JPWO2009153960A1 - 糖鎖付加ｇｌｐ−１ペプチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＧＬＰ−１と比べて、血中半減期が長く、かつ好ましくは高い血糖値抑制活性を示す糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを提供することを課題とするものである。本発明は、（ａ）ＧＬＰ−１；（ｂ）ＧＬＰ−１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；又は、（ｃ）ＧＬＰ−１の類縁体；において少なくとも２個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、ＧＬＰ−１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを提供する。本発明はまた、前記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）において、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたＧＬＰ−１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記糖鎖がオリゴヒアルロン酸を含む糖鎖である糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを提供する。糖鎖付加アミノ酸は、糖鎖とアミノ酸がリンカーを介して結合していてもよい。

Description

本発明は、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドに関する。
ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド−１：ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−１）は、糖のホメオスタシスの制御に深く関与する腸起源のペプチドである。ＧＬＰ−１は、グルカゴン前駆体のプレプログルカゴンの組織特異的な翻訳後プロセシングにより腸のＬ細胞において合成され、食事に反応して循環中へ放出される。このペプチドは、腸島軸（ｅｎｔｅｒｏｉｎｓｕｌａｒ ａｘｉｓ）の主要メディエーターであり、特定の受容体に結合することによって作用する。
ＧＬＰ−１は、主として膵臓に作用し、β細胞によるインスリン放出をグルコース濃度依存的に促進することが知られている。また、グルカゴンの分泌を抑制し、胃の空洞化を遅らせ、末梢のグルコース処理を高める可能性が示唆されている。
ＧＬＰ−１の投与によりインスリン非依存型糖尿病患者において食後のグルコースレベルが正常化され得ることから、ＧＬＰ−１の治療薬としての可能性が示唆されている。また、ＧＬＰ−１はインスリン依存型糖尿病患者において血糖コントロールを改善する作用も有している。さらに、ＧＬＰ−１のインスリン放出促進作用は血漿グルコース濃度に依存しているため、低い血漿グルコース濃度ではＧＬＰ−１介在性のインスリン放出が低く、重篤な低血糖症を招かないメリットがある。従って、必要に応じ、血中ＧＬＰ−１量をコントロールすることによって、安全性の高い糖尿病治療が可能になると考えられる。しかしながら、ＧＬＰ−１の血中の半減期は、２〜６分と極めて短く、その治療剤としての可能性が限定されるという問題がある。
このような問題を解決する手段として、ＧＬＰ−１を改変する試みがなされている。例えば、特許文献１には、少なくとも１個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に共役的に結合したＧＬＰ−１化合物を含むペグ化ＧＬＰ−１化合物が開示されている。当該ペグ化ＧＬＰ−１化合物では、各ＰＥＧがＧＬＰ−１化合物に、Ｃｙｓ又はＬｙｓアミノ酸にて、もしくはカルボキシ末端アミノ酸にて結合している。当該ペグ化ＧＬＰ−１化合物は、少なくとも１時間の排出半減期を有する。
特許文献１によれば、非ペグ化（ｕｎＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ペプチドと比べて、半減期が延長され、クリアランスが遅延化された生理活性ペプチドが得られる。また、これらのペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ＧＬＰ−１化合物及び組成物は、糖尿病、肥満、過敏性腸症候群、ならびに血糖を低下させること、胃及び／又は腸運動性を抑制すること、及び、胃及び／又は腸内容排出を抑制すること、又は食物摂取を抑制すること等、健康状態の治療に有用であることが開示されている（例えば、非特許文献１）。
しかしながら、ＰＥＧは、生体内で代謝されない化合物であるため、ペグ化ＧＬＰ−１化合物の投与を続けると、ＰＥＧが生体内に蓄積され、生体に薬害を与える危険性がある（非特許文献１）。
また、半減期を延長するために、ＧＬＰ−１やその改変体に糖鎖を付加する方法も提案されている（例えば、特許文献３及び４）。特許文献３には、ＧＬＰ−１の２６位、３４位、および／又は３７位に糖鎖付加アミノ酸を導入する方法等が記載されているが、糖鎖の種類や糖鎖を付加する位置が、必ずしも最適化されているとはいえない。一方、特許文献４には、分子量２００ＫＤａ程度のヒアルロン酸修飾物をＧＬＰ−１アナログに結合させる方法が記載されている。しかしながら、このように巨大なヒアルロン酸分子を大量に製造する場合、長さや構造を均一にするのは困難であり、実際には各ヒアルロン酸の構造や長さにはかなりばらつきが生じているものと考えられる。医薬品として用いる場合には、長さや構造が均一な糖鎖付加ペプチドが必要とされる。
また、ＧＬＰ−１に類似した構造で、同様の活性を有し、かつ、血中安定性の高い化合物として、トカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ）の唾液から発見されたエキセンジン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）（非特許文献２）が米国で上市されているが、ｅｘｅｎｄｉｎ−４は非ヒト型配列であり、長期投与による中和抗体の出現やそれに伴う薬効の減弱が懸念される（非特許文献３〜５）。
一方、糖鎖は生体内において様々な役割を担っていることが明らかになってきており、その研究の重要性を認識されながらも、構造の複雑さや多様性によって研究が遅れている。組成が一定した糖ペプチドを得るための方法も試みられているが（特許文献２）、簡便さや大量生産の観点から充分な製造方法とは言えず、また、特に生体内に存在する長い糖鎖に関しては実用的な製造方法とはいえない。
特表２００６−５２０８１８号公報 再表２００５−０９５３３１号公報 再表２００６−０９５７７５号広報 国際公開第２００７／０６３９０７号パンフレット Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２，１５２−１５７（１９９８）。 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６７，４０２−５（１９９２） Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｒｉｓｋ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ２，６９−７７（２００６） ＪＡＭＡ．２９８，１９４−２０６（２００７） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８，１８７−２１８（２００７）
本発明の課題は、ＧＬＰ−１と比べて、血中安定性が増大しており、さらに好ましくは、高い血糖値抑制活性を示す、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを提供することにある。
以上の課題を解決するために本発明は以下の特徴を有し得る。すなわち、本発明は、（ａ） ＧＬＰ−１；
（ｂ） ＧＬＰ−１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；又は、
（ｃ） ＧＬＰ−１の類縁体；
において、少なくとも２個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、ＧＬＰ−１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであり得る。
また、本発明は、
（ａ） ＧＬＰ−１；又は、
（ｂ） ＧＬＰ−１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドであって、ＧＬＰ−１活性を有するペプチド；
において、少なくとも２個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、ＧＬＰ−１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであり得る。
また、本発明は、
（ａ） ＧＬＰ−１において、２以上のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、少なくとも１つの置換部位が、１８、２０、２２、２６、３０、３４又は３６位である糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド；又は、
（ｂ）（ａ）で定義される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド；
であって、ＧＬＰ−１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであり得る。
また、本発明は、
（ａ） ＧＬＰ−１において、２以上のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、いずれの置換部位も１８、２０、２２、２６、３０、３４又は３６位からなる群から選択される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド；又は、
（ｂ）（ａ）で定義される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド；
であって、ＧＬＰ−１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであり得る。
本発明において、糖鎖付加アミノ酸は、実施態様によっては、好ましくは糖鎖付加Ａｓｎ又は糖鎖付加Ｃｙｓであり得るが、これらに限定されない。
また、本発明において、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドに結合した複数の糖鎖付加アミノ酸は、糖鎖やアミノ酸の種類において同じものであってもよいし、異なるものであってもよい。
また、本発明において、糖鎖付加アミノ酸においては、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合することも、リンカーを介することなく結合することもできる。実施態様によっては、好ましくは、リンカーを介することなく（直接に）結合している。
また、本発明において、糖鎖は、４個以上の糖からなる糖鎖であることが、一般には好ましい。さらに、実施態様によっては、５個〜１１個の糖からなる糖鎖であることが好ましい場合がある。
また、本発明において、糖鎖は、実施態様によっては、２本鎖複合型糖鎖が好ましい。また、実施態様によっては、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖及びジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖であることが好ましい場合があるが、これらに限定されない。
また、本発明において、糖鎖は、実施態様によっては、以下の式で表される糖鎖が好ましい場合があるが、これらに限定されない。
Figure 2009153960
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
Figure 2009153960
 を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
また、本発明は、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換され、該糖鎖がオリゴヒアルロン酸である糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであり得る。オリゴヒアルロン酸としては、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸とからなる単位を１単位とした場合に、２単位（４糖）以上８単位以下の糖鎖を挙げることができ、２単位（４糖）や４単位（８糖）とすることができる。
また、本発明は、少なくとも１個のアミノ酸にリンカーを介して糖鎖が結合している糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであり得る。リンカーが結合するＧＬＰ−１ペプチドのアミノ酸としては、例えばＬｙｓを挙げることができる。この場合、リンカーが、その糖鎖側の末端にアミノ酸を含んでいてもよい。リンカーの糖鎖側末端に含まれるアミノ酸としては、例えばＡｓｎを挙げることができる。
本発明においては、糖鎖が実質的に均一であることが好ましく、例えば、９０％以上均一、あるいは９９％以上均一であることが好ましい。
本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、好ましくは、ＧＬＰ−１と比較して増大した血中安定性を有する。
本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、ＧＬＰ−１と比較して好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは２０倍以上のＯＧＴＴ（Ｏｒａｌ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ Ｔｅｓｔ）における血糖値抑制活性を有し得る。
本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、ＧＬＰ−１と比較して好ましくは２０倍以上、より好ましくは３０倍以上、さらに好ましくは５０倍以上のＤＰＰ−ＩＶ耐性を有し得る。
本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを新規な有効成分として医療用途に用いることができる。そのような医療用途としては、ＧＬＰ−１に関連する疾患の治療又は予防が含まれる。そのような疾患の代表例は、例えば、糖尿病である。
以上述べた本発明の特徴の一又は複数を、任意に組み合わせたものも、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであることはいうまでもない。
本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、ＧＬＰ−１と比較して、血中安定性が増大し、また、本発明の一態様において、ＧＬＰ−１と比較して、血糖値抑制活性が増大している。よって、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、ＧＬＰ−１と比較して、その投与量及び投与回数を低減することができる。
また、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドに付加される糖鎖は、生体内で容易に分解されるので、その蓄積により生体に薬害を与えることはない。
また、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドに付加される糖鎖の一部又は全部は、ヒトを含む哺乳類、鳥類等の生体内に存在する糖鎖やその改変体であり、体内に投与しても副作用や抗原性を示す可能性が低い。アレルギー反応や、抗体産生が生じたり、それによって薬効が得られなくなったりする等の心配が少ない。
さらに、本発明で用いられる糖鎖には、比較的短いものが多いので、複雑な製造工程を経ずに、均一な構造のものを得ることができる。従って、大規模かつ安定に医薬品レベルの高品質な糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを得ることができる。
図１は、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（２６位，３４位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ−１又は１８位，３６位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ−１）又はＧＬＰ−１の投与による血糖値上昇抑制作用を経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）により測定した結果を示す。２６位，３４位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ−１、１８位，３６位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ−１は０．９ｎｍｏｌ／ｋｇ投与し、ＧＬＰ−１は９ｎｍｏｌ／ｋｇ投与した。 図２は、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（２２位，３０位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ−１、２２位，３６位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ−１又は３０位，３６位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ−１）又はＧＬＰ−１の投与による血糖値上昇抑制作用を経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）により測定した結果を示す。２２位，３０位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ−１、２２位，３６位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ−１、３０位，３６位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ−１は０．９ｎｍｏｌ／ｋｇ投与し、ＧＬＰ−１は９ｎｍｏｌ／ｋｇ投与した。 図３は、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（３６位Ｃｙｓ−ヒアルロン酸４糖付加ＧＬＰ−１又は３６位Ｃｙｓ−ヒアルロン酸８糖付加ＧＬＰ−１）又はＧＬＰ−１の投与による血糖値上昇抑制作用を経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）により測定した結果を示す。３６位Ｃｙｓ−ヒアルロン酸４糖付加ＧＬＰ−１、３６位Ｃｙｓ−ヒアルロン酸８糖付加ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１は９ｎｍｏｌ／ｋｇ投与した。 図４は、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（２６位Ｌｙｓ−アシアロ糖鎖Ａｓｎリンカー修飾ＧＬＰ−１）又はＧＬＰ−１の投与による血糖値上昇抑制作用を経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）により測定した結果を示す。２６位Ｌｙｓ−アシアロ糖鎖Ａｓｎリンカー修飾ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１は９ｎｍｏｌ／ｋｇ投与した。 図５は、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの投与量が血糖値上昇抑制作用に与える影響を調べるために実施した経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）の結果を示す。１８位，３６位Ｃｙｓジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ−１は０．９ｎｍｏｌ／ｋｇ投与し、ＧＬＰ−１は９ｎｍｏｌ／ｋｇ投与した。
本明細書において「ＧＬＰ−１」とは、グルカゴン様ペプチド−１（ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−１）を示し、ＧＬＰ−１（７−３７）を指す。
ＧＬＰ−１（７−３７）は、下記のアミノ酸配列を有する。
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号２）
本発明において、「ＧＬＰ−１の類縁体」とは、ＧＬＰ−１と構造上類似したペプチド及び／又はＧＬＰ−１と重複した構造を有するペプチド、例えば：ＧＬＰ−１のアミノ酸において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；ＧＬＰ−１のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド；ＧＬＰ−１改変体；ＧＬＰ−１活性を有するＧＬＰ−１のフラグメント；ＧＬＰ−１活性を有する伸長ＧＬＰ−１；並びにエキセンジン−４（以下、「Ｅｘ−４」と記載する場合もある。）及びその類縁体が挙げられる（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ８，８４２−８（２００７），Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０７，４９０−４９６（２００３），Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５０，２５３０−９（２００１）等）。
本明細書中において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えば、天然タンパク原性Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク原性アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。非天然アミノ酸の例として、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニンなど）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン及びα−メチル−ヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。ＧＬＰ−１活性を有するＧＬＰ−１類縁体のいくつかは、非天然アミノ酸を含むことが知られる。好ましい態様において、本発明の化合物に含まれるアミノ酸は、天然アミノ酸のみからなる。
