KR20120070692A

KR20120070692A - 융합 단백질 및 이를 포함하는 바이오센서

Info

Publication number: KR20120070692A
Application number: KR1020100132115A
Authority: KR
Inventors: 고성호; 김아람; 이성훈
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2010-12-22
Publication date: 2012-07-02
Also published as: KR101300187B1

Abstract

본 발명은 융합 단백질, 이를 포함하는 바이오센서, 바이오센서의 제조방법 및 바이오센서를 이용한 면역분석법에 관한 것으로, 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질 및 골드결합 단백질이 링커에 의해 연결된 융합 단백질을 제공한다. 본 발명에 따른 융합 단백질은 항체를 적절한 배향성을 가진 채 간단히 골드-함유 고체상에 고정 시킬 수 있을 뿐 아니라, 링커에 의해 유연성이 증가되어 항체와의 결합 빈도를 높여 줌으로써 고가의 항체 손실을 최소화시킬 수 있어 바이오센서의 대량생산을 유도할 수 있는 효과가 있다.

Description

융합 단백질 및 이를 포함하는 바이오센서{Fusion proteins and bio-sensor comprising the same}

본 발명은 융합 단백질, 이를 포함하는 바이오센서, 바이오센서의 제작방법 및 바이오센서를 이용한 면역분석법에 관한 것이다.

항체를 기본으로 하는 면역분석법은 목표 항원에 대한 높은 선택성과 친화성 때문에 바이오물질들을 분석하는데 매우 중요한 기술 중의 하나이다(Fung et al., Curr. Opin. Biotechnol. 12:65, 2001). 이러한 면역분석법 분야에서, 골드 콜로이드 입자, 나노-골드 입자, 골드-코팅 입자, 혹은 골드가 도포된 기판과 같은 골드-함유 고체상(solid phase)에 항체를 효과적으로 고정화시키는 것은 바이오센서에 필수적으로 요구된다.

일반적으로, 항체나 다른 단백질들은 생물학적 활성을 유지한 채 골드에 쉽게 흡착되지 않는다. 항체를 골드에 물리적으로 흡착시키는 현재의 대부분의 방법은 실험 중 용액상태에서 떨어져 나갈 수 있어 지속적인 실험 결과를 얻지 못하는 문제가 있다.

또한, 항체가 골드 표면에 임의로 흡착될 수 있어 항원과 결합하는 활성화 부위가 항원이 있는 용액의 방향으로 향하는 적절한 배향성(orientation)을 유지하지 못 할 수 있고 항체의 변성 역시 야기시 킬 수 있다.

이러한 결과는, 항체-골드 반응을 응용하는 분야에서 민감성(sensitivity)과 재현성(reproducibility)을 떨어뜨려 이 방법의 유용성을 감소시키는 문제를 야기하였다. 이와 같은 이유로 좀 더 견고한 공유결합으로 골드 칩 위에 항체를 고정화하는 여러 방법이 시도되었다. 단백질-단백질, DNA-RNA, 탄수화물-단백질 상호작용에 관한 기술은 친화성 태그(Ni-NTA, Streptavidin, GST 등) 또는 골드 칩 표면에 화학적인 방법, 예를 들면 아민(amine), 리간드 티올(ligand thiol), 알데히드(aldehyde)를 수식화하거나, 기능기가 부착된 리간드로 자기조립 단일층(self-assembly monolayers)을 형성하여 목적 단백질을 고정화하는 방법들이 연구되어 왔다(Goodrich et al., J. Am. Chem. Soc., 126:4086, 2004).

그러나, 이 방법들 또한 항체의 적절한 배향성(orientation)을 부여하지는 못하여 생물학적 활성을 소실케 함과 동시에, 복잡하고 시간이 오래 걸릴 뿐만 아니라 알칸티올(Alkanethiol) 단일층이 시스테인(cysteine)을 가진 단백질을 포함한 황(sulfur)을 가진 혼합물을 처리했을 때 황-골드 결합 자체가 불안정하게 될 수 있는 화학적 처리 방법을 사용하고 있었다.

따라서, 항체의 Fc 부위에 특이적으로 결합하는 단백질 A 혹은 단백질 G의 성질을 이용하여 항체의 배향성을 증가시키고자 하는 시도가 있어왔으나, 여전히 단백질 A 또는 단백질 G를 골드에 결합시킬 때 복잡하고 시간이 많이 걸리는 화학적 방법을 사용하고 있는 문제가 있었다.

이러한 문제를 해결하기 위하여 간단하고 경제적으로 골드-함유 고체상에 항원 결합 부위인 항체의 Fab 부위가 분석용액 방향으로 향하는 적절한 배향성을 유지하도록 하는 골드-함유 고체상과 항체를 연결하는 연결자가 요구된다. 이에, 본 발명자들은 골드결합 단백질 및 단백질 A 또는 단백질 G의 융합 재조합 단백질을 개발하여 국내등록특허를 받은바 있다(국내등록특허 제10-0965480호).

그러나, 여전히 상기 재조합 단백질을 연결자로 이용한 골드-함유 고체상을 포함하는 바이오센서 칩 제작 시 연결자와 사용된 항체의 결합 빈도를 높여 고가의 항체 손실을 최소화 할 필요가 있다.

이에, 본 발명자들은 항체를 골드-함유 고체상에 결합시키기 위한 연결자를 연구하던 중에, 펩티드 링커를 사용하여 골드결합 단백질 및 단백질 G를 연결한 융합 단백질이 골드-함유 고체상에 결합하는 능력이 우수할 뿐 아니라, 펩티드 링커의 유연성에 의해 항체와의 결합 빈도가 현저히 향상되었음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질 및 골드결합 단백질이 펩티드 링커에 의해 연결된 융합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질이 결합된 골드-함유 고체상을 포함하는 바이오센서를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질이 결합된 골드-함유 고체상을 포함하는 바이오센서의 제작방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 융합 단백질이 결합된 골드-함유 고체상을 포함하는 바이오센서를 이용한 면역분석법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질 및 골드결합 단백질이 펩티드 링커에 의해 연결된 융합 단백질을 제공한다.

