WO2007126101A1 - 蛋白質チップ - Google Patents

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WO2007126101A1
WO2007126101A1 PCT/JP2007/059336 JP2007059336W WO2007126101A1 WO 2007126101 A1 WO2007126101 A1 WO 2007126101A1 JP 2007059336 W JP2007059336 W JP 2007059336W WO 2007126101 A1 WO2007126101 A1 WO 2007126101A1
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WO
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protein
pdz domain
substrate
oligonucleotide
bound
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Application number
PCT/JP2007/059336
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takaaki Sato
Shinji Irie
Original Assignee
Toppan Printing Co., Ltd.
Ilamm, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toppan Printing Co., Ltd., Ilamm, Inc. filed Critical Toppan Printing Co., Ltd.
Priority to JP2008513319A priority Critical patent/JP4243319B2/ja
Publication of WO2007126101A1 publication Critical patent/WO2007126101A1/ja

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures

Definitions

  • the present invention relates to a PDZ domain protein and SZT—X—V that specifically binds to the PDZ domain.
  • the present invention relates to a protein chip using a protein having a consensus sequence consisting of ZLZI and a method for producing the same.
  • a protein chip is obtained by bonding various proteins on a substrate such as a glass substrate.
  • the function of each protein immobilized on the protein chip is used for various diagnoses, tests, and search for molecules that bind to other proteins.
  • Methods for immobilizing a protein on a substrate include a method of immobilizing a protein on the substrate surface by passive adsorption, a method of binding a protein to the substrate using a coupling reagent, and a biological method using a protein tag.
  • the anchorage is reproducible and can be anchored with the same efficiency even if the protein properties (size, hydrophilicity, hydrophobicity) are different, and can be used for mass processing and automation.
  • it is desirable that the activity of the immobilized protein is completely maintained.
  • Non-patent document 1 Hui Ge, 2000, Nucleic Acid Research, vol.28 (2), e3
  • Non-patent document 2 Lucy J. Holt et al., 2 000, Nucleic Acid Research, vol. 28 (15), e72
  • non-patent document 3 Dmitry Guschin, 1997, Analytical Biochemistry, vol. 250 (2), pp. 203-211).
  • these methods are easy to operate, it is impossible to control the quantitativeness and the direction of protein molecule fixation.
  • it is not preferable because it is difficult to maintain the activity of the protein to be immobilized and the reproducibility and efficiency fluctuate.
  • Non-Patent Document 4 Gavin MacBeath, 2000, Science, vol.289 (5485), pp.1760 -1763
  • a method of fixing a protein to an epoxy group by modifying the glass surface with an epoxy group There is.
  • These methods can stably fix the protein to the substrate, can be applied to various proteins, and have good reproducibility, but the direction of the fixation cannot be completely controlled.
  • Derivatives of compounds used for coupling can alter protein function. Therefore, when this method is used, it is necessary to examine the combination of the binding agent and the surface of the substrate (substrate) without changing or eliminating the function of the protein to be immobilized.
  • biological capture methods using proteins as tags include methods using the interaction of piotin z streptavidin or hexahistidine z nickel. These methods are methods for forming a stable and specific bond between a protein and a carrier (substrate) surface, and the direction of the bond can be controlled.
  • Patent Document 1 US Pat. No. 6,743,630. That is, by immobilizing a protein having a PDZ domain on a substrate and adding another protein having a consensus sequence consisting of S / TXV / LZI, the other protein binds to the PDZ domain via the consensus sequence.
  • a chip in which the target protein is immobilized on the substrate can be produced.
  • the protein chip production method using the interaction between the PDZ domain and the SZT—X—VZLZI consensus sequence is to transmit the FAP-1 (Fas-associated phosphatase-1) force apoptosis signal into the cell.
  • FAP-1 Fes-associated phosphatase-1
  • Non-Patent Document 5 Sato, T., et al. Science 268, 411-415, 1995
  • Non-patent Document 6 Yanagisawa, J. et al., The Journal of Biolgical Chemistry, 272, pp.8539-8545, 1997), from the SZT—X—VZLZl of the C-terminal of proteins.
  • the consensus sequence was found to bind to the PDZ domain of FAP-1.
  • Patent Document 1 US Patent No. 6,743,630 Patent Document 2: Japanese Patent Laid-Open No. 2002-082116
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-014747
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-153698
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-57113
  • Patent Document 6 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-230545
  • Patent Document 7 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-347317
  • Patent Document 8 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-57113
  • Patent Document 9 Special Table 2002-520618
  • Patent Document 10 Special Table 2002-520620
  • Patent Document 11 Special Table 2006—511797
  • Patent Document 12 International Publication No. 95Z04069 Pamphlet
  • Patent Document 13 Pamphlet of International Publication No. 98Z05347
  • Non-patent literature l Hui Ge, 2000, Nucleic Acid Research, vol.28 (2), e3
  • Non-patent document 2 Lucy J. Holt et al, 2000, Nucleic Acid Research, vol. 28 (15), e72
  • Non-patent document 3 Dmitry Guschin, 1997, Analytical Biochemistry, vol. 250 (2), pp. 203- 2
  • Non-Patent Document 4 Gavin MacBeath, 2000, Science, vol. 289 (5485), pp. 1760-1763
  • Non-Patent Document 5 Sato, T "et al. Science 268, pp. 411-415, 1995
  • Non-Patent Document 6 Yanagisawa, J. et al., The Journal of Biolgical Chemistry, 272, pp.853 9-8545, 1997)
  • the protein chip utilizing the interaction between the PDZ domain and the SLV sequence is based on a conventional fixed anchor method, and its practical application is expected.
  • a protein consisting of a partial length containing a PDZ domain which is not the full length protein of FAP-1
  • the binding force between the PDZ domain and the consensus sequence consisting of SZT—X—VZLZI is not sufficient. was there.
  • the reason for this is not clear, but the higher-order structure becomes unstable when a partial long-strength protein containing the PDZ domain is immobilized on the substrate.
  • One reason may be that the function is impaired.
  • Knockground noise is a force derived from nonspecific binding of proteins. The main reason for this is thought to be the insufficient purification of the protein immobilized on the substrate.
  • As an efficient method for obtaining a protein with high purity there is a method in which a protein fused with a tag is expressed in a cell and the protein is purified by the tag.
  • the function may be impaired by the tag. Therefore, it was not preferred for producing high-quality protein chips.
  • the conventional protein chip requires a dispensing robot equipped with an inkjet printing apparatus or a capillary to finely spot the protein on the substrate. Therefore, it has been desired to develop a protein chip that can array proteins in an arbitrary sequence in a laboratory without requiring a special apparatus.
  • the present inventors have found that when a property tag is linked to a protein having a PD z domain, SZT —X—VZLZI As a result, it was found that the binding force with the consensus sequence is not greatly impaired, and the protein chip of the present invention was invented.
  • the affinity tag linked to a protein having a PDZ domain is used for protein purification, and by utilizing the strong binding force of the consensus sequence consisting of the PDZ domain and SZT—X—VZL / I, It has been found that a high-quality protein chip can be produced at low cost with low background noise, preventing protein binding to the substrate, and inventing the protein chip production method of the present invention. It came.
  • the present inventors prepared a substrate on which an oligonucleotide was immobilized, an oligonucleotide having a sequence complementary to the oligonucleotide at an arbitrary position on the substrate, a protein having a PDZ domain, and SZT-X—
  • a complex of an arbitrary protein having a consensus sequence consisting of VZLZI is prepared, and the nucleotide of the complex with the oligonucleotide at the arbitrary position is prepared.
  • the inventors have found that any protein can be arrayed at any position on the substrate by hybridizing the leotide, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following protein chips (1) to (14), a production method thereof and a kit.
  • a protein chip in which the other protein is bound to the PDZ domain via the consensus sequence is bound to the PDZ domain via the consensus sequence.
  • the substrate is a substrate on which an oligonucleotide is immobilized, and an oligonucleotide having a sequence complementary to the oligonucleotide is bound to the affinity tag,
  • affinity tag is a affinity tag that also has a fusion protein power of GST and avidin.
  • a method for producing a protein chip comprising the following steps:
  • step (C) a step of purifying the protein having the PDZ domain obtained in the step (A) using the affinity tag as an index;
  • step (D) a step of immobilizing the protein having the PDZ domain purified in the step (C) to a substrate;
  • step (E) Adding the other protein obtained in the step (B) to the substrate on which the protein having the PDZ domain is immobilized in the step (D), and then the protein having the PDZ domain and the other protein The process of combining.
  • a method for producing a protein chip comprising the following steps.
  • step (F) The substrate obtained in the step (D) is combined with the protein oligonucleotide complex obtained in the step (E), and the oligonucleotide on the substrate and the nucleotide of the complex are hybridized.