本明細書中において、アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたという場合、置換等されるアミノ酸の個数は、ＧＬＰ−１活性を保持する限り特に限定されないが、１〜９個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個程度であるかあるいは全体の長さの２０％以内、好ましくは１０％以内である。置換又は付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸又はアミノ酸アナログであり得、好ましくは天然のアミノ酸である。アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたＧＬＰ−１ペプチドの例としては、例えば、８位のＡｌａと３５位のＧｌｙを非天然アミノ酸のα−メチルアラニン（アミノイソブタン酸、Ａｉｂとも呼ぶ）で置換し、３７位のＧｌｙを欠失させ、３６位のＡｒｇがアミド化されたＢＩＭ５１０７７（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ８，８４２−８（２００７））が挙げられる。
本明細書中において、「アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換された」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数及び／又は疎水性指数が類似している置換であって、そのような置換の前後で、ＧＬＰ−１活性の明らかな低下又は消失を生じない置換をいう。
本明細書中において、「ＧＬＰ−１改変体」とは、ＧＬＰ−１を天然又は人工的に改変した化合物であり、そのような改変としては、例えば、ＧＬＰ−１の１又は複数のアミノ酸残基の、アルキル化、アシル化（例えばアセチル化）、アミド化、カルボキシル化、エステル形成、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、水酸化、標識成分の結合等が挙げられる。
本明細書中において、「ＧＬＰ−１活性を有するＧＬＰ−１のフラグメント」とは、ＧＬＰ−１のＮ末端及び／又はＣ末端から１個又はそれ以上のアミノ酸が欠失し、かつＧＬＰ−１活性を維持したペプチドである。
本明細書中において、「ＧＬＰ−１活性を有する伸長ＧＬＰ−１」とは、ＧＬＰ−１のＮ末端及び／又はＣ末端に１個又はそれ以上のアミノ酸が付加され、かつＧＬＰ−１活性を維持したペプチドである（例えば、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２５，３１０９−１４（１９８９）を参照）。
本明細書中において、「ＧＬＰ−１のＣ末端（３７位）にさらに、１若しくは数個のアミノ酸が付加されたペプチド」という場合、ＧＬＰ−１のＣ末端に付加されたアミノ酸から順に、３８位のアミノ酸、３９位のアミノ酸・・・等と呼び、また、「ＧＬＰ−１のＮ末端（７位）にさらに、１若しくは数個のアミノ酸が付加されたペプチド」という場合、ＧＬＰ−１のＮ末端に付加されたアミノ酸から順に、６位のアミノ酸、５位のアミノ酸・・・等と呼ぶものとする。例えば、「ＧＬＰ−１のＣ末端（３７位）にさらに、１個のアミノ酸が付加されたペプチド」として、ＧＬＰ−１の３７位のＧｌｙにＡｓｎ又はＣｙｓが結合したペプチドが挙げられる。
本発明の「糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド」は、少なくとも１個のアミノ酸が、糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする。
本明細書中において、「糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド」には、ＧＬＰ−１の少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたペプチド、上記ＧＬＰ−１類縁体において少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたペプチドが含まれ、それぞれ、さらに糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていても、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドに含まれる。これらのペプチドのＣ末端がアミド化されたペプチド（たとえば、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＮＨ２（配列番号３）のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたペプチド）も、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドに含まれる。さらに、これらのペプチドの塩も、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドに含まれる。
本明細書中において、塩は、酸付加塩又は塩基付加塩のいずれであってもよい。酸付加塩を形成するために通常用いられる酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等の無機酸及びｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等の有機酸である。塩基付加塩としては、水酸化アンモニウム又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等の無機塩基から誘導された塩が挙げられる。特に、薬学的に許容される塩が好ましい。
本明細書中において、「糖鎖付加アミノ酸」とは、糖鎖が結合したアミノ酸であり、ここで糖鎖とアミノ酸とは、リンカーを介して結合していてもよい。糖鎖とアミノ酸との結合部位に特に制限はないが、糖鎖の還元末端にアミノ酸が結合していることが好ましい。
糖鎖が結合するアミノ酸の種類に特に限定はなく、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のいずれを用いることもできる。糖鎖付加アミノ酸が生体内に糖ペプチド（糖たんぱく質）として存在するものと同一又は類似の構造を有するという観点からは、糖鎖付加アミノ酸は、Ｎ−結合型糖鎖のような糖鎖付加Ａｓｎ、Ｏ−結合型糖鎖のような糖鎖付加Ｓｅｒ及び糖鎖付加Ｔｈｒが好ましく、特に糖鎖付加Ａｓｎが好ましい。
また、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとの結合容易性という観点からは、糖鎖付加アミノ酸のアミノ酸は、アスパラギン酸やグルタミン酸等の分子内に２つ以上のカルボキシル基を持つアミノ酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン等の分子内に２以上のアミノ基を持つアミノ酸、セリン、スレオニン、チロシン等の分子内に水酸基を持つアミノ酸、システイン等の分子内にチオール基を持つアミノ酸、アスパラギン、グルタミン等の分子内にアミド基を持つアミノ酸、が好ましい。特に、反応性の観点からは、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンが好ましい。
なお、本発明の任意の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドについて、糖鎖構造、糖鎖以外の構造、糖鎖の付加部位及び糖鎖の付加数が同一である場合に、糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎ（リンカーを介さない）の場合と糖鎖付加Ｃｙｓ（リンカーを介する）の場合で、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの血糖値上昇抑制活性に大きな違いはみられない。
糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとしては、当該分野において用いられているものを広く使用することができるが、例えば、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ａ−ＣＨ２−（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）、Ｃ１−１０ポリメチレン、−ＣＨ２−Ｒ−（ここで、Ｒは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基及び置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が１つ脱離して生ずる基である）、−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ａ−（ＣＯ）−（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）等を挙げることができる。
糖鎖付加アミノ酸において糖鎖とＧＬＰ−１骨格上のアミノ酸がリンカーを介して結合している場合、リンカーが、糖鎖側の末端にアミノ酸を含むことも好ましい。アミノ酸の種類は特に限定されないが、好ましい例としてはＡｓｎを挙げることができる。
糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合している場合、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合と比較して、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの抗原性は低くなり得る。糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合している場合と比較して、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの血中安定性が高くなり得る。
なお、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、その記載（例えば、「アミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド」という記載）によって何ら製造方法が限定されるものではなく、後述のＡ法〜Ｃ法のいずれの方法で製造した糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであっても、「アミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド」に含まれる。また、例えば、アミノ酸の結合していない糖鎖を、ペプチド上のアミノ酸に直接又はリンカーを介して結合した糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド；糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドにおいて、付加した糖鎖にさらに糖又は糖鎖を付加することですでに付加された糖鎖を伸長させた糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド；糖鎖付加アミノ酸のアミノ基及び／又はカルボキシル基に１又は数個のアミノ酸を結合させ、さらにこれを１又は複数のＧＬＰ−１フラグメントと連結させた糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド；アミノ酸の結合した糖鎖を、ペプチド上のアミノ酸にリンカーを介して結合した糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド、なども最終的な構造が一致している限り、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドに含まれる。
ＧＬＰ−１のアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する数は、血中安定性や血糖値抑制活性等の生理活性、最終的な糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドに存在するアミノ酸の個数や糖鎖付加前後の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの分子量、等により適宜調節すればよい。例えば、１〜５個置換することが好ましく、１〜３個置換することがより好ましい。本発明の一態様においては、２個以上置換することが好ましく、例えば、２〜５個置換することが好ましく、２〜３個置換することがより好ましい。簡便性の観点からは、１個の置換で所望の活性が得られるのであれば、１個の置換を選択することが好ましいであろう。一般に、ＧＬＰ−１の１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１個以上をさらに糖鎖付加アミノ酸で置換した場合、血中安定性は増大し、血糖値抑制活性は減少する傾向がある（但し、血中安定性が増大することで、減少した血糖値抑制活性を補償することが可能である）。
本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドにおいて、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、血中安定性や血糖値抑制活性により適宜調節することができる。
本発明の一態様において、ＧＬＰ−１アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、所望の活性に応じてＧＬＰ−１の任意の部位を選択することができ、例えばＧＬＰ−１の８、９、１２、１８、１９、２０、２２、２６、３０、３４、３６及び３８位（＝３７位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位であり、好ましくは、１８、２０、２２、２６、３０、３４、３６及び３８位から選択される１以上の部位であり、例えば、１８、２６、３０、３４及び３６位から選択される１以上の部位であり、特に３０及び３６位から選択される１以上の部位である。
本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの血中安定性という観点からは、ＧＬＰ−１の任意の部位を選択することができ、例えばＧＬＰ−１の９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２２、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３２、３４、３６及び３８位（＝３７位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位であり、好ましくは９、１０、１１、１２、１４及び２８位から選択される１以上の部位であり、特に好ましくは９、１０、１１及び１２から選択される１以上の部位である。特にＧＬＰ−１のＮ末端に近い部位のアミノ酸の置換も好ましい。特にＧＬＰ−１の２以上のアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位の例として、例えばＧＬＰ−１の１８位と３６位の置換、２６位と３４位の置換、２２位と３０位の置換、２２位と３６位の置換、３０位と３６位の置換などを挙げることができる。
本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの血糖値抑制作用という観点からは、例えばＧＬＰ−１の１８、２０、２２、２６、３０、３４、３６及び３８位（＝３７位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位であり、好ましくは１８、２６、３０、３４及び３６位から選択される１以上の部位であり、特に３０及び３６位から選択され１以上の部位である。特にＧＬＰ−１の２以上のアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位の例として、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの血糖値抑制作用という観点から、例えばＧＬＰ−１の１８位と３６位の置換、２６位と３４位の置換、２２位と３０位の置換、２２位と３６位の置換、３０位と３６位の置換などを挙げることができる。
本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドのＧＬＰ−１活性のうち、ｃＡＭＰ合成能に関する観点からは、好ましくは２２、２６、２７、３０、３４、３６及び３８位（＝３７位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位であり、より好ましくは２２、２６、３０、３４、３６及び３８位から選択される１以上の部位である。
本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、ＧＬＰ−１の８、９及び１２位以外の部位から選択される１以上の部位である。
本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、ＧＬＰ−１の７、１０、１３、１５、１９、２１、２８及び２９位以外の部位から選択される１以上の部位、特に、７、１０、１５及び２８位以外の部位から選択される１以上の部位である。
本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、ＧＬＰ−１のＧＬＰ−１受容体への結合部位からも、決定することができる。
本発明の一態様において、２以上のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されている場合に、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、上記のいずれの組み合わせも採用することができるがこれに限定されない。例えば、１の部位が上記の好ましい部位から選択され、他の部位がＧＬＰ−１の任意の部位から選択される組み合わせ；１の部位が上記の好ましい部位から選択され、他の部位がＧＬＰ−１のＣ末端（３７位）にさらに付加された１若しくは数個のアミノ酸の任意の部位から選択される組み合わせ等もまた、本発明の好ましい一態様に含まれる。
本発明の一態様において、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、ＧＬＰ−１における：
８位のＡｌａがＧｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸での置換；
９位のＧｌｕがＡｓｐ及びＬｙｓ からなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
１１位のＴｈｒがＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
１２位のＰｈｅがＴｒｐ及びＴｙｒからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
１３位のＴｈｒがＳｅｒで置換；
１４位のＳｅｒがＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
１５位のＡｓｐがＧｌｕで置換；
１６位のＶａｌがＰｈｅ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｔｙｒ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
１７位のＳｅｒがＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
１８位のＳｅｒがＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
１９位のＴｙｒがＰｈｅ，Ｔｒｐ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
２０位のＬｅｕがＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
２１位のＧｌｕがＡｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
２２位のＧｌｙがＡｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
２３位のＧｌｎがＡｓｎ，Ａｒｇ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
２４位のＡｌａがＧｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ａｒｇ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
２５位のＡｌａが Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
２６位のＬｙｓがＡｒｇ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＨｉｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
２７位のＧｌｕがＡｓｐ，Ｉｌｅ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
２８位のＰｈｅがＴｒｐで置換；
２９位のＩｌｅがＬｅｕ，Ｖａｌ及びＡｌａからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
３０位のＡｌａがＧｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
３１位のＴｒｐ がＰｈｅ，Ｔｙｒ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
３２位のＬｅｕ がＧｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
３３位のＶａｌ がＧｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
３４位のＬｙｓ がＡｒｇ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＨｉｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
３５位のＧｌｙ がＡｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
３６位のＡｒｇがＬｙｓ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＨｉｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；及び／又は３７位のＧｌｙがＡｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ及びＬｙｓからなる群のいずれか１つのアミノ酸で置換；
であることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
