synthetic Example 2) <400> 76<210> 77 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> amino acid sequence having blocking groups(Synthetic Example 3) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Cys having blocking group Trt <400> 77<210> 78 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> amino acid sequence(Synthetic Example 3) <400> 78<210> 79 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> amino acid sequence having blocking groups(Synthetic Example 4) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Arg having blocking group Pbf <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 79<210> 80 <211> 31 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> amino acid sequence(Synthetic Example 4) <400> 80<210> 81 <211> 39 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> amino acid sequence having blocking groups(Synthetic Example 5) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE<222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Arg having blocking group Pbf <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Asn having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 81<210> 82 <211> 39 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> amino acid sequence(Synthetic Example 5) <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> AMIDATION <400> 82<210> 83 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> amino acid sequence having blocking groups(synthetic Example 6) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa8：Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17)<223> Gln having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Trp having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa35：Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg having blocking group Pbf <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 83<210> 84 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> amino acid sequence(Synthetic Enample 6)<220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa8：Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa35：Aib <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> AMIDATION <400> 84

Claims (25)

  1. 一種附加糖鏈GLP-1胜肽，係在(a)以附加糖鏈胺基酸來置換各序列號2或序列號3之GLP-1胜肽之至少2個之胺基酸且各置換部位係選自由序列號2或序列號3之GLP-1胜肽的第18、22、26、30、34及36位置所組成之群組的附加糖鏈GLP-1胜肽；或(b)以該(a)所規定之附加糖鏈GLP-1胜肽之胺基酸序列中，其特徵在於：其為進一步被缺失、置換或附加附加糖鏈胺基酸以外之1個或數個胺基酸之具有GLP-1活性之附加糖鏈GLP-1胜肽，該糖鏈係為各自獨立的2條鏈複合型糖鏈且由5個以上的糖所組合之糖鏈；該附加糖鏈GLP-1胜肽，於OGTT中(口服葡萄糖耐受實驗：Oral Glucose Tolerance Test)，當測定服用葡萄糖後30分鐘之血糖值時，表示在服用GLP-1胜肽時得到之血糖值為80%以下，且於DPP-IV溶液中之該附加糖鏈GLP-1胜肽之半衰期，為GLP-1胜肽之半衰期之至少2倍以上，以及該附加糖鏈GLP-1胜肽，第26位置及第34位置並非藉由雙唾液酸附加糖鏈胺基酸或雙唾液酸附加糖鏈胺基酸二聚物所置換之附加糖鏈GLP-1胜肽。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中該各置換部位係選自從序列號2或序列號3之GLP-1胜肽之第18、22、30及36位置所組成之群組。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中該糖鏈以任何獨立【化1】 〔式中R1 及R2 為同一或相異 來表示；乙醯基以Ac表示〕來表示之糖鏈之附加糖鏈GLP-1胜肽。
  4. 如申請專利範圍第1或3項所述之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中該糖鏈係單獨選自於雙唾液酸糖鏈、單唾液酸糖鏈、去唾液酸糖鏈、雙N-乙醯胺基葡萄糖糖鏈及雙甘露糖糖鏈之族群中之糖鏈來形成附加糖鏈GLP-1胜肽。
  5. 如申請專利範圍第1項或第3項所述之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中該糖鏈為實質均一之附加糖鏈GLP-1胜肽。