본 발명의 융합 단백질은 바이오센서의 골드-함유 고체상과 항체를 연결시키는 연결자로서 역할을 한다. 본 발명의 "융합 단백질"은 단백질을 연결시킬 수 있는 펩티드 링커를 사용하여 기원이 다른 두 개 이상의 이종 단백질의 일부 또는 전부가 연결 또는 결합된 융합 단백질을 의미한다. 이와 같은 융합 단백질은 하나의 벡터 내에서 재조합 방법에 의해 링커가 포함된 형태로 제작되거나, 각기 서로 다른 벡터에서 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질 및 골드결합 단백질을 발현시킨 후, 효소나 화학적 방법에 의해 링커를 결합하여 제작될 수 있다. 본 발명의 목적상 바람직하게는 하나의 벡터에서 발현시킬 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 단백질 1-링커-단백질 2와 같이 표시할 수 있다. 예를 들면, 골드결합 단백질을 6개의 알라닌으로 이루어진 펩티드 링커를 통하여 단백질 G와 연결시킨 융합 단백질을 GBP-6Ala-protein G와 같이 나타낼 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 항체와의 특이적 결합 효율성을 향상시키기 위하여 펩티드 링커를 통해 골드결합 단백질 및 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질을 연결한 융합 단백질로서, 바람직하게는 도 1에 도시한 바와 같이, 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질(도 1의 protein A)의 N-말단 및 골드결합 단백질(GBP)의 C-말단에 펩티드 링커가 연결될 수 있다(도 1). 이와 같은 연결은 항체의 항원과 결합하는 활성화 부위가 항원이 있는 용액의 방향으로 향하도록 하는 적절한 배향성을 줄 수 있게 한다.

본 발명의 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질은 항체의 Fc 부위에 결합하는 활성을 가진 단백질로서, 이러한 활성을 가진 단백질, 펩티드는 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명의 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질은 바람직하게는 단백질 G 또는 단백질 A일 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 1의 단백질 G 또는 서열번호 2의 단백질 A일 수 있다.

단백질 G : 서열번호1

L K G E T T T E A V D A A T A E K V F K Q Y A N D N G V D G E W T Y D D A T K T F T V T E K P E V I D A S E L T P A V T T Y K L V I N G K T L K G E T T T E A V D A A T A E K V F K Q Y A N D N G V D G E W T Y D D A T K T F T V T E K P E V I D A S E L T P A V T T Y K L V I N G K T L K G E T T T K A V D A E T A E K A F K Q Y A N D N G V D G V W T Y D D A T K T F T V T E L E H H H H H H

단백질 A : 서열번호 2

A Q H D E A Q Q N A F Y Q V L N M P N L N A D Q R N G F I Q S L K D D P S Q S A N V L G E A Q K L N D S Q A P K A D A Q Q N N F N K D Q Q S A F Y E I L N M P N L N E A Q R N G F I Q S L K D D P S Q S T N V L G E A K K L N E S Q A P K A D N N F N K E Q Q N A F Y E I L N M P N L N E E Q R N G F I Q S L K D D P S Q S A N L L S E A K K L N E S Q A P K A D N K F N K E Q Q N A F Y E I L H L P N L N E E Q R N G F I Q S L K D D P S V S K E I L A E A K K L N D A Q A P K E E D N K K P G K E D G N K P G K E D G N K P G K E D N K K P G K E D G N K P G K E D N N K P G K E D G N K P G K E D N N K P G K E D G N K P G K E D G N K P G K E D G N G V H V V K P G D T V N D I A K A N G T T A D K I A A D N K L A D K N M I K P G Q E L V V D K K Q P A N H A D A N K A Q A L P E T G E E N P F I G T T V F G G L S L A L G A A L L A G R R R E L L E H H H H H H

단백질 G는 그룹 G 스트렙토코카이(streptococci)에서 분리된 박테리아 세포막 단백질(cell wall protein)로서, 포유동물 항체의 Fc 부위 및 Fab 부위와 결합하는 것으로 알려져 있다(J. Immuunol. Methods 1988, 112,113-120). 그러나, 단백질 G는 항체의 Fc 부위에 대한 결합력이 Fab 부위에 대한 결합력보다 약 10배 정도 높다고 알려져 있다.

단백질 A 는 스타필로코쿠스 오레우스(Staphylococcus aureus)에서 발견되는 세포 표면 단백질이다. 이는 포유동물 항체, 특히 IgG 클래스(class) 항체의 Fc 부위에 결합하는 성질을 가진다. 제공된 클래스의 항체 내에서, 종 기원 및 항체 서브클래스(subclass) 또는 알로타입(allotype)에 관하여, 상기 친화성은 조금씩 변한다(Surolia, A. 등, 1982 Protein A: Nature's universal, antibody, TIBS 7, 74-76; Langone 등, 1982, Protein A of staphylococcus aureus and related immunoglobulin receptors, Advances in Immunology 32:157-252). 단백질 A 는 단백질 A를 분비하는 S. aureus의 배양으로부터 직접 분리될 수 있거나, 더욱 편리하게는 E. coli내에서 재조합적으로 발현시킬 수 있다. 본 발명에 있어서, 단백질 A 및 단백질 G는 그 기원이 특별히 제한되지 아니하며, 항체의 Fc 부위와의 결합력을 보유하는 한 천연형의 단백질 A 및 단백질 G 에 아미노산이 결실, 부가, 치환 등이 일어난 단백질 A 및 단백질 G 유도체도 본 발명의 목적에 부합되게 사용될 수 있다.

본 발명의 펩티드 링커는 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질과 골드결합 단백질에 삽입되어 양 단백질을 연결함으로써 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질에 유연성을 부여하는 역할을 한다.

상기 펩티드 링커는 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질과 골드결합 단백질에 삽입되는 임의의 아미노산 서열을 가진 펩티드로서, 기능기를 갖지 않으며 크기가 작은 아미노산이 적합하며, 바람직하게는 알라닌, 글라이신 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커일 수 있다. 즉, 알라닌으로 이루어진 링커, 글라이신으로 이루어진 링커 또는 알라닌 및 글라이신으로 이루어진 링커일 수 있다. 상기와 같은 아미노산은 기능기가 없어서 비특이적 결합이 일어나지 않으며, 접힘(folding)에 있어서 문제점도 없다는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명의 펩티드 링커는 보다 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 링커일 수 있다.