本発明の一態様において、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加が生ずる部位は、ＧＬＰ−１の７、１０、１３、１５、１９、２１、２８及び２９位以外の部位から選択される１以上の部位、例えば、７、１０、１５及び２８位以外の部位から選択される１以上の部位であることが好ましい（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｌ，ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖｏｌ．２６９，Ｎｏ．９，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｍａｒｃｈ ４，ｐｐ．６２７６−６２７８．１９９４）。
本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドとしては、例えば、
一般式（１）
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ２６−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ３４−Ｇｌｙ−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７
［式中、Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１９は、Ｔｙｒ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、糖鎖付加Ｃｙｓ、糖鎖付加Ａｓｎ、又は糖鎖付加Ｌｙｓを示す。
Ｘａａ３０は、Ａｌａ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、糖鎖付加Ｃｙｓ、糖鎖付加Ａｓｎ、又は糖鎖付加Ｌｙｓを示す。
Ｘａａ３６は、Ａｒｇ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ、ＮＨ２、Ｇｌｙ−糖鎖付加Ｃｙｓ又はＧｌｙ−糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１８がＳｅｒであり、Ｘａａ１９がＴｙｒであり、Ｘａａ２２がＧｌｙであり、Ｘａａ２６がＬｙｓであり、Ｘａａ３０がＡｌａであり、Ｘａａ３４がＬｙｓであり、かつＸａａ３６がＡｒｇである場合、Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ−糖鎖付加Ｃｙｓ又はＧｌｙ−糖鎖付加Ａｓｎを示す。］
で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって：２以上のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド；糖鎖がオリゴヒアルロン酸である糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド；糖鎖が高マンノース型糖鎖である糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド等が挙げられる。尚、糖鎖付加Ｃｙｓ、糖鎖付加Ａｓｎ及び糖鎖付加Ｌｙｓは、いずれも糖鎖とアミノ酸との間にリンカーを含んでもよい。本明細書において、一般式（１）で表されるペプチドを配列番号１で示す。
具体的には、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドとしては、例えば、
（ａ１）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号４）；
（ａ２）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号５）；
（ａ３）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号６）；
（ａ４）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号７）
（ａ５）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号８）
（ａ６）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号９）；
（ａ７）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙ−糖鎖付加Ｃｙｓを示すペプチド（配列番号１０）；
（ａ８）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１１）；
（ａ９）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１２）；
（ａ１０）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１３）；
（ａ１１）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１４）；
（ａ１２）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１５）；
（ａ１３）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１６）；
（ａ１４）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１７）；
（ａ１５）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙ−糖鎖付加Ａｓｎを示すペプチド（配列番号１８）；
（ａ１６）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号１９）；
（ａ１７）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号２０）；
（ａ１８）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示す化合物（配列番号２１）；
（ａ１９）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示す化合物（配列番号２２）；
（ａ２０）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示す化合物（配列番号２３）；
（ａ２１）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示す化合物（配列番号２４）；
（ａ２２）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号２５）；
（ａ２３）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号２６）；
（ａ２４）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号２７）；
（ａ２５）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号２８）；
（ａ２６）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号２９）；
（ａ２７）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号３０）；
（ａ２８）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号３１）；
（ａ２９）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号３２）；又は
（ａ３０）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号３３）等が挙げられる。
以上の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの例において、糖鎖は、例えばオリゴヒアルロン酸や、高マンノース型糖鎖であることが好ましい。
また、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドとしては、
（ａ３１）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ｌｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号３４）；又は
（ａ３２）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４が糖鎖付加Ｌｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号３５）等も挙げられる。
以上の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの例においては、例えば、糖鎖付加Ｌｙｓにおける糖鎖とＬｙｓがリンカーを介して結合していることが好ましい。
また、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドとしては、
（ａ３３）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号３６）；
（ａ３４）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号３７）；
（ａ３５）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号３８）；
（ａ３６）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号３９）；
（ａ３７）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号４０）；
（ａ３８）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号４１）；
（ａ３９）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号４２）；
（ａ４０）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号４３）；
（ａ４１）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号４４）；
（ａ４２）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号４５）等も挙げられる。
以上の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの例において糖鎖は、例えば、２本鎖複合型糖鎖であることが好ましい。
また、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドとしては、
（ａ４３）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２６がＬｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙ−糖鎖付加Ｃｙｓを示すペプチド（配列番号４６）；
（ａ４４）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ｃｙｓを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙを示すペプチド（配列番号４７）；
（ａ４５）前記一般式（１）においてＸａａ１８がＳｅｒを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２がＧｌｙを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、かつＸａａ３７がＧｌｙ−糖鎖付加Ａｓｎを示すペプチド（配列番号４８）；
（ａ４６）前記一般式（１）においてＸａａ１８が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ１９がＴｙｒを示し、Ｘａａ２２が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ２６が糖鎖付加Ａｓｎを示し、Ｘａａ３０がＡｌａを示し、Ｘａａ３４がＬｙｓを示し、Ｘａａ３６がＡｒｇを示し、かつＸａａ３７がＮＨ２を示すペプチド（配列番号４９）等も挙げることができる。
以上の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの例において糖鎖は、例えば、２本鎖複合型糖鎖であることが好ましい。
また、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド類縁体として、例えば、以下のアミノ酸配列を有するエキセンジン−４に糖鎖を付加したものを挙げることができる。
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＮＨ２（配列番号５０）
糖鎖付加エキセンジン−４は、例えば、以下の一般式（２）で表わされる。
一般式（２）
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１２−Ｇｌｎ−Ｘａａ１４−Ｇｌｕ−Ｘａａ１６−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｘａａ２０−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｘａａ２８−Ｇｌｙ−Ｘａａ３０−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＮＨ２
［式中、Ｘａａ１２は、Ｌｙｓ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１４は、Ｍｅｔ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１６は、Ｇｌｕ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２０は、Ａｒｇ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２４は、Ｇｌｕ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２８は、Ａｓｎ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ３０は、Ｇｌｙ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１２、Ｘａａ１４、Ｘａａ１６、Ｘａａ２０、Ｘａａ２４、Ｘａａ２８及びＸａａ３０の少なくとも１つは糖鎖付加Ｃｙｓまたは糖鎖付加Ａｓｎである。］（配列番号５１）
この中でも、例えば、Ｘａａ２４及び／又はＸａａ３０が糖鎖付加Ｃｙｓ又は糖鎖付加Ａｓｎであることが好ましく、特に、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ｃｙｓであることが好ましい。
また、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１のうち、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたＧＬＰ−１に糖鎖を付加した例として、例えば、以下のアミノ酸配列を有するＢＩＭ５１０７７に糖鎖を付加したものを挙げることができる。
Ｈｉｓ−Ｒ２−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｒ２−Ａｒｇ−ＮＨ２
［式中、Ｒ２は、α−メチルアラニンを示す。］（配列番号５２）
糖鎖付加ＢＩＭ５１０７７は、例えば、以下の一般式（３）で表わされる。
一般式（３）
Ｈｉｓ−Ｒ２−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｔｙｒ−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ２６−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ３４−Ｒ２−Ｘａａ３６−ＮＨ２
［式中、Ｒ２は、α−メチルアラニンを示し、
Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２０は、Ｌｅｕ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、糖鎖付加Ｃｙｓ、糖鎖付加Ａｓｎ、又は糖鎖付加Ｌｙｓを示す。
Ｘａａ３０は、Ａｌａ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、糖鎖付加Ｃｙｓ、糖鎖付加Ａｓｎ、又は糖鎖付加Ｌｙｓを示す。
Ｘａａ３６は、Ａｒｇ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１８、Ｘａａ２０、Ｘａａ２２、Ｘａａ２６、Ｘａａ３０、Ｘａａ３４及びＸａａ３６のすくなくとも１つは糖鎖付加Ｃｙｓまたは糖鎖付化Ａｓｎである。］（配列番号５３）
なお、エキセンジン−４やＢＩＭ５１０７７のように、本来Ｃ末端がアミド化されているペプチドについては、当該Ｃ末端のアミノ酸に糖鎖を付加した糖鎖付加アミノ酸を合成する場合、Ｃ末端をアミド化しない場合もある。
本明細書中において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖及び／又はその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類及び多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸並びにそれらの複合体及び誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解又は誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。糖鎖は直鎖型であっても分岐鎖型であってもよい。
また、本明細書中において、「糖鎖」には糖鎖の誘導体も含まれ、糖鎖の誘導体としては、例えば、糖鎖を構成する糖が、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ−１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルクロン酸））、アミノ基又はアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなど）、アミノ基及びカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２−デオキシ−Ｄ−リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などである糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明において、好ましい糖鎖は、ＧＬＰ−１に付加された場合（糖鎖付加アミノ酸の形でＧＬＰ−１のアミノ酸と置換された場合）に、ＧＬＰ−１の血中安定性を増大させ、かつ、より好ましくは血糖値抑制活性を消失させない糖鎖である。本発明のある態様において、好ましい糖鎖は、ＧＬＰ−１に付加された場合（糖鎖付加アミノ酸の形でＧＬＰ−１のアミノ酸と置換された場合）に、ＧＬＰ−１の血糖値抑制活性を増大させる糖鎖である。
本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドにおける糖鎖は特に限定されず、生体内で複合糖質（糖ペプチド（又は糖タンパク質）、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であってもよいし、生体内では複合糖質として存在しない糖鎖であってもよい。
生体内で複合糖質として存在する糖鎖は、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドが生体に投与されるという観点から好ましい。かかる糖鎖としては、生体内で糖ペプチド（又は糖タンパク質）としてペプチド（又はタンパク質）に結合している糖鎖であるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖等が挙げられる。好ましくは、Ｎ−結合型糖鎖が用いられる。Ｎ結合型糖鎖としては、例えば、高マンノース（ハイマンノース）型、複合（コンプレックス）型、混成（ハイブリッド）型を挙げることができ、特に好ましくは、複合型が良い。
本発明で使用する好ましい複合型糖鎖としては、例えば、下記一般式
Figure 2009153960
 ［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
Figure 2009153960
 を示す。Ａｃはアセチル基を示す。］
で表される糖鎖等が挙げられる。
尚、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドにおいては、糖鎖が生体内で複合糖質として存在する糖鎖であっても、Ｏ−結合型及びＮ−結合型以外の方法でＧＬＰ−１ペプチドに結合していてもよい。例えば、上述のとおり、糖鎖がリンカーを介してＣｙｓやＬｙｓに結合しているものも、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドに含まれる。
本発明の好ましい一態様において、糖鎖は、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ〜Ｃ、ヘパリン、へパラン硫酸、ケラタン硫酸を含む、比較的低分子のグリコサミノグリカンである。これらの糖鎖は、アミノ糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）と、ウロン酸（グルクロン酸又はＬ−イズロン酸）とからなる二糖単位の繰り返しが直鎖状に連なっている。なお、本明細書において、比較的低分子のグリコサミノグリカンとは、例えば分子量が約１０ｋＤａ以下、好ましくは６ｋＤａ以下、さらに好ましくは約４ｋＤａ以下であること、あるいは、糖の数が約５０個以下、好ましくは３０個以下、さらに好ましくは２０個以下であることをいう。
本発明の一態様において、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドにおける糖鎖は、４個以上、例えば５個以上、７個以上、特に９個以上、１１個以上の糖からなる糖鎖であることが好ましい。
本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドにおける糖鎖は、５〜１１個、９〜１１個又は１１個の糖からなる糖鎖である。
本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドにおける糖鎖は、２本鎖の複合型糖鎖である。複合型糖鎖とは、２種類以上の単糖を含み、以下に示す基本構造と、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃで示されるラクトサミン構造を有することを特徴とする。