  • the other protein is a plurality of other proteins
  • the other proteins are a plurality of types of oligonucleotides having different oligonucleotide force sequences
  • a method for producing a protein chip characterized in that, in the step (E), the type of nucleotide to be bound via a affinity tag is varied depending on the type of another protein to be bound to the PDZ domain.
  • a PDZ domain protein is bound on the substrate, and any protein having a consensus sequence consisting of SZT-X-VZLZI can be bound to the C-terminus of the protein that binds to the protein.
  • a PDZ domain protein is bound on the substrate, and an arbitrary antibody with a consensus sequence consisting of SZT-X-VZLZI added to the heavy chain constant region C-terminus is bound to the PDZ domain protein, and the antibody is arbitrarily selected.
  • a heavy chain invariable region characterized in that the binding ability between the antibody and an arbitrary protein is improved by inhibiting the protein binding site of the antibody from contacting the substrate.
  • a protein chip that binds to an arbitrary antibody strength s PDZ domain protein to which a consensus sequence consisting of ZLZI is added and binds the complex on a substrate.
  • An arbitrary protein having a consensus sequence consisting of SZT-X-VZLZI at the C-terminus of the protein is bound to a PDZ domain protein linked to an arbitrary oligonucleotide, and a nucleotide complementary to the oligonucleotide
  • PDZ domain protein is avidin-labeled or piotin-labeled, and the oligonucleotide is linked to thiotin-labeled or avidin-labeled to bind the avidin-labeled and piotine-labeled PDZ domain protein and the oligonucleotide
  • the protein chip according to (12) wherein
  • SZT—X VZLZI is as follows: S is serine, T is threonine, V is parin, L is leucine, I is isoleucine, and X is Nin, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, ferulalanin, glycine, histidine Any amino acid selected from the group consisting of lysine, isoleucine, lysine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, arginine, serine, threonine, Norin, tryptophan and tyrosine. In addition,-(hyphen) indicates a peptide bond, and amino acids shown as options are separated by Z (slash). That is, SZT indicates that it is either serine or threonine.
  • the protein is fixed to the substrate through at least the PDZ domain, the three-dimensional structure of the protein, the loss of function, and the like caused by the protein directly binding to the substrate are changed. Furthermore, since the functional site of the protein is prevented from being exposed on the substrate surface, a highly sensitive protein chip can be provided.
  • a protein containing a PDZ domain is immobilized on a substrate, the PDZ domain and SZT—X—V
  • the PDZ domain is stabilized by linking the affinity tag to the protein containing the PDZ domain, and the ability to bind the consensus sequence composed of ZLZI is impaired.
  • the binding force with the consensus sequence consisting of SZT-X-VZLZI can be kept strong.
  • the reason why the binding force between the PDZ domain and the consensus sequence is firmly maintained is not clear, but it is possible to stabilize the three-dimensional structure of the PD Z domain by binding to the affinity tag, or the PDZ domain can be directly connected to the substrate. This may be because the function is stable due to the unbonded V.
  • a protein tag is linked to a protein having a PDZ domain, and the protein having the PDZ domain is purified using the affinity tag as an index. Proteins with a pure PDZ domain can be immobilized.
  • the substrate on which the oligonucleotide is immobilized the oligonucleotide having a sequence complementary to the oligonucleotide, a protein having a PDZ domain, and an arbitrary consensus sequence comprising SZT-X-VZLZI
  • the oligonucleotide on the substrate and the oligonucleotide of the complex complementary thereto can be neutralized to obtain any protein. It is possible to array at any position on the substrate.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram schematically showing that the orientation of proteins to be analyzed bound to PDZ domain proteins is uniform.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a protein chip in which a protein having a PDZ domain linked with a property tag is immobilized on a substrate.
  • FIG. 3 PDZ domain protein is bound on the substrate, and any antibody with the SLV amino acid sequence added to the C-terminus of the heavy chain constant region is bound to the PDZ domain protein.
  • FIG. 4 is an explanatory view schematically showing a protein chip on which an SLV protein PDZ domain protein oligonucleotide is arranged.
  • FIG. 5 is an explanatory view schematically showing that the binding ability between an antibody and the protein to be analyzed (antigen) is reduced by contacting the antigen-binding site of the antibody with the substrate.
  • FIG. 6 is an explanatory view schematically showing that the three-dimensional structure of the protein is changed by placing the protein on the substrate, and the sensitivity to the molecules to be bound is reduced.
  • FIG. 7 is a diagram showing the degradability of a protein having a PDZ domain.
  • FIG. 9 is a view showing the ability of PDZ domain immobilized on a plate to capture ribosomal protein-SLV in a cell lysate.
  • FIG. 10 is a diagram showing the SLV specificity of the ability to capture GFP-SLV by the PDZ domain immobilized on the plate.
  • FIG. 11 is a diagram showing the capture of GFP-SLV via a Piotinylated oligonucleotide.
  • the protein chip of the present invention binds a protein having a PDZ domain as a capture agent for immobilization of an arbitrary protein on a substrate directly or via a nucleotide or the like on the substrate, and SZT— By binding an arbitrary protein to which a consensus sequence consisting of X—VZLZI is bound via the PDZ domain, the arbitrary protein is bound to the substrate.
  • the present invention provides a protein chip that suppresses a change in the three-dimensional structure of the arbitrary protein by being directly arranged on the substrate, or can align the alignment of the arbitrary protein on the substrate.
  • the protein chip of the present invention when a protein containing a PDZ domain is immobilized on a substrate,
  • the PDZ domain used in the present invention is not particularly limited as long as it is a PDZ domain capable of binding to a consensus sequence consisting of SZT-X-VZLZI.
  • human PDAP The PDZ domain of Fas associated phosphatase-1 can be used.
  • Human FAP1 protein has 6 PDZ domains. Of these, it is preferable to use the 3rd, 4th and 5th PDZ domains, more preferably the 3rd PDZ domain. Is good.
  • the PDZ domain used in the protein chip of the present invention is a PDZ domain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence having 80% or more, more preferably 90% or more homology with the amino acid sequence.
  • the protein having a PDZ domain may be a protein in which another protein or peptide is fused to the PDZ domain, or a protein in which the human FAP1 protein is shortened so that the PDZ domain is included. It may be.
  • a protein containing multiple PDZ domains can also be used, but a protein having a single PDZ domain is used to create a protein chip having a certain binding capacity for each array in which proteins are difficult to be decomposed. It is preferable.
  • SZT-X-VZLZI used in the present invention is a three amino acid force.
  • S represents serine
  • T represents threonine
  • V represents parin
  • L represents leucine
  • I represents isoleucine.
  • X is alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, ferrolanine, glycine, histidine, isoleucine, lysine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, anoleginin, serine, threonine, norin, tryptophan, tyrosine Force Indicates any amino acid selected.
  • (hyphen) indicates a peptide bond
  • the amino acids shown as options are separated by a Z (slash). That is, SZT indicates either serine or threonine.
  • LZl is the C-terminal amino acid of the protein.
  • the C-terminus may be any of a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO—), an amide (—CO NH 3) or an ester (—COOR), but a carboxyl group (—COOH).
  • the amino acid sequence of SLV is serine bite isine-parin (COOH).
  • the affinity tag to be linked to the PDZ domain used in the present invention is not particularly limited as long as it has an affinity for other substances, but a peptide tag having 20 amino acid residues or more is preferred.
  • GST Deepathione S-transferase
  • avidin examples thereof include a combined peptide, biotinylated peptide, cellulose binding protein, Strep tag-containing peptide, and thioredoxin.
  • a polypeptide in which two or more of these tags are fused can also be used as the affinity tag.
  • a particularly preferred affinity tag used in the present invention is an affinity tag comprising a fusion protein of GST and avidin.
  • avidin it is particularly preferable to use streptavidin with little nonspecific binding! /.
  • Examples of the substrate that can be used in the protein chip of the present invention include glass, metal, resin, fiber, quartz, semipermeable membrane, or a substrate using a biological material such as collagen or chitin. It is done.
  • the surface of the substrate can be coated with a substance having affinity for a protein such as a nitrocellulose film, a PVDF film, or a three-dimensional polyacrylamide gel.
  • the surface of the substrate can be modified with an aldehyde group or an epoxy group that reacts with a protein.
  • the shape of the substrate is not particularly limited, and may be a plate shape with a smooth surface, or a multi-well plate or a microwell plate in which recesses are arranged vertically and horizontally. Also, it may be a special shape like a sphere.
  • a method for immobilizing a protein containing a PDZ domain on a substrate there are a method of directly binding to a substrate and a method of binding via an oligonucleotide or the like.
  • This method includes immobilization by covalent bond and immobilization by noncovalent bond.