  6. 如申請專利範圍第1項或第3項所述之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中該各糖鏈為雙唾液酸糖鏈之附加糖鏈GLP-1胜肽。
  7. 如申請專利範圍第1項或第3項所述之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中分別以附加糖鏈胺基酸置換之至少2個之胺基酸之置換部位，於序列號2或序列號3之GLP-1胜肽，係選自由第18位置與第36位置、第26位置與第34位置、第22位置與第30位置、第22位置與第36位置及第30位置與第36位置所組成之群組而形成的附加糖鏈GLP-1胜肽。
  8. 如申請專利範圍第7項之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中分別以附加糖鏈胺基酸置換之至少2個之胺基酸之置換部位，於序列號2或序列號3之GLP-1胜肽，係選自由第18位置與第36位置、第22位置與第30位置、第22位置與第36位置及第30位置與第36位置所組成之群組而形成附加糖鏈GLP-1胜肽。
  9. 如申請專利範圍第8項之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中以附加糖鏈胺基酸各自置換之至少2個之胺基酸之置換部位，係於序列號2或序列號3之GLP-1胜肽，為第22位置與第30位置或第22位置與第36位置而形成附加糖鏈GLP-1胜肽。
  10. 如申請專利範圍第1項或第3項所述之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中各該附加糖鏈胺基酸為各自獨立之附加糖鏈Asn及/或附加糖鏈Cys來形成附加糖鏈GLP-1胜肽。
  11. 如申請專利範圍第1項或第3項所述之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中具有以下特性：與GLP-1胜肽比較具有增大血糖穩定性；於OGTT(口服葡萄糖耐受實驗)，與GLP-1胜肽比較具有10倍以上之血糖值抑制活性；及/或於DPP-IV溶液中之半衰期，為GLP-1胜肽之半衰期之20倍以上， 而形成附加糖鏈GLP-1胜肽。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中於DPP-IV溶液中之半衰期，為GLP-1胜肽之半衰期之30倍以上而形成附加糖鏈GLP-1胜肽。
  13. 一種具有GLP-1活性之附加糖鏈GLP-1胜肽，係在(a)序列號2或序列號3之GLP-1胜肽；或(b)於該(a)所規定之GLP-1胜肽之胺基酸序列，進一步被缺失、置換或附加1個或數個胺基酸之具有GLP-1活性之胜肽中；係以附加糖鏈胺基酸來置換最少1個胺基酸之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中，該附加糖鏈GLP-1胜肽，於OGTT中(口服葡萄糖耐受實驗：Oral Glucose Tolerance Test)，當測定服用葡萄糖後30分鐘之血糖值時，表示服用GLP-1胜肽時得到之血糖值為80%以下，且於DPP-IV溶液中之該附加糖鏈GLP-1胜肽之半衰期，為GLP-1胜肽之半衰期之至少2倍以上，該糖鏈為寡聚透明質酸之糖鏈，以及該寡聚透明質酸係由N-乙醯葡萄糖胺及葡萄糖醛酸所形成之單位作為1單位，且由2單位(4糖)以上至8單位(16糖)以下之糖鏈而形成附加糖鏈GLP-1胜肽。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中該寡聚透明質酸係由N-乙醯葡萄糖胺及葡萄糖醛酸所形成之單位作為1單位，且由2單位(4糖)之糖鏈而形成附加糖鏈GLP-1胜肽。
  15. 如申請專利範圍第13項或14項所述之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中該附加糖鏈胺基酸為附加糖鏈Cys而形成附加糖鏈GLP-1胜肽。
  16. 如申請專利範圍第13項或第14項所述之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中該糖鏈為實質均一而形成附加糖鏈GLP-1胜肽。
  17. 一種具有GLP-1活性之附加糖鏈GLP-1胜肽，係在(a)序列號2或序列號3之GLP-1胜肽；或(b)於該(a)所規定之GLP-1之胺基酸序列，進一步被缺失、置換或附加1個或數個胺基酸之具有GLP-1活性之胜肽中；其為以附加糖鏈胺基酸來置換至少之1個胺基酸之附加糖鏈GLP-1胜肽，該附加糖鏈GLP-1胜肽，於OGTT中(口服葡萄糖耐受實驗：Oral Glucose Tolerance Test)，當測定服用葡萄糖後30分鐘之血糖值時，表示服用GLP-1胜肽時得到之血糖值為80%以下，且於DPP-IV溶液中之該附加糖鏈GLP-1胜肽之半衰期，為GLP-1胜肽之半衰期之至少2倍以上，以及其中在該附加糖鏈胺基酸中，糖鏈與胺基酸藉由結合子結合且與該結合子結合之胺基酸為Lys而形成附加糖鏈GLP-1胜肽。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中結合子係在該糖鏈側之末端上含有胺基酸而形成附加糖鏈GLP-1胜肽。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中在該結合子上所含之胺基酸為Asn而形成附加糖鏈GLP-1胜肽。
  20. 如申請專利範圍第17項或第18項所述之附加糖鏈GLP-1胜肽，其中該糖鏈為實質均一而形成附加糖鏈GLP-1胜肽。
  21. 一種含有如申請專利範圍第1項至第20項任一項所述之附加糖鏈GLP-1胜肽作為有效成份之醫藥組成物。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之醫藥組成物，其中該糖鏈為90%以上均一之醫藥組成物。
  23. 如申請專利範圍第21項或第22項所述之醫藥組成物，其中該醫藥組成物係有關於GLP-1病患之治療或預防之醫藥組成物。
  24. 如申請專利範圍第23項所述之醫藥組成物，其中該醫藥組成物係有關於GLP-1之糖尿病病患之醫藥組成物。
  25. 一種如申請專利範圍第1項至第20項任一項所述之附加糖鏈GLP-1胜肽之使用，其係用於有關GLP-1病患之治療或預防用醫藥之製造。
TW098120124A 2008-06-17 2009-06-16 附加糖鏈胰高血糖素樣肽－１胜肽 TWI459960B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008157583 2008-06-17
JP2008326609 2008-12-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201004643A TW201004643A (en) 2010-02-01
TWI459960B true TWI459960B (zh) 2014-11-11