Figure 2009153960
 ２本鎖複合型糖鎖とは、基本構造の末端の２つのマンノースに、それぞれ０〜３糖からなる１本鎖の糖鎖が結合しているものをいう。２本鎖複合型糖鎖としては、例えば、以下に示すジシアロ糖鎖、
Figure 2009153960
 モノシアロ糖鎖、
Figure 2009153960
 アシアロ糖鎖、
Figure 2009153960
 ジグルクナック糖鎖、
Figure 2009153960
 ジマンノース糖鎖、
Figure 2009153960
 等が好ましく、より好ましくはジシアロ糖鎖である。
また、本明細書中において「ジシアロ糖鎖」、「モノシアロ糖鎖」、「アシアロ糖鎖」、「ジグルクナック糖鎖」、「ジマンノース糖鎖」には、上記化学式で示したもののほか、化学式で示した例と結合様式の異なるものも含まれ、かかる糖鎖も本発明の糖鎖として好ましく用いられる。かかる糖鎖としては、例えば、ジシアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖においてシアル酸とガラクトースが（α２→３）結合で結合しているもの等が挙げられる。
また、本発明で用いられる高マンノース型糖鎖は、上述した複合型糖鎖の基本構造に、さらにマンノースが２個以上結合している糖鎖である。高マンノース型糖鎖は嵩高いので、ペプチドに高マンノース型糖鎖を結合させることにより血中安定性がより高くなりうる。哺乳類の高マンノース型糖鎖のように、５〜９個のマンノースを含む糖鎖が好ましいが、酵母の高マンノース型糖鎖のように、より多くのマンノースを含む糖鎖であってもよい。本発明に好ましく用いられる高マンノース型糖鎖としては、例えば、
ハイマンノース−５（Ｍ−５）
Figure 2009153960
 ハイマンノース−９（Ｍ−９）
Figure 2009153960
 等を挙げることができる。
本発明において、好ましい糖鎖としては、例えば、ヒト体内において、タンパク質と結合した糖タンパク質として存在する糖鎖（例えば、「ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．３，Ｆｅｂ．１９７５」に記載の糖鎖）と、同一の構造を有する糖鎖（構成糖の種類及びそれらの結合様式が同一の糖鎖）又はこれの非還元末端から１又は複数の糖を失った糖鎖である、下記表１〜４に記載の糖鎖を挙げることができる。
Figure 2009153960
Figure 2009153960
Figure 2009153960
Figure 2009153960
また、本発明の一態様において、好ましい糖鎖は、直鎖構造を有する糖鎖である。かかる糖鎖としては、例えば、オリゴヒアルロン酸が挙げられる。本明細書において、オリゴヒアルロン酸とは、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸が交互に２〜３２糖、好ましくは２〜１６糖、より好ましくは４〜８糖、直鎖上に結合した糖鎖をいう。
本発明に用いられるオリゴヒアルロン酸のうち、特に好ましいものとして、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸とからなる単位を１単位とした場合、２単位（４糖）以上８単位（１６糖）以下の糖鎖が挙げられ、さらに好ましくは、２単位（４糖）〜４単位（８糖）、最も好ましくは２単位（４糖）である。
本発明に好ましく用いられるヒアルロン酸としては、例えば、
４糖のオリゴヒアルロン酸、
Figure 2009153960
 ８糖のオリゴヒアルロン酸
Figure 2009153960
 等が挙げられる。
本発明の好ましい一態様において、本発明の糖ペプチドにおける糖鎖の構造は、均一である。本明細書中において、糖ペプチドにおける糖鎖の構造が均一であるとは、糖ペプチド間で比較した場合に、ペプチド中の糖鎖付加部位、糖鎖を構成する各糖の種類、結合順序、及び糖間の結合様式が同一であることをいい、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の糖鎖の構造が均一であることを言う。糖鎖が均一である糖ペプチドは、品質が一定であり、特に医薬品の製造や、アッセイなどの分野において好ましい。均一な糖鎖の割合は、例えば、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、ＮＭＲ、質量分析等を用いた方法によって測定することが可能である。
本発明において、好ましい糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、例えば、後述の実施例１〜１５において製造した糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（配列番号５４〜６６）である。すなわち、以下のＧＬＰ−１の配列：
Ｈｉｓ７−Ａｌａ８−Ｇｌｕ９−Ｇｌｙ１０−Ｔｈｒ１１−Ｐｈｅ１２−Ｔｈｒ１３−Ｓｅｒ１４−Ａｓｐ１５−Ｖａｌ１６−Ｓｅｒ１７−Ｓｅｒ１８−Ｔｙｒ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｕ２１−Ｇｌｙ２２−Ｇｌｎ２３−Ａｌａ２４−Ａｌａ２５−Ｌｙｓ２６−Ｇｌｕ２７−Ｐｈｅ２８−Ｉｌｅ２９−Ａｌａ３０−Ｔｒｐ３１−Ｌｅｕ３２−Ｖａｌ３３−Ｌｙｓ３４−Ｇｌｙ３５−Ａｒｇ３６−Ｇｌｙ３７（配列番号２）において：
（ｂ１）２６位のＬｙｓ及び３４位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１）（配列番号５４）；
（ｂ２）１８位のＳｅｒ及び３６位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例２）（配列番号５５）；
（ｂ３）２２位のＧｌｙ及び３０位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例３）（配列番号５６）；
（ｂ４）２２位のＧｌｙ及び３６位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例４）（配列番号５７）；
（ｂ５）３０位のＡｌａ及び３６位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例５）（配列番号５８）；
（ｂ６）３０位のＡｌａがオリゴヒアルロン酸４糖（ＨＡ−４）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例６）（配列番号５９）；
（ｂ７）３０位のＡｌａがオリゴヒアルロン酸８糖（ＨＡ−８）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例７）（配列番号６０）；
（ｂ８）３６位のＡｒｇがオリゴヒアルロン酸４糖（ＨＡ−４）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例８）（配列番号６１）；
（ｂ９）３６位のＡｒｇがオリゴヒアルロン酸８糖（ＨＡ−８）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例９）（配列番号６２）；
（ｂ１０）３０位のＡｌａがオリゴヒアルロン酸１６糖（ＨＡ−１６）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１０）（配列番号６３）；
（ｂ１１）３６位のＡｒｇがオリゴヒアルロン酸１６糖（ＨＡ−１６）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１１）（配列番号６４）；
（ｂ１２）３６位のＡｒｇが高マンノース型糖鎖（Ｍ５）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１２）（配列番号６５）；
（ｂ１３）２６位のＬｙｓに、リンカーを介してアシアロ糖鎖付加Ａｓｎが結合した糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１３）（配列番号６６）である。
また、
（ｂ１４）以下のエキセンジン−４の配列：
Ｈ−Ｈｉｓ１−Ｇｌｙ２−Ｇｌｕ３−Ｇｌｙ４−Ｔｈｒ５−Ｐｈｅ６−Ｔｈｒ７−Ｓｅｒ８−Ａｓｐ９−Ｌｅｕ１０−Ｓｅｒ１１−Ｌｙｓ１２−Ｇｌｎ１３−Ｍｅｔ１４−Ｇｌｕ１５−Ｇｌｕ１６−Ｇｌｕ１７−Ａｌａ１８−Ｖａｌ１９−Ａｒｇ２０−Ｌｅｕ２１−Ｐｈｅ２２−Ｉｌｅ２３−Ｇｌｕ２４−Ｔｒｐ２５−Ｌｅｕ２６−Ｌｙｓ２７−Ａｓｎ２８−Ｇｌｙ２９−Ｇｌｙ３０−Ｐｒｏ３１−Ｓｅｒ３２−Ｓｅｒ３３−Ｇｌｙ３４−Ａｌａ３５−Ｐｒｏ３６−Ｐｒｏ３７−Ｐｒｏ３８−Ｓｅｒ３９−ＮＨ２（配列番号５０）において：
３０位のＧｌｙがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１４）（配列番号６７）である。
さらに、
（ｂ１５）以下のＢＩＭ５１０７７の配列：
Ｈｉｓ７−Ｒ２８−Ｇｌｕ９−Ｇｌｙ１０−Ｔｈｒ１１−Ｐｈｅ１２−Ｔｈｒ１３−Ｓｅｒ１４−Ａｓｐ１５−Ｖａｌ１６−Ｓｅｒ１７−Ｓｅｒ１８−Ｔｙｒ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｕ２１−Ｇｌｙ２２−Ｇｌｎ２３−Ａｌａ２４−Ａｌａ２５−Ｌｙｓ２６−Ｇｌｕ２７−Ｐｈｅ２８−Ｉｌｅ２９−Ａｌａ３０−Ｔｒｐ３１−Ｌｅｕ３２−Ｖａｌ３３−Ｌｙｓ３４−Ｒ２３５−Ａｒｇ３６−ＮＨ２［式中、Ｒ２はα−メチルアラニンを示す。］（配列番号５２）において：
２６位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１５）（配列番号６８）である。
また、
（ｂ１６）上記エキセンジン‐４の配列（配列番号５０）において、３０位のＧｌｙが高マンノース型糖鎖（Ｍ５）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１６）である。
本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、当業者に公知のペプチド合成方法に、糖鎖付加工程を組み込むことで製造することができる。糖鎖付加に際しては、トランスグルタミナーゼに代表される、酵素の逆反応を利用する方法も用いることができるが、この場合、付加する糖鎖が大量に必要になる、最終工程後の精製が煩雑になる、糖鎖の付加位置及び付加可能な糖鎖が制限される、等の問題があるため、アッセイ用等の少量の合成には用いることが可能でも、医薬品製造等の大規模な製造には実用的な方法とは言えないことがある。
本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの簡便な製造方法であって、かつ、糖鎖の構造が均一である糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの安定した製造方法の具体例として、以下、糖鎖付加アミノ酸として糖鎖付加Ａｓｎを使用し、固相合成、液相合成等の公知のペプチド合成方法を適用することにより糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを製造する方法（Ａ法）、及びＧＬＰ−１の任意のアミノ酸をＣｙｓで置換したペプチドを公知のペプチド合成方法に従って製造し、その後、Ｃｙｓに化学合成により糖鎖を付加し、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを製造する方法（Ｂ法）を例示する。さらに、糖鎖付加アミノ酸において糖鎖とアミノ酸がリンカーを介して結合しており、且つ、当該リンカーが糖鎖側末端にアミノ酸を含む糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの製造例として、まず糖鎖付加Ａｓｎにリンカーの一端を結合した後、リンカーの他端にＮ−ヒドロキシコハク酸イミジル基を結合させ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミジル基をＧＬＰ−１ペプチドのＬｙｓ残基の側鎖アミノ基と反応させて、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを製造する方法（Ｃ法）を示す。これらの製造方法を参考に、当業者であれば様々な糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを製造することが可能であり、得られる糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド及びその製造方法は、特に医薬品製造の分野において、非常に有用である。また、これらのＡ法〜Ｃ法は、２つ以上を組み合わせて行うことも可能である。アッセイなどに用いる少量の合成であれば、さらに、上記の方法に、転移酵素による糖鎖伸長反応を組み合わせることも可能である。なお、Ａ法は、国際公開第ＷＯ２００４／００５３３０号パンフレット（ＵＳ２００５２２２３８２（Ａ１））に、Ｂ法は、国際公開第ＷＯ２００５／０１００５３号パンフレット（ＵＳ２００７０６０５４３（Ａ１））に、それぞれ記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。また、Ａ法乃至Ｃ法において用いられる糖鎖構造が均一な糖鎖の製造に関しては、第ＷＯ０３／００８４３１号パンフレット（ＵＳ２００４１８１０５４（Ａ１））、第ＷＯ２００４／０５８９８４号パンフレット（ＵＳ２００６２２８７８４（Ａ１））、第ＷＯ２００４／０５８８２４号パンフレット（ＵＳ２００６００９４２１（Ａ１））、第ＷＯ２００４／０７００４６号パンフレット（ＵＳ２００６２０５０３９（Ａ１））、第ＷＯ２００７／０１１０５５号パンフレット等に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを製造する方法（Ａ法）
先ず、（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応させる。この場合アミノ酸のアミノ基窒素を脂溶性保護基で保護しているので、アミノ酸同士の自己縮合は防止され、レジンの水酸基とアミノ酸のカルボキシル基が反応してエステル化が起こる。
次に（２）上記で得られたエステルの脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、（３）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
（４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（５）上記（３）及び（４）の工程を１回以上繰り返すことにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有するペプチドが得られる。
（６）次に、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギン（糖鎖付加アスパラギン）のアスパラギン部分のカルボキシル基と上記遊離アミノ基をアミド化反応させ、
（７）更に上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（８）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
（９）上記（７）及び（８）の工程を１回以上繰り返し、
（１０）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させることにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有し、中間に糖鎖アスパラギンを有する糖ペプチドが得られる。
（１１）そして、酸で樹脂（レジン）を切断することにより、糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することができる。
また、この糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の端部に導入することもできる。
水酸基を有する樹脂（レジン）としては、通常、固相合成で使用する水酸基を有する樹脂（レジン）であればよく、例えば、Ａｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）Ｗａｎｇレジン（メルク社製）、ＨＭＰＡ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）等を用いることができる。
アミノ酸としては全てのアミノ酸を用いることができ、例えば、天然アミノ酸である、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）を挙げることができる。
脂溶性保護基としては、例えば９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等の、カーボネート系又はアミド系の保護基等を挙げることができる。脂溶性保護基を導入するには、例えばＦｍｏｃ基を導入する場合には９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１〜５時間程度行うのが良い。
脂溶性保護基で保護したアミノ酸としては、上記のアミノ酸を上記の方法で製造することができる。また、市販のものも使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−ＡＩａ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏを挙げることができる。
エステル化触媒として、例えば１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、前者１重量部に対して、後者が、通常１〜１０重量部、好ましくは２〜５重量部である。
エステル化反応は、例えば、固相カラムにレジンを入れ、このレジンを溶剤で洗浄し、その後アミノ酸の溶液を加えることにより行うのが好ましい。洗浄用溶剤としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２−プロパノール、塩化メチレン等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。エステル化反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０分〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。
この時固相上の未反応の水酸基を無水酢酸等を用いてアセチル化してキャッピングすることも好ましい。
脂溶性保護基の脱離は、例えば塩基で処理することにより行うことができる。塩基としては、例えばピペリジン、モルホリン等を挙げることができる。その際、溶媒の存在下行うのが好ましい。溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール等を挙げることができる。
遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とのアミド化反応は、活性化剤及び溶媒の存在下行うのが好ましい。
活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウム（ＤＩＰＣＩ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ−ＯＨ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロジ−４−オキサ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ）等を挙げることができる。
活性化剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１〜２０当量、好ましくは１〜１０当量、さらに好ましくは、１〜５当量とするのが好ましい。
溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。脂溶性保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。
樹脂（レジン）からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。酸としては、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、弗化水素（ＨＦ）等を挙げることができる。
上記（６）の、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とペプチドの遊離アミノ基をアミド化反応させ、（７）の、上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程を、適宜追加することにより、少なくとも２以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することができる。またこの時、異なる糖鎖アスパラギンを用いることにより２種以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することもできる。
また上記（６）の、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とアミド化反応させ、（７）の、上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程を、最終工程、即ち工程（９）及び（１０）に代えて行うことにより、少なくとも１以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖に有する糖ペプチドを製造することができる。
また、上記工程（１）を行う際、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸に代えて、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基を、レジンの水酸基とエステル化反応させることにより、Ｃ末端に糖鎖アスパラギンを有する糖ペプチドを製造することができる。このとき、工程（６）をさらに行ってもよく、行わなくてもよい。
このようにして、所望の位置を糖鎖付加Ａｓｎで置換した糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを得ることができる。
糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを製造する方法（Ｂ法）
先ず、Ｃｙｓを含むペプチドを、固相合成法、液相合成法、細胞による合成、天然に存在するものを分離抽出する方法等により製造する。Ｃｙｓの位置を変えることにより、所望の位置に糖鎖を付加することができる。
次に、ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体を上記で得たＣｙｓを含むペプチドと反応させることにより製造する。上記反応は、通常０〜８０℃、好ましくは、１０〜６０℃、更に好ましくは１５〜３５℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常３０分〜５時間程度である。反応終了後は、適宜、公知の方法（例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））で精製するのが良い。
ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体は、例えば、複合型アスパラギン結合型糖鎖の１位の炭素に結合している水酸基を、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ａ−ＣＨ２Ｘ（Ｘはハロゲン原子、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）で置換した化合物である。
具体的には、ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体とＣｙｓ含有ペプチドとをリン酸緩衝液中、室温で反応させる。反応終了後、ＨＰＬＣで精製することにより糖鎖付加Ｃｙｓで置換した糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを得ることができる。
糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを製造する方法（Ｃ法）
先ず、Ｌｙｓを含むペプチドを、固相合成法、液相合成法、細胞による合成、天然に存在するものを分離抽出する方法等により製造する。
次に、糖鎖付加アミノ酸に、グルタル酸を結合させる。例えば、糖鎖付加アミノ酸をＤＭＳＯ溶液に溶解させ、この溶液に、グルタル酸−ＥＤＣ混合のＤＭＳＯ溶液を加え、室温で１日撹拌する。反応混合物を適宜希釈した後、分子量排除ゲルクロマトグラフィー等で分画することにより、α−アミノ基にグルタル酸を結合させた糖鎖付加アミノ酸を得ることができる。
次いで、グルタル酸結合糖鎖付加アミノ酸のＤＭＳＯ溶液に、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドのＤＭＳＯ溶液およびＥＤＣのＤＭＳＯ溶液を加え、室温で６時間撹拌した後、ＥＤＣを不活化することにより、グルタル酸結合糖鎖付加アミノ酸のＮ−ヒドロキシコハク酸イミジルエステルを合成することができる。
続いて、ＧＬＰ−１ペプチドのＤＭＳＯ溶液に、ＤＩＰＥＡ及びグルタル酸結合糖鎖付加アミノ酸のＮ−ヒドロキシコハク酸イミジルエステルを加え、室温で２時間撹拌した後、グリシン水溶液を加えて反応を停止し、適宜精製することにより、ＧＬＰ−１ペプチドのＬｙｓ残基にグルタル酸リンカーを介して糖鎖付加アミノ酸を結合させることができる。こうして、糖鎖付加アミノ酸において糖鎖とアミノ酸（Ｌｙｓ）がリンカーを介して結合し、該リンカーが糖鎖側の末端にアミノ酸（Ａｓｎ）を含む糖鎖付加ＧＬＰ−１が得られる。
ＧＬＰ−１ペプチドの所望の部位のアミノ酸をＬｙｓに置換したり、ＧＬＰ−１ペプチドの野生型に含まれるＬｙｓ残基を他のアミノ酸で置換したりすることにより、所望の部位に糖鎖付加アミノ酸を結合させた糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを得ることが可能である。また、Ｃ法によれば、野生型ＧＬＰ−１に含まれるＬｙｓに糖鎖付加する場合、ペプチド骨格が野生型と同一の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを得ることができる。
本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、ＧＬＰ−１活性を有する。
本明細書中において、「ＧＬＰ−１活性」とは、ＧＬＰ−１について公知の生理活性の一部又は全部をいう。ＧＬＰ−１は、血糖値抑制作用のほか、例えば、膵島作用として、ｃＡＭＰ合成誘導に伴うインスリン分泌、膵島保護（アポトーシス抑制）、膵島増殖、膵外作用として、食欲抑制、消化管運動抑制、カルシトニン分泌促進、虚血時の心保護作用等を有することが知られる。従って、ＧＬＰ−１活性とは、これらの作用に関連する生理活性の全部又は一部を指し、それぞれ、当業者に公知の手法を用いて測定することができる。
例えば、ＧＬＰ−１活性のうち、血糖値抑制活性は、糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂマウス）における血糖値低下作用の測定や、経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ： Ｏｒａｌ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ Ｔｅｓｔ）における血糖値上昇抑制作用の測定などを用いて測定することができる。なお、本明細書中において、「血糖値抑制」とは、血糖値の上昇を抑制すること及び血糖値を低下させることのいずれの概念も含む。特に、本明細書中において、ｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖値抑制作用を「血糖値低下作用」、ＯＧＴＴにおける血糖値抑制作用を「血糖値上昇抑制作用」ということがある。
ＯＧＴＴによる血糖値抑制活性は、マウスに強制的に糖を飲ませた際の血糖値上昇の抑制の測定によって判断することができる。例えば、後述の試験例２の手法を用いた場合、まず、被験化合物を一晩絶食させたマウスに投与し、その３０分後にグルコース溶液を経口投与する。グルコース投与によりマウス血糖値は上昇し、投与後約３０分後に最大となり徐々に減少する。グルコース投与後３０分の血糖値を測定し、ＧＬＰ−１投与の場合の血糖値と比較することで、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの血糖値抑制作用を測定することができる。この３０分後の血糖値をＧＬＰ−１を投与した場合と比較した場合、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、好ましくは８０％以下、より好ましくは６０％以下、さらに好ましくは４０％以下、特に好ましくは３０％以下の血糖値を示す。また、ＯＧＴＴにおいて同程度の血糖値上昇抑制作用が確認された際の投与量を比較することで、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの血糖値抑制活性の強さを判断することができる。例えば、ＧＬＰ−１を１０投与した場合と、ある糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを１投与した場合で同じ血糖値抑制作用が得られる場合、該糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの血糖値抑制活性は、ＧＬＰ−１の１０倍である。本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、ＧＬＰ−１と比較して、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上もしくはそれ以上の血糖値抑制活性を有する。
なお、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドが、ＧＬＰ−１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドに糖鎖付加したものである場合や、ＧＬＰ−１類縁体に糖鎖付加したものである場合、ＧＬＰ−１活性を比較する対象として、ＧＬＰ−１類縁体や、その糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドと糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸配列が同一であるＧＬＰ−１ペプチドを用いてもよい。
ｄｂ／ｄｂマウスを用いた血糖値抑制活性は、糖尿病マウスに被験化合物を投与後の血糖値の測定によって判断することができる。例えば、被験化合物投与後の血糖値を経時で測定し、例えば投与後１２０分の血糖値が投与時より低下していれば、血糖値低下作用を確認することができる。また、例えば投与後３００分の血糖値を測定することで、血糖値低下作用の持続性も判断することができる。例えば、投与後１２０分の血糖値をＧＬＰ−１投与の場合と比較した場合、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、好ましくは８０％以下、より好ましくは７０％以下、特に好ましくは６０％以下、の血糖値を示す。また、投与後１２０分の血糖値を、投与時の血糖値と比較した場合、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、好ましくは７０％以下、より好ましくは６０％以下、特に好ましくは５０％以下（例えば４５％以下）の血糖値を示す。投与後３００分の血糖値をＧＬＰ−１投与の場合と比較した場合、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、好ましくは７０％以下、より好ましくは５０％以下の血糖値を示す。また、投与後３００分の血糖値を、投与時の血糖値と比較した場合、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、好ましくは７０％以下、より好ましくは５０％以下の血糖値を示す。
なお、血糖値抑制活性がＧＬＰ−１と比較して低い場合あっても、血中安定性が増大することで、この活性の低さを補償することができる。
例えば、ＧＬＰ−１活性のうち、インスリン分泌活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｃＡＭＰ合成能試験などを用いて測定することができる。ＧＬＰ−１はＧＬＰ−１受容体と結合することにより細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させ、インシュリン分泌を促進させる。従って、例えば、マウスＧＬＰ−１受容体発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞を糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドで刺激し、細胞内で合成されるｃＡＭＰ量を測定し、ＥＣ５０値をＧＬＰ−１と比較することで、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドのインスリン分泌活性を測定することができる。
本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、ＧＬＰ−１よりも増大した血中安定性を有する。血中安定性は当業者に公知の手法を用いて測定することができ、例えば、血漿中における安定性や、ＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）に対する耐性を測定し、半減期、ＡＵＣ（薬物血中濃度−時間曲線下面積）等を指標に判断することができる。また、腎クリアランスの増大も血中安定性の増大に寄与する。
本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、ＧＬＰ−１と比較して、血漿中における安定性が増大している。
ＤＰＰ−ＩＶに対する耐性は、例えば後述の試験例１のように、ＤＰＰ−ＩＶ溶液中における半減期の測定により判断することができる。本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、ＧＬＰ−１と比較して、ＤＰＰ−ＩＶに対する耐性が増大しており、例えば後述の試験例１の手法を用いてＤＰＰ−ＩＶに対する耐性を測定した場合、その半減期は、ＧＬＰ−１と比較して１．２倍以上、（例えば２倍以上）、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上、特に好ましくは２０倍以上（例えば１００倍以上）増大している。
また、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、好ましくは少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも３、５、７、１０、１５、２０時間及びさらに好ましくは少なくとも２４時間の血中半減期を有する。
次に、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物について説明する。
本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、ＧＬＰ−１に関連する疾患の治療又は予防に有効である。上述の通り、ＧＬＰ−１には種々の作用が知られており、これらの作用に関連する疾患も様々である。例えば、ＧＬＰ−１が、インスリン放出を刺激することにより、細胞によるグルコース取り込み及び血糖値の低下を引き起こすことが見出されている。また、胃及び／又は腸運動性を抑制すること、胃及び／又は腸内容排出を抑制すること並びに食物摂取を抑制することも見出されている。従って、ＧＬＰ−１に関連する疾患には、例えば、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、インスリン依存性糖尿病、脳卒中（Ｅｆｅｎｄｉｃによる国際公開公報第ＷＯ００／１６７９７号パンフレットを参照）、心筋梗塞（Ｅｆｅｎｄｉｃによる国際公開公報第ＷＯ９８／０８５３１号パンフレットを参照）、肥満（Ｅｆｅｎｄｉｃによる国際公開公報第ＷＯ９８／１９６９８号パンフレットを参照）、機能性消化不良、過敏性腸症候群（Ｅｆｅｎｄｉｃによる国際公開公報第ＷＯ９９／６４０６０号パンフレットを参照）、膵島移植が含まれる。本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、特に糖尿病の治療又は予防に有効であり、より特定すれば、１型糖尿病の予防、２型糖尿病の治療に有効である。
上記医薬組成物は、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を用いて、通常の医薬組成物の形態に製剤したものである。
このような医薬組成物としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤等が挙げられる。
医薬組成物中に含有される本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの量は、特に限定されず広い範囲内から適宜選択することができるが、通常、医薬組成物中に本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを１〜７０重量％含有させるのが好ましい。
本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、さらに他の有効成分を含有することもできるし、他の有効成分を含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。また、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、さらに異なる１以上の本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを有効成分として含有することもできるし、異なる１以上の本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。
本発明に係る医薬組成物の投与方法としては特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、疾患の状態、その他の条件に応じた方法で投与される。錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤の場合の投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。また、注射剤の場合には、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して、静脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内に投与することができる。坐剤の場合には、直腸内に投与される。
上記医薬組成物の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、通常、体重１ｋｇに対して本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドが０．１〜９００ｎｍｏｌ、好ましくは１〜９０ｎｍｏｌとなる投与量である。本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドはＧＬＰ−１に比べ、血中安定性が非常に高く、また、一態様において、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドはＧＬＰ−１に比べ、血糖値抑制活性が非常に高いため、投与量を減らすことができるという利点がある。
上記医薬組成物の投与回数は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、例えば、３回／１日、２回／１日、１回／１日、さらにはその血中安定性に応じて、より頻度の少ない投与回数（例えば、１回／週、１回／月など）も選択しうる。好ましくは、上記医薬組成物の投与回数は、１回以下／１日である。本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドはＧＬＰ−１に比べ、血中安定性が非常に高いため、投与回数を減らすことができるという利点がある。
本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドに付加された糖鎖は、体内の代謝系で容易に分解される。また、本発明の一態様において、該糖鎖は生体内で糖ペプチド（又は糖タンパク質）として結合して存在する構造を有する。従って、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド及び該ペプチドを有効成分として含む医薬組成物は、生体内に投与しても副作用や抗原性を示すことがなく、アレルギー反応や、抗体産生により薬効が得られなくなる心配が少ないなどの利点を有する。
さらに、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは安定して簡便に大量に供給することが可能であり、品質の安定した、高品質の医薬品の提供という観点からも、非常に有用である。
本発明はまた、本発明の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの有効量を投与することを特徴とする、ＧＬＰ−１に関連する疾患の治療又は予防方法も提供する。
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、 例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが何らこれらに限定されるものではない。
実施例１ ２６位，３４位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂上にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基のペプチドを得た（配列番号６９）。
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ−１の２６位及び３４位のＬｙｓがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。
以下に示すブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）１０．５ｍｇと上記で合成したペプチド鎖２．１ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、２１０μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。
Figure 2009153960
ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ−１の２６及び３４位のＬｙｓが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（２６，３４Ｃｙｓ ＧＬＰ−１−ｄｉｓｉａｌｏ）を０．１ｍｇ得た。
実施例２ １８位，３６位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ−１の合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号７０）。
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ−１の１８位のＳｅｒ及び３６位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）１０．５ｍｇと上記で合成したペプチド鎖２．１ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、２１０μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ−１の１８位のＳｅｒ及び３６位のＡｒｇが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（１８，３６Ｃｙｓ ＧＬＰ−１−ｄｉｓｉａｌｏ）を０．８ｍｇ得た。
実施例３ ２２位，３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ−１の合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号７１）。
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ−１の２２位のＧｌｙ及び３０位のＡｌａがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）７．９ｍｇと上記で合成したペプチド鎖１．３ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、２００μｌに溶かし、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ−１の２２位のＧｌｙ及び３０位のＡｌａが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（２２，３０Ｃｙｓ ＧＬＰ−１−ｄｉｓｉａｌｏ）を１．０ｍｇ得た。
実施例４ ２２位，３６位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ−１の合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号７２）。
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ−１の２２位のＧｌｙ及び３６位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）１１．９ｍｇと上記で合成したペプチド鎖２．０ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、４００μｌに溶かし、３７℃で１時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ−１の２２位のＧｌｙ及び３６位のＡｒｇが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（２２，３６Ｃｙｓ ＧＬＰ−１−ｄｉｓｉａｌｏ）を２．９ｍｇ得た。