또한, 본 발명의 펩티드 링커는 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질의 항체와의 결합능을 방해하지 않으며, 적절한 배향성을 유지할 수 있도록 하는 유연성을 줄 수 있는 개수까지의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 1개 내지 6개의 아미노산으로 이루어질 수 있고, 보다 바람직하게는 6개의 아미노산으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 실시예를 보면, 골드결합 단백질 및 단백질 G를 서열번호 4의 6개의 알라닌으로 이루어진 펩티드 링커를 통해 연결시킨 융합 단백질의 단백질 G와 hIgG와의 반응성(결합 빈도)이 링커로 연결되지 않은 골드결합 단백질 및 단백질 G의 융합 단백질에 비하여 약 20% 향상되었음을 알 수 있었다(실험예 2). 또한, 골드결합 단백질 및 단백질 G를 서열번호 5의 6개의 글라이신으로 이루어진 펩티드 링커를 통해 연결시킨 융합 단백질의 단백질 G와 hIgG와의 반응성(결합 빈도)이 링커로 연결되지 않은 골드결합 단백질 및 단백질 G의 융합 단백질에 비하여 약 9% 향상되었음을 알 수 있었다(실험예 2).

이러한 결과는 도 2에 도시된 분자동역학 시뮬레이션에 의한 GBP-Linker-protein G 융합 단백질의 3차원 구조에 나타난 바와 같이, 골드결합 단백질과 단백질 G를 펩티드 링커를 사용하여 연결시킨 경우에 삽입된 펩티드 링커에 의하여 단백질 G의 유연성이 증가함으로써 항체와의 반응성(결합 빈도)이 현저히 향상되었기 때문이다(도 2).

즉, 상기의 결과는 기존의 링커가 삽입되지 않은 융합 단백질에 비해 링커의 삽입으로 인해 항체와의 결합 빈도가 현저히 향상되는 것을 시사하는 것이며, 바이오센서에 적용시 고가인 항체의 손실을 최소화 할 수 있으며, 신호의 세기도 증폭될 수 있음을 시사하는 것이다.

본 발명의 골드결합 단백질(gold binding protein, GBP)은 골드-함유 고체상에 결합하는 활성을 가진 단백질로서, 본 발명의 융합 단백질의 분리를 편하게 하기 위하여 N-말단에 단백질 정제를 위한 태그를 포함할 수 있다.　 본 발명의 실시예에서는 핵사 히스티딘(6His)을 N-말단에 결합시켰으나, 본 발명의 목적상 단백질 정제를 위한 태그는 공지된 태그를 제한 없이 사용할 수 있다.　

본 발명의 골드결합 단백질은 바람직하게는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 골드결합 단백질 일 수 있다.

골드결합 단백질 : 서열번호 3

M H G K T Q A T S G T I Q S M H G K T Q A T S G T I Q S M H G K T Q A T S G T I Q S

본 발명의 실시예를 보면, 골드결합 단백질과 단백질 G를 펩티드 링커를 통해 연결시킨 융합 단백질의 경우에 골드결합 단백질 및 단백질 G 융합 단백질에 비해 골드-함유 고체상과의 결합능력에는 유의적인 차이를 보이지 않아 펩티드 링커의 삽입이 골드결합 단백질과 골드와의 결합능력에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다(실험예 1).

본 발명은 다른 하나의 양태로서, 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 배양하여 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질 및 골드결합 단백질이 펩티드 링커에 의해 연결된 융합 단백질을 코딩하는 DNA, RNA 등의 폴리뉴클레오티드로서, 바람직하게는 서열번호 6 또는 서열번호 7의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

GBP-6Gly-protein G : 서열번호 6

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GBP-6Ala-protein G : 서열번호 7

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발현벡터는 본 발명의 융합 단백질을 발현시키는 형질전환체를 만들기 위하여 숙주세포에 DNA를 도입하여 융합 단백질을 발현시키기 위한 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다. 본 발명의 목적상 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인헨서 같은 발현조절 엘리먼트를 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 6개의 알라닌 또는 6개의 글라이신으로 이루어진 펩티드 링커를 통하여 연결된 골드결합 단백질 및 단백질 G의 융합 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 발현벡터 pET-22b-GBP-6Ala-protein G, pET-22b-GBP-6Gly-protein G를 제조하였다(실시예 3).

형질전환체는 본 발명의 융합 단백질을 발현할 수 있는 대장균(E.coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등의 임의의 숙주세포를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 대장균을 사용할 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 펩티드 합성법에 의해 제조할 수도 있으나, 유전공학적 방법에 의해 특히 효율적으로 제조할 수 있다. 유전공학적 방법은 유전자조작에 의해 원하는 단백질을 대장균(E.coli) 등의 숙주세포에서 다량으로 발현시키는 방법이다.

본 발명의 융합 단백질의 제조는 바람직하게는 a) 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; b) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체로 형질전환하는 단계; 및 c) 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 통하여 제조할 수 있다.

상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환하는 방법은 바람직하게 본 발명의 DNA를 포함하는 발현 벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적인 형질감염(transient transfection), 미세 주사, 형질 도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposem-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질 감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기 침공법(electroporation) 등의 공지 방법으로 숙주세포에 도입하여 형질전환 시킬 수 있다.

형질전환체를 배양하여 본 발명의 융합 단백질을 생산하기 위한 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있는데, 예를 들면, 대장균을 키우는 일반적인 조건인 37℃, 호기조건, LB 배지에서 수행할 수 있다.

본 발명의 실시예를 보면, 대장균 BL21(DE3)을 컴피턴트 세포로 제작한 후 발현벡터 pET-22b-GBP-6Ala-protein G 및 pET-22b-GBP-6Gly-protein G로 형질전환하여 본 발명의 링커가 삽입된 융합 단백질 GBP-6Ala-protein G 및 GBP-6Gly-protein G를 발현시켰다(실시예 4). 또한, 도 3을 보면, 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 대장균으로부터 융합 단백질 GBP-6Ala-protein G(도 3의 GBP-A-pG) 및 GBP-6Gly-protein G(도 3의 GBP-G-pG)가 발현되었음을 알 수 있다(도 3).

본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 융합 단백질이 결합된 골드 함유 고체상을 포함하는 바이오센서 및 바이오센서의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 융합 단백질은 골드결합 단백질과 단백질 A 또는 단백질 G가 펩티드 링커를 통하여 연결된 형태로서, 여기서 본 발명에 따른 상기 골드결합 단백질은 42개의 아미노산으로 이루어져 있으며 골드에 선택적으로 결합할 수 있다. 상기 융합단백질의 단백질 A 또는 단백질 G는 다른 단백질과 달리 항체의 Fc 부위에 특이적으로 결합한다.