Family

ID=41433882

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW098120124A TWI459960B (zh) 2008-06-17 2009-06-16 附加糖鏈胰高血糖素樣肽－１胜肽

Country Status (11)

Country Link
US (1) US8765669B2 (zh)
EP (1) EP2298801A4 (zh)
JP (1) JP5604297B2 (zh)
KR (1) KR101609005B1 (zh)
CN (1) CN102083854A (zh)
AU (1) AU2009261441B2 (zh)
BR (1) BRPI0914889A2 (zh)
CA (1) CA2727147A1 (zh)
RU (1) RU2543157C2 (zh)
TW (1) TWI459960B (zh)
WO (1) WO2009153960A1 (zh)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101870728A (zh) * 2009-04-23 2010-10-27 派格生物医药(苏州)有限公司 新型Exendin变体及其缀合物
EP2495255A4 (en) * 2009-10-30 2013-05-15 Otsuka Chemical Co Ltd GLYCOSYLATED FORM OF AN ANTIGENIC GLP-1 ANALOG
DE102010015123A1 (de) 2010-04-16 2011-10-20 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Benzylamidische Diphenylazetidinone, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und deren Verwendung
US8530413B2 (en) 2010-06-21 2013-09-10 Sanofi Heterocyclically substituted methoxyphenyl derivatives with an oxo group, processes for preparation thereof and use thereof as medicaments
WO2011162830A2 (en) * 2010-06-24 2011-12-29 Biousian Biosystems, Inc. Glucagon-like peptide-1 glycopeptides
TW201221505A (en) 2010-07-05 2012-06-01 Sanofi Sa Aryloxyalkylene-substituted hydroxyphenylhexynoic acids, process for preparation thereof and use thereof as a medicament
TW201215388A (en) 2010-07-05 2012-04-16 Sanofi Sa (2-aryloxyacetylamino)phenylpropionic acid derivatives, processes for preparation thereof and use thereof as medicaments
TW201215387A (en) 2010-07-05 2012-04-16 Sanofi Aventis Spirocyclically substituted 1,3-propane dioxide derivatives, processes for preparation thereof and use thereof as a medicament
CN102718858B (zh) * 2011-03-29 2014-07-02 天津药物研究院 胰高血糖素样肽-1类似物单体、二聚体及其制备方法与应用
CN106146649B (zh) * 2011-09-04 2020-09-01 株式会社糖锁工学研究所 附加糖链的多肽和含有该多肽的医药组合物
US9422357B2 (en) * 2011-09-04 2016-08-23 Glytech, Inc. Glycosylated polypeptide and drug composition containing said polypeptide
EP2567959B1 (en) 2011-09-12 2014-04-16 Sanofi 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-styryl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors
WO2013037390A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 Sanofi 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-styryl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors
EP2760862B1 (en) 2011-09-27 2015-10-21 Sanofi 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-alkyl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors
IN2014CN02982A (zh) * 2011-10-01 2015-07-03 Glytech Inc
RS61391B1 (sr) 2012-06-08 2021-02-26 Alkermes Pharma Ireland Ltd Ligandi modifikovani primenom cirkularnog permutiranja kao agonisti i antagonisti
