WO2024101434A1 - 眼疾患の治療のための生理活性ペプチド誘導体、医薬組成物、経鼻・点鼻製剤及び生理活性ペプチド誘導体の使用 - Google Patents

眼疾患の治療のための生理活性ペプチド誘導体、医薬組成物、経鼻・点鼻製剤及び生理活性ペプチド誘導体の使用 Download PDF

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peptide derivative
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親正 山下
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    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons

Definitions

  • the present invention relates to a physiologically active peptide derivative, a pharmaceutical composition, a nasal or nasal drop preparation, and the use of the physiologically active peptide derivative for the treatment of eye diseases.
  • Intravitreal injection is a method of treating eye diseases in which a drug is injected into the eyeball using a syringe (see, for example, Patent Document 1).
  • a drug is injected into the eyeball using a syringe (see, for example, Patent Document 1).
  • anti-VEGF substances which have the effect of shrinking abnormal blood vessels (choroidal neovascularization) that grow from the choroid under the retina toward the retina, are injected into the eyeball to treat eye diseases such as age-related macular degeneration.
  • Patent Document 1 JP 2022-81491 A
  • the present invention aims to provide novel physiologically active peptide derivatives, pharmaceutical compositions, nasal and nasal drop preparations, and uses of the physiologically active peptide derivatives for the treatment of eye diseases.
  • a physiologically active peptide derivative for treating an eye disease comprising a physiologically active peptide sequence and a functional sequence including a membrane permeation-promoting sequence and an endosomal escape-promoting sequence.
  • the physiologically active peptide derivative according to ⁇ 1> further comprising a glycosylated molecule containing a sugar chain.
  • the physiologically active peptide derivative according to ⁇ 2> wherein the glycosylation molecule is bound to the C-terminus or N-terminus of the physiologically active peptide sequence.
  • ⁇ 4> The physiologically active peptide derivative according to ⁇ 2>, wherein the number of monosaccharide residues per sugar chain is 5 to 20.
  • ⁇ 5> The physiologically active peptide derivative according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the number of amino acid residues in the physiologically active peptide sequence is 200 or less.
  • ⁇ 6> The physiologically active peptide derivative according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the membrane permeation enhancing sequence is cationic.
  • ⁇ 7> The physiologically active peptide derivative according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein half or more of the total number of amino acid residues in the membrane permeation promoting sequence are basic amino acid residues.
  • ⁇ 8> The physiologically active peptide derivative according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the endosomal escape-promoting sequence is an amino acid sequence selected from the group consisting of FFLIPKG, LILIG, FFG, FFFFG, and FFFFFFG.
  • the physiologically active peptide derivative according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8> which reaches the optic nerve or retina via the lateral geniculate nucleus.
  • a pharmaceutical composition comprising the physiologically active peptide derivative according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9> as an active ingredient.
  • a nasal or nasal drop preparation comprising the physiologically active peptide derivative according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9> as an active ingredient.
  • a physiologically active peptide derivative having a physiologically active peptide sequence and a functional sequence including a membrane permeation-promoting sequence and an endosomal escape-promoting sequence in the treatment of an eye disease.
  • the present invention provides novel bioactive peptide derivatives, pharmaceutical compositions, nasal and nasal drop preparations, and uses of the bioactive peptide derivatives for the treatment of eye diseases.
  • FIG. 2 shows the results of fluorescence observation of the mouse eyeball and optic nerve in Example 1.
  • FIG. 1 shows the results of fluorescence observation of the mouse eyeball and optic nerve in Example 2.
  • FIG. 13 shows the results of fluorescence observation of mouse optic nerve in Example 3.
  • FIG. 13 shows the results of fluorescence observation of mouse optic nerve in Example 4.
  • FIG. 13 shows the results of fluorescence observation of mouse retina in Example 5.
  • FIG. 13 shows the results of fluorescence observation of the mouse lateral geniculate nucleus in Example 6.
  • FIG. 13 shows the results of fluorescence observation of mouse eyeballs in Example 7.
  • FIG. 13 shows the results of fluorescence observation of mouse optic nerve in Example 8.
  • FIG. 13 shows the results of fluorescence observation of mouse retina in Example 8.
  • a numerical range indicated using “to” indicates a range including the numerical values before and after "to” as the minimum and maximum values, respectively.
  • the left side is the N-terminus side
  • the right side is the C-terminus side.
  • Amino acid residues contained in an amino acid sequence may be represented by single-letter symbols well known in the art (e.g., glycine residue is represented by "G”).
  • treatment refers to an action or effect of eliminating or alleviating a symptom, as well as an action or effect of suppressing the worsening of the symptom.
  • the physiologically active peptide derivative of the present invention has a physiologically active peptide sequence and a functional sequence including a cell penetrating peptide (hereinafter also referred to as CPP) and an endosomal escape promoting sequence (hereinafter also referred to as PAS).
  • CPP cell penetrating peptide
  • PAS endosomal escape promoting sequence
  • the present inventors have observed that when a peptide bound to a functional sequence including a membrane permeation-promoting sequence and an endosomal escape-promoting sequence was administered intranasally to mice, the peptide was transferred to the eyeball or optic nerve of the mice.
  • the physiologically active peptide derivative of the present invention can effectively act on the affected area by a non-invasive method, i.e., intranasal administration of a peptide as a therapeutic agent for eye diseases, and is therefore useful as a therapeutic agent for eye diseases containing a peptide as an active ingredient.
  • physiologically active peptide derivatives are not particularly limited as long as they utilize the pharmacological effects exerted by the action of the physiologically active peptide sequence contained in the physiologically active peptide derivative on the eyeball or optic nerve.
  • uses of the physiologically active peptide derivatives include the treatment or improvement of various eye diseases, eye damage, eye strain, and symptoms caused by eye strain.
  • eye diseases to which the present invention is applicable include optic neuritis, retrobulbar neuritis, neuromyelitis optica, age-related macular degeneration, myopic choroidal neovascularization, branch retinal vein occlusion, central retinal vein occlusion, diabetic retinopathy, diabetic maculopathy, allergic conjunctivitis, viral conjunctivitis, bacterial conjunctivitis, infectious endophthalmitis, conjunctivochalasis, chalazion, dacryocystitis, dacryocanaliculitis, orbital cellulitis, malignant tumor, retinitis pigmentosa, retinal break, intraocular lymphoma, thyroid eye disease, sarcoidosis, dry eye, Vogt-Koyanagi-Harada disease, macular hole, corneal infection, uveitis, glaucoma, optic neuropathy, cataract, Behcet's disease, etc.
  • the present invention is not limited to
  • the total number of amino acid residues in a physiologically active peptide derivative is not particularly limited.
  • the total number of amino acid residues in a physiologically active peptide derivative may be 250 or less, 200 or less, or 150 or less.
  • the number of amino acid residues contained in a physiologically active peptide derivative may be, for example, 10 or more, 20 or more, or 30 or more.
  • Each of the amino acid residues constituting the physiologically active peptide derivative may be in either the L- or D-configuration, so long as the effects of the present invention are achieved.
  • the method for producing the physiologically active peptide derivative may be by collection from living organisms or natural products, genetic engineering methods, organic synthetic chemistry methods, etc.
  • the physiologically active peptide sequence in the physiologically active peptide derivative is not particularly limited as long as it is derived from a peptide that acts on the eyeball or optic nerve to exert a pharmacological effect.
  • the method of binding the physiologically active peptide sequence, the membrane permeation promoting sequence, and the endosomal escape promoting sequence is not particularly limited, and can be performed by a known method.
  • peptides that act on the eyeball or optic nerve to exert a pharmacological effect include GLP-1 (23 amino acid residues), GLP-2 (37 amino acid residues), G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor, 174 or 177 amino acid residues), PEG-G-CSF (pegylated G-CSF, 174 or 177 amino acid residues), erythropoietin (165 amino acid residues), PEGylated erythropoietin (165 amino acid residues), vasoactive intestinal peptide (VIP, 28 amino acid residues), oxytocin (9 amino acid residues), and transforming growth factor TGF- ⁇ (112 amino acid residues).
  • GLP-1 23 amino acid residues
  • GLP-2 37 amino acid residues
  • G-CSF granulocyte colony-stimulating factor, 174 or 177 amino acid residues
  • PEG-G-CSF pegylated G-CSF, 174 or 177 amino acid residues
  • the number of amino acid residues contained in the physiologically active peptide sequence is not particularly limited.
  • the total number of amino acid residues contained in the physiologically active peptide sequence may be 5 to 200, 5 to 170, 9 to 120, 9 to 70, or 9 to 60.
  • the number of amino acid residues contained in the physiologically active peptide sequence may be 5 or more, 10 or more, or 15 or more.
  • the number of amino acid residues contained in the physiologically active peptide sequence may be 200 or less, 170 or more, 120 or less, 70 or less, 60 or less, or 51 or less.
  • the membrane permeation enhancing sequence is an amino acid sequence derived from a peptide (membrane permeable peptide) that has the ability to pass through a cell membrane and be transported into the cell.