  • immobilization by non-covalent bonding include, for example, nitrocellulose (Non-Patent Document l: Hui Ge, 2000, Nucleic Acid Research, vol. 28 (2), e3) or PVDF membrane (Non-patent Document 2: Lucy J. Holt et al, 2000, Nucleic Acid Research, vol.28 (15), e72) includes a physical adsorption method in which a protein containing a PDZ domain is spotted in the manner of a dot plot.
  • Non-patent Document 3 Dmitry Guschin, 1997, Analytical Biochemistry, vol. 250 (2), pp.203-211). Fixation can also be carried out in the pores of HydroGel TM (Perkin Elma) based on a three-dimensional polyacrylamide gel.
  • HydroGel TM Perkin Elma
  • Piotin Z Streptavidin and Hexahistidine using modified proteins are used.
  • z Nickel interaction can also be used.
  • Non-patent Document 4 Gavin MacBeath, 2000, Science, vol. 289 (5485), pp. 1760-1763
  • carbides such as hafnium carbide, niobium carbide, silicon carbide, tantalum carbide, thorium carbide, titanium carbide, uranium carbide, tungsten carbide, zirconium carbide, or a mixture of these carbides with metals, ceramics, etc.
  • a surface treatment layer having a laminate strength is formed by sputtering or the like, and a group in which an active ester group is bonded to the end of the hydrocarbon group is fixed through an amide bond. It is also possible to activate the treatment layer and covalently bond the amino group at the protein end to this activated ester group (Patent Document 2: JP 2002-082116, Patent Document 3: JP 2003-014747). Publication).
  • proteins having a consensus sequence consisting of SZT-X-VZLZl at the C-terminus used in the present invention are not particularly limited, and proteins such as transcription factors, signal transduction factors, receptors, enzymes, etc. may be used in the PDZ domain.
  • the protein chip can be produced by fixing to a substrate via the substrate.
  • the protein to be assembled is labeled with a radioisotope or a fluorescent dye, and the labeled protein is spotted on the protein chip, whereby the protein to be assembled and the protein on the protein chip are separated.
  • the binding property can be measured by radiation or fluorescence.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram schematically showing a protein chip in which an arbitrary protein is bound to a PDZ domain protein immobilized on a substrate by the above method.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram schematically showing a protein chip in which a property tag is further linked to a protein having a PDZ domain in order to stabilize the PDZ domain. It is not clear why linking the affinity tag strongly maintains the binding force between the PDZ domain and the consensus sequence, but by binding to the affinity tag, the three-dimensional structure of the PDZ domain This may be because the structure is stable or the PDZ domain is not directly bonded to the substrate, so its function is stable.
  • the PDZ domain protein is bound on the substrate, and an arbitrary antibody having a consensus sequence consisting of SZT-X-VZLZI added to the heavy chain constant region C-terminus is added to the PDZ domain.
  • an arbitrary antibody having a consensus sequence consisting of SZT-X-VZLZI added to the heavy chain constant region C-terminus is added to the PDZ domain.
  • a protein chip to which this antibody is immobilized for example, a substance contained in a sample can be detected and quantified by another type of antibody on the chip.
  • Fig. 3 shows that a PDZ domain protein is bound on a substrate, and an arbitrary antibody having a consensus sequence consisting of SZT-X-VZLZl added to the C-terminus of the heavy chain constant region is bound to the PDZ domain protein.
  • 1 shows a protein chip that can bind an arbitrary protein to the antibody. In this protein chip, the binding ability between the antibody and an arbitrary protein is improved by inhibiting the protein binding site of the antibody from contacting the substrate.
  • SZT is added to the heavy chain constant region c-terminus by genetic engineering techniques in the antibody producing cell.
  • X The method of introducing a consensus sequence consisting of VZLZI and the method of using protein production / modification techniques using transgenic mice (including knock-in mice).
  • an antibody comprising a polypeptide corresponding to a part of the antigen recognition site of the antibody may be used instead of so-called immunoglobulin.
  • This polypeptide is a polypeptide that can bind to a target substance, and can be obtained, for example, by screening using a phage display method.
  • the present invention relates to a substrate on which an oligonucleotide is immobilized, an oligonucleotide having a sequence complementary to the oligonucleotide, a protein having a PDZ domain, and another protein having a consensus sequence consisting of SZT-X-VZLZI.
  • the protein having the PDZ domain is immobilized on the substrate via the oligonucleotide, and the PDZ domain and the SZT are further immobilized on the substrate by hybridizing the oligonucleotide on the substrate and the oligonucleotide of the complex.
  • FIG. 4 is a diagram schematically illustrating a method for producing a protein chip on which the above-described arbitrary SLV protein PDZ domain protein oligonucleotide is placed.
  • the same technique as the above-described protein immobilization method using a covalent bond or a non-covalent bond can be used.
  • the length of the oligonucleotide can be sufficiently combined with a complementary oligonucleotide, so there may be an error of several bases as long as it can be sufficiently combined.
  • proteins are arranged directly on a substrate, there is already a technology for integrating oligonucleotides on a substrate at a high density in a protein chip on which any SLV protein—PDZ domain protein—oligonucleotide is arranged. This has the advantage of collecting arbitrary proteins on a substrate at high density.
  • the method for producing a protein chip of the present invention includes the following steps.
  • step (D) a step of immobilizing the protein having the PDZ domain purified in the step (C) to a substrate;
  • examples of the method for expressing a protein in a cell or enzymatically synthesizing include the following methods. That is, as a method for obtaining a protein by expressing it in a cell, a host is transformed with an expression vector containing DNA encoding the target protein, and the resulting transformant is cultured to obtain the target protein. The method of manufacturing is mentioned.
  • a cell-free protein translation system such as a rabbit reticulocyte lysate, wheat germ lysate, or E. coli lysate is used, using RNA corresponding to the DNA encoding the target protein as a saddle type.
  • a method of in vitro synthesis is mentioned.
  • the affinity tag has affinity.
  • a purification method using beads or columns to which substances are bound is mentioned.
  • the method for immobilizing the protein having the PDZ domain on the substrate is as described in detail above.
  • step (E) in order to bind a protein having a PDZ domain to another protein, a consensus sequence consisting of SZT-X-VZL / I is placed on the substrate on which the PDZ domain is immobilized at the C-terminus.
  • the solution containing the other protein may be added with impurities other than the other protein.
  • the manufacturing method includes the following steps. (A) a step of expressing in a cell or enzymatically synthesizing a protein having a PDZ domain linked with a affinity tag;
  • a known method for producing a DNA array can be used as a method for immobilizing an oligonucleotide on a substrate.
  • a known method for producing a DNA array there are a method of fixing DNA while synthesizing the probe DNA one base at a time on a substrate by photolithography technology or ink jet technology, and a method for preparing probe DNA that has been synthesized separately beforehand. Examples of the method include immobilization on a substrate using mechanical micro spotting technology and inkjet technology.
  • step (E) as a method for linking an oligonucleotide to a protein having a PDZ domain, for example, avidin is used as a affinity tag, and a piotin-labeled oligonucleotide is passed through the avidin.
  • the method of connecting is mentioned.
  • Examples of the method for binding thiotin to the oligonucleotide include a method using an enzyme (Patent Document 12: International Publication No. 95Z04069 Pamphlet, Patent Document 4: JP-A No. 2003-153698, Patent Document 6: Special No. 2004-230545).
  • the sequences are different from each other.
  • a complex is prepared. Any protein can be fixed at any location on the substrate.
  • the present invention also provides a kit comprising a substrate on which an oligonucleotide is immobilized, and a protein having a PDZ domain bound to an oligonucleotide having a sequence complementary to the oligonucleotide.
  • This kit makes it possible to produce a protein chip in which an arbitrary protein is arrayed at a position on an arbitrary substrate even in a laboratory without a special apparatus.
  • CD NA derived from FAP-1 (Non-Patent Document 2: Sato, T “et al. Science 268, pp.411-415, 1995), HFAPD (FAP-1 3,898-5,712 (start codon is at position +64))
  • a DNA fragment containing the PDZ domain was prepared by PCR using the pGE X plasmid containing (SEQ ID NO: 2) as a template, and the streptavidin region (Stv) was prepared using the Streptomyces avidinii genomic DNA (ATCCF # 27149) as a PCR.
  • PDZ and Stv were sub-cloned into pBluescript II SK (Stratagene) pSK [KpnI / XhoI / HindIII]-Stv-PDZ, and the prepared plasmid was transformed into pGEX-6 Pl [BamHI / PCR fragments for insertion into SmaI (Amersham Biosciences) were prepared and tethered, and the primers used for PCR are listed below.