UA116217C2 (uk) 2012-10-09 2018-02-26 Санофі Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону
WO2014064215A1 (en) 2012-10-24 2014-05-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) TPL2 KINASE INHIBITORS FOR PREVENTING OR TREATING DIABETES AND FOR PROMOTING β-CELL SURVIVAL
JP6211533B2 (ja) 2012-11-22 2017-10-11 株式会社糖鎖工学研究所 糖鎖付加リンカー、糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩、及びそれらの製造方法
KR102227919B1 (ko) 2012-11-30 2021-03-15 가부시키가이샤 도우사 고가쿠 겐큐쇼 당쇄 부가 링커, 당쇄 부가 링커와 생리 활성 물질을 포함하는 화합물 또는 그 염, 및 그것들의 제조 방법
CN104870009B (zh) 2012-12-21 2021-05-18 赛诺菲 官能化的毒蜥外泌肽-4衍生物
BR112015024423B1 (pt) * 2013-03-29 2023-04-25 Glytech, Inc Polipeptídeo glicosilado tendo atividade de interferon ?, composição farmacêutica e uso de um polipeptídeo glicosilado
TW201609795A (zh) 2013-12-13 2016-03-16 賽諾菲公司 作為雙重ｇｌｐ－１／ｇｉｐ受體促效劑的艾塞那肽－４（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）胜肽類似物
EP3080154B1 (en) 2013-12-13 2018-02-07 Sanofi Dual glp-1/gip receptor agonists
EP3080149A1 (en) 2013-12-13 2016-10-19 Sanofi Dual glp-1/glucagon receptor agonists
EP3080152A1 (en) 2013-12-13 2016-10-19 Sanofi Non-acylated exendin-4 peptide analogues
TW201625668A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 作為胜肽性雙重ｇｌｐ－１／昇糖素受體激動劑之艾塞那肽－４衍生物
TW201625670A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自ｅｘｅｎｄｉｎ－４之雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑
TW201625669A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自艾塞那肽－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）之肽類雙重ＧＬＰ－１／升糖素受體促效劑
US9932381B2 (en) 2014-06-18 2018-04-03 Sanofi Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists
US10426818B2 (en) 2015-03-24 2019-10-01 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Method and pharmaceutical composition for use in the treatment of diabetes
AR105319A1 (es) 2015-06-05 2017-09-27 Sanofi Sa Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico
TW201706291A (zh) 2015-07-10 2017-02-16 賽諾菲公司 作為選擇性肽雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑之新毒蜥外泌肽（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）衍生物
JP2019218265A (ja) * 2016-09-14 2019-12-26 生化学工業株式会社 ペプチドの血中滞留性を増強させる方法
CN109021093B (zh) * 2018-08-29 2021-09-07 上海生物制品研究所有限责任公司 聚乙二醇修饰的glp-1衍生物及其药用盐
CN115417914A (zh) * 2019-10-11 2022-12-02 润辉生物技术（威海）有限公司 一种乙酰透明质酸寡肽及其制备与应用方法
JPWO2022239839A1 (zh) * 2021-05-13 2022-11-17
CN115215948B (zh) * 2022-06-02 2023-07-11 润辉生物技术（威海）有限公司 一种低分子的乙酰透明质酸脱羧肌肽衍生物、制备方法及应用
WO2024101434A1 (ja) * 2022-11-10 2024-05-16 学校法人東京理科大学 眼疾患の治療のための生理活性ペプチド誘導体、医薬組成物、経鼻・点鼻製剤及び生理活性ペプチド誘導体の使用
WO2024101433A1 (ja) * 2022-11-10 2024-05-16 学校法人東京理科大学 神経ペプチド配列及び糖鎖を含む糖鎖修飾神経ペプチド誘導体、医薬組成物、経鼻・点鼻製剤及び糖鎖修飾神経ペプチド誘導体の使用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007063907A1 (ja) * 2005-11-30 2007-06-07 Shionogi & Co., Ltd. ペプチド糖鎖付加体およびそれを有効成分とする医薬