  • membrane-permeable peptides that constitute membrane permeation-promoting sequences include oligoarginine (Rn, n is the number of arginine residues, 6 to 12), oligolysine (Kn, n is the number of lysine residues, 6 to 12), penetratin (RQIKIWFQNRRMKWKK, 16 amino acid residues, SEQ ID NO: 3), TAT (GRKKRRQRRR, 10 amino acid residues, SEQ ID NO: 4), mini-penetratin (RRMKWKK, 7 amino acid residues, SEQ ID NO: 5), R9FC (RRRRRRRRRRRFFC, 12 amino acid residues, SEQ ID NO: 6), No.
  • AIP6 RLRWR, 5 amino acid residues, SEQ ID NO: 7
  • DPV3 RKKRRRESRKKRRRES, 16 amino acid residues, SEQ ID NO: 8
  • DPV6 GRPRESGKKRKRKRLKP, 17 amino acid residues, SEQ ID NO: 9
  • Pep-1 KETWETWWTEWSQPKKKRKV, 21 amino acid residues, SEQ ID NO: 10
  • MPG GLAFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV, 27 amino acid residues, SEQ ID NO: 11
  • Transportan GWTLNS AGYLLGKINLKALAALAKKIL 27 amino acid residues, SEQ ID NO: 12
  • MAP KLALKALKALKAALKLA, 17 amino acid residues, SEQ ID NO: 13
  • W/R RRWWRRWRR, 9 amino acid residues, SEQ ID NO: 14
  • CADY GLWRALWRLLRSLWRLLWRA, 20 amino acid residues, SEQ ID NO:
  • the membrane-permeable peptide constituting the membrane-permeation promoting sequence is preferably a positively charged membrane-permeable peptide or a cationic membrane-permeable peptide.
  • a cationic membrane-permeable peptide consisting of an amino acid sequence rich in basic amino acid residues such as arginine, lysine, histidine, tryptophan, etc. (for example, more than half of the total number of amino acid residues are basic amino acid residues) is preferred.
  • membrane-permeable peptides examples include oligoarginine, TAT derived from the Tat protein of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), penetratin, Pep-1, MPG, MAP, CADY, EB-1, Transportan, etc. It is believed that a membrane-permeable peptide consisting of an amino acid sequence rich in basic amino acid residues induces macropinocytosis, a type of endocytosis in which cells take in extracellular substances. This is believed to enable more efficient introduction of physiologically active peptide derivatives into cells.
  • HAV-1 human immunodeficiency virus type 1
  • the number of amino acid residues in the membrane permeability-promoting sequence is not particularly limited, but is preferably, for example, 5 to 27. In addition, it is preferable that more than half of the total number of amino acid residues in the membrane permeability-promoting sequence are basic amino acid residues, and it is more preferable that the peptide contains arginine residues among the basic amino acid residues, and it is even more preferable that the oligoarginine is an oligoarginine consisting of 6 to 12 arginine residues, even more preferable that the oligoarginine is an oligoarginine consisting of 7 to 9 arginine residues, and even more preferable that the oligoarginine is an oligoarginine consisting of 8 arginine residues.
  • Endosome escape promoting sequence shortens the time that the bioactive peptide derivative introduced into the cell remains in the endosome, enabling the bioactive peptide derivative to escape from the endosome in a shorter time, and as a result, it is considered that the transfer and distribution of the bioactive peptide derivative to the eyeball or optic nerve can be achieved in a shorter time.
  • the structure of the endosomal escape-promoting sequence is not particularly limited. Examples of sequences that promote endosomal escape include FFLIPKG (SEQ ID NO: 22), LILIG (SEQ ID NO: 23), FFG, FFFFG (SEQ ID NO: 24), and FFFFFFG (SEQ ID NO: 25).
  • the positions of the membrane permeation-promoting sequence and the endosomal escape-promoting sequence in the physiologically active peptide derivative are not particularly limited.
  • the membrane permeation-promoting sequence may be located closer to the physiologically active peptide sequence, or the endosomal escape-promoting sequence may be located closer to the physiologically active peptide sequence. From the viewpoint of more effectively achieving the effects of the present invention, it is more preferable that the membrane permeation-promoting sequence is located closer to the physiologically active peptide sequence, and it is even more preferable that the membrane permeation-promoting sequence is located closer to the physiologically active peptide sequence and that the endosomal escape-promoting sequence is present on the N-terminal or C-terminal side of the membrane permeation-promoting sequence.
  • the physiologically active peptide derivative preferably has a glycosylated molecule that contains a sugar chain.
  • the type of glycan contained in the glycomodified molecule is not particularly limited.
  • Specific examples of glycans include N-linked glycans such as high mannose type, complex type, and hybrid type (a combination of high mannose type and complex type), O-linked glycans, and proteoglycans such as mucin, heparan sulfate, chondroitin sulfate, keratan sulfate, hyaluronic acid, and dermatan sulfate.
  • N-linked glycans are preferred, and complex glycans are more preferred.
  • the structure of the glycan is not particularly limited, and may be a two-chain structure or other structures (such as a branched structure).
  • monosaccharides constituting the glycan include glucose, mannose, galactose, fructose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, N-acetylmannosamine, fucose, sialic acid, N-acetylneuraminic acid, N-glycolylneuraminic acid, deaminoneuraminic acid, glucuronic acid, iduronic acid, galacturonic acid, xylose, ribose, and deoxyribose.
  • the monosaccharides constituting the glycan may be in the D- or L-form.
  • the monosaccharides constituting the glycan may be in the ⁇ - or ⁇ -anomer.
  • the number of glycosylated molecules that a physiologically active peptide derivative has may be one or more, and the number of sugar chains that one glycosylated molecule has may be one or more.
  • the number of sugar chains that a physiologically active peptide derivative has may be one or two or more.
  • the number of glycans is counted for each glycan base, i.e., one collection of monosaccharide residues extending from one base is counted as "one chain.”
  • a glycosylated molecule may be composed of only a glycan, or may be composed of a glycan and a moiety other than the glycan. That is, the glycan may be directly or indirectly bound to an amino acid residue constituting a physiologically active peptide derivative.
  • both a state in which a glycan is directly or indirectly bound to an amino acid residue constituting a physiologically active peptide derivative are included in the state in which "a glycosylated molecule is bound to an amino acid residue constituting a physiologically active peptide derivative."
  • Examples of the state in which the sugar chain is indirectly bound to the amino acid residue constituting the physiologically active peptide derivative include the state in which it is bound via an amino acid residue such as a cysteine residue or an asparagine residue, a linker, or the like.
  • the glycosylation molecule is preferably bound to a site where the function of the membrane permeability-promoting sequence or the endosomal escape-promoting sequence can be well maintained, and is preferably bound to a physiologically active peptide sequence.
  • the binding site of the glycosylated molecule is not particularly limited as long as it is a position that does not reduce the stability or pharmacological activity of the physiologically active peptide sequence, i.e., it may be the N-terminus, C-terminus, or any other position of the physiologically active peptide sequence.
  • a part of the physiologically active peptide sequence may be substituted with an amino acid such as a cysteine residue or an asparagine residue that is easily bound to a glycosylated molecule.
  • an amino acid residue may be introduced at the end of the physiologically active peptide sequence, and the glycosylated molecule may be bound to this amino acid residue.
  • the binding site of a sugar chain-modified molecule in a physiologically active peptide sequence is preferably a site that ensures an appropriate distance from the functional sequence.
  • Methods for ensuring the distance between the glycosylation molecule and the functional sequence include binding the glycosylation molecule to the C-terminus of the physiologically active peptide sequence when the functional sequence is added to the N-terminus of the physiologically active peptide sequence, and binding the glycosylation molecule to the N-terminus of the physiologically active peptide sequence when the functional sequence is added to the C-terminus of the physiologically active peptide sequence.
  • Another method for ensuring the distance between the glycosylated molecule and the functional sequence is to further include a linker in which the glycosylated molecule further contains a linker and the sugar chain is bound via the linker.
  • the type of linker contained in the glycosylated molecule is not particularly limited, and examples thereof include an alkylene group, a polyethylene glycol (PEG) group, and the like.
  • the linker is an alkylene group, from the viewpoint of ensuring an appropriate distance between the glycosylated molecule and the functional sequence, the alkylene group preferably has 3 to 15 carbon atoms, more preferably 4 to 12 carbon atoms, and even more preferably 5 to 10 carbon atoms.
  • the number of monosaccharide residues per sugar chain contained in the glycosylated molecule is not particularly limited and may be, for example, in the range of 5 to 20, or 5 to 15. From the viewpoint of improving the solubility of the physiologically active peptide derivative in aqueous solvents, the number of monosaccharide residues per sugar chain is preferably 5 or more, and more preferably 10 or more.
  • the physiologically active peptide derivative may further have a spacer sequence disposed between the physiologically active peptide sequence and the functional sequence.
  • the presence of the spacer sequence between the physiologically active peptide sequence and the functional sequence is expected to have the effect of preventing the activity of the physiologically active peptide sequence from being reduced or impaired.
  • the spacer sequence may be disposed between the physiologically active peptide sequence and the membrane permeation-promoting sequence, or between the physiologically active peptide sequence and the endosomal escape-promoting sequence.
  • a membrane permeation-promoting sequence is composed of basic amino acids. Therefore, when a physiologically active peptide sequence contains acidic amino acid residues, the presence of a spacer sequence containing, for example, 1 to 10, preferably 2 to 6, neutral amino acid residues such as glycine can prevent the membrane permeation-promoting sequence and the physiologically active peptide sequence from interacting with each other, thereby preventing the activity of the physiologically active peptide sequence from being reduced or impaired.