実施例５ ３０位，３６位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加ＧＬＰ−１の合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号７３）。
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ−１の３０位のＡｌａ及び３６位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたペプチドが得られた。
ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）１１．４ｍｇと上記で合成したペプチド鎖２．１ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、４００μｌに溶かし、３７℃で１時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ−１の３０位のＡｌａ及び３６位のＡｒｇが糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（３０，３６Ｃｙｓ ＧＬＰ−１−ｄｉｓｉａｌｏ）を１．６ｍｇ得た。
実施例６ ３０位Ｃｙｓ−ヒアルロン酸４糖（ＨＡ−４）付加ＧＬＰ−１ペプチドの合成法
合成例１にて得られたヒアルロン酸４糖（以下、実施例において、オリゴヒアルロン酸を単に「ヒアルロン酸」と呼ぶこともある。）１２．７ｍｇに水２５．４μｌ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）４８３μｌを加えて溶かした。この溶液に炭酸水素アンモニウム２００ｍｇを加え３７℃で３０時間処理した後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品に炭酸水素ナトリウム２２．４ｍｇ、水３００μｌを加え、予め１７μｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた無水ブロモ酢酸（アルドリッチ社製）３４．９ｍｇを加え、氷冷しながら１時間反応させた。１時間後、反応系を室温に戻しさらに１時間反応させた後、ゲルろ過にて精製を行い、以下に示すブロモアセチル化ヒアルロン酸４糖（Ｉ）１１．５ｍｇを得た。
Figure 2009153960
得られたブロモアセチル化ヒアルロン酸４糖（Ｉ）２．４ｍｇと合成例２で合成したＧＬＰ−１の３０位のＡｌａがＣｙｓで置換されたペプチド（配列番号７６）１．３ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１３０μｌに溶かし、３７℃で１．５時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、３０位のＡｌａがヒアルロン酸４糖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（３０Ｃｙｓ ＧＬＰ−１−ＨＡ−４）１．０ｍｇを得た。
実施例７ ３０位Ｃｙｓ−ヒアルロン酸８糖（ＨＡ−８）付加 ＧＬＰ−１ペプチドの合
成法
合成例１にて得られたヒアルロン酸８糖８．７ｍｇに水１７．４μｌ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）３１４μｌを加えて溶かした。この溶液に炭酸水素アンモニウム１００ｍｇを加え３７℃で４５時間処理した後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品に炭酸水素ナトリウム７．６ｍｇ、水１８０μｌを加え、予め７μｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた無水ブロモ酢酸（アルドリッチ社製）１３．８ｍｇを加え、氷冷しながら１時間反応させた。１時間後、反応系を室温に戻しさらに１時間反応させた後、ゲルろ過にて精製を行い、以下に示すブロモアセチル化ヒアルロン酸８糖（ＩＩ）７．３ｍｇを得た。
Figure 2009153960
得られたブロモアセチル化ヒアルロン酸８糖（ＩＩ）２．９ｍｇと合成例２で合成したＧＬＰ−１の３０位のＡｌａがＣｙｓで置換されたペプチド（配列番号７６）１．５ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１５０μｌに溶かし、３７℃で１．５時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、３０位のＡｌａがヒアルロン酸８糖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（３０Ｃｙｓ ＧＬＰ−１−ＨＡ−８）０．５ｍｇを得た。
実施例８ ３６位Ｃｙｓ−ヒアルロン酸４糖（ＨＡ−４）付加 ＧＬＰ−１ペプチドの合成法
合成例１にて得られたヒアルロン酸４糖１２．７ｍｇに水２５．４μｌ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）４８３μｌを加えて溶かした。この溶液に炭酸水素アンモニウム２００ｍｇを加え３７℃で３０時間処理した後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品に炭酸水素ナトリウム２２．４ｍｇ、水３００μｌを加え、予め１７μｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた無水ブロモ酢酸（アルドリッチ社製）３４．９ｍｇを加え、氷冷しながら１時間反応させた。１時間後、反応系を室温に戻しさらに１時間反応させた後、ゲルろ過にて精製を行いブロモアセチル化ヒアルロン酸４糖（Ｉ）１１．５ｍｇを得た。
得られたブロモアセチル化ヒアルロン酸４糖（Ｉ）１．１ｍｇと合成例３で合成したＧＬＰ−１の３６位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたＧＬＰ−１ペプチド（配列番号７８）１．５ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１３０μｌに溶かし、３７℃で１．５時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、３６位のＡｒｇがヒアルロン酸４糖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（３６Ｃｙｓ ＧＬＰ−１−ＨＡ−４）０．９ｍｇを得た。
実施例９ ３６位Ｃｙｓ−ヒアルロン酸８糖（ＨＡ−８）付加ＧＬＰ−１ペプチドの合成法
合成例１にて得られたヒアルロン酸８糖８．７ｍｇに水１７．４μｌ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）３１４μｌを加えて溶かした。この溶液に炭酸水素アンモニウム１００ｍｇを加え３７℃で４５時間処理した後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品に炭酸水素ナトリウム７．６ｍｇ、水１８０μｌを加え、予め７μｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた無水ブロモ酢酸（アルドリッチ社製）１３．８ｍｇを加え、氷冷しながら１時間反応させた。１時間後、反応系を室温に戻しさらに１時間反応させた後、ゲルろ過にて精製を行いブロモアセチル化ヒアルロン酸８糖（ＩＩ）７．３ｍｇを得た。
得られたブロモアセチル化ヒアルロン酸８糖（ＩＩ）２．４ｍｇと合成例３で合成したＧＬＰ−１の３６位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたＧＬＰ−１ペプチド（配列番号７８）１．５ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１３０μｌに溶かし、３７℃で２時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、３６位のＡｒｇがヒアルロン酸８糖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（３６Ｃｙｓ ＧＬＰ−１−ＨＡ−８）０．５ｍｇを得た。
実施例１０ ３０位Ｃｙｓ−ヒアルロン酸１６糖（ＨＡ−１６）付加ＧＬＰ−１ペプチドの合成法
合成例１にて得られたヒアルロン酸１６糖１１．６ｍｇに水３５μｌ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）６８０μｌを加えて溶かした。この溶液に炭酸水素アンモニウム２６０ｍｇを加え３７℃で７５時間処理した後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品に炭酸水素ナトリウム５．５ｍｇ、水２３０μｌを加え、予め５．１μｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた無水ブロモ酢酸（アルドリッチ社製）１０．２ｍｇを加え、氷冷しながら１時間反応させた。１時間後、反応系を室温に戻しさらに１時間反応させた後、ゲルろ過にて精製を行い、以下に示すブロモアセチル化ヒアルロン酸１６糖（ＩＩＩ）８．７ｍｇを得た。
Figure 2009153960
 ブロモアセチル化ヒアルロン酸（ＩＩＩ）１６糖３．１ｍｇと合成例２で合成したペプチド鎖（配列番号７６）１．０ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１９０μｌに溶かし、１０ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩水溶液１０μｌを加え、３７℃で８時間反応させた。ＨＰＬＣで原料の減少が見られなくなったため、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ−１の３０位のＡｌａがヒアルロン酸１６糖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（３０Ｃｙｓ ＧＬＰ−１−ＨＡ−１６）を０．４ｍｇ得た。
実施例１１ ３６位Ｃｙｓ−ヒアルロン酸１６糖（ＨＡ−１６）付加ＧＬＰ−１ペプチドの合成法
実施例１０にて調製したブロモアセチル化ヒアルロン酸１６糖（ＩＩＩ）４．９ｍｇと合成例３で合成した３６位ＣｙｓＧＬＰ−１ペプチド鎖（配列番号７８）１．２ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１９０μｌに溶かし、１０ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩水溶液３６μｌを加え、３７℃で４時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ−１の３６位のＡｒｇがヒアルロン酸１６糖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（３６Ｃｙｓ ＧＬＰ−１−ＨＡ−１６）を０．３ｍｇ得た。
実施例１２ ３６位Ｃｙｓ高マンノース型糖鎖（Ｍ５）付加ＧＬＰ−１ペプチドの合成法
大豆パウダー１００ｇを、５００ｍｌのアセトンで２回、５００ｍｌのメタノールで２回洗浄し脱脂大豆パウダー６１．４ｇを得た。
得られた脱脂大豆パウダー４３．０ｇに水４３０ｍｌ、液化酵素Ｔ（ＨＢＩ社製）４．３ｇを加え、撹拌しながら７０℃で１９時間反応させた。反応液を遠心分離（１００００Ｇ、１０分）して上清と沈殿物に分け、上清８００ｍｌを得た。さらに沈殿物に水４３０ｍｌ、液化酵素Ｔ４．３ｇを加えて再度７０℃で１９時間反応させ、反応液を遠心分離（１００００Ｇ、１０分）して上清と沈殿物に分け、上清６００ｍｌを得た。得られた上清を合わせ（計１４００ｍｌ）、５００ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０を１００ｍｌ、オリエンターゼＯＮＳ（ＨＢＩ社製）３．０ｇを加え、撹拌しながら５０℃で１９時間反応を行った。反応後の液をろ過して不溶物を除き、ロータリーエバポレーターにて液量が４００ｍｌになるまで濃縮した。得られた液を分画分子量１Ｋの限外ろ過膜（Ｍｉｎｉｍａｔｅ ＴＦＦ Ｃａｐｓｕｌｅ １Ｋ ｍｅｍｂｒａｎｅ ポール社製）を用いて限外ろ過を行った。
６時間の処理の後、膜を透過しなかった液２３０ｍｌを回収した。回収した液に１Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０を２０ｍｌ、アジ化ナトリウム２５０ｍｇ、アクチナーゼＥ（科研製薬社製）４２３．５ｍｇを加え３７℃で８２時間反応させた。反応液をろ過して不溶物を除いた後、ロータリーエバポレーターにて液量が１００ｍｌになるまで濃縮した。濃縮液を半分ずつ２回にわけてＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５（φ２５ｍｍ×１００ｍｍ）カラムにて分画し、糖鎖含有画分のみを集めて濃縮し２．２２ｇを得た。
得られた糖鎖含有画分に蒸留水２１．０ｍｌ、エタノール１４．９ｍｌを加えて溶かし、炭酸水素ナトリウム１．１３ｇ、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ ２．０２ｇを加え室温で１６時間反応させた。反応後アセトン２５０ｍｌを加え沈殿物をメンブレンフィルター（φ４７ｍｍ、保持粒子経０．５μｍ アドバンテック東洋社製）でろ過した。膜上に残った不溶物を蒸留水に溶かして回収し、ロータリーエバポレーターにて液量が１０ｍｌ以下になるまで濃縮した。濃縮液をＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５（φ２５ｍｍ×１００ｍｍ）カラムにて分画し、糖鎖含有画分を集めて濃縮し１．３７ｇを得た。
これをさらに蒸留水４ｍｌに溶かしてＯＤＳカラム（ワコーゲル１００Ｃ１８、φ２５ｍｍ×１５０ｍｍ）にて分画し、糖鎖含有画分のみを集めて濃縮し、粗精製糖鎖４８．６ｍｇを得た。粗精製糖鎖をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ−ＰａｃｋＯＤＳ−ＡＭ φ２０×２５０ｍｍ、溶離液：アセトニトリル／２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液＝８２／１８、流速：８．０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、ハイマンノース型Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖鎖（Ｍ５糖鎖）１３．０ｍｇを得た。
得られたＭ５糖鎖１１．０ｍｇに水１６５μｌを加えて溶かした。この溶液に炭酸水素アンモニウム２００ｍｇを加え室温で４１時間処理した後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品に炭酸水素ナトリウム１２．５ｍｇ、水１１０μｌを加え、予め１０μｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた無水ブロモ酢酸（アルドリッチ社製）１９．９ｍｇを加え、氷冷しながら１時間反応させた。１時間後、反応系を室温に戻しさらに１時間反応させた後、ゲルろ過にて精製を行い、以下に示すブロモアセチル化Ｍ５糖鎖（ｂ）７．９ｍｇを得た。
Figure 2009153960
 得られたブロモアセチル化Ｍ５糖鎖（ｂ）４．１ｍｇと合成例３で合成した３６位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたＧＬＰ−１ペプチド（配列番号７８）１．２ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、１９０μｌに溶かし、１００ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩水溶液２４μｌを加え、３７℃で１０時間反応させた。反応後、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ−１の３６位のＡｒｇが高マンノース型Ｍ５糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（３６Ｃｙｓ ＧＬＰ−１−Ｍ５）を０．３ｍｇ得た。
実施例１３ ２６位Ｌｙｓ−アシアロ糖鎖Ａｓｎリンカー修飾Ａｒｇ３４ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチドの合成法
（１）アスパラギン結合アシアロ糖鎖グルタル酸の合成
１０ｍＬのナス型フラスコにて、アスパラギン結合アシアロ糖鎖（５０．６ｍｇ、２８．７μｍｏｌ）をＤＭＳＯ−水（４：１、ｖ／ｖ、１．５ｍＬ）に溶解させた。この溶液に０．５２Ｍのグルタル酸−ＥＤＣ混合（１：１、ｍｏｌ／ｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液（１００μＬ、５１．７μｍｏｌ）を加え、室温にて１日間撹拌した。反応混合物を蒸留水（１．５ｍＬ）で希釈した後、分子量排除ゲルクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、φ１．５×４５ｃｍ、蒸留水）で３回繰り返し分画した。凍結乾燥後、以下に示すアスパラギン結合アシアロ糖鎖グルタル酸（ｃ）（５１．４ｍｇ）を得た。（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ Ｍａｓｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ ［Ｍ＋Ｎａ］＋ １８９１．６６，ｆｏｕｎｄ １８９１．７８）
Figure 2009153960
 （２）アスパラギン結合アシアロ糖鎖グルタル酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミジルエステルの合成
１．５ｍＬのエッペンドルフチューブにて、アスパラギン結合アシアロ糖鎖グルタル酸（ｃ）（１７．２ｍｇ、９．２μｍｏｌ）のＤＭＳＯ（２００μＬ）溶液に、０．４４ＭのＮ−ヒドロキシコハク酸イミドのＤＭＳＯ溶液（２５μＬ、１１．０μｍｏｌ）および０．３７ＭのＥＤＣのＤＭＳＯ溶液（７５μＬ、２７．６μｍｏｌ）を加えた。室温にて６時間撹拌した後、ＤＴＴ（５．７ｍｇ、３６．８μｍｏｌ）を加え、ＥＤＣを不活性化した（Ｇｒａｂａｒｅｋ，Ｚ．，Ｇｅｒｇｅｌｙ，Ｊ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０，１８５，１３１−１３５）。そのまま、以下に示すアスパラギン結合アシアロ糖鎖グルタル酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミジルエステル（ｄ）を含むこの混合液を糖リンカー試薬（０．０３Ｍ溶液）としてペプチドとの縮合に用いた。
Figure 2009153960
 （３）２６位Ｌｙｓ−アシアロ糖鎖Ａｓｎリンカー修飾Ａｒｇ３４ＧＬＰ−１（７−３７）の合成
１．５ｍＬのエッペンドルフチューブにて、合成例４で合成したＬｙｓ２６Ａｒｇ３４ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号８０）（２．８ｍｇ、０．８３μｍｏｌ）のＤＭＳＯ（３００μＬ）溶液に、ＤＩＰＥＡ（４．８μＬ、２７．６μｍｏｌ）および上記にて調製した０．０３Ｍの糖リンカー試薬（１５０μＬ、４．５μｍｏｌ）を加えた。室温にて２時間撹拌した後、グリシン（２ｍｇ、２６．６μｍｏｌ）の水溶液（２００μＬ）を加え反応を停止し、そのままＨＰＬＣ［カラム：Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−ＣＮ、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ １．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液１０→４０％（０−８ｍｉｎ）４０→５０％（８−２０ｍｉｎ）ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて保持時間１５．５ｍｉｎのピークの画分を集め、凍結乾燥後、以下に示す２６位Ｌｙｓ−アシアロ糖鎖Ａｓｎリンカー修飾Ａｒｇ３４ＧＬＰ−１（７−３７）（０．７ｍｇ）を得た。（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ Ｍａｓｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ ［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋ ５２３６．３５，ｆｏｕｎｄ ５２３６．１）
Figure 2009153960
実施例１４ ３０位−Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加エキセンジン−４の合成法
合成例５にて合成したＥｘ−４の３０位のＧｌｙがＣｙｓで置換された３９残基のペプチド１２．０ｍｇとブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（大塚化学株式会社製）３６ｍｇを１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４、５ｍＭトリスカルボキシエチルホスフィン １ｍＬ中、３７℃で１時間反応させた。そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ８ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→５０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、Ｅｘ−４の３０位のＧｌｙがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加Ｅｘ−４ペプチド（３０Ｃｙｓ Ｅｘ−４−ｄｉｓｉａｌｏ）を１０．６ｍｇ得た。（Ｍ：Ｃ２７１Ｈ４２２Ｎ５８Ｏ１２３Ｓ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ Ｍａｓｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ ［Ｍ＋Ｈ］＋ ６４９３．６３，ｆｏｕｎｄ ６４９４．３３）
実施例１５ ２６位−Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加ＢＩＭ５１０７７の合成法