따라서, 본 발명에 따른 융합 단백질에 골드결합 단백질 부분은 골드-함유 고체상에 선택적으로 결합하고, 단백질 A 또는 단백질 G 부분은 항체의 Fc 부위에 특이적으로 결합함으로, 이를 이용하는 경우, 골드-함유 고체상에 선택적으로 결합하면서, 항체의 Fc 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 바이오센서를 제공할 수 있게 된다.

이로써 상기 바이오센서는, 상기 융합 단백질이 골드-함유 고체상에 결합되며, 또한 항체의 Fc 부위에 결합하여 항원이 결합하는 활성화 부분인 Fab 부분이 용액의 방향으로 향하는 적절한 배향성을 유지할 수 있게 됨으로써, 항체-골드 반응을 응용하는 면역분석 분야에서 유용하게 사용될 수 있다. 이러한 배향성으로 인해 항체의 항원과 결합하는 활성화 부위가 효율적으로 항원과 반응할 수 있다. 또한, 링커에 의한 유연성으로 항체와의 결합 빈도 증가와 함께 항원 검출능력이 증가할 수 있다.

바이오센서(biosensor)는 생물이 가지고 있는 기능을 이용하여 물질의 성질 등을 조사하는 기계로서, 효소 분석법과 면역 분석법에 사용하는 바이오센서, 광학적 바이오센서와 전기화학적 바이오센서 등이 있으며, 본 발명의 바이오센서는 샘플 주입, 혼성화 반응과 검출 등 실험의 전 과정을 하나의 작은 칩으로 자동적으로 처리하는 랩온어칩(lab-on-a-chip)일 수 있다.

또한, 본 발명의 바이오센서는 바람직하게는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)을 이용한 바이오센서일 수 있다. 표면 플라즈몬 공명을 이용하는 바이오센서는 정성적인 정보(두 분자들이 특이적으로 결합을 하는지)와 정량적인 정보(반응 속도, Kinetics와 평형상수, equilibrium constants)를 제공할 뿐만 아니라 형광으로 표지할 필요 없이 실시간으로 감지할 수 있어, 항원과 항체 결합을 측정하는데 특히 유용하다.

본 발명의 골드-함유 고체상은 바람직하게는 골드 콜로이드 입자, 나노-골드 입자, 골드-코팅 입자 및 골드가 도포된 기판으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 바이오센서는 융합 단백질을 이용하여 다른 생물학적 활성에 영향을 주지 않으면서 강력하게 항체를 골드-함유 고체상에 고정시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 융합 단백질은 링커의 삽입으로 인해 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질의 유연성이 증가하여, 항체와의 결합 빈도가 현저히 증가하기 때문에 고가인 항체의 낭비를 막을 수 있으며, 결합 능력도 증가시킬 수 있다.

본 발명의 바이오센서는 a) 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 삽입하여 형질전환체를 준비하는 단계; b) 상기 형질전환체를 배양하여 본 발명의 융합 단백질을 발현시키는 단계; c) 상기 융합 단백질이 발현된 형질전환체를 회수한 다음, 파쇄하여 상기 융합 단백질을 수득하는 단계; 및 d) 상기 수득한 융합 단백질을 골드-함유 고체상에 특이적으로 고정시키는 단계를 통하여 제조할 수 있다.

본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 바이오센서를 이용한 면역분석법을 제공한다.

본 발명의 바이오센서에는 항체가 결합되어 있으므로 상기 항체에 특이적으로 결합하는 항원을 검출할 수 있다.

항원-항체의 특이적 결합을 확인하는 것을 특징으로 하는 면역검출법은 가시적(visually), 광학적(optically), 전기화학적(electrochemically) 방법을 통해 수행할 수 있으며, 특히, 광학적 방법의 한 예로 표면플라즈몬공명(SPR) 기술을 들 수 있다.

본 발명의 면역분석법은 바람직하게는 표면 플라즈몬 공명 방법을 사용할 수 있다. 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR)은 전반사(attenuated total reflectance)에 의한 표면 플라즈몬 공명 현상을 이용하는 것으로, 전류 또는 기계적 변화를 이용하는 검출 시스템과 비교하였을 때, 용매의 흐름이나 전기적 잡음에 의해 방해받지 않기 때문에 안정된 신호를 얻을 수 있다는 장점을 가지고 있다.

본 발명의 면역분석법은 a) 바이오센서의 링커가 삽입된 융합 단백질에 항체를 특이적으로 결합시키는 단계; 및 b) 상기 항체에 특이적인 항원을 처리하여 항원-항체의 특이적 결합을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 링커가 삽입된 융합 단백질 GBP-6Ala-protein G 및 P-6Gly-protein G에 항체를 특이적으로 결합시키고, 그 결합 정도를 융합 단백질 GBP-protein G와 비교하였다. 비교 결과, 링커가 삽입된 융합 단백질 GBP-6Ala-protein G의 항체와의 결합정도가 융합 단백질 GBP-protein G에 비해 약 20% 향상되었고, 링커가 삽입된 융합 단백질 GBP-6Gly-protein G의 항체와의 결합정도는 융합 단백질 GBP-protein G에 비해 약 9% 향상되었음을 알 수 있었다(실험예 2).

따라서, 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 바이오센서를 이용한 면역분석은 링커가 삽입된 융합 단백질이 항체와 결합하는 빈도가 현저히 향상되었기 때문에, 고가인 항체의 손실 없이 융합 단백질에 결합된 항체에 반응시키고자 하는 항원을 처리하고, 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화를 측정함으로써 항원-항체의 특이적 결합을 검출할 수 있는 이점이 있다.