  • the spacer sequence may contain a lysine residue (K).
  • Lysine is an amino acid that has a 4-aminobutyl group in its side chain.
  • an alkylene group with four carbon atoms can be interposed between the glycosylated molecule and the spacer sequence. This allows an appropriate distance to be secured between the glycosylated molecule and the functional sequence.
  • a spacer sequence containing a lysine residue includes a spacer sequence containing, for example, 1 to 10, preferably 2 to 6, neutral amino acid residues such as glycine, in which one or more amino acid residues are replaced with a lysine residue.
  • the physiologically active peptide derivatives may be modified in various ways depending on the application. For example, modifications such as amino group modification (biotinylation, myristoylation, palmitoylation, acetylation, maleimidation, etc.), carboxyl group modification (amidation, esterification, etc.), thiol group modification (farnesylation, geranylation, methylation, palmitoylation, etc.), hydroxyl group modification (phosphorylation, sulfation, octanoylation, palmitoylation, palmitoleoylation, etc.), various fluorescent labels (FITC, FAM, ICG, rhodamine, BODIPY, NBD, MCA, etc.), PEGylation, introduction of non-natural amino acids, D-amino acids, etc. may be performed. The modifications may be performed in any of the physiologically active peptide sequence, membrane permeation promoting sequence, endosomal
  • the physiologically active peptide derivative may have, from the N-terminus, an endosomal escape-promoting sequence, a membrane permeation-promoting sequence, a spacer sequence optionally placed, and a physiologically active peptide sequence, in this order.
  • the physiologically active peptide derivative may have, from the C-terminus, an endosomal escape-promoting sequence, a membrane permeation-promoting sequence, a spacer sequence optionally placed, and a physiologically active peptide sequence, in this order.
  • the endosomal escape-promoting sequence may be selected from FFLIPKG, LILIG, FFG, FFFFG, or FFFFFFG.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the above-mentioned physiologically active peptide derivative as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has excellent migration to the eyeball or optic nerve when administered nasally, and can efficiently exert a pharmacological effect. Therefore, it is useful, for example, for the treatment of eye diseases that require daily administration of a drug at home. Therefore, a suitable dosage form of the pharmaceutical composition includes a nasal or nasal drop preparation.
  • the details and preferred embodiments of the physiologically active peptide derivative contained in the pharmaceutical composition are as described above. From the viewpoint of delivery to the eyeball or optic nerve, the pharmaceutical composition is preferably used via nasal administration or nasal drops.
  • the pharmaceutical composition may contain components other than the physiologically active peptide derivative. Specific examples of components that may be contained other than the pharmaceutical composition include a medium used in the preparation of the pharmaceutical composition and formulation additives.
  • the formulation additives include excipients, disintegrants, binders, lubricants, surfactants, buffers, solubilizers, stabilizers, isotonicity agents, suspending agents, emulsifiers, solvents, thickeners, mucolytic agents, wetting agents, preservatives, etc.
  • the dosage of the pharmaceutical composition is selected depending on the type of disease, the symptoms, weight, age, etc. of the patient, the mode of administration, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is particularly suitable as a nasal or nasal drop preparation. That is, one embodiment of the present invention is the use of the physiologically active peptide derivative of the present invention or a pharmaceutical composition containing the same for nasal or nasal administration.
  • the nasal and nasal drop preparation of the present invention contains the above-mentioned physiologically active peptide derivative as an active ingredient.
  • the nasal and nasal drop preparation of the present invention has excellent migration to the eyeball or optic nerve and can effectively exert a pharmacological action.
  • it since it is a less invasive administration form, it is suitable for improving symptoms of diseases that require daily administration at home.
  • Nasal and nasal drop formulations may contain ingredients other than the physiologically active peptide derivatives.
  • ingredients other than the physiologically active peptide derivatives include the media and formulation additives used in the preparation of pharmaceutical compositions described above.
  • An embodiment of the present invention includes the use of a pharmaceutical composition containing the above-mentioned physiologically active peptide derivative as an active ingredient for nasal or nasal administration.
  • the details and preferred aspects of the physiologically active peptide derivative and pharmaceutical composition for such use are as described above.
  • An embodiment of the present invention includes a method for treating an eye disease, which comprises administering to a patient the above-mentioned physiologically active peptide derivative or pharmaceutical composition.
  • the details and preferred aspects of the physiologically active peptide derivative and pharmaceutical composition in the method are as described above.
  • the eye diseases to be treated by the above-mentioned method include the eye diseases mentioned above as the targets for which the physiologically active peptide derivatives are applicable.
  • the method for administering the physiologically active peptide derivative or pharmaceutical composition to a patient is not particularly limited, but nasal administration is preferred.
  • GLP-2 used in the preparation of physiologically active peptide derivatives is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD (SEQ ID NO: 1)
  • GLP-1 is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR- NH2 (active form 7-36 amide, SEQ ID NO: 2).
  • Example 1 Delivery of GLP-2 derivative to eyeball and optic nerve
  • a GLP-2 derivative (C-terminal 11 sugars) was prepared by a standard method, in which an endosomal escape promoting sequence (PAS: FFLIPKG), a membrane permeation promoting sequence (CPP: RRRRRRRRR), a spacer sequence (GG), and an amino acid sequence derived from GLP-2 as a physiologically active peptide sequence were arranged in this order from the N-terminus.
  • the physiologically active peptide sequence used was a GLP-2 with a sugar chain consisting of 11 monosaccharide residues added to the C-terminus via a cysteine residue.
  • the structure of the prepared GLP-2 derivative is shown below.
  • DMSO 16% DMSO (Vehicle) or a DMSO solution of an ICG-labeled GLP-2 derivative (3.0 nmol/mouse or 12.0 nmol/mouse) was administered intranasally to mice (male ddY mice, 7 weeks old, the same below). 20 minutes after administration, the eyeballs were removed and infiltrated and fixed overnight with a 4% PFA solution. The eyeballs were then washed with 1x PBS and placed on a petri dish, and measurements were performed using an optical imaging device (Clairvivo OPT plus; Shimadzu, Kyoto, Japan, the same below). The measurement conditions were set as follows: excitation wavelength: 785 nm, fluorescence wavelength: 849 nm, exposure time: 6 sec. The results are shown in Figure 1.
  • Example 2 Delivery of GLP-1 derivative to eyeball and optic nerve A GLP-1 derivative (C-terminal 11 sugars) in which a sugar chain was added to the C-terminus of GLP-1 was prepared in the same manner as in Example 1, except that the physiologically active peptide sequence was changed from GLP-2 to GLP-1.
  • the structure of the prepared GLP-1 derivative is shown below.
  • DMSO 16% DMSO (Vehicle) or a DMSO solution of an ICG-labeled GLP-1 derivative (0.9 nmol/mouse) was administered intranasally to mice. Five and 20 minutes after administration, the eyeballs were removed and infiltrated and fixed overnight in a 4% PFA solution. The eyeballs were then washed with 1x PBS and placed on a petri dish, and measurements were taken using an optical imaging device. Measurement conditions were set as follows: excitation wavelength: 785 nm, fluorescence wavelength: 849 nm, exposure time: 6 sec. The results are shown in Figure 2.
  • Example 3 Distribution of GLP-2 derivative to the optic nerve PBS (Vehicle) or a PBS solution of the GLP-2 derivative used in Example 1 (3.0 nmol/mouse) was administered intranasally to mice. 20 minutes after administration, the eyeball was removed and infiltration-fixed overnight in 4% PFA. The next day after removal, the medium was replaced with 30% sucrose and substituted overnight (4°C). Then, a cryostat (CM3050S; Leica Microsystems, WetZlar, Germany, the same below) was used to prepare frozen sections of the optic nerve with a thickness of 10 ⁇ m. The sections were placed on slide glass, blocking buffer was added, and blocking was performed at room temperature for 30 minutes.
  • C3050S Leica Microsystems, WetZlar, Germany
  • a primary antibody solution containing Neuro-Chrom TM Pan Neuronal Marker Antibody-Rabbit (1:500) and GLP-2 polyclonal antibody (1:200) diluted with blocking buffer was added, and incubated at room temperature for 2 hours.
  • a secondary antibody solution containing Alexa Fluor® 568 Goat Anti-Mouse IgG H&L diluted 500-fold with 1% BSA/PBS solution and 40 ng/ml DAPI was added, and incubated at room temperature for 1 hour.
  • Example 4 Distribution of GLP-1 derivative to the optic nerve
  • PAS-CPP-GLP-1 derivative sucgar-free
  • PAS endosomal escape-promoting sequence
  • CPP membrane permeability-promoting sequence
  • GCG spacer sequence containing a cysteine residue
  • amino acid sequence derived from GLP-1 as a neuropeptide sequence were arranged in this order from the N-terminus.
  • the structure of the obtained GLP-1 derivative is shown below.
  • a sugar chain (11 sugars) was attached to the cysteine residue of the spacer sequence to obtain a PAS-CPP-GLP-1 derivative (N-terminal 11 sugars) in which the N-terminus of GLP-1 was sugar-modified.
  • the structure of the obtained GLP-1 derivative is shown below.