合成例６にて合成したＢＩＭ５１０７７の２６位のＬｙｓがＣｙｓで置換された３０残基のペプチド（２．４ｍｇ，０．７２μｍｏｌ）およびグアニジン（２１６ｍｇ）を蒸留水（２４０μＬ）に溶解し、順次ＴＣＥＰ水溶液（１００ｍＭ、１００μＬ）、ブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（ａ）（１０ｍｇ／ｍＬ，１００μＬ，４．２６μｍｏｌ）ならびに 、５００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４，１００μＬ）を加えた。３７℃で２時間反応させた。そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＢＩＭ５１０７７の２６位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＢＩＭ５１０７７ペプチド（２６Ｃｙｓ ＢＩＭ５１０７７−ｄｉｓｉａｌｏ）を１．９ ｍｇ得た。（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ Ｍａｓｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ ［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋ ５５７８．７２，ｆｏｕｎｄ ５５７８．７４）
実施例１６ ３０位−Ｃｙｓ−Ｍ５糖鎖付加エキセンジン−４の合成法
合成例５にて合成したＥｘ−４の３０位のＧｌｙがＣｙｓで置換された３９残基のペプチド１．２ｍｇと実施例１２で合成したブロモアセチル化したＭ５糖鎖（ｂ）３．９ｍｇを３５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４、１ｍＭトリスカルボキシエチルホスフィン ０．１７ｍＬ中、３７℃で３時間反応させた。そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→５０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、Ｅｘ−４の３０位のＧｌｙが高マンノース型Ｍ５糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加Ｅｘ−４ペプチド（３０Ｃｙｓ Ｅｘ−４−Ｍ５）を０．５ｍｇ得た。（ Ｍ：Ｃ２３３Ｈ３６２Ｎ５４Ｏ９７Ｓ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ Ｍａｓｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ ［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋ ５５０４．７４，ｆｏｕｎｄ ５５０６．８５）
以下の表５は、実施例１〜１６で得られた糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドのＭＳスペクトルデータ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ｍａｓｓ）である。
Figure 2009153960
比較例１
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎ（１００μｍｏｌ）を入れ、ＤＣＭ、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）とＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮＭＰ（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５ＭＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に，固相合成用カラムに加え、続いて０．９ＭＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号７４）。
ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、３１残基のペプチド５μｍｏｌ相当の樹脂をエッペンチューブに移した。
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ ｃｏｌｕｍｎ Ｃ１８ １００×１０ｍｍ 展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液 Ｂ：０．１％ＴＦＡ アセトニトリル：水＝９０：１０ グラジエントＡ：Ｂ＝９５：５→５：９５ １５分 流速３．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し、ＧＬＰ−１を得た。
合成例１ オリゴヒアルロン酸糖鎖の合成
ヒアルロン酸（資生堂社製、平均分子量１２０万）５００ｍｇにｐＨ４の酢酸緩衝液１００ｍｌを加え溶けるまでよく撹拌した。ヒアルロニダーゼ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、Ｂｏｖｉｎｅ Ｔｅｓｔｅｓ由来）を２．５ｋＵ加え、３７℃で２日間反応させた。この溶液を濃縮後、再度４５ｍｌの酢酸緩衝液（ｐＨ４）に溶かし、ヒアルロニダーゼ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、Ｂｏｖｉｎｅ Ｔｅｓｔｅｓ由来）を４．５ｋＵ加え、３７℃でさらに２日間反応させた。反応液を分子量分画３ｋＤａ、１ｋＤａ限外ろ過膜（ミリポア社製）を用いて分画し、凍結乾燥して分子量１〜３ｋＤａのヒアルロン酸画分２６８．４ｍｇを得た。
得られた分子量１〜３ｋＤａヒアルロン酸画分には複数種類のオリゴヒアルロン酸が含まれているため、これを分離するためにＨＰＬＣにて分取を行った。分子量１〜３ｋＤａのオリゴヒアルロン酸画分を少量の水に溶解させＨＰＬＣ［カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−９０ ２０Ｆ ９μｍ，φ２０．０ｘ３００ｍｍ、移動相：１８０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ａｑ］にて数回に分けて精製し、溶出ピークごとに分画した。得られた画分をゲルろ過にて脱塩し、凍結乾燥してオリゴヒアルロン酸（４糖〜１８糖）を得た。以下に各オリゴヒアルロン酸の収量を示す。
オリゴヒアルロン酸４糖２２．５ｍｇ（ｔＲ＝１０．０ｍｉｎ）
オリゴヒアルロン酸６糖５１．１ｍｇ（ｔＲ＝１１．８ｍｉｎ）
オリゴヒアルロン酸８糖５２．７ｍｇ（ｔＲ＝１４．０ｍｉｎ）
オリゴヒアルロン酸１０糖２７．０ｍｇ（ｔＲ＝１７．０ｍｉｎ）
オリゴヒアルロン酸１２糖９．６ｍｇ（ｔＲ＝２１．４ｍｉｎ）
オリゴヒアルロン酸１４糖７．８ｍｇ（ｔＲ＝２７．６ｍｉｎ）
オリゴヒアルロン酸１６糖４．１ｍｇ（ｔＲ＝３６．０ｍｉｎ）
オリゴヒアルロン酸１８糖２．０ｍｇ（ｔＲ＝４７．４ｍｉｎ）
合成例２ ＧＬＰ−１の３０位がＣｙｓで置換されたペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号７５）。
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ−１の３０位のＡｌａがＣｙｓで置換された３１残基ペプチドが得られた（配列番号７６）。
合成例３ ＧＬＰ−１の３６位がＣｙｓで置換されたペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号７７）。
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ−１の３６位のＡｒｇがＣｙｓで置換された３１残基ペプチドが得られた（配列番号７８）。
合成例４ ＧＬＰ−１の３４位がＡｒｇで置換されたペプチドの合成法
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号７９）。
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＧＬＰ−１の３４位のＬｙｓがＡｒｇで置換された３１残基ペプチドが得られた（配列番号８０）。
合成例５ エキセンジン−４の３０位がＣｙｓで置換されたペプチドの合成法
固相合成用カラムにＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｏ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）をＤＭＦで洗浄後、ペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を０．４５Ｍ ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｏｍｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、
固相樹脂にＳｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）
の３９残基ペプチドを得た（配列番号８１）。
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、Ｅｘ−４の３０位のＧｌｙがＣｙｓで置換された３９残基のペプチドが得られた。（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ Ｍａｓｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ ［Ｍ＋Ｈ］＋ ４２３０．６０，ｆｏｕｎｄ ４２３１．２７）（配列番号８２）
合成例６ ＢＩＭ５１０７７の２６位がＣｙｓで置換されたペプチドの合成法
固相合成用カラムにＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｏ−ＰＥＧＡ ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）をＤＭＦで洗浄後、ペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を０．４５Ｍ ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ Ａｃｉｄ（Ａｉｂ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂上にＡｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｉｂ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｉｂ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３０残基ペプチドを得た（配列番号８３）。
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ ８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％ ２０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＢＩＭ５１０７７の２６位のＬｙｓがＣｙｓで置換された３０残基のペプチド１２ｍｇが得られた。（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ Ｍａｓｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ ［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋ ３３１５．６９，ｆｏｕｎｄ ３３１４．７２）（配列番号８４）
以上の各実施例において製造された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、以下のＧＬＰ−１の配列：
Ｈｉｓ７−Ａｌａ８−Ｇｌｕ９−Ｇｌｙ１０−Ｔｈｒ１１−Ｐｈｅ１２−Ｔｈｒ１３−Ｓｅｒ１４−Ａｓｐ１５−Ｖａｌ１６−Ｓｅｒ１７−Ｓｅｒ１８−Ｔｙｒ１９−Ｌｅｕ２０−Ｇｌｕ２１−Ｇｌｙ２２−Ｇｌｎ２３−Ａｌａ２４−Ａｌａ２５−Ｌｙｓ２６−Ｇｌｕ２７−Ｐｈｅ２８−Ｉｌｅ２９−Ａｌａ３０−Ｔｒｐ３１−Ｌｅｕ３２−Ｖａｌ３３−Ｌｙｓ３４−Ｇｌｙ３５−Ａｒｇ３６−Ｇｌｙ３７（配列番号２）において：
（ｂ１）２６位のＬｙｓ及び３４位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１）（配列番号５４）；
（ｂ２）１８位のＳｅｒ及び３６位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例２）（配列番号５５）；
（ｂ３）２２位のＧｌｙ及び３０位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例３）（配列番号５６）；
（ｂ４）２２位のＧｌｙ及び３６位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例４）（配列番号５７）；
（ｂ５）３０位のＡｌａ及び３６位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例５）（配列番号５８）；
（ｂ６）３０位のＡｌａがヒアルロン酸４糖（ＨＡ−４）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例６）（配列番号５９）；
（ｂ７）３０位のＡｌａがヒアルロン酸８糖（ＨＡ−８）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例７）（配列番号６０）；
（ｂ８）３６位のＡｒｇがヒアルロン酸４糖（ＨＡ−４）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例８）（配列番号６１）；
（ｂ９）３６位のＡｒｇがヒアルロン酸８糖（ＨＡ−８）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例９）（配列番号６２）；
（ｂ１０）３０位のＡｌａがヒアルロン酸１６糖（ＨＡ−１６）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１０）（配列番号６３）；
（ｂ１１）３６位のＡｒｇがヒアルロン酸１６糖（ＨＡ−１６）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１１）（配列番号６４）；
（ｂ１２）３６位のＡｒｇが高マンノース型糖鎖（Ｍ５）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１２）（配列番号６５）；
（ｂ１３）２６位のＬｙｓに、リンカーを介してアシアロ糖鎖付加Ａｓｎが結合した糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１３）（配列番号６６）；である。
また、
（ｂ１４）以下のエキセンジン−４の配列：
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＮＨ２（配列番号５０）において：
３０位のＧｌｙがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１４）（配列番号６７）である。
さらに
（ｂ１５）以下のＢＩＭ５１０７７の配列：
Ｈｉｓ−Ｒ２−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｒ２−Ａｒｇ−ＮＨ２［式中、Ｒ２はα−メチルアラニンを示す。］（配列番号５２）において：
２６位のがＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１５）（配列番号６８）である。
また、
（ｂ１６）上記エキセンジン‐４の配列（配列番号５０）において、３０位のＧｌｙが高マンノース型糖鎖（Ｍ５）付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド（実施例１６）である。
実施例１〜１５のいくつかの例について以下の試験例１及び／又は２を行った。
試験例１（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）に対する耐性試験）
０．５ｍｌのエッペンチューブ中に実施例で製造した糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド又は比較例１で製造したＧＬＰ−１を１７．７ｎｍｏｌとＤＰＰ−ＩＶ（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ＰｅｐｔｉｄａｓｅＩＶ ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ、ＳＩＧＭＡ社製）２．２ｍＵとを加え、それぞれ１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液全量で１００μＬになるように調製し、３７℃で反応させた。反応液１０μＬを、あらかじめ別のエッペンチューブに用意した１０％トリフルオロ酢酸１５μＬと混和させ、ＨＰＬＣに２０μＬインジェクションし、原料の消失をモニターした（ＨＰＬＣ条件：カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯＣＡＰＣＥＬＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液、展開溶媒Ｂ：０．０９％ＴＦＡアセトニトリル／水＝９０／１０、グラジェントＡ／Ｂ＝６５／３０→３０／６０ ２０分 流速０．７ｍｌ／分）。ＤＰＰ−ＩＶに対する耐性の指標となる半減期（ｔ１／２）を、糖鎖が付加していない比較例１のＧＬＰ−１の半減期（ｔ１／２）を基準（＝１）として、各実施例の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドについて評価した値の代表的なものを表６に示す。
Figure 2009153960
各実施例の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドは、比較例１のＧＬＰ−１の２．１倍〜１２８倍のＤＰＰ−ＩＶ耐性を示した。
試験例２ 経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ： Ｏｒａｌ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ Ｔｅｓｔ）
実施例で製造した糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド又は比較例１で製造したＧＬＰ−１のＰＢＳ溶液を、一晩絶食させたＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウス（１０週齢、雄）に１０ｍｌ／ｋｇの投与量で腹腔内に投与した。３０分後にグルコース溶液を１ｍｇ／ｇの投与量で経口投与した。グルコース投与前、グルコース投与３０分後、６０分後、１２０分後に眼窩採血を行い、アキュチェックアビバ（ロッシュダイアグノスティックス社）を用いて血糖値を測定した。代表的な結果を図１〜４に示す。以下の図中、例えば、ＧＬＰ−１の２６位と３４位のアミノ酸がジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである「２６，３４Ｃｙｓ ＧＬＰ−１−ｄｉｓｉａｌｏ」を必要に応じて「Ｃ２６，Ｃ３４」と記載することがある。他の糖鎖及びアミノ酸部位に関しても同様である。
次に１８，３６Ｃｙｓ ＧＬＰ−１−ｄｉｓｉａｌｏについて投与量を１／１０（０．９ｎｍｏｌ／ｋｇ）とし、ＧＬＰ−１について投与量を９ｎｍｏｌ／ｋｇとして、ＯＧＴＴを行い、比較した。結果を図５に示す。
投与量０．９ｎｍｏｌ／ｋｇの１８，３６Ｃｙｓ ＧＬＰ−１−ｄｉｓｉａｌｏの血糖値上昇抑制作用は投与量９ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ−１とほぼ同等であった。１８，３６Ｃｙｓ ＧＬＰ−１−ｄｉｓｉａｌｏの血糖値上昇抑制作用はＧＬＰ−１に比べ１０倍程度増大していた。
配列表フリーテキスト
配列番号１は、一般式（１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２は、ＧＬＰ−１（７−３７）である。
配列番号３は、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２である。