  • PDZ part of Stv-PDZ (Forward): 5 '-CCGCTCGAGAAGATGAATTTTAAAACT -3' (SEQ ID NO: 5)
  • E. coli BL21 transformed with the obtained plasmid was cultured (37 ° C, 3.5 hours, 4.5 hours at 25 ° C after addition of O.lmM IP TG), suspended in PBS, and then treated with lysozyme (final concentration) lmg / mL), and after ultrasonic disruption, Triton X-100 (final concentration 1%) was added and left at 4 ° C for 30 minutes, followed by centrifugation to prepare a supernatant as a cell lysate.
  • Dartathione Sepharose 4B (Amersham Biosciences) was added to this, mixed at 1 ° C at 4 ° C, and the beads were precipitated by centrifugation and washed with PBS (5 times).
  • Example 2 50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM It was suspended in NaCl, 5 mM DTT, 10% Glycerol (50% slurry), and this was used as the dartathione beads to which each GST fusion protein was bound. A portion was suspended in a sample buffer and heated, then fractionated by 10% SDS-PAGE, and the production of the fusion protein was confirmed by CBB staining (Quick-CBB, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As shown in FIG. 7, GST-HFA PD had a force that was partially decomposed. GST-Stv-PDZ had a relatively high molecular weight.
  • Example 2 50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM It was suspended in NaCl, 5 mM DTT, 10% Glycerol (50% slurry), and this was used as the dartathione beads to which each GST fusion protein was bound. A portion was suspended in a sample buffer and heated, then fractionated by 10% SDS-PAGE, and the production of
  • An expression plasmid for cultured cells of human ribosomal protein was prepared as an arbitrary protein having an SLV sequence at the C-terminus.
  • Human ribosomal protein-SLV is reverse transcribed from Human Reference Total RNA (Stratagene) using a primer set that contains a restriction enzyme recognition site on the 5 'side and an SLV codon, termination codon, and restriction enzyme recognition site on the 3' side.
  • a cDNA fragment prepared from the enzyme-prepared cDNA was prepared in a cage shape and inserted into EcoRI-XhoI or BamHI-XhoI of the expression vector pCMV-Tag-2B (Stratagene). The primers used for PCR are listed below.
  • the resulting human ribosomal protein-SLV expression plasmid was transferred to human kidney-derived 293T cells using FuGENE HD (Roche), and the recovered cells were 150m containing protease inhibitor cocktail (Roche).
  • a cell lysate was prepared by suspending in NaCl, 20 mM Tris-HC1 pH 7.4, ImM EDT A, 1% Triton X-100.
  • Each human liposomal protein-SLV was fractionated by 15% SDS-PAGE, Western blotted, and anti-FLAG antibody (Sigma, M2) that recognizes the FLAG peptide derived from vector 1 and anti-antibody as a secondary antibody.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • pGLO Bio-Rad
  • the GFP protein was obtained by inducing expression of pGLO (expressing wild-type GFP) and the constructed plasmid (GFP-SLV) in a arabinose-containing medium using Escherichia coli BL21, followed by hydrophobic chromatography (Bio-Rad Macro-Prep Simple purification with HIC carrier). The obtained crude protein fluoresced both GFP and GF P-SLV.
  • Jurkat cells expressing Fas molecules with SLV at the C-terminal were lysed with buffer (150 mM NaCl, 20 mM Tris—HCl pH8.0, ImM EDTA, 1% Triton X—100, protease inhibitor cocktail tablet [Roche]) After suspension, prepare a supernatant by centrifugation. In a tube containing the cell lysate, place the suspension of Dartathione beads prepared in Example 1 and bring the tube to 4 ° C. And mixed 1 turn. The beads collected by centrifugation are suspended in a cell lysis buffer and centrifuged to repeat washing, then the tube containing the remaining buffer and beads is heated, and the solution is 10% SDS-PAGE.
  • buffer 150 mM NaCl, 20 mM Tris—HCl pH8.0, ImM EDTA, 1% Triton X—100, protease inhibitor cocktail tablet [Roche]
  • nitrocellulose membrane Hybond C super, Amersham Biosciences. After blocking the filter (soaked in 5% skim milk or BSA), soaked in the primary antibody (anti-Fas antibody, sc-715, Suntacles) and secondary antibody labeled with HRP (anti-usagi IgG, BD Farmin) After immersion in JEN Co., Ltd., detection was performed with ECL. Fas molecule was confirmed in GST-Stv-PDZ together with GST-HFAPD, and it was confirmed that Fas molecule was captured and pulled down in PDZ domain Example 4
  • the ribosomal protein has a sequence encoding SLV at the C-terminal by PCR in the ribosomal protein cDNA as an example. SLV is added by amplification with primers, the PCR product is incorporated into an expression vector, transformed into cultured cells using the constructed plasmid, and prepared as a crude protein. Each ribosomal protein-SLV in the crude protein is added to the PDZ. We examined whether it was captured.
  • each ribosomal protein to which SLV was added in cultured cells was confirmed in advance by Western blotting as shown in Example 2 (1).
  • GST-Stv-PDZ beads or GST-PDZ (H FAPD) beads are added to the lysate of each confirmed cell and pulled down, Western blotted, and ribosomal protein-SLV on the filter is anti-FLAG. Detected by antibody. As a result, binding between various ribosomal proteins-SLV and PDZ domain was confirmed.
  • Cell lysate prepared from E. coli BL21 expressing GST-Stv-PDZ was bound to dalutathion beads, and eluted GST-Stv-PDZ was immobilized on a 96-well microplate, and purified GFP and GFP-SLV were stepped. After dilution, the captured GFP was detected with an anti-GFP antibody. As shown in Fig. 10, although non-specific binding was observed on the GST-immobilized plate when the protein amount of lOOug was added, GFP was hardly bound on the GST-Stv-PDZ plate. -Specific binding in SLV was confirmed.
  • Double-stranded DNA solution on each well of polystyrene microplate 50 ng each of DNA encoding ribosomal proteins S8, S12, S30, 450 ssDNA mixed, rapidly cooled after heating at 95 ° C for 5 minutes
  • 50 uL and 50 uL immobilization buffer 1.5N NaCl, 0.3M Tris— HC1 pH7.5, 0.3M MgCl
  • Pre-hybridization solution (6x SSPE, 0.05% Tween, 20mM EDTA, 5x Denhal tz, lOOng / uL ssDNA, 0.05% SDS) in each well, hold lOOuL, hold at 45 ° C for 30 minutes, and then room temperature in 5% BSA Soaked for 1 hour.