  • Example 5 Distribution of GLP-1 derivatives in the retina PBS (Vehicle) or a PBS solution (3.6 nmol/mouse) of the GLP-1 derivative (N-terminal 11 sugar) used in Example 4 was intranasally administered to mice. Twenty minutes after administration, the eyeballs were removed, and frozen sections of the retina were prepared in the same manner as in Example 4 and subjected to fluorescence observation. The results are shown in FIG.
  • Example 6 Distribution of GLP-2 Derivative to the Lateral Geniculate Nucleus A GLP-2 derivative (N-terminal 11 sugars) in which a sugar chain was added to the N-terminus of GLP-2 was prepared in the same manner as in Example 4, except that the physiologically active peptide sequence was changed from GLP-2 to GLP-1. The structure of the prepared GLP-2 derivative is shown below.
  • PBS or a PBS solution of GLP-2 derivative (3.0 nmol/mouse) was administered intranasally to mice. Five minutes after administration, the brain was removed and infiltrated and fixed overnight at 4°C with 4% PFA solution. The day after removal, the brain sample was replaced overnight with 20% sucrose (4°C), and then replaced overnight with 30% sucrose (4°C). Then, a cryostat was used to prepare a frozen section of the lateral geniculate body with a thickness of 30 ⁇ m. The prepared section was placed on a slide glass, and a circle was drawn around the section with liquid blocker. Blocking buffer was added in the circle, and blocking was performed at room temperature for 30 minutes.
  • a primary antibody solution containing GLP-2 polyclonal antibody diluted 200 times with blocking buffer was added, and the sample was incubated at room temperature for 1 hour.
  • a secondary antibody solution containing Alexa Fluor® 568 Goat Anti-Mouse IgG H&L diluted 500-fold with 1% BSA/PBS solution was added and incubated at room temperature for 1 hour.
  • the sections were mounted with ProLong TM Diamond Antifade Mountant. After confirming that the mounting agent had solidified, fluorescence observation was performed using a confocal laser microscope and software. The results are shown in FIG. 6.
  • Example 7 Transfer of GLP-2 derivative bound to a sugar chain via a linker into the eyeball
  • the spacer sequence (GCG) of the GLP-2 derivative (N-terminal 11 sugars) prepared in Example 6 was changed to a spacer sequence (GKG), and a GLP-2 derivative (C6 linker N-terminal 11 sugars) was prepared in which a sugar chain (11 sugars) and a molecule containing an alkylene group having 6 carbon atoms as a linker were bound to a lysine residue (K) in the spacer sequence.
  • the structure of the prepared GLP-2 derivative is shown below.
  • a primary antibody solution containing Neuro-Chrom TM Pan Neuronal Marker Antibody-Rabbit (1:500) and GLP-2 polyclonal antibody (1:200) diluted with blocking buffer was added, and incubated at room temperature for 2 hours.
  • a secondary antibody solution containing Alexa Fluor TM 568 Goat Anti-Mouse IgG H&L diluted 500-fold with 1% BSA/PBS solution and 20 ⁇ g/ml DAPI was added, and incubated at room temperature for 1 hour. After washing three times with 1x PBS, mounting was performed. Then, fluorescence observation was performed using a confocal laser microscope and software.
  • FIG. 8 The results of the fluorescence observation of the area corresponding to the optic nerve are shown in FIG. 8, and the results of the fluorescence observation of the area corresponding to the retina are shown in FIG.
  • Figures 8 and 9 it was confirmed that the nasally administered GLP-2 derivative (C6 linker N-terminal 11 sugar, corresponding to dot-shaped fluorescence) was transferred to the retinal ganglion cell and inner reticulated layer within 20 minutes after administration.

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Abstract

生理活性ペプチド配列と、膜透過促進配列及びエンドソーム脱出促進配列を含む機能性配列と、を有する、眼疾患の治療のための生理活性ペプチド誘導体。

Description

眼疾患の治療のための生理活性ペプチド誘導体、医薬組成物、経鼻・点鼻製剤及び生理活性ペプチド誘導体の使用
　本発明は、眼疾患の治療のための生理活性ペプチド誘導体、医薬組成物、経鼻・点鼻製剤及び生理活性ペプチド誘導体の使用に関する。
　硝子体注射は、注射器を用いて薬剤を眼球内に注射する眼疾患の治療方法である（例えば、特許文献１参照）。例えば、網膜の下にある脈絡膜から網膜へ向かって生えてくる異常血管（脈絡膜新生血管）を縮小させる効果のある抗ＶＥＧＦ物質を眼球内に注射することが加齢黄斑変性等の眼疾患の治療のために行われている。
　特許文献１　特開２０２２－８１４９１号公報
　硝子体注射は薬剤を効果的に眼球内に投与できる一方で、患者の身体的及び精神的負担や感染症のリスクが大きい。したがって、より侵襲性の小さい方法で薬剤を投与できる手法の開発が望まれている。
　さらに、近年では生理活性作用を示すペプチドが種々の疾患の治療に利用されている。したがって、ペプチドを眼疾患の治療薬として利用するケースが今後増大する可能性がある。
　上記課題に鑑み、本発明は、眼疾患の治療のための新規な生理活性ペプチド誘導体、医薬組成物、経鼻・点鼻製剤及び生理活性ペプチド誘導体の使用を提供することを課題とする。
　前記課題を達成するための具体的手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞生理活性ペプチド配列と、膜透過促進配列及びエンドソーム脱出促進配列を含む機能性配列と、を有する、眼疾患の治療のための生理活性ペプチド誘導体。
＜２＞糖鎖を含む糖鎖修飾分子をさらに有する、＜１＞に記載の生理活性ペプチド誘導体。
＜３＞前記糖鎖修飾分子は前記生理活性ペプチド配列のＣ末端側又はＮ末端側に結合している、＜２＞に記載の生理活性ペプチド誘導体。
＜４＞前記糖鎖の１本あたりの単糖残基の数は５～２０である、＜２＞に記載の生理活性ペプチド誘導体。