본 발명에 따른 융합 단백질은 항체를 적절한 배향성을 가진 채 간단히 골드-함유 고체상에 고정 시킬 수 있을 뿐 아니라, 링커에 의해 유연성이 증가되어 항체와의 결합 빈도를 높여 줌으로써 고가의 항체가 손실되는 것을 최소화 시킬 수 있어 바이오센서의 대량생산을 유도할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질 및 골드결합 단백질이 펩티드 링커에 의해 연결된 융합 단백질을 보인 도면이다.
도 2는 분자동역학 시뮬레이션에 의한 GBP-Linker-protein G 융합 단백질의 3차원 구조를 보인 도면이다.
도 3은 대장균에서 발현된 GBP-6Ala-protein G 및 GBP-6Gly-protein G 융합 단백질의 전기영동 사진이다. L은 라이소자임처리, S는 초음파 처리한 경우의 전기영동 결과이다.
도 4는 GBP와 protein G 사이에 알리닌 또는 글라이신 링커를 삽입하기 위한 프라이머 서열을 보인 도면이다.
도 5는 GBP-6Ala-protein G 및 GBP-6Gly-protein G의 합성 확인을 위한 전기영동 사진이다.
도 6은 pET-22b 벡터에 GBP-6Ala-protein G 및 GBP-6Gly-protein G DNA 단편들의 삽입여부 확인을 위한 전기영동 사진이다.
도 7은 GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질의 골드와의 결합 정도를 나타낸 SPR 센서그램을 보인 도면이다.
도 8은 GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질과 hIgG와의 결합 정도를 나타낸 SPR 센서그램을 보인 도면이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 재조합 GBP-protein G 융합 단백질의 제조

Streptococcus G148의 Protein G 유전자(Goward et al., Biochem. J., 1990, 서열번호 8)를 인공적으로 합성(Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA, 미국)하였으며, 이를 주형 DNA로 사용하고, 서열번호 9(5'-ggaattcttgaaaggcgaaacaactactga agctgttgatgctgctactg-3'; 프라이머 1)와 서열번호 10(5'-gaggatccttattcagttaccgtaaag-3'; 프라이머 2)의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 최종적으로 6His-GBP와 protein G가 융합된 형태의 유전자 산물 6His-GBP-protein G를 수득하였다. PCR 조건으로 첫 번째 변성(denaturation)은 94℃에서 5분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성은 94℃에서 1분간, 교잡(annealing)은 56℃에서 1분 30초간, 연장(extension)은 72℃에서 1분간 수행하였으며 이를 30회 반복하였다. 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 한번 더 수행하였다.

<실시예 2> 펩티드 링커가 삽입된 GBP-6Ala-protein G 및 GBP-6Gly-protein G 융합 단백질의 제조

링커로 20개의 아미노산 중에 기능기를 갖지 않으면서 크기가 작은 알라닌(alanine)과 글라이신(glycine)을 선택하여 각각 GBP와 protein G사이에 삽입하였다. 구체적으로, 알라닌 6개를 링커로 삽입하기 위해 서열번호 11의 프라이머(5'-ggtaccattcagtctgcggcagctgcggcc-3' ; 프라이머 3 ; 도 4의 ① 프라이머)와 서열번호 12의 프라이머(5'-gcagctgcggccgcattgaaaggcgaaaca-3' ; 프라이머 4 ; 도 4의 ② 프라이머) 및 글라이신 6개 삽입을 위해 서열번호 13의 프라이머(5'-ggtaccattc agtctggtggcgggggaggt-3' ; 프라이머 5 ; 도 4의 ③ 프라이머)와 서열번호 14의 프라이머(5'-ggcgggggaggtggattgaaaggcgaaaca-3' ; 프라이머 6 ; 도 4의 ④ 프라이머)를 제작하였고, 또한, 상기 ① 프라이머와 ③ 프라이머의 reverse(각각 서열번호 15, 서열번호 16 ; 5'-ggccgcagctgccgcagactgaatggtacc-3' ; 5'-acctcccccgccaccagact gaatggtacc-3')도 PCR을 하기 위해 제작하였다(도 4).

상기 실시예 1에서 제작한 6His-GBP-protein G의 염기서열을 주형으로 하여 표 1과 같은 조건으로 1차 PCR을 수행하였다. PCR은 주형 1㎕, 10mM dNTPs 0.4㎕, 프라이머 10 pmol 1㎕씩, 10X 버퍼 2㎕, taq polymerase(Takara LA taq) 0.2㎕에 나머지를 D.W.로 채워 전체 볼륨을 20㎕으로 넣어 준 PCR mixture를 사용하였다. 이후, 1차 PCR 산물을 주형으로 하여 T7 프로모터 프라이머(서열번호 17 ; 프라이머 7 ; 5'-taatacgactcactataggg-3') 및 T7 종결(terminator) 프라이머(서열번호 18 ; 프라이머 8 ; 5'-gctagttattgctcagcgg-3')를 사용하여 2차 PCR을 수행하였다.

PCR에 의해 Ala과 Gly 링커가 올바르게 증폭되었는지 확인하고자 아가로스 겔에 로딩하여 전기영동 하였다. 그 결과, lane 1, lane 2에서 약 1kb의 밴드가 형성되어 PCR에 의해 Ala과 Gly 링커가 올바르게 증폭되었음을 확인할 수 있었다(도 5).

<실시예 3> 재조합 플라스미드 제작

GBP-6Ala-protein G와 GBP-6Gly-protein G DNA 단편을 각각 Not1/xho1 enzyme(NEB)과 Ndel/xho1 제한효소들을 사용하여 pET-22b 벡터에 삽입한 후 라이게이션(ligation) 시키고, 증폭하였다.

DNA 단편들이 벡터에 각각 성공적으로 삽입되었음을 확인하기 위하여 DNA 10㎕, 효소 0.5㎕, 10X 버퍼 2㎕에 D.W를 전체 볼륨이 20μl가 되도록 채운 enzyme cutting mixture를 사용하여 37℃의 온도에서 1시간 동안 배양한 뒤, 바로 얼음에 넣어 아가로오즈 겔(agarose gel)에 로딩하여 전기영동 하였다.

도 6을 보면, 전기영동 결과 약 1kb 정도에서 밴드가 형성됨을 확인함으로써 이 DNA 단편들이 벡터에 각각 성공적으로 삽입되었음이 확인되었다(도 6).

<실시예 4> 재조합 플라스미드를 도입한 재조합 대장균의 제조 및 융합 단백질의 정제

융합 단백질을 발현시키기 위해 대장균 BL21(DE3)을 컴피턴트 세포(competent cell, cp cell)로 제작하여 형질전환시켰다. 컴피턴트 세포 제작을 위해 1M CaCl, D.W, LB 액체 배지를 고압멸균(autoclave)하여 4℃의 온도에서 보관하였다. BL21(DE3) 세포를 서브 클로닝(sub cloning)하여 LB 플레이트에서 37℃의 온도로 밤새 배양하여 키우고, 이 중 하나의 콜로니를 취하여 50㎖의 LB 액체 배지에 분주하여 200rpm, 37℃의 온도 조건으로 진탕(shaking) 배양하여 광학밀도(O.D)값이 0.6~0.8로 나올 때까지 배양하였다.