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Abstract

任意の蛋白質を生理的条件下に近い条件で維持することのできる蛋白質チップを提供する。ＰＤＺドメイン蛋白質を基板上に結合させ、当該蛋白質に結合する蛋白質のＣ末端にＳＬＶのアミノ酸配列を有する任意の蛋白質を結合可能とし、当該任意の蛋白質が基板上に配置することによる当該蛋白質の立体構造の変化を抑制すること、又は当該蛋白質の配向を揃えることを特徴とする、基板上にＰＤＺドメイン蛋白質を結合させた蛋白質チップとする。

Description

明 細 書
蛋白質チップ
技術分野
[0001] 本発明は、 PDZドメイン蛋白質と、 PDZドメインに特異的に結合する SZT— X— V
ZLZIからなるコンセンサス配列を有する蛋白質を利用した蛋白質チップ及びその 製造方法に関する。
背景技術
[0002] 蛋白質チップとは、ガラス基板等の基板上に、種々の蛋白質を結合させたものであ る。そして蛋白質チップ上に固定化されたそれぞれの蛋白質の機能を利用して、各 種診断、検査や、当該他の蛋白質と結合する分子の探索などに供されるものである。
[0003] 基板へ蛋白質を固定する方法には、蛋白質を基板表面へ受動的吸着により固定 化する方法、カップリング試薬を用いて蛋白質を基板に結合させる方法、蛋白のタグ を用いた生物学的な捕捉方法等がある。理想的には、固定ィ匕に再現性があり、蛋白 質の性質 (サイズ、親水性、疎水性)が異なっても同等の効率で固定ィ匕でき、尚且つ 大量処理と自動化に対応可能であること、更に固定化された蛋白質の活性が完全に 保持されるものであることが望まれる。
蛋白質を基板表面へ受動的吸着により固定ィ匕する方法としては、ナイロン、ニトロ セルロース、 PVDF、ポリアクリルアミドゲル、ポリ一 L—リジンゃァミノプロビルシラン 等で基板をコートし、その表面に蛋白質を吸着させる方法がある（非特許文献 1： Hui Ge, 2000, Nucleic Acid Research, vol.28(2), e3、非特許文献 2 : Lucy J. Holt et al., 2 000, Nucleic Acid Research, vol.28(15), e72、非特許文献 3 : Dmitry Guschin, 1997, Analytical Biochemistry, vol.250(2), pp.203— 211)。し力し、これらの方法は操作が容 易であるものの、定量性及び蛋白質分子の固定の方向性の制御が不可能である。ま た、固定ィ匕する蛋白質の活性保持が困難であり、再現性と効率も変動するため好ま しくない。
次に、カップリング試薬を用いて蛋白質を基板に結合させる方法としては、アルデヒ ド修飾ガラスを利用して、タンパク質を構成するアミノ酸の側鎖との間の反応性を利 用する方法（非特許文献 4 : Gavin MacBeath, 2000, Science, vol.289(5485), pp.1760 -1763)や、ガラス表面をエポキシ基で修飾して、これに蛋白質を固定ィ匕する方法が ある。これらの方法は、蛋白質を基板へ安定に固定ィ匕することができ、様々な蛋白質 にも適応でき、更に再現性が良いものの、固定ィ匕の方向性を完全に制御することは できず、カップリングに使用する化合物の誘導体が蛋白質の機能を変えてしまうこと もある。そのためこの方法を利用する場合には、固定ィ匕する蛋白質の機能を変化-消 失させな!/ヽカップリング剤と担体 (基板)表面との組み合わせを検討することが必要で ある。
最後に、蛋白質をタグとして用いた生物学的な捕捉法としては、ピオチン zストレブ トァビジンやへキサヒスチジン zニッケル相互作用を利用する方法等がある。これら の方法は、蛋白質と担体 (基板)表面との間に安定且つ特異的な結合を形成する方 法であり、尚且つ結合の方向性を制御することが可能である。
本発明者らは、以前に、ユニークな生物学的補足法を利用した蛋白質チップとして
、 PDZドメインと SZT—X—VZLZIからなるコンセンサス配列の相互作用により蛋 白質を基板に固定ィ匕する方法を開発した (特許文献 1 :米国特許第 6, 743, 630号 公報)。すなわち、基板上に PDZドメインを有する蛋白質を固定し、 S/T-X-V/ LZIからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質を加えることにより、該コンセンサ ス配列を介して当該他の蛋白質が当該 PDZドメインに結合し、 目的の蛋白質が基板 上に固定化されたチップを作成することができる。
尚、 PDZドメインと SZT—X—VZLZIからなるコンセンサス配列の相互作用を利 用した蛋白質チップの製造方法は、 FAP- 1 (Fas-associated phosphatase- 1)力 ァ ポトーシスシグナルを細胞内に伝達するため細胞表面に存在する Fas受容体の C末 端に相互作用するという、本発明者らの発見 (非特許文献 5 : Sato, T., et al. Science 268, 411-415, 1995)に基づく技術であり、その後の研究（非特許文献 6 :Yanagisawa, J. et al., The Journal of Biolgical Chemistry, 272, pp.8539- 8545, 1997)により、蛋白 質の C末端の SZT— X— VZLZlからなるコンセンサス配列が FAP— 1の PDZドメ インに結合することを見出したことから発案されたものである。
特許文献 1 :米国特許第 6, 743, 630号公報 特許文献 2 :特開 2002— 082116号公報
特許文献 3 :特開 2003— 014747号公報
特許文献 4：特開 2003— 153698号公報
特許文献 5：特開 2004 - 57113号公報
特許文献 6：特開 2004 - 230545号公報
特許文献 7：特開 2004 - 347317号公報
特許文献 8：特開 2004 -57113号公報
特許文献 9：特表 2002— 520618号公報
特許文献 10：特表 2002— 520620号公報
特許文献 11：特表 2006— 511797号公報
特許文献 12：国際公開第 95Z04069号パンフレット
特許文献 13：国際公開第 98Z05347号パンフレット
非特許文献 l : Hui Ge, 2000, Nucleic Acid Research, vol.28(2), e3
非特許文献 2 : Lucy J. Holt et al, 2000, Nucleic Acid Research, vol.28(15), e72 非特許文献 3 : Dmitry Guschin, 1997, Analytical Biochemistry, vol.250(2), pp.203- 2
11
非特許文献 4 : Gavin MacBeath, 2000, Science, vol.289(5485), pp.1760- 1763 非特許文献 5 : Sato, T" et al. Science 268, pp.411- 415, 1995
非特許文献 6 :Yanagisawa, J. et al., The Journal of Biolgical Chemistry, 272, pp.853 9-8545, 1997)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
PDZドメインと SLV配列の相互作用を利用した蛋白質チップは、従来にな ヽュ- ークな固定ィ匕方法に基づくものであり、その実用化が期待されるものであった。し力し 、 FAP— 1の全長蛋白質ではなぐ PDZドメインを含む部分長カゝらなる蛋白質を基板 に固定すると、 PDZドメインと SZT—X—VZLZIからなるコンセンサス配列との結 合力が十分でないという問題があった。その理由は明らかではないが、 PDZドメイン を含む部分長力もなる蛋白質を基板に固定した場合に、高次構造が不安定となって 機能が損なわれることが一つの理由として考えられる。
また、実用的な蛋白質チップを製造するためには、ノ ックグラウンドノイズの低減と チップの低コストィ匕が最大の解決すべき課題となる。ノ ックグラウンドノイズは、蛋白 質の非特異的な結合に由来するものである力 その最大の理由は、基板に固定する 蛋白質の精製が十分でないことによるものと考えられる。しかし、高純度の蛋白質を 得ようとすると、多大な時間と資材を要し、チップの低コスト化と両立できないという難 題が存在していた。純度の高い蛋白質を得る効率的な方法としては、タグと融合した 蛋白質を細胞内で発現させて、タグにより蛋白質を精製する方法があるが、蛋白質 によってはタグによりその機能が損なわれるものもあるため、高品質の蛋白質チップ を製造するためには好まし 、ものではなかった。
さらに、従来の蛋白質チップは、基板上に蛋白質を微細にスポットするにあたって、 インクジェット印刷装置又はキヤピラリーを備えた分注ロボット等を必要とするものであ つた。そこで、特別な装置を必要とせずに、研究室内で蛋白質を任意の配列にァレ ィすることができる蛋白質チップの開発が望まれていた。
課題を解決するための手段
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討し試行錯誤を重ねた結果、 PD zドメインを有する蛋白質にァフィ-ティタグを連結させると、基板に固定しても SZT —X—VZLZIからなるコンセンサス配列との結合力が大きく損なわれないことを見 出し、本発明の蛋白質チップを発明するに至った。
また、 PDZドメインを有する蛋白質に連結させたァフィ-ティタグを、蛋白質の精製 に使用するとともに、 PDZドメインと SZT—X—VZL/Iからなるコンセンサス配列の 強固な結合力を利用することによって、夾雑蛋白質が基板へ結合することを防ぎ、バ ックグラウンドノイズが低ぐ低コストで、高品質な蛋白質チップを製造することができ ることを見出し、本発明の蛋白質チップの製造方法を発明するに至った。