＜５＞前記生理活性ペプチド配列のアミノ酸残基数は２００以下である、＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載の生理活性ペプチド誘導体。
＜６＞前記膜透過促進配列はカチオン性である、＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の生理活性ペプチド誘導体。
＜７＞前記膜透過促進配列はアミノ酸残基総数の半数以上が塩基性のアミノ酸残基である、＜１＞～＜６＞のいずれか１項に記載の生理活性ペプチド誘導体。
＜８＞前記エンドソーム脱出促進配列はＦＦＬＩＰＫＧ、ＬＩＬＩＧ、ＦＦＧ、ＦＦＦＦＧ及びＦＦＦＦＦＦＧからなる群より選択されるアミノ酸配列である、＜１＞～＜７＞のいずれか１項に記載の生理活性ペプチド誘導体。
＜９＞外側膝状体を経由して視神経や網膜へ到達する、＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載の生理活性ペプチド誘導体。
＜１０＞＜１＞～＜９＞のいずれか１項に記載の生理活性ペプチド誘導体を有効成分として含む、医薬組成物。
＜１１＞＜１＞～＜９＞のいずれか１項に記載の生理活性ペプチド誘導体を有効成分として含む、経鼻・点鼻製剤。
＜１２＞生理活性ペプチド配列と、膜透過促進配列及びエンドソーム脱出促進配列を含む機能性配列と、を有する生理活性ペプチド誘導体の、眼疾患の治療への使用。
　本発明によれば、眼疾患の治療のための新規な生理活性ペプチド誘導体、医薬組成物、経鼻・点鼻製剤及び生理活性ペプチド誘導体の使用が提供される。
実施例１におけるマウス眼球及び視神経の蛍光観察結果を示す図である。 実施例２におけるマウス眼球及び視神経の蛍光観察結果を示す図である。 実施例３におけるマウス視神経の蛍光観察結果を示す図である。 実施例４におけるマウス視神経の蛍光観察結果を示す図である。 実施例５におけるマウス網膜の蛍光観察結果を示す図である。 実施例６におけるマウス外側膝状体の蛍光観察結果を示す図である。 実施例７におけるマウス眼球の蛍光観察結果を示す図である。 実施例８におけるマウス視神経の蛍光観察結果を示す図である。 実施例８におけるマウス網膜の蛍光観察結果を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態について説明する。これらの説明及び実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
　本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。アミノ酸配列の記載は、左側がＮ末端側であり、右側がＣ末端側である。アミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基は、当該技術分野で周知の一文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇ」）で表記する場合がある。
　本明細書において「治療」とは、症状を消失又は軽減させる作用又は効果のほか、当該症状の悪化を抑制する作用又は効果も意味する。
＜生理活性ペプチド誘導体＞
　本発明の生理活性ペプチド誘導体は、生理活性ペプチド配列と、膜透過促進配列（Ｃｅｌｌ　ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ、以下ＣＰＰとも称する）及びエンドソーム脱出促進配列（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ　ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ、以下ＰＡＳとも称する）を含む機能性配列と、を有する。本発明の生理活性ペプチド誘導体は、眼疾患の治療に用いられる。
　本発明者は、膜透過促進配列及びエンドソーム脱出促進配列を含む機能性配列を結合させたペプチドをマウスに経鼻投与すると、マウスの眼球又は視神経へのペプチドの移行が観察された。
　すなわち、本発明の生理活性ペプチド誘導体は、眼疾患の治療薬としてのペプチドを経鼻投与という非侵襲的な方法によって患部に効果的に作用させることができる。このため、ペプチドを有効成分として含む眼疾患の治療薬として有用である。
　生理活性ペプチド誘導体の用途は、生理活性ペプチド誘導体に含まれる生理活性ペプチド配列が眼球又は視神経に作用して発現する薬理効果を利用するものであれば特に制限されない。生理活性ペプチド誘導体の用途として例えば、各種の眼疾患、眼球の損傷、眼精疲労又は眼精疲労に起因する症状などの治療又は改善が挙げられる。
　本発明の適用対象となる眼疾患として具体的には、視神経炎、球後視神経炎、視神経脊髄炎、加齢黄斑変性、近視性脈絡膜新生血管、網膜静脈分枝閉塞、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑症、アレルギー性結膜炎、ウイルス性結膜炎、細菌性結膜炎、感染性眼内炎、結膜弛緩症、霰粒腫、涙嚢炎、涙小管炎、眼窩蜂窩織炎、悪性腫瘍、網膜色素変性、網膜裂孔、眼内リンパ腫、甲状腺眼症、サルコイドーシス、ドライアイ、フォークト－小柳－原田病、黄斑円孔、角膜感染症、ぶどう膜炎、緑内障、視神経症、白内障、ベーチェット病等が挙げられる。ただし、本発明の適用対象はこれらに制限されない。
　生理活性ペプチド誘導体のアミノ酸残基の総数は、特に制限されない。例えば、生理活性ペプチド誘導体アミノ酸残基の総数は、２５０個以下であってもよく、２００個以下であってもよく、１５０個以下であってもよい。生理活性ペプチド誘導体に含まれるアミノ酸残基の残基数は、例えば、１０個以上であってもよく、２０個以上であってもよく、３０個以上であってもよい。
　生理活性ペプチド誘導体を構成するアミノ酸残基のそれぞれは、本発明の効果が達成される限りＬ体又はＤ体のいずれであってもよい。生理活性ペプチド誘導体の作製方法は特に制限されず、生体や天然物からの採取、遺伝子工学的方法、有機合成化学的方法等のいずれであってもよい。
（生理活性ペプチド配列）
　生理活性ペプチド誘導体における生理活性ペプチド配列は、眼球又は視神経に作用して薬理効果を発現するペプチドに由来するものであれば、特に制限されない。生理活性ペプチド誘導体において、生理活性ペプチド配列、膜透過促進配列及びエンドソーム脱出促進配列を結合する方法は特に制限されず、公知の方法により行うことができる。
　眼球又は視神経に作用して薬理効果を発現するペプチドとして具体的には、ＧＬＰ－１（アミノ酸残基数２３個）、ＧＬＰ－２（アミノ酸残基数３７個）、Ｇ－ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子、アミノ酸残基数１７４個あるいは１７７個）、ＰＥＧ－Ｇ－ＣＳＦ（ペグ化Ｇ－ＣＳＦ、アミノ酸残基数１７４個あるいは１７７個）、エリスロポエチン（アミノ酸残基数１６５個）、ＰＥＧ化エリスロポエチン（アミノ酸残基数１６５個）、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ、アミノ酸残基２８個）、オキシトシン（アミノ酸残基９個）、トランスフォーミング増殖因子ＴＧＦ－β（アミノ酸残基１１２個）などが挙げられる。
　生理活性ペプチド配列に含まれるアミノ酸残基の数は、特に制限されない。生理活性ペプチド配列に含まれるアミノ酸残基の総数は５個～２００個であってもよく、５個～１７０個であってもよく、９個～１２０個であってもよく、９個～７０個であってもよく、９個～６０個であってもよい。生理活性ペプチド配列に含まれるアミノ酸残基の数は、５個以上であってもよく、１０個以上であってもよく、１５個以上であってもよい。生理活性ペプチド配列に含まれるアミノ酸残基の数は、２００個以下であってもよく、１７０個以上であってもよく、１２０個以下であってもよく、７０個以下であってもよく、６０個以下であってもよく、５１個以下であってもよい。
（膜透過促進配列）
　膜透過促進配列は、細胞膜を通過して細胞内に移行する作用を有するペプチド（膜透過性ペプチド）に由来するアミノ酸配列である。
　膜透過促進配列を構成する膜透過性ペプチドの例としてはオリゴアルギニン（Ｒｎ、ｎはアルギニン残基の数であり６～１２）、オリゴリジン（Ｋｎ、ｎはリジン残基の数であり６～１２）、ペネトラチン（ＲＱＩＫIＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、アミノ酸残基１６個、配列番号３）、ＴＡＴ（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、アミノ酸残基１０個、配列番号４）、ミニペネトラチン（ＲＲＭＫＷＫＫ、アミノ酸残基７個、配列番号５）、Ｒ９ＦＣ（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＦＦＣ、アミノ酸残基１２個、配列番号６）、ＡＩＰ６（ＲＬＲＷＲ、アミノ酸残基５個、配列番号７）、ＤＰＶ３（ＲＫＫＲＲＲＥＳＲＫＫＲＲＲＥＳ、アミノ酸残基１６個、配列番号８）、ＤＰＶ６（ＧＲＰＲＥＳＧＫＫＲＫＲＫＲＬＫＰ、アミノ酸残基１７個、配列番号９）、Ｐｅｐ－１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、アミノ酸残基２１個、配列番号１０）、ＭＰＧ（ＧＬＡＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、アミノ酸残基２７個、配列番号１１）、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ（ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬアミノ酸残基２７個、配列番号１２）、ＭＡＰ（ＫＬＡＬＫＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ、アミノ酸残基１７個、配列番号１３）、Ｗ／Ｒ（ＲＲＷＷＲＲＷＲＲ、アミノ酸残基９個、配列番号１４）、ＣＡＤＹ（ＧＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＲＡ、アミノ酸残基２０個、配列番号１５）、ＥＢ－１（ＬＩＲＬＷＳＨＬＩＨＩＷＦＱＮＲＲＬＫＷＫＫ、アミノ酸残基２２個、配列番号１６）、ＨＲＳＶ（ＲＲＩＰＮＲＲＰＲＲ、アミノ酸残基１０個、配列番号１７）、ＰＴＤ－５（ＲＲＱＲＲＲＴＳＫＬＭＫＲ、アミノ酸残基１３個、配列１８）、ＴＡＴ４７－５７（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、アミノ酸残基１１個、配列番号１９）、ＴＰ２（ＰＬＩＹＬＲＬＬＲＧＱＦ、アミノ酸残基１２個、配列番号２０）、ＴＰ１０（ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＨＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、アミノ酸残基２１個、配列番号２１）、ヘパランに結合するカチオン性の配列、ＲＮＡに結合するカチオン性の配列、ＤＮＡに結合するカチオン性の配列などが挙げられる。