그 후, BL21(DE3) 세포를 5000rpm, 10분의 조건으로 원심분리하여 상등액을 버리고 얼음에 보관하였다. 0.1M CaCl 25㎖을 BL21(DE3) 세포가 있는 팔콘 튜브(falcon tube)에 넣고 재현탁(resuspention)한 뒤 0.1M CaCl 25㎖을 다시 한 번 넣고, 얼음에 10분 동안 배양 한 뒤 3000rpm으로 4℃의 온도에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛(pellet)을 취하였다. 0.1M CaCl을 25㎖ 넣어 재현탁한 뒤 얼음에 5분 동안 배양함과 동시에 일정시간마다 inverting 하였다. 이후, 원심분리(3000rpm, 5분, 4℃)하여 상등액을 제거하고 원심분리를 동일 조건으로 돌린 뒤 0.1M CaCl 1㎖을 넣고 재현탁하여 얼음에 넣고 보관하였다. 농도가 1㎍/㎕인 플라스미드(TE buffer 내)를 100㎕ 컨피턴트 세포에 넣고 재현탁한 뒤 얼음에 30분간 배양하고, 42℃ 온도의 진탕기에서 30초간 배양하여 형질전환 시킨 후, 즉시 얼음에 2~3분간 놓아두었다.

액체 LB 배지 900㎕을 넣고 200rpm 37℃의 온도 조건으로 1시간 동안 진탕 배양을 한 뒤 앰피실린(ampicillin) 100mg/L을 포함한 LB 플레이트에 깔아주고, 37℃ 온도의 배양기에서 밤새 배양하였다. 형성된 콜로니를 LA 배지(앰피실린을 포함하고 있는 LB 배지) 10ml에서 37℃의 온도로 밤새 배양한 후, 1ml를 취해 DNA를 추출하여 플라스미드가 세포내에 성공적으로 삽입되었는지를 확인하고, 나머지는 70% 글리세롤에 보관하였다.

이후, 보관된 세포 200㎕를 LA 배지 5㎖에 첨가한 후 37℃에서 밤새 170rpm으로 진탕 배양한 후, 1㎖를 신선한 60㎖ LA 배지에 분주하였다. 이를 분광광도계 600nm에서 O.D값 0.6이 나올때까지 배양한 후 1mM IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여 진탕 배양을(170rpm, 37℃, 3시간)하면서 융합 단백질을 발현시키고, 원심분리(4000g, 4℃, 30분)하여 상등액을 제거하고, TE 버퍼(Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, 10mM iminazole, pH8.0) 1.4㎖를 넣어 피페팅(pipetting) 하였다. 세포를 튜브(epitube)에 옮겨 2초간 초음파처리, 5초간 얼음에서 배양하는 방법으로 총 10분간 초음파처리 하였다. 그 후, 원심분리(12000g, 4℃, 30분)를 실시하여 상등액을 취하였다. 또한, 라이소자임(lysozme) 처리(효소처리)도 병행하여 초음파처리의 융합 단백질 추출 정도와 비교하였다.

융합 단백질의 정제는 Ni-NTA 컬럼(Qiagen)을 이용하였다. 컬럼에 반응버퍼(50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 10mM imidazole, pH 8.0) 600㎕ 넣고 원심분리(890g, 4℃, 2분)한 후, 컬럼에 동량의 단백질을 넣어 또 한 번 원심분리(270g, 4℃, 5분)하여 컬럼의 Ni와 융합 단백질의 His-tag가 결합하도록 했다. 세척 버퍼(50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 20mM imidazole, pH 8.0) 600㎕를 넣고 890g로 4℃의 온도에서 2분 동안 원심분리를 2회 반복한 뒤, 300㎕ 용리 버퍼(elution buffer, 50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 500mM imidazole, pH 8.0)를 넣어 융합 단백질을 얻었다. 각 융합 단백질들은 센트리콘(centricon, >10KDa)으로 PBS 버퍼에 농축하여 4℃에서 냉장보관 하였다.

도 3은 대장균에서 발현된 융합 단백질의 전기영동 사진을 나타낸다. 도 3 의 L은 효소처리, S는 초음파처리를 나타낸다. 도 3을 보면, GBP-protein G, GBP-Ala-protein G(도 3의 GBP-A-protein G), GBP-Gly-protein G(도 3의 GBP-G-protein G) 융합 단백질 모두에서 효소처리보다 초음파처리에서 좀 더 많은 융합 단백질을 얻을 수 있음을 알 수 있었다(도 3).

<실시예 5> 링커가 삽입된 융합 단백질을 고정한 바이오센서의 제작

실시예 4에서 수득한 GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질을 함유하는 수용성 단백질 분획을 PBS 버퍼(pH 7.4)로 1 mg/ml 농도로 희석하였다. 골드 칩(Biacore Internation AB, Uppsala, 스웨덴)을 normalization 용액(70% glycerol, v/v)으로 6분 동안 처리하여 표면의 유기물을 완전히 제거하고 골드 칩 사이의 미세 채널을 이용하여 SPR 장치내 시린지펌프(Syringe pump)로 5 μl/min 유속으로 PBS 버퍼를 흘리면서 골드 칩의 표면을 안정화시켜서 상기 융합 단백질을 고정화시킬 수 있는 바이오센서를 제작하였다.

<실험예 1> 분자동역학 시뮬레이션 분석

펩티드 링커로 연결된 골드결합 단백질-펩티드 링커-단백질 G에 대한 분자동역학(molecular dynamics)을 분석하였다. Amber 10 분자동역학 툴을 사용하였으며, 단백질 구조는 Swiss-prot에서 제공하는 homology modeling sever에서 예측된 것을 사용하였다.

도 2를 보면, 시뮬레이션 결과, 골드결합 단백질과 단백질 G 사이에 삽입된 펩티드 링커에 의해 단백질 G의 유연성이 향상되었음을 확인할 수 있었다(도 2).