さらに、本発明者らは、オリゴヌクレオチドが固定された基板を用意し、基板上の任 意の位置のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、 PDZドメ インを有する蛋白質及び SZT— X— VZLZIからなるコンセンサス配列を有する任 意の蛋白質の複合体を作製し、当該任意の位置のオリゴヌクレオチドと複合体のヌク レオチドをハイブリダィズさせることによって、基板上の任意の位置に任意の蛋白質 をアレイすることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、次の（1)〜（14)の蛋白質チップ、その製造方法及びキットを 提供するものである。
(1) 基板；
ァフィ二ティタグが連結された PDZドメインを有する蛋白質；及び、
c末端に SZT—X—VZLZIからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質； を含み、
当該コンセンサス配列を介して当該他の蛋白質が当該 PDZドメインに結合した蛋 白質チップ。
(2) 前記基板が、オリゴヌクレオチドが表面に固定化された基板であり、 前記ァフィ二ティタグに、当該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌク レオチドが結合しており、
当該オリゴヌクレオチド及びこれに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをノヽィ ブリダィズさせたものである、 (1)に記載の蛋白質チップ。
(3) 前記ァフィ二ティタグが、 GSTとアビジンの融合蛋白質力もなるァフィ-ティタグ である、（1)又は（2)に記載の蛋白質チップ。
(4) 前記 PDZドメイン力 ヒトの FAP1蛋白質の PDZドメインである、（1)〜（3)のい ずれかに記載の蛋白質チップ。
(5) 前記コンセンサス配列力 SLVからなる配列である、（1)〜（4)のいずれかに記 載の蛋白質チップ。
(6) 蛋白質チップの製造方法であって、以下の工程を含む製造方法：
(A)ァフィ-ティタグが連結された PDZドメインを有する蛋白質を、細胞内で発現さ せ又は酵素的に合成する工程；
(B) C末端に SZT— X— VZLZIからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質 を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
(C)上記 (A)の工程で得られた PDZドメインを有する蛋白質を、ァフィ-ティタグを 指標にして精製する工程； (D)上記 (C)の工程で精製された PDZドメインを有する蛋白質を、基板に固定する 工程；
(E)上記 (D)の工程で PDZドメインを有する蛋白質が固定された基板に、上記 (B) の工程で得られた他の蛋白質を加えて、前記 PDZドメインを有する蛋白質と前記他 の蛋白質を結合させる工程。
(7) 蛋白質チップの製造方法であって、以下の工程を含む製造方法。
(A)ァフィ-ティタグが連結された PDZドメインを有する蛋白質を、細胞内で発現さ せ又は酵素的に合成する工程；
(B) C末端に SZT— X— VZLZIからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質 を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
(C)上記 (A)の工程で得られた PDZドメインを有する蛋白質を、ァフィ-ティタグを 指標にして精製する工程；
(D)基板にオリゴヌクレオチドを固定する工程；
(E)上記 (C)の工程で精製された PDZドメインを有する蛋白質に、当該 PDZドメイ ンを介して前記 (B)の工程で得られた他の蛋白質を結合させ、さらに、前記ァフィ二 ティタグを介して前記オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを 結合させて、蛋白オリゴヌクレオチド複合体を作製する工程；
(F)上記 (D)の工程により得られた基板に、上記 (E)の工程により得られた蛋白ォ リゴヌクレオチド複合体をカ卩えて、基板上のオリゴヌクレオチド及び複合体のヌクレオ チドをハイブリダィズさせる工程；
(8) 請求項 7に記載の蛋白質チップの製造方法であって、
前記 (B)の工程において、前記他の蛋白質が、複数種の他の蛋白質であり、 前記 (D)の工程において、前記オリゴヌクレオチド力 配列の異なる複数種のオリゴ ヌクレオチドであり、
前記 (E)の工程において、前記 PDZドメインに結合させる他の蛋白質の種類に応 じて、ァフィ-ティタグを介して結合させるヌクレオチドの種類を異ならせることを特徴 とする、蛋白質チップの製造方法。
(9) オリゴヌクレオチドが固定された基板、及び、当該オリゴヌクレオチドに相補的な 配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した PDZドメインを有する蛋白質を含むキット
(10) PDZドメイン蛋白質を基板上に結合させ、当該蛋白質に結合する蛋白質の C 末端に SZT— X— VZLZIからなるコンセンサス配列を有する任意の蛋白質を結 合可能とし、当該任意の蛋白質が基板上に配置することによる当該蛋白質の立体構 造の変化を抑制すること、又は当該蛋白質の配向を揃えることを特徴とする、基板上 に PDZドメイン蛋白質を結合させた蛋白質チップ。
(11) PDZドメイン蛋白質を基板上に結合させ、重鎖不変領域 C末端に SZT—X —VZLZIからなるコンセンサス配列が付加された任意の抗体を、当該 PDZドメイン 蛋白質に結合させ、当該抗体に任意の蛋白質を結合可能とし、当該抗体の蛋白質 結合部位が当該基板に接触することを抑制することにより、当該抗体と任意の蛋白質 との結合能力を向上させたことを特徴とする、重鎖不変領域 C末端に SZT—X—V
ZLZIからなるコンセンサス配列が付加された任意の抗体力 sPDZドメイン蛋白質に 結合させ、当該複合体を基板上に結合させた蛋白質チップ。
(12) 蛋白質の C末端に SZT— X— VZLZIからなるコンセンサス配列を有する任 意の蛋白質に対して、任意のオリゴヌクレオチドを連結した PDZドメイン蛋白質を結 合させ、当該オリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを配置させたマイクロアレイで あって、任意の蛋白質 PDZドメイン蛋白質 オリゴヌクレオチドを配置させる蛋白 質チップ。
(13) PDZドメイン蛋白質にアビジン標識若しくはピオチン標識をし、オリゴヌクレオ チドにピオチン標識若しくはアビジン標識を結合させることにより、アビジン標識及び ピオチン標識が結合することを利用した前記 PDZドメイン蛋白質と前記オリゴヌタレ ォチドとを結合させることを特徴とする（12)に記載の蛋白質チップ。
(14) 前記 SZT— X— VZLZIからなるコンセンサス配列力 SLV力もなる配列で あることを特徴とする、（10)〜（13)のいずれかに記載の蛋白質チップ。
ここで、 SZT— X VZLZIの各文字及び記号の意味は、 Sはセリンを、 Tはスレ ォニンを、 Vはパリンを、 Lはロイシンを、 Iはイソロイシンを、それぞれ示し、 Xは、ァラ ニン、システィン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、フエ-ルァラニン、グリシン、ヒスチジ ン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチォニン、ァスパラギン、プロリン、グルタミン、ァ ルギニン、セリン、スレオニン、ノ リン、トリプトファン、チロシンから選ばれる任意のアミ ノ酸を示す。また、 - (ハイフン）はペプチド結合を示し、選択肢として示されているァ ミノ酸は Z (スラッシュ）により隔てられている。すなわち、 SZTとは、セリン又はスレオ ニンの 、ずれかであることを示す。
発明の効果
本発明によれば、少なくとも PDZドメインを介して蛋白質が基板に固定されることに なるため、蛋白質が基板に直接結合することによって生じる、当該蛋白質の立体構 造の変化、機能の喪失'変化等、更に当該蛋白質の機能部位が基板表面に露出し ないことが抑制されることから、感度の高い蛋白質チップを提供することができる。 また、 PDZドメインを含む蛋白質を基板に固定すると、 PDZドメインと SZT—X—V
ZLZIからなるコンセンサス配列との結合力が損なわれてしまうという問題があった 力 本発明によれば、 PDZドメインを含む蛋白質にァフィ-ティタグを連結することに より、 PDZドメインを安定化させて、 SZT—X—VZLZIからなるコンセンサス配列と の結合力を強固に保つことができる。 PDZドメインとコンセンサス配列との結合力が 強固に保たれる理由は明らかではないが、ァフィ-ティタグと結合することにより、 PD Zドメインの立体構造が安定すること、あるいは、 PDZドメインが基板と直接結合しな V、ことにより、その機能が安定すること等が理由として考えられる。
そして、本発明の蛋白質チップの製造方法によれば、 PDZドメインを有する蛋白質 にァフィ-ティタグを連結させ、そのァフィ二ティタグを指標として PDZドメインを有す る蛋白質を精製するため、基板上に高純度の PDZドメインを有する蛋白質を固定す ることができる。そして、 SZT— X— VZLZIからなるコンセンサス配列を有する他の 蛋白質を添加すれば、当該他の蛋白質の純度が低ぐ夾雑蛋白質を多く含む場合 であったとしても、 PDZドメインと SZT— X—VZLZIからなるコンセンサス配列との 高い結合力により、 SZT—X—VZLZIからなるコンセンサス配列を有する蛋白質 のみが PDZドメインを介して基板に固定されることになるため、夾雑蛋白質が基板に 固定されることを防ぐことができる。すなわち、ノ ックグラウンドノイズの低い蛋白質チ ップを、複雑な精製工程を必要とせずに低コストで製造することが可能となる。さらに は、検体と反応する他の蛋白質には、わず力 3アミノ酸残基力 なる SZT— X— VZ LZIコンセンサス配列を付加するだけでよいため、検体と反応する他の蛋白質の機 能を損なう恐れがなぐ高品質の蛋白質チップを製造することが可能となる。