　膜透過促進配列を構成する膜透過性ペプチドとしては、プラスに荷電した膜透過性ペプチド又はカチオン性の膜透過性ペプチドが好ましい。例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリプトファン等の塩基性のアミノ酸残基に富む（例えば、アミノ酸残基総数の半数以上が塩基性のアミノ酸残基である）アミノ酸配列からなるカチオン性膜透過性ペプチドが好ましい。このような膜透過性ペプチドとしては、オリゴアルギニン、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）のＴａｔタンパク質に由来するＴＡＴ、ペネトラチン、Ｐｅｐ－１、ＭＰＧ、ＭＡＰ、ＣＡＤＹ、ＥＢ－１、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ等が挙げられる。塩基性のアミノ酸残基に富むアミノ酸配列からなる膜透過性ペプチドは、細胞が細胞外の物質を取り込む過程であるエンドサイトーシスの一種であるマクロピノサイトーシスを誘発すると考えられる。これにより、生理活性ペプチド誘導体をより効率的に細胞内に導入することができると考えられる。
　膜透過性促進配列のアミノ酸残基数は特に制限されないが、例えば、５個～２７個であることが好ましい。また、膜透過性促進配列のアミノ酸残基総数の半数以上が塩基性アミノ酸残基であることが好ましく、塩基性アミノ酸残基の中でも特にアルギニン残基が含まれるペプチドであることがより好ましく、６個～１２個のアルギニン残基からなるオリゴアルギニンであることがさらに好ましく、７個～９個のアルギニン残基からなるオリゴアルギニンであることがさらにより好ましく、８個のアルギニン残基からなるオリゴアルギニンであることがさらにより好ましい。
（エンドソーム脱出促進配列）
　エンドソーム脱出促進配列は、細胞内に導入された生理活性ペプチド誘導体がエンドソームに留まる時間を短縮し、より短時間でのエンドソーム脱出を可能にすると考えられる。その結果、生理活性ペプチド誘導体の眼球又は視神経への移行及び分布がより短い時間で達成されると考えられる。
　エンドソーム脱出促進配列の構造は特に制限されない。例えば、ＦＦＬＩＰＫＧ（配列番号２２）、ＬＩＬＩＧ（配列番号２３）、ＦＦＧ、ＦＦＦＦＧ（配列番号２４）、ＦＦＦＦＦＦＧ（配列番号２５）等のエンドソーム脱出を促進する配列を挙げることができる。
　生理活性ペプチド誘導体における膜透過促進配列及びエンドソーム脱出促進配列の位置は特に制限されない。例えば、膜透過促進配列が生理活性ペプチド配列に近い側に位置していても、エンドソーム脱出促進配列が生理活性ペプチド配列に近い側に位置していてもよい。本発明の効果をより効果的に達成する観点からは、膜透過促進配列が生理活性ペプチド配列に近い側に位置していることがより好ましく、膜透過促進配列が生理活性ペプチド配列に近い側に位置し、かつ膜透過促進配列のＮ末端側あるいはＣ末端側にエンドソーム脱出促進配列が存在していることがさらに好ましい。
（糖鎖修飾分子）
　生理活性ペプチド誘導体の眼球又は視神経への移行及び分布を促進する観点から、生理活性ペプチド誘導体は糖鎖を含む糖鎖修飾分子を有することが好ましい。
　糖鎖修飾分子に含まれる糖鎖の種類は特に制限されない。糖鎖として具体的には、高マンノース型、複合型、ハイブリッド型（高マンノース型と複合型の組み合わせ）などのＮ結合型糖鎖、Ｏ結合型糖鎖、並びにムチン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸などのプロテオグリカンが挙げられる。これらの中でもＮ結合型糖鎖が好ましく、複合型糖鎖がより好ましい。
　糖鎖の構造は特に制限されず、２本鎖構造であってもその他の構造（分岐を有する構造など）であってもよい。糖鎖を構成する単糖としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－アセチルマンノサミン、フコース、シアル酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、デアミノノイラミン酸、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、キシロース、リボース、デオキシリボースなどが挙げられる。糖鎖を構成する単糖は、Ｄ体であってもＬ体であってもよい。糖鎖を構成する単糖は、α－アノマーであってもβ－アノマーであってもよい。
　生理活性ペプチド誘導体が有する糖鎖修飾分子の数は、１個でも２個以上であってもよく、１個の糖鎖修飾分子が有する糖鎖の数は１本でも２本以上であってもよい。
　生理活性ペプチド誘導体が有する糖鎖の数は、１本でも２本以上であってもよい。
　本開示において糖鎖の数は、糖鎖の基部ごとに数える。すなわち、１つの基部から連なる単糖残基の集合体１つ分を「１本」として数える。
　糖鎖修飾分子は、糖鎖のみから構成されても、糖鎖と糖鎖以外の部位とから構成されてもよい。すなわち、糖鎖は、生理活性ペプチド誘導体を構成するアミノ酸残基に直接結合していても、間接的に結合していてもよい。本開示では、糖鎖が生理活性ペプチド誘導体を構成するアミノ酸残基に直接結合している状態と間接的に結合している状態のいずれも「糖鎖修飾分子が生理活性ペプチド誘導体を構成するアミノ酸残基に結合している」状態に含まれる。
　糖鎖が生理活性ペプチド誘導体を構成するアミノ酸残基に間接的に結合している状態としては、システイン残基、アスパラギン残基等のアミノ酸残基、リンカー等を介して結合している状態が挙げられる。
　糖鎖修飾分子は膜透過性促進配列やエンドソーム脱出促進配列の機能を良好に維持できる位置に結合していることが好ましく、生理活性ペプチド配列に結合していることが好ましい。
　糖鎖修飾分子が生理活性ペプチド配列に結合している場合、糖鎖修飾分子の結合部位は、生理活性ペプチド配列の安定性や薬理作用が低下しない位置であれば、特に制限されない。すなわち、生理活性ペプチド配列のＮ末端であってもＣ末端であっても末端以外の位置であってもよい。
　生理活性ペプチド配列の薬理作用に影響を与えないのであれば、生理活性ペプチド配列の一部を糖鎖修飾分子に結合させやすいシステイン残基やアスパラギン残基などのアミノ酸に置換してもよい。あるいは、生理活性ペプチド配列の末端にアミノ酸残基を導入し、糖鎖修飾分子をこのアミノ酸残基に結合させてもよい。
　糖鎖が機能性配列の機能に与える影響を低減する観点から、生理活性ペプチド配列における糖鎖修飾分子の結合位置は、機能性配列との間の距離を適切に確保できる位置であることが好ましい。
　糖鎖修飾分子と機能性配列との間の距離を確保する方法としては、機能性配列を生理活性ペプチド配列のＮ末端側に付加させる場合は糖鎖修飾分子を生理活性ペプチド配列のＣ末端側に結合させ、機能性配列を生理活性ペプチド配列のＣ末端側に付加させる場合は糖鎖修飾分子を生理活性ペプチド配列のＮ末端側に結合させる方法が挙げられる。
　糖鎖修飾分子と機能性配列との間の距離を確保する別の方法としては、糖鎖修飾分子はリンカーをさらに含み、リンカーを介して糖鎖を結合させる方法が挙げられる。
　糖鎖修飾分子に含まれるリンカーの種類は特に制限されない。例えば、アルキレン基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基等が挙げられる。
　リンカーがアルキレン基である場合、糖鎖修飾分子と機能性配列との距離を適切に確保する観点からは、アルキレン基の炭素数は３～１５であることが好ましく、４～１２であることがより好ましく、５～１０であることがさらに好ましい。
　糖鎖修飾分子に含まれる糖鎖１本あたりの単糖残基の数は、特に制限されない。例えば、５個～２０個の範囲であってもよく、５個～１５個の範囲であってもよい。
　生理活性ペプチド誘導体の水系溶媒に対する溶解性を向上させる観点からは、糖鎖１本あたりの単糖残基の数は５個以上であることが好ましく、１０個以上であることがより好ましい。
（スペーサー配列）
　生理活性ペプチド誘導体は、生理活性ペプチド配列と機能性配列との間に配置されるスペーサー配列をさらに有していてもよい。生理活性ペプチド配列と機能性配列との間にスペーサー配列が存在することで、生理活性ペプチド配列の活性が低下又は損なわれることを防ぐ効果が期待できる。
　生理活性ペプチド誘導体がスペーサー配列を有する場合、スペーサー配列は生理活性ペプチド配列と膜透過促進配列との間に配置されても、生理活性ペプチド配列とエンドソーム脱出促進配列との間に配置されてもよい。
　一般に、膜透過促進配列は塩基性アミノ酸から構成される。従って、生理活性ペプチド配列が酸性アミノ酸残基を含む場合、グリシン等の中性アミノ酸残基を、例えば１～１０個、好ましくは２個～６個含むスペーサー配列を存在させることで、膜透過促進配列と生理活性ペプチド配列とが相互作用して生理活性ペプチド配列の活性が低下又は損なわれるのを防ぐことができる。
　スペーサー配列はリシン残基（Ｋ）を含んでもよい。リシンは側鎖に４－アミノブチル基を持つアミノ酸である。糖鎖修飾分子を４－アミノブチル基の末端アミノ基と結合させることで、糖鎖修飾分子とスペーサー配列との間に炭素数４のアルキレン基を介在させることができる。このため、糖鎖修飾分子と機能性配列との間の距離を適切に確保することができる。
　リシン残基を含むスペーサー配列としては、グリシン等の中性アミノ酸残基を、例えば１～１０個、好ましくは２個～６個含むスペーサー配列のうち１個以上のアミノ酸残基をリシン残基に置換したものが挙げられる。
　生理活性ペプチド誘導体は、上述した糖鎖の付加に加え、用途に応じて種々の改変を施してもよい。例えば、アミノ基修飾（ビオチン化、ミリストイル化、パルミトイル化、アセチル化、マレイミド化等）、カルボキシル基修飾（アミド化、エステル化等）、チオール基修飾（ファルネシル化、ゲラニル化、メチル化、パルミトイル化等）、水酸基修飾（リン酸化、硫酸化、オクタノイル化、パルミトイル化、パルミトレオイル化等）、各種蛍光標識（ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＩＣＧ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＢＯＤＩＰＹ、ＮＢＤ、ＭＣＡ等）、ＰＥＧ化、非天然アミノ酸、Ｄ－アミノ酸等の導入などの改変を施してもよい。改変は、生理活性ペプチド誘導体の生理活性ペプチド配列、膜透過促進配列、エンドソーム脱出促進配列、スペーサー配列のいずれにおいて施されていてもよい。