配列番号４は、（ａ１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号５は、（ａ２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号６は、（ａ３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号７は、（ａ４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号８は、（ａ５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号９は、（ａ６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１０は、（ａ７）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１１は、（ａ８）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１２は、（ａ９）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１３は、（ａ１０）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１４は、（ａ１１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１５は、（ａ１２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１６は、（ａ１３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１７は、（ａ１４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１８は、（ａ１５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号１９は、（ａ１６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２０は、（ａ１７）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２１は、（ａ１８）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２２は、（ａ１９）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２３は、（ａ２０）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２４は、（ａ２１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２５は、（ａ２２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２６は、（ａ２３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２７は、（ａ２４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２８は、（ａ２５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号２９は、（ａ２６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号３０は、（ａ２７）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号３１は、（ａ２８）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号３２は、（ａ２９）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号３３は、（ａ３０）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号３４は、（ａ３１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号３５は、（ａ３２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号３６は、（ａ３３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号３７は、（ａ３４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号３８は、（ａ３５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号３９は、（ａ３６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号４０は、（ａ３７）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号４１は、（ａ３８）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号４２は、（ａ３９）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号４３は、（ａ４０）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号４４は、（ａ４１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号４５は、（ａ４２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号４６は、（ａ４３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号４７は、（ａ４４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号４８は、（ａ４５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号４９は、（ａ４６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号５０は、エキセンジン−４である。
配列番号５１は、一般式（２）で表わされる糖鎖付加エキセンジン−４である。
配列番号５２は、ＢＩＭ５１０７７である。
配列番号５３は、一般式（３）で表わされる糖鎖付加ＢＩＭ５１０７７である。
配列番号５４は、（ｂ１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号５５は、（ｂ２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号５６は、（ｂ３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号５７は、（ｂ４）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号５８は、（ｂ５）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号５９は、（ｂ６）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号６０は、（ｂ７）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号６１は、（ｂ８）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号６２は、（ｂ９）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号６３は、（ｂ１０）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号６４は、（ｂ１１）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号６５は、（ｂ１２）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号６６は、（ｂ１３）で表される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号６７は、（ｂ１４）で表わされる糖鎖付加エキセンジン−４である。
配列番号６８は、（ｂ１５）で表わされる糖鎖付加ＢＩＭ５１０７７である。
配列番号６９は、実施例１において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号７０は、実施例２において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号７１は、実施例３において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号７２は、実施例４において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号７３は、実施例５において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号７４は、比較例１において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号７５は、合成例２において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号７６は、合成例２において合成された３１残基ペプチドである。
配列番号７７は、合成例３において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号７８は、合成例３において合成された３１残基ペプチドである。
配列番号７９は、合成例４において合成された保護基を有する３１残基ペプチドである。
配列番号８０は、合成例４において合成された３１残基ペプチドである。
配列番号８１は、合成例５において合成された保護基を有する３９残基ペプチドである。
配列番号８２は、合成例５において合成された３９残基ペプチドである。
配列番号８３は、合成例６において合成された保護基を有する３０残基ペプチドである。
配列番号８４は、合成例６において合成された３０残基ペプチドである。
本発明は、ＧＬＰ−１と比べて、血中安定性が増大し、好ましくは、血糖値抑制活性の増大した、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを提供する。本発明は、特に医薬品の分野において有用である。

Claims (40)

  1. （ａ） ＧＬＰ−１；
    （ｂ） ＧＬＰ−１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；又は、
    （ｃ） ＧＬＰ−１の類縁体；
    において、少なくとも２個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、ＧＬＰ−１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  2. （ａ） ＧＬＰ−１；又は、
    （ｂ） ＧＬＰ−１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；
    において、少なくとも２個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、ＧＬＰ−１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  3. （ａ） ＧＬＰ−１；又は、
    （ｂ） ＧＬＰ−１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドであって、ＧＬＰ−１活性を有するペプチド；
    において、少なくとも２個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする、ＧＬＰ−１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎ及び／又は糖鎖付加Ｃｙｓである、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合していることを特徴とする、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも４個以上の糖からなる糖鎖である、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも２本鎖複合型糖鎖である、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  8. 請求項７に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも独立に、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖及びジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖である、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  9. 請求項１〜８に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも独立に、
    Figure 2009153960
     ［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
    Figure 2009153960
     を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
    で表される糖鎖である、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記糖鎖が実質的に均一である、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  11. （ａ） ＧＬＰ−１において、２以上のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、少なくとも１つの置換部位が、１８、２０、２２、２６、３０、３４又は３６位である糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド；又は、
    （ｂ）（ａ）で定義される糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド；
    であって、ＧＬＰ−１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  12. 請求項１１に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎ及び／又は糖鎖付加Ｃｙｓである、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  13. 請求項１１又は１２のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合していることを特徴とする、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  14. 請求項１１〜１３に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも４個以上の糖からなる糖鎖である、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  15. 請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも２本鎖複合型糖鎖である、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  16. 請求項１５に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも独立に、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖及びジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖である、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  17. 請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記糖鎖がいずれも独立に、
    Figure 2009153960
     ［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
    Figure 2009153960
     を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
    で表される糖鎖である、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  18. 請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記糖鎖が９９％以上均一である、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  19. 請求項１１に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、
    前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎであり、
    前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合しており、
    前記糖鎖が４個以上の糖からなる糖鎖であり、
    前記糖鎖がいずれも独立に、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖及びジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖である、
    前記糖鎖が実質的に均一である、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  20. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、ＧＬＰ−１と比較して増大した血中安定性を有する、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  21. 請求項１〜２０のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、ＧＬＰ−１と比較して１０倍以上のＯＧＴＴ（Ｏｒａｌ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ Ｔｅｓｔ）における血糖値抑制活性を有する、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  22. 請求項１〜２０のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、ＧＬＰ−１と比較して３０倍以上のＤＰＰ−ＩＶ耐性を有する、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  23. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
  24. 請求項２３に記載の医薬組成物であってＧＬＰ−１に関連する疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
  25. 請求項２４に記載の医薬組成物であってＧＬＰ−１に関連する疾患が糖尿病である医薬組成物。
  26. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの有効量を投与することを特徴とする、ＧＬＰ−１に関連する疾患の治療又は予防方法。
  27. （ａ） ＧＬＰ−１；
    （ｂ） ＧＬＰ−１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；又は、
    （ｃ） ＧＬＰ−１の類縁体；
    において、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたＧＬＰ−１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、
    前記糖鎖がオリゴヒアルロン酸である糖鎖である糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  28. （ａ） ＧＬＰ−１；又は、
    （ｂ） ＧＬＰ−１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；
    において、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたＧＬＰ−１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、
    前記糖鎖がオリゴヒアルロン酸である糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  29. 請求項２７又は２８に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記オリゴヒアルロン酸が、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸とからなる単位を１単位として２単位（４糖）以上、８単位（１６糖）以下の糖鎖である糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  30. 請求項２７又は２８に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記オリゴヒアルロン酸が、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸とからなる単位を１単位として２単位（４糖）の糖鎖である糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  31. 請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ｃｙｓである、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  32. （ａ） ＧＬＰ−１；
    （ｂ） ＧＬＰ−１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；又は、
    （ｃ） ＧＬＰ−１の類縁体；
    において、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたＧＬＰ−１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、
    前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸がリンカーを介して結合している、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  33. （ａ） ＧＬＰ−１；又は、
    （ｂ） ＧＬＰ−１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；
    において、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたＧＬＰ−１活性を有する糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、
    前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸がリンカーを介して結合している、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  34. 請求項３２又は３３に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記リンカーと結合しているアミノ酸が、Ｌｙｓである、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  35. 請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記リンカーが、前記糖鎖側の末端にアミノ酸を含む糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  36. 請求項３５に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、
    前記リンカーに含まれるアミノ酸がＡｓｎである、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  37. 請求項２７〜３６のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記糖鎖が実質的に均一である、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド。
  38. 請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
  39. 請求項３８に記載の医薬組成物であって、前記糖鎖が９０％以上均一である医薬組成物。
  40. 請求項３８または３９に記載の医薬組成物であって、ＧＬＰ−１に関連する疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
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