さらに、本発明によれば、オリゴヌクレオチドが固定された基板、並びに、当該オリゴ ヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、 PDZドメインを有する蛋白 質及び SZT—X—VZLZIからなるコンセンサス配列を有する任意の蛋白質の複 合体を用意することにより、特別な装置を備えていない研究室内においても、基板上 のオリゴヌクレオチドとそれに相補的な複合体のオリゴヌクレオチドをノヽイブリダィズさ せることによって、任意の蛋白質を任意の基板上の位置にアレイすることを可能とす る。
図面の簡単な説明
[図 1]PDZドメイン蛋白質に結合した解析対象蛋白質の配向が揃うことを模式的に示 す説明図である。
[図 2]ァフィ-ティタグを連結した PDZドメインを有する蛋白質を基板に固定させた蛋 白質チップを示す模式図である。
[図 3]PDZドメイン蛋白質を基板上に結合させ、重鎖不変領域 C末端に SLVのァミノ 酸配列が付加された任意の抗体を、当該 PDZドメイン蛋白質に結合させ、当該抗体 に解析対象の蛋白質を結合可能とし、当該抗体の蛋白質結合部位が当該基板に接 触することを抑制することにより、当該抗体と解析対象の蛋白質との結合能力を向上 させたことを模式的に示す説明図である。
[図 4]SLV蛋白質 PDZドメイン蛋白質 オリゴヌクレオチドを配置させる蛋白質チ ップを模式的に示す説明図である。
[図 5]抗体の抗原結合部位が基板に接触することにより、当該抗体と解析対象である 蛋白質 (抗原)との結合能力が低下したことを模式的に示す説明図である。
[図 6]蛋白質が基板上に配置することによる当該蛋白質の立体構造の変化を起こし、 結合すべき分子等との感受性が低下をしていることを模式的に示す説明図である。
[図 7]PDZドメインを有する蛋白質の分解性を示す図である。
[図 8]プレートに固定した PDZドメインによる細胞溶解液中のリボゾーム蛋白質 SL Vの捕捉能を示す図である。
[図 9]プレートに固定した PDZドメインによる細胞溶解液中のリボゾーム蛋白質- SLV の捕捉能を示す図である。
[図 10]プレートに固定した PDZドメインによる GFP— SLVの捕捉能の SLV特異性を 示す図である。
[図 11]ピオチンィ匕したオリゴヌクレオチドを介した GFP - SLVの捕獲を示す図である 符号の説明
1 · · '基板
2 " •解析対象蛋白質
3· · '解析対象蛋白質に結合する抗体
4· · '解析対象蛋白質に結合する分子
5· · •PDZドメイン蛋白質
5' · · ·ァフィ二ティタグ
6· · • SLVの配列であるペプチド
6，· • · SLVの配列であるペプチドを重鎖不変領域 C末端に有する抗体
7 " 'アビジン標識
8· · 'ピオチン標識
9· · •ォリゴヌクレオチド 1
lO- • ·ォリゴヌクレオチド 1に相補的なオリゴヌクレオチド 2
ll - • ·ォリゴヌクレオチドを固定した基板
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明を実施するための最良の形態について説明する力 本発明はこの 形態に限られるものではな 、。
本発明の蛋白質チップは、 PDZドメインを有する蛋白質を、任意の蛋白質の基板 上への固定ィ匕用捕捉剤として、基板上に直接的に又はヌクレオチド等を介して結合 させ、 c末端に SZT—X—VZLZIからなるコンセンサス配列が結合した任意の蛋 白質を、当該 PDZドメインを介して結合させることにより、当該任意の蛋白質が基板 上に直接的に配置することによる当該任意の蛋白質の立体構造変化を抑制し、又は 当該任意の蛋白質の基板上における配向を揃えることを可能にした、蛋白質チップ を提供するものである。
さらに、本発明の蛋白質チップは、 PDZドメインを含む蛋白質を基板に固定すると、
PDZドメインと SZT—X—VZLZIからなるコンセンサス配列との結合力が損なわれ るという問題を、 PDZドメインを有する蛋白質にァフィ-ティタグを連結させて、 PDZド メインを安定ィ匕させることにより解決したものである。
[0013] ここで、本発明で用いる PDZドメインとしては、 SZT—X—VZLZIからなるコンセ ンサス配列と結合することができる PDZドメインであれば特に限定されな 、が、例え ば、ヒトの FAPl (Fas associated phosphatase- 1)の PDZドメインを用いることができる 。ヒトの FAP1蛋白質は 6つの PDZドメインを有する力 これらのうち N末端から数えて 3, 4, 5番目の PDZドメインを使用するのが好ましぐより好ましくは 3番目の PDZドメ インを使用するのがよい。
また、本発明の蛋白質チップで用いる PDZドメインとしては、配列番号 1で示される アミノ酸配列からなる PDZドメイン、又は、当該アミノ酸配列と 80%以上、より好ましく は 90%以上の相同性のあるアミノ酸配列を有する PDZドメインを用いることができる 本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotecnnology Information Basic Local Alignment search οοΐ) を用い、以下の条件（期待値 =10；ギャップを許す；マトリクス =BLOSUM62；フィルタリ ング =OFF)にて計算することができる。
本発明における、 PDZドメインを有する蛋白質とは、 PDZドメインに他の蛋白質若し くはペプチドを融合した蛋白質であってもよぐまた、 PDZドメインが含まれるようにヒト の FAP1蛋白質を短くした蛋白質であってもよい。また、複数の PDZドメインを含む 蛋白質を使用することもできるが、蛋白質が分解されにくぐアレイごとに一定の結合 能を有する蛋白質チップを作成するためには、 1つの PDZドメインを有する蛋白質を 用いることが好ましい。
[0014] 本発明で用いる、 SZT—X—VZLZIからなるコンセンサス配列とは、 3アミノ酸力 らなる配列であって、 Sはセリンを、 Tはスレオニンを、 Vはパリンを、 Lはロイシンを、 I はイソロイシンを、それぞれ示す。 Xは、ァラニン、システィン、ァスパラギン酸、グルタ ミン酸、フエ-ルァラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチォ ニン、ァスパラギン、プロリン、グルタミン、ァノレギニン、セリン、スレオニン、ノ リン、トリ プトファン、チロシン力 選ばれる任意のアミノ酸を示す。また、 （ハイフン）はぺプ チド結合を示し、選択肢として示されているアミノ酸は Z (スラッシュ）により隔てられて いる。すなわち、 SZTとは、セリン又はスレオニンのいずれかであることを示す。 vZ
LZlは蛋白質の C末端のアミノ酸となる。
尚、 C末端は、カルボキシル基（- COOH)、カルボキシレート (- COO— )、アミド（-CO NH )またはエステル（-COOR)の何れであってもよいが、カルボキシル基（-COOH)
2
であることが好ましい。
[0015] SZT—X—VZLZIからなるコンセンサス配列のうち、 SLVからなる配列力 PDZ ドメインと最も強固に結合するため、特に好ましいものである。ここで SLVのアミノ酸配 列とは、セリン一口イシン一パリン（COOH)である。
本発明者らは、アポトーシス情報伝達系に関わる Fas/FAP- 目互作用の解析から 、 Fasのカルボキシル基 (C)末端部の 3アミノ酸（SLV)力FAP1の PDZドメインと強固 に結合することを明らかにし、その蛋白質 蛋白質結合のコンセンサスモチーフ（S/ T- X- V/L/I- PDZドメイン）を見出した（非特許文献 6 :Yanagisawa, J. et al.， The Jou rnal of Biolgical Chemistry, 272, pp.8539- 8545, 1997)。現在ヒトゲノムにおいて PDZ ドメインを持つ蛋白質は約 500種類あると考えられている力 その中でも SLV— PDZ ドメイン（FAP1)の結合特性が最も強い事が判明している。この 3アミノ酸の配列と同 じ配列が任意の蛋白質の C末端にある確率は、理論的には全ゲノム蛋白質数約 300, 000当たり、約 40以下である（約300,000720 20 20)。従って、この結合特異性を 用いれば、次世代プロテインチップの開発のみならず、蛋白質結合阻害剤のターゲ ットドラッグスクリーニングのアツセィ系を構築することが可能である。
[0016] 本発明で用いる、 PDZドメインに連結させるァフィ-ティタグとしては、他の物質との 親和性を有する物質であれば特に限定されな 、が、 20アミノ酸残基以上のペプチド タグが好ましぐ GST (ダルタチオン S—トランスフェラーゼ）、アビジン、マルトース結 合ペプチド、ビォチン化ペプチド、セルロースバインディングプロテイン、 Strepタグ 含有ペプチド、チォレドキシン等が挙げられる。また、これらのタグを二つ 2以上融合 させたポリペプチドをァフィ-ティタグとして用いることもできる。本発明で用いられる ァフィ-ティタグとして特に好ましいものとしては、 GSTとアビジンとの融合蛋白質から なるァフィ二ティタグが挙げられる。ここで、アビジンとしては、非特異的結合の少ない ストレプトアビジンを用いることが特に好まし!/、。
[0017] 本発明の蛋白質チップにおいて使用可能な基板としては、ガラス、金属、榭脂、繊 維、石英、半透性膜、又は、コラーゲン若しくはキチンなどの生物性材料を用いた基 板が挙げられる。