　生理活性ペプチド誘導体を構成する生理活性ペプチド配列、膜透過促進配列及びエンドソーム脱出促進配列の組み合わせは特に制限されず、用途に応じて選択できる。
　ある実施態様では、生理活性ペプチド誘導体はＮ末端側からエンドソーム脱出促進配列、膜透過促進配列、必要に応じて配置されるスペーサー配列、及び生理活性ペプチド配列をこの順に有するものであってもよい。
　ある実施態様では、生理活性ペプチド誘導体はＣ末端側からエンドソーム脱出促進配列、膜透過促進配列、必要に応じて配置されるスペーサー配列、及び生理活性ペプチド配列をこの順に有するものであってもよい。
　上記構成において、エンドソーム脱出促進配列はＦＦＬＩＰＫＧ、ＬＩＬＩＧ、ＦＦＧ、ＦＦＦＦＧ、又はＦＦＦＦＦＦＧから選択されてもよい。
　上記構成において、膜透過促進配列はオリゴアルギニン（例えば、Ｒｎ、ｎ＝６～１２）から選択されてもよい。
　上記構成において、スペーサー配列はグリシン残基（例えば、Ｇｎ、ｎ＝２～６）からなる配列、グリシン残基とシステイン残基とからなる配列（例えば、ＧＣＧ） 及びグリシン残基とリシン残基とからなる配列（例えば、ＧＫＧ）から選択されてもよい。
＜医薬組成物＞
　本発明の医薬組成物は、上述した生理活性ペプチド誘導体を有効成分として含む。本発明の医薬組成物は、生理活性ペプチド誘導体を有効成分として含むことにより、経鼻投与したときの眼球又は視神経への移行性に優れ、効率的に薬理効果を発現させることができる。このため、例えば、在宅で薬剤を連日投与する必要のある眼疾患の治療に有用である。従って、医薬組成物の好適な剤形としては経鼻・点鼻製剤が挙げられる。
　医薬組成物に含まれる生理活性ペプチド誘導体の詳細及び好ましい態様は、上述したとおりである。医薬組成物の使用方法は、眼球又は視神経への送達性の観点からは、経鼻・点鼻投与が好ましい。
　医薬組成物は、生理活性ペプチド誘導体以外の成分を含んでいてもよい。医薬組成物以外に含まれてもよい成分の具体例としては、医薬組成物の調製に用いられる媒質及び製剤用添加物を挙げることができる。製剤用添加物としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、緩衝剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、溶剤、増粘剤、粘液溶解剤、湿潤剤、防腐剤などが挙げられる。医薬組成物の投与量は、疾患の種類、患者の症状、体重、年齢等、投与態様などに応じて選択される。
　本発明の医薬組成物は、経鼻・点鼻製剤として特に好適である。すなわち、本発明の一実施態様は本発明の生理活性ペプチド誘導体又はこれを含む医薬組成物の経鼻・点鼻投与への使用である。
＜経鼻・点鼻製剤＞
　本発明の経鼻・点鼻製剤は、上述した生理活性ペプチド誘導体を有効成分として含む。本発明の経鼻・点鼻製剤は、生理活性ペプチド誘導体を有効成分として含むことにより、眼球又は視神経への移行性に優れ、効果的に薬理作用を発現することができる。また、侵襲性が低い投与形態であるため、在宅で連日投与する必要のある疾患の症状改善に好適である。
　経鼻・点鼻製剤は、生理活性ペプチド誘導体以外の成分を含んでいてもよい。生理活性ペプチド誘導体以外の成分としては、医薬組成物調製に用いられる媒質及び製剤用添加物として上述したものを挙げることができる。
　本発明の実施態様には、上述した生理活性ペプチド誘導体を有効成分として含む医薬組成物の、経鼻・点鼻投与への使用が含まれる。当該使用における生理活性ペプチド誘導体及び医薬組成物の詳細及び好ましい態様は、上記したとおりである。
＜眼疾患の治療方法＞
　本発明の実施態様には、上述した生理活性ペプチド誘導体又は医薬組成物を患者に投与することを含む、眼疾患の治療方法が含まれる。当該方法における生理活性ペプチド誘導体及び医薬組成物の詳細及び好ましい態様は、上記したとおりである。
　上記方法の治療対象である眼疾患は、生理活性ペプチド誘導体の適用対象として上記した眼疾患が挙げられる。
　生理活性ペプチド誘導体又は医薬組成物を患者に投与する方法は特に制限されないが、経鼻投与であることが好ましい。
　以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。従って、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
　以下の実施例において、生理活性ペプチド誘導体の作製に使用したＧＬＰ－２はＨＡＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤで表されるアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号１）であり、ＧＬＰ－１はＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ－ＮＨ２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（活性体７－３６アミド、配列番号２）である。
＜実施例１：ＧＬＰ－２誘導体の眼球及び視神経への移行＞
　Ｎ末端側からエンドソーム脱出促進配列（ＰＡＳ：ＦＦＬＩＰＫＧ）、膜透過促進配列（ＣＰＰ：ＲＲＲＲＲＲＲＲ）、スペーサー配列（ＧＧ）、及び生理活性ペプチド配列としてＧＬＰ－２に由来するアミノ酸配列がこの順に配置されたＧＬＰ－２誘導体（Ｃ末１１糖）を、定法により作製した。生理活性ペプチド配列としては、ＧＬＰ－２のＣ末端にシステイン残基を介して１１個の単糖残基からなる糖鎖を付加したものを使用した。作製したＧＬＰ－２誘導体の構造を下記に示す。
　１６％ＤＭＳＯ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）またはＩＣＧ標識したＧＬＰ－２誘導体のＤＭＳＯ溶液（３．０ｎｍｏｌ／ｍｏｕｓｅもしくは１２．０ｎｍｏｌ／ｍｏｕｓｅ）をマウス（雄性ｄｄＹマウス、７週齢、以下同じ）に経鼻投与した。投与から２０分後に眼球を摘出し、４％ＰＦＡ溶液で一晩浸潤固定を行った。その後、眼球を１×ＰＢＳで洗浄してシャーレ上に載せ、光イメージング装置（Ｃｌａｉｒｖｉｖｏ　ＯＰＴ　ｐｌｕｓ；Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ、以下同じ）で測定を行った。測定条件は、励起波長：７８５ｎｍ、蛍光波長：８４９ｎｍ、露光時間：６ｓｅｃに設定した。結果を図１に示す。
　図１に示すように、経鼻投与されたＧＬＰ－２誘導体が眼球及び視神経に移行することが確認された。
＜実施例２：ＧＬＰ－１誘導体の眼球及び視神経への移行＞
　生理活性ペプチド配列をＧＬＰ－２からＧＬＰ－１に変更したこと以外は実施例１と同様にして、ＧＬＰ－１のＣ末端側に糖鎖が付加されたＧＬＰ－１誘導体（Ｃ末１１糖）を作製した。作製したＧＬＰ－１誘導体の構造を下記に示す。
　１６％ＤＭＳＯ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）またはＩＣＧ標識したＧＬＰ－１誘導体のＤＭＳＯ溶液（０．９ｎｍｏｌ／ｍｏｕｓｅ）をマウスに経鼻投与した。投与から５分後及び２０分後に眼球を摘出し、４％ＰＦＡ溶液で一晩浸潤固定を行った。その後、眼球を１×ＰＢＳで洗浄してシャーレ上に載せ、光イメージング装置で測定を行った。測定条件は、励起波長：７８５ｎｍ、蛍光波長：８４９ｎｍ、露光時間：６ｓｅｃに設定した。結果を図２に示す。
　図２に示すように、経鼻投与されたＧＬＰ－１誘導体（Ｃ末１１糖）が眼球及び視神経に移行することが確認された。
＜実施例３：ＧＬＰ－２誘導体の視神経への分布＞
　ＰＢＳ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）または実施例１で使用したＧＬＰ－２誘導体のＰＢＳ溶液（３．０ｎｍｏｌ／ｍｏｕｓｅ）をマウスに経鼻投与した。投与から２０分後に眼球を摘出し、４％ＰＦＡ中で一晩浸潤固定を行った。摘出翌日に３０％スクロースに入れ替え、一晩置換（４℃）した。その後、クライオスタット（ＣＭ３０５０Ｓ；Ｌｅｉｃａ　Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＷｅｔＺｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ、以下同じ）を用いて厚さが１０μｍである視神経の凍結切片を作製した。切片をスライドガラスに載せ、ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを添加し、３０分間室温でブロッキングを行った。その後、ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒで希釈したＮｅｕｒｏ－ＣｈｒｏｍＴＭ　Ｐａｎ　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　Ｍａｒｋｅｒ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｒａｂｂｉｔ（１：５００）およびＧＬＰ－２　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：２００）を含む一次抗体溶液を添加し、室温で２時間インキュベートした。１×ＰＢＳで３回洗浄した後、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で５００倍に希釈したＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８　Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　Ｈ＆Ｌと４０　ｎｇ／ｍｌ　ＤＡＰＩを含む二次抗体溶液を添加し、室温で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳで３回洗浄した後マウントを行い、共焦点レーザー顕微鏡（ＴＣＳ　ＳＰ８；Ｌｅｉｃａ，ＷｅｔＺｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ、以下同じ）でソフトウェア（Ｌｅｉｃａ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｕｉｔｅ　Ｘ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ；　Ｌｅｉｃａ，ＷｅｔＺｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ、以下同じ）を使用し、蛍光観察を行った。結果を図３に示す。