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6277819B1 (en) 1996-08-30 2001-08-21 Eli Lilly And Company Use of GLP-1 or analogs in treatment of myocardial infarction
UA65549C2 (uk) 1996-11-05 2004-04-15 Елі Ліллі Енд Компані Спосіб регулювання ожиріння шляхом периферійного введення аналогів та похідних glp-1 (варіанти) та фармацевтична композиція
SE9802080D0 (sv) 1998-06-11 1998-06-11 Hellstroem Pharmaceutical composition for the treatment of functional dyspepsia and/or irritable bowel syndrome and new use of substances therein
MY155270A (en) 1998-09-24 2015-09-30 Lilly Co Eli Use of glp-1 or analogs in treatment of stroke
WO2001068136A1 (fr) * 2000-03-17 2001-09-20 Ajinomoto Co., Inc. Medicaments permettant de traiter les complications du diabete et des neuropathies et utilisation de ces medicaments
ES2402089T3 (es) 2001-06-19 2013-04-26 Glytech, Inc. Procedimiento para producir derivado de asparagina de la cadena de azúcar
US7265085B2 (en) * 2001-10-10 2007-09-04 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7943763B2 (en) 2002-07-05 2011-05-17 Otsuka Chemical Holdings Co., Ltd. Process for preparing glycopeptides having asparagine-linked oligosaccharides, and the glycopeptides
TWI335920B (en) 2002-12-24 2011-01-11 Yasuhiro Kajihara Sugar chain asparagine derivatives, sugar chain asparagine and sugar chain and manufacture thereof
AU2003292641B2 (en) 2002-12-26 2007-11-29 Glytech, Inc. Three-branched sugar-chain asparagine derivatives, the sugar-chain asparagines, the sugar chains, and processes for producing these
US7772188B2 (en) 2003-01-28 2010-08-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
TR201820053T4 (tr) 2003-02-04 2019-01-21 Glytech Inc Şeker zinciri asparajin türevi üretmeye yönelik proses.
EP2657255A1 (en) 2003-07-28 2013-10-30 Glytech, Inc. Aminated complex-type sugar chain derivatives and process for the production thereof
WO2005095331A1 (ja) 2004-03-31 2005-10-13 Shionogi & Co., Ltd. 糖鎖－ペプチド結合剤
WO2006010143A2 (en) * 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
TWI376234B (en) 2005-02-01 2012-11-11 Msd Oss Bv Conjugates of a polypeptide and an oligosaccharide
TW200643033A (en) 2005-03-08 2006-12-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Conjugate of water-soluble modified hyaluronic acid and glp-1 analogue
TWI466897B (zh) 2005-07-19 2015-01-01 Glytech Inc 癌細胞之檢測方法、糖鏈之構造解析方法，以及糖鏈衍生物
EP2049567A2 (en) 2006-07-18 2009-04-22 Centocor, Inc. Human glp-1 mimetibodies, compositions, methods and uses
CN101516388B (zh) 2006-07-21 2012-10-31 诺和诺德公司 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化
DK2172479T3 (en) 2007-06-19 2016-12-19 Glytech Inc GLP-1 peptide having the sugar chain attached thereto

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007063907A1 (ja) * 2005-11-30 2007-06-07 Shionogi & Co., Ltd. ペプチド糖鎖付加体およびそれを有効成分とする医薬

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110031458A (ko) 2011-03-28
EP2298801A4 (en) 2011-08-03
AU2009261441A1 (en) 2009-12-23
JP5604297B2 (ja) 2014-10-08
RU2543157C2 (ru) 2015-02-27
TW201004643A (en) 2010-02-01
CN102083854A (zh) 2011-06-01
JPWO2009153960A1 (ja) 2011-11-24
EP2298801A1 (en) 2011-03-23
RU2011101464A (ru) 2012-07-27
CA2727147A1 (en) 2009-12-23
BRPI0914889A2 (pt) 2015-11-24
US8765669B2 (en) 2014-07-01
US20110195897A1 (en) 2011-08-11
AU2009261441B2 (en) 2013-01-10
WO2009153960A1 (ja) 2009-12-23
KR101609005B1 (ko) 2016-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI459960B (zh) 附加糖鏈胰高血糖素樣肽－１胜肽
TWI423821B (zh) Glucose-containing glucagon-like peptide-1 peptide
WO2011052523A1 (ja) 抗原性ｇｌｐ－１アナログの糖鎖付加体
JP2012532898A (ja) アシル化グルカゴン類似体
KR20140060548A (ko) 당쇄 부가 폴리펩티드 및 당해 폴리펩티드를 포함하는 의약 조성물
TWI633115B (zh) 加成糖鏈之多胜肽及含有該多胜肽之醫藥組成物
US20230365623A1 (en) Derivatisation of peptides and proteins