<실험예 2> GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질의 골드-함유 고체상과의 결합능력 측정

유전자 재조합 방법으로 합성된 GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질의 특성을 분석하기 위해 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 신호의 변화를 측정하였다. 구체적으로, 각각의 융합 단백질(300μg/ml)을 20분 동안 SPR 골드 칩 표면에 미세 채널을 통해서 흘려준 후 버퍼로 세척하여 골드와의 특이적 결합 정도를 분석하였다. 또한, 대조군으로 BSA와 골드와의 결합 정도를 분석하였다.

도 7은 GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질의 골드와의 결합 정도를 나타낸 SPR 센서그램을 보인 도면이다. 도 7을 보면, 대조군으로 반응시킨 BSA는 골드와 거의 반응하지 않았으며, GBP-6Ala-protein G의 RU값 2198 및 GBP-6Gly-protein G의 RU값 2004가 GBP-protein G의 RU값 2286보다 아주 약간 작은 값을 보이나 유의적인 차이는 보이지 않았음을 알 수 있었다(도 7).

이러한 결과는 6개의 Ala 또는 Gly을 각각 링커로 삽입하여 GBP와 protein G를 연결하는 경우에도 융합 단백질(골드결합 단백질-링커-단백질 G)의 골드와의 특이적 결합능력에는 영향을 미치지 않음을 나타낸다.

<실험예 3> GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질의 항체와의 반응성 측정

GBP-protein G 융합 단백질의 링커(6Ala, 6Gly) 삽입으로 인한 항체 Fc 부위와의 반응성이 증가하는지 여부를 실험하였다. 이를 위해, 골드-함유 고체상에 결합된 GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질에 인간 면역글로블린(hIgG, 100μg/ml)을 10분 동안 반응시키고, 대조군으로 BSA를 10분 동안 반응시킨 후 PBS 버퍼로 세척하였다.

도 8은 GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질과 hIgG와의 결합 정도를 나타낸 SPR 센서그램을 보인 도면이다. 도 8을 보면, 융합 단백질의 protein G와 hIgG와의 결합 정도는 GBP-protein G, GBP-6Ala-protein G, GBP-6Gly-protein G에서 각각 4005 RU, 4899 RU, 4363 RU 값을 보였고, 대조군인 BSA와는 아주 약간의 반응 정도를 보였다. 구체적으로, 6Ala 링커가 삽입되어 있는 융합 단백질(GBP-6Ala-protein G)의 protein G와 hIgG의 결합 정도는 링커가 없는 융합 단백질(GBP-protein G)보다 약 20% 증가했고, 6Gly 링커가 삽입되어 있는 융합 단백질(GBP-6Gly-protein G)은 GBP-protein G 융합 단백질보다 약 9% 증가하였음을 확인되었다.

GBP-6Ala-protein G 융합 단백질 분자 1개당 hIgG와의 결합 정도는 GBP-protein G 융합 단백질보다 약 27% 증가했으며, GBP-6Gly-protein G 융합 단백질의 경우에는 약 24% 증가하였다. 이러한 결과는 링커를 통하여 연결된 GBP와 protein G 융합 단백질은 골드-함유 고체상과의 결합능력은 유지하면서 항체의 Fc 부위와의 결합 정도(결합 빈도)가 상당히 향상되었음을 나타낸다.

도 2는 분자동역학 시뮬레이션에 의한 골드결합 단백질-링커-단백질 G 융합 단백질의 3차원 구조를 보인 도면이다. 도 2를 보면, 골드결합 단백질과 단백질 G를 링커를 통하여 연결한 융합 단백질은 삽입된 링커로 인하여 단백질 G 부분의 유연성(flexibility)이 증가하였음을 알 수 있으며, 따라서, 링커를 통하여 골드결합 단백질과 단백질 G를 연결한 융합 단백질에 있어서 항체와의 반응성(결합 빈도)이 향상되는 것은 링커의 삽입으로 인한 단백질 G의 유연성이 증가하였기 때문임을 알 수 있다.