　図３に示すように、経鼻投与されたＧＬＰ－２誘導体（Ｃ末１１糖、ドット状の蛍光に相当）が視神経に分布することが確認された。
＜実施例４：ＧＬＰ－１誘導体の視神経への分布＞
　Ｎ末端側からエンドソーム脱出促進配列（ＰＡＳ：ＦＦＬＩＰＫＧ）、膜透過促進配列（ＣＰＰ：ＲＲＲＲＲＲＲＲ）、システイン残基を含むスペーサー配列（ＧＣＧ）、及び神経ペプチド配列としてＧＬＰ－１に由来するアミノ酸配列がこの順に配置されたＰＡＳ－ＣＰＰ－ＧＬＰ－１誘導体（無糖）を得た。得られたＧＬＰ－１誘導体の構造を下記に示す。
　次いで、スペーサー配列のシステイン残基に糖鎖（１１糖）を結合させて、ＧＬＰ－１のＮ末端側が糖鎖修飾されたＰＡＳ－ＣＰＰ－ＧＬＰ－１誘導体（Ｎ末１１糖）を得た。得られたＧＬＰ－１誘導体の構造を下記に示す。
　ＰＢＳ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）またはＧＬＰ－１誘導体（Ｎ末１１糖）のＰＢＳ溶液（３．６ｎｍｏｌ／ｍｏｕｓｅ）をマウスに経鼻投与した。投与から２０分後に眼球を摘出し、実施例３と同様にして視神経の凍結切片を作製して蛍光観察を行った。結果を図４に示す。
　図４に示すように、経鼻投与されたＧＬＰ－１誘導体（Ｎ末１１糖、ドット状の蛍光に相当）が視神経に分布することが確認された。
＜実施例５：ＧＬＰ－１誘導体の網膜への分布＞
　ＰＢＳ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）または実施例４で使用したＧＬＰ－１誘導体（Ｎ末１１糖）のＰＢＳ溶液（３．６ｎｍｏｌ／ｍｏｕｓｅ）をマウスに経鼻投与した。投与から２０分後に眼球を摘出し、実施例４と同様にして網膜の凍結切片を作製して蛍光観察を行った。結果を図５に示す。
　図５に示すように、経鼻投与されたＧＬＰ－１誘導体（Ｎ末１１糖、矢印で示す蛍光に相当）が網膜に分布することが確認された。
＜実施例６：ＧＬＰ－２誘導体の外側膝状体への分布＞
　生理活性ペプチド配列をＧＬＰ－２からＧＬＰ－１に変更したこと以外は実施例４と同様にして、ＧＬＰ－２のＮ末端側に糖鎖が付加されたＧＬＰ－２誘導体（Ｎ末１１糖）を作製した。作製したＧＬＰ－２誘導体の構造を下記に示す。
　ＰＢＳまたはＧＬＰ－２誘導体のＰＢＳ溶液（３．０ｎｍｏｌ／ｍｏｕｓｅ）をマウスに経鼻投与した。投与から５分後に脳を摘出し、４％ＰＦＡ溶液で一晩、４℃で浸潤固定した。摘出翌日に、脳サンプルを２０％スクロースで一晩置換（４℃）し、さらに３０％スクロースに入れ替えて一晩置換（４℃）した。その後、クライオスタットを用いて厚さが３０μｍである外側膝状体の凍結切片を作製した。作製した切片をスライドガラスに載せ、リキッドブロッカーで切片周りにサークルを描いた。サークル内にｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを添加し、３０分間室温でブロッキングを行った。その後、ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒで２００倍に希釈したＧＬＰ－２　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙを含む一次抗体溶液を添加し、室温で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で５００倍に希釈したＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８　Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　Ｈ＆Ｌを含む二次抗体溶液を添加し、室温で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳで３回洗浄した後、ＰｒｏＬｏｎｇＴＭ　Ｄｉａｍｏｎｄ　Ａｎｔｉｆａｄｅ　Ｍｏｕｎｔａｎｔでマウントした。マウント剤の固化を確認した後、共焦点レーザー顕微鏡およびソフトウェアを使用して蛍光観察を行った。結果を図６に示す。
　図６に示すように、経鼻投与されたＧＬＰ－２誘導体に相当する蛍光が外側膝状体に観察され、経鼻投与されたＧＬＰ－２誘導体が外側膝状体を介して眼球及び視神経に移行することが示唆された。このことは経鼻投与されたペプチドが視床の外側膝状体を介して眼球及び視神経へ移行するという、今までに報告されていない新しい経路の発見であると同時に、経鼻投与されたペプチドの視神経炎や視神経症などの眼疾患の治療への適用を示唆するものである。
＜実施例７：リンカーを介して糖鎖が結合したＧＬＰ－２誘導体の眼球への移行＞
　実施例６で作製したＧＬＰ－２誘導体（Ｎ末１１糖）のスペーサー配列（ＧＣＧ）をスペーサー配列（ＧＫＧ）に変更し、糖鎖（１１糖）及びリンカーとしての炭素数６のアルキレン基を含む分子がスペーサー配列中のリシン残基（Ｋ）に結合した状態のＧＬＰ－２誘導体（Ｃ６リンカーＮ末１１糖）を作製した。作製したＧＬＰ－２誘導体の構造を下記に示す。
　１６％ＤＭＳＯ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）またはＩＣＧ標識したＧＬＰ－２誘導体（Ｃ６リンカーＮ末１１糖）のＤＭＳＯ溶液（３．０ｎｍｏｌ／ｍｏｕｓｅ）をマウスに経鼻投与した。投与から５分、１０分、２０分、６０分又は９０分後に眼球を摘出し、４％ＰＦＡ溶液で一晩浸潤固定を行った。その後、眼球を１×ＰＢＳで洗浄してシャーレ上に載せ、光イメージング装置で測定を行った。測定条件は、励起波長：７８５ｎｍ、蛍光波長：８４９ｎｍ、露光時間：６ｓｅｃに設定した。結果を図７に示す。
　図７に示すように、経鼻投与されたＧＬＰ－２誘導体（Ｃ６リンカーＮ末１１糖）は投与から５分以内に眼球に移行することが確認された。また、眼球に移行した（Ｃ６リンカーＮ末１１糖）は投与から９０分後も眼球に存在することが確認された。
＜実施例８　リンカーを介して糖鎖が結合したＧＬＰ－２誘導体の視神経及び網膜への分布＞
　ＰＢＳ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）またはＧＬＰ－２誘導体（Ｃ６リンカーＮ末１１糖）のＰＢＳ溶液（３．０ｎｍｏｌ／ｍｏｕｓｅ）をマウスに経鼻投与した。投与から２０分後に眼球を摘出し、４％ＰＦＡ中で一晩浸潤固定を行った。摘出の翌日に眼球を３０％スクロースに入れ替え、一晩置換（４℃）した。その後、クライオスタットを用いて１０μｍ厚の視神経及び網膜の凍結切片を作製した。切片をスライドガラスに載せ、ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを添加し、３０分間室温でブロッキングを行った。その後、ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒで希釈したＮｅｕｒｏ－ＣｈｒｏｍＴＭ　Ｐａｎ　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　Ｍａｒｋｅｒ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｒａｂｂｉｔ（１：５００）およびＧＬＰ－２　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：２００）を含む一次抗体溶液を添加し、室温で２時間インキュベートした。１×ＰＢＳで３回洗浄した後、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で５００倍に希釈したＡｌｅｘａ　ＦｌｕｏｒＴＭ　５６８　Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　Ｈ＆Ｌと、２０μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを含む二次抗体溶液を添加し、室温で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳで３回洗浄した後マウントを行った。その後、共焦点レーザー顕微鏡およびソフトウェアを使用して蛍光観察を行った。
　視神経に相当する部位の蛍光観察の結果を図８に示し、網膜に相当する部位の蛍光観察の結果を図９に示す。
　図８及び図９に示すように、経鼻投与されたＧＬＰ－２誘導体（Ｃ６リンカーＮ末１１糖、ドット状の蛍光に相当）は投与から２０分以内に網膜神経節（ｒｅｔｉｎａｌ　ｇａｎｇｌｉｏｎ　ｃｅｌｌ）や内網状層（Ｉｎｎｅｒ　ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅｄ　ｌａｙｅｒ）に移行することが確認された。
　特願２０２２－１８０３８１号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。

Claims (12)

  1. 　生理活性ペプチド配列と、膜透過促進配列及びエンドソーム脱出促進配列を含む機能性配列と、を有する、眼疾患の治療のための生理活性ペプチド誘導体。
  2. 　糖鎖を含む糖鎖修飾分子をさらに有する、請求項１に記載の生理活性ペプチド誘導体。
  3. 　前記糖鎖修飾分子は前記生理活性ペプチド配列のＣ末端側又はＮ末端側に結合している、請求項２に記載の生理活性ペプチド誘導体。
  4. 　前記糖鎖の１本あたりの単糖残基の数は５～２０である、請求項２に記載の生理活性ペプチド誘導体。
  5. 　前記生理活性ペプチド配列のアミノ酸残基数は２００以下である、請求項１に記載の生理活性ペプチド誘導体。
  6. 　前記膜透過促進配列はカチオン性である、請求項１に記載の生理活性ペプチド誘導体。
  7. 　前記膜透過促進配列はアミノ酸残基総数の半数以上が塩基性のアミノ酸残基である、請求項１に記載の生理活性ペプチド誘導体。
  8. 　前記エンドソーム脱出促進配列はＦＦＬＩＰＫＧ、ＬＩＬＩＧ、ＦＦＧ、ＦＦＦＦＧ及びＦＦＦＦＦＦＧからなる群より選択されるアミノ酸配列である、請求項１に記載の生理活性ペプチド誘導体。
  9. 　外側膝状体を経由して視神経や網膜へ到達する、請求項１に記載の生理活性ペプチド誘導体。
  10. 　請求項１～請求項９のいずれか１項に記載の生理活性ペプチド誘導体を有効成分として含む、医薬組成物。
  11. 　請求項１～請求項９のいずれか１項に記載の生理活性ペプチド誘導体を有効成分として含む、経鼻・点鼻製剤。
  12. 　生理活性ペプチド配列と、膜透過促進配列及びエンドソーム脱出促進配列を含む機能性配列と、を有する生理活性ペプチド誘導体の、眼疾患の治療への使用。
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