<110> Korea Food Research Institute <120> Fusion proteins and bio-sensor comprising the same <130> PA100645KR <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic amino acid sequence of protein G <400> 1 Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu 1 5 10 15 Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp 20 25 30 Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu 35 40 45 Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu 50 55 60 Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn 85 90 95 Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr 100 105 110 Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala 115 120 125 Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu 130 135 140 Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys 145 150 155 160 Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp 165 170 175 Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Leu Glu His His His His His 180 185 190 His <210> 2 <211> 422 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic amino acid sequence of protein A <400> 2 Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn 65 70 75 80 Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp 85 90 95 Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu 100 105 110 Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn 115 120 125 Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg 130 135 140 Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn 145 150 155 160 Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala 165 170 175 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 180 185 190 His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 195 200 205 Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys 210 215 220 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Glu Asp Asn Lys Lys Pro 225 230 235 240 Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro 245 250 255 Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro 260 265 270 Gly Lys Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro 275 280 285 Gly Lys Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro 290 295 300 Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Gly Val 305 310 315 320 His Val Val Lys Pro Gly Asp Thr Val Asn Asp Ile Ala Lys Ala Asn 325 330 335 Gly Thr Thr Ala Asp Lys Ile Ala Ala Asp Asn Lys Leu Ala Asp Lys 340 345 350 Asn Met Ile Lys Pro Gly Gln Glu Leu Val Val Asp Lys Lys Gln Pro 355 360 365 Ala Asn His Ala Asp Ala Asn Lys Ala Gln Ala Leu Pro Glu Thr Gly 370 375 380 Glu Glu Asn Pro Phe Ile Gly Thr Thr Val Phe Gly Gly Leu Ser Leu 385 390 395 400 Ala Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu 405 410 415 His His His His His His 420 <210> 3 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gold binding protein <400> 3 Met His Gly Lys Thr Gln Ala Thr Ser Gly Thr Ile Gln Ser Met His 1 5 10 15 Gly Lys Thr Gln Ala Thr Ser Gly Thr Ile Gln Ser Met His Gly Lys 20 25 30 Thr Gln Ala Thr Ser Gly Thr Ile Gln Ser 35 40 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker of fusion protein <400> 4 Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker of fusion protein <400> 5 Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 6 <211> 741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of GBP-6Gly-protein G <400> 6 atgcaccatc accatcacca ccacggcaaa acccaggcga ccagcggcac catccagagc 60 atgcatggta aaacgcaagc cacgtctggt acgattcaat ctatgcacgg taaaacccaa 120 gcgacgagcg gtaccattca gtctggtggc gggggaggtg gattgaaagg cgaaacaact 180 actgaagctg ttgatgctgc tactgcagaa aaagtcttca aacaatacgc taacgacaac 240 ggtgttgacg gtgaatggac ttacgacgat gcgactaaga cctttacagt tactgaaaaa 300 ccagaagtga tcgatgcgtc tgaattaaca ccagccgtga caacttacaa acttgttatt 360 aatggtaaaa cattgaaagg cgaaacaact actgaagctg ttgatgctgc tactgcagaa 420 aaagtcttca aacaatacgc taacgacaac ggtgttgacg gtgaatggac ttacgacgat 480 gcgactaaga cctttacagt tactgaaaaa ccagaagtga tcgatgcgtc tgaattaaca 540 ccagccgtga caacttacaa acttgttatt aatggtaaaa cattgaaagg cgaaacaact 600 actaaagcag tagacgcaga aactgcagaa aaagccttca aacaatacgc taacgacaac 660 ggtgttgatg gtgtttggac ttatgatgat gcgactaaga cctttacggt aactgaactc 720 gagcaccacc accaccacca c 741 <210> 7 <211> 741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of GBP-6Ala-protein G <400> 7 atgcaccatc accatcacca ccacggcaaa acccaggcga ccagcggcac catccagagc 60 atgcatggta aaacgcaagc cacgtctggt acgattcaat ctatgcacgg taaaacccaa 120 gcgacgagcg gtaccattca gtctgcggca gctgcggccg cattgaaagg cgaaacaact 180 actgaagctg ttgatgctgc tactgcagaa aaagtcttca aacaatacgc taacgacaac 240 ggtgttgacg gtgaatggac ttacgacgat gcgactaaga cctttacagt tactgaaaaa 300 ccagaagtga tcgatgcgtc tgaattaaca ccagccgtga caacttacaa acttgttatt 360 aatggtaaaa cattgaaagg cgaaacaact actgaagctg ttgatgctgc tactgcagaa 420 aaagtcttca aacaatacgc taacgacaac ggtgttgacg gtgaatggac ttacgacgat 480 gcgactaaga cctttacagt tactgaaaaa ccagaagtga tcgatgcgtc tgaattaaca 540 ccagccgtga caacttacaa acttgttatt aatggtaaaa cattgaaagg cgaaacaact 600 actaaagcag tagacgcaga aactgcagaa aaagccttca aacaatacgc taacgacaac 660 ggtgttgatg gtgtttggac ttatgatgat gcgactaaga cctttacggt aactgaactc 720 gagcaccacc accaccacca c 741 <210> 8 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence of protein G <400> 8 ttgaaaggcg aaacaactac tgaagctgtt gatgctgcta ctgcagaaaa agtcttcaaa 60 caatacgcta acgacaacgg tgttgacggt gaatggactt acgacgatgc gactaagacc 120 tttacagtta ctgaaaaacc agaagtgatc gatgcgtctg aattaacacc agccgtgaca 180 acttacaaac ttgttattaa tggtaaaaca ttgaaaggcg aaacaactac tgaagctgtt 240 gatgctgcta ctgcagaaaa agtcttcaaa caatacgcta acgacaacgg tgttgacggt 300 gaatggactt acgacgatgc gactaagacc tttacagtta ctgaaaaacc agaagtgatc 360 gatgcgtctg aattaacacc agccgtgaca acttacaaac ttgttattaa tggtaaaaca 420 ttgaaaggcg aaacaactac taaagcagta gacgcagaaa ctgcagaaaa agccttcaaa 480 caatacgcta acgacaacgg tgttgatggt gtttggactt atgatgatgc gactaagacc 540 tttacggtaa ctgaa 555 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 9 ggaattcttg aaaggcgaaa caactactga agctgttgat gctgctactg 50 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 10 gaggatcctt attcagttac cgtaaag 27 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 11 ggtaccattc agtctgcggc agctgcggcc 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 12 gcagctgcgg ccgcattgaa aggcgaaaca 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5 <400> 13 ggtaccattc agtctggtgg cgggggaggt 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6 <400> 14 ggcgggggag gtggattgaa aggcgaaaca 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of primer 3 <400> 15 ggccgcagct gccgcagact gaatggtacc 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of primer 5 <400> 16 acctcccccg ccaccagact gaatggtacc 30 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 7 <400> 17 taatacgact cactataggg 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 8 <400> 18 gctagttatt gctcagcgg 19

Claims

항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질 및 골드결합 단백질이 펩티드 링커에 의해 연결된 융합 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 펩티드 링커는 항체의 Fc 부위에 결합하는 단백질의 N-말단 및 골드결합 단백질의 C-말단에 연결된 것인 융합 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 항체의 Fc 영역에 결합하는 단백질은 단백질 A(protein A) 또는 단백질 G(protein G)인 것인 융합 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 펩티드 링커는 알라닌(Ala), 글라이신(Gly) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 융합 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 펩티드 링커는 1개 내지 6개의 아미노산으로 이루어진 것인 융합 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 항체의 Fc 영역에 결합하는 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것인 융합 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 골드결합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것인 융합 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 펩티드 링커는 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 것인 융합 단백질.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제 9항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6의 염기서열 또는 서열번호 7의 염기서열을 갖는 것인 폴리뉴클레오티드.
제 9항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
제 11항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
a) 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; b) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체로 형질전환하는 단계; 및 c) 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 제조하는 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 융합 단백질이 결합된 골드-함유 고체상을 포함하는 바이오센서.
다음의 단계를 포함하는 제14항의 바이오센서 제작방법;
a) 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 삽입하여 형질전환체를 준비하는 단계; b) 상기 형질전환체를 배양하여 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 발현시키는 단계; c) 상기 융합 단백질이 발현된 형질전환체를 회수한 다음, 파쇄하여 상기 융합 단백질을 수득하는 단계; 및 d) 상기 수득한 융합 단백질을 골드-함유 고체상에 특이적으로 고정시키는 단계.
제 14항의 바이오센서를 이용한 면역검출법.
제 16항에 있어서, 상기 바이오센서의 융합 단백질에 항체를 특이적으로 결합시키는 단계; 및 상기 항체에 특이적인 항원을 처리하여 항원-항체의 특이적 결합을 검출하는 단계를 포함하는 면역검출법.