そして、基板の表面には、必要により、ニトロセルロース膜、 PVDF膜、 3次元ポリア クリルアミドゲル等の蛋白質と親和性を有する物質をコートすることができる。また、基 板の表面を、蛋白質と反応するアルデヒド基、エポキシ基等で修飾することもできる。 基板の形状としては、特に限定されず、表面が滑らかなプレート状であっても、縦横 に凹部を配列したマルチウエルプレート又はマイクロウェルプレートであってもよい。 また、球状のような特殊な形状のものであってもよ 、。
[0018] 基板に PDZドメインを含む蛋白質を固定する方法としては、直接基板に結合させる 方法と、オリゴヌクレオチド等を介して結合させる方法がある。
まず、基板に PDZドメインを有する蛋白質を直接固定する方法について以下に記 載する。この方法には、共有結合による固定化と非共有結合による固定ィ匕がある。 非共有結合による固定化としては、例えば、ニトロセルロース (非特許文献 l : Hui G e, 2000, Nucleic Acid Research, vol.28(2), e3)又は PVDF膜（非特許文献 2 : Lucy J. Holt et al, 2000, Nucleic Acid Research, vol.28(15), e72)に、 PDZドメインを含む 蛋白質をドットプロットの要領でスポットする物理吸着法が挙げられる。また、スライド ガラス上に厚さ 10〜： L00 mのポリアクリルアミドのパッドを接合して、これに蛋白を スポットする方法も挙げられる（非特許文献 3 : Dmitry Guschin, 1997, Analytical Bioc hemistry, vol.250(2), pp.203- 211)。 3次元のポリアクリルアミドゲルに基づく HydroGel ™ (パーキンエルマ一社)の多孔質内で固定ィ匕を行うこともできる。また、生物学的な 結合法として、修飾蛋白質を用いるピオチン Zストレプトアビジンやへキサヒスチジン zニッケル相互作用を利用することもできる。
[0019] 共有結合による固定化としては、例えば、アルデヒド修飾ガラスを利用して、タンパ ク質を構成するアミノ酸の側鎖との間の反応性を利用する方法 (非特許文献 4： Gavin MacBeath, 2000, Science, vol.289(5485), pp.1760- 1763)や、ガラス表面をエポキシ 基で修飾して、これに蛋白質を固定化する方法がある。また、スライドガラス表面上に 、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、 炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム等の炭化物、あるいはこれら炭化物 と金属やセラミックス等との混合体、積層体力 なる表面処理層をスパッタ法などによ り形成し、さらに、炭化水素基の末端に活性ィ匕エステル基が結合した基を、アミド結 合を介して固定ィ匕することによりこの表面処理層を活性ィ匕し、この活性化エステル基 に蛋白質末端のアミノ基を共有結合させることもできる（特許文献 2 :特開 2002— 08 2116号公報、特許文献 3：特開 2003— 014747号公報)。
[0020] 本発明で用いる、 C末端に SZT—X—VZLZlからなるコンセンサス配列を有する 他の蛋白質としては、特に限定されず、転写因子、シグナル伝達因子、リセプター、 酵素等の蛋白質を、 PDZドメインを介して基板に固定して蛋白質チップを製造するこ とができる。この蛋白質チップの利用方法としては、例えば、アツセィしたい蛋白質を 放射性同位体又は蛍光色素などで標識し、この標識した蛋白質を蛋白質チップにス ポットすることにより、アツセィしたい蛋白質と蛋白質チップ上の蛋白質との結合性を 、放射線又は蛍光により測定することができる。
[0021] 図 1は、上記の方法により、基板上に固定された PDZドメイン蛋白質に任意の蛋白 質を結合させた蛋白質チップを模式的に示す説明図である。
図 1に示すように、この蛋白質チップ上では、図 6に示す従来の蛋白質チップとは 異なり、結合した任意の蛋白質の立体構造が保たれ、配向が揃うので、感度の高い 結合解析を行うことが可能となる。
図 2は、 PDZドメインを安定ィ匕させるために、さらに、ァフィ-ティタグを PDZドメイン を有する蛋白質に連結した蛋白質チップを模式的に示す説明図である。ァフィ二ティ タグを連結させると PDZドメインとコンセンサス配列との結合力が強固に保たれる理 由は明らかではないが、ァフィ-ティタグと結合することにより、 PDZドメインの立体構 造が安定すること、あるいは、 PDZドメインが基板と直接結合しないことにより、その機 能が安定すること等が理由として考えられる。
[0022] 本発明の蛋白質チップにおいてはまた、 PDZドメイン蛋白質を基板上に結合させ、 重鎖不変領域 C末端に SZT— X— VZLZIからなるコンセンサス配列が付加された 任意の抗体を、当該 PDZドメイン蛋白質に結合させることにより、抗体がアレイされた 蛋白質チップを製造することができる。
この抗体が固定ィ匕された蛋白質チップを用いれば、例えば、サンプル中に含まれる 物質を、チップ上の他種類の抗体により検出'定量することが可能となる。
[0023] 図 3は、 PDZドメイン蛋白質を基板上に結合させ、重鎖不変領域 C末端に SZT— X—VZLZlからなるコンセンサス配列が付加された任意の抗体を、当該 PDZドメイ ン蛋白質に結合させ、当該抗体に任意の蛋白質を結合可能とした蛋白質チップを示 すものである。この蛋白質チップにおいては、当該抗体の蛋白質結合部位が当該基 板に接触することを抑制することにより、当該抗体と任意の蛋白質との結合能力が向 上している。
図 3に示すように、この蛋白質チップ上では、図 5に示す従来の蛋白質チップとは異 なり、抗体と任意の蛋白質との結合能が低下することはないので、感度の高い結合 解析を行うことが可能となる。
[0024] ここで、抗体の重鎖不変領域 C末端に SZT—X—VZLZIからなるコンセンサス 配列を付加する方法としては、抗体産生細胞内で遺伝子工学的手法により重鎖不 変領域 c末端に SZT— X— VZLZIからなるコンセンサス配列を導入する方法や、 トランスジェニックマウス (ノックインマウス含む)を用いた蛋白質の生産 ·修飾技術を 利用する方法などが挙げられる。
ここで、抗体としては、いわゆる免疫グロブリンの代わりに、抗体の抗原認識部位の 一部に相当するポリペプチドからなる抗体を用いてもよい。このポリペプチドは、目的 の物質に結合することができるポリペプチドであって、例えば、ファージディスプレイ 法を使用したスクリーニングにより得ることができる。
[0025] 基板に PDZドメインを含む蛋白質を固定する方法としては、基板に直接固定する 方法の他に、オリゴヌクレオチドを介して結合させる方法がある。 すなわち、本発明は、オリゴヌクレオチドが固定された基板、並びに、当該オリゴヌク レオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、 PDZドメインを有する蛋白質及 び SZT— X— VZLZIからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質の複合体を 調整し、当該基板上のオリゴヌクレオチドと当該複合体のオリゴヌクレオチドをハイブ リダィズさせることにより、基板上にオリゴヌクレオチドを介して PDZドメインを有する蛋 白質を固定し、さらに PDZドメインと SZT—X—VZLZIからなるコンセンサス配列と の結合を介して他の蛋白質を固定した、蛋白質チップを提供するものである。
[0026] 図 4は、上記した任意の SLV蛋白質 PDZドメイン蛋白質 オリゴヌクレオチドを配 置させる蛋白質チップの作成方法を模式的に説明する図である。
ここで、任意のオリゴヌクレオチドを基板上に結合させるには、上記した共有結合も しくは非共有結合による蛋白質の固定ィ匕方法と同様の手法を用いることができる。ま た、オリゴヌクレオチドの長さは、相補的なオリゴヌクレオチドと十分に結合ができるも のでよぐ十分に結合ができれば数塩基の誤差等があってもよい。任意の SLV蛋白 質— PDZドメイン蛋白質—オリゴヌクレオチドを配置させる蛋白質チップでは、基板上 に直接蛋白質を配置する場合と異なり、既に基板上に高密度にオリゴヌクレオチドを 集積させる技術があるので、これを利用して、任意の蛋白質を高密度に基板上に集 積させるという利点がある。
[0027] 以下、本発明の蛋白質チップの製造方法について、詳細に説明する。
本発明の蛋白質チップの製造方法は以下の工程を含む。
(A)ァフィ-ティタグが連結された PDZドメインを有する蛋白質を、細胞内で発現さ せ又は酵素的に合成する工程；
(B) C末端に SZT— X— VZLZIからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質を 、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
(C)上記 (A)の工程で得られた PDZドメインを有する蛋白質を、ァフィ-ティタグを指 標にして精製する工程；
(D)上記 (C)の工程で精製された PDZドメインを有する蛋白質を、基板に固定する 工程；
(E)上記 (D)の工程で PDZドメインを有する蛋白質が固定された基板に、上記 (B) の工程で得られた他の蛋白質を加えて、前記 PDZドメインを有する蛋白質と前記他 の蛋白質を結合させる工程。
[0028] 上記 (A)及び (B)の工程において、蛋白質を細胞内で発現させ又は酵素的に合 成する方法としては、例えば、次の方法が挙げられる。すなわち、細胞内で発現させ ることにより蛋白質を得る方法としては、目的の蛋白質をコードする DNAを含む発現 ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、目的の 蛋白質を製造する方法が挙げられる。また、酵素的に合成する方法としては、目的の 蛋白質をコードする DNAに対応する RNAを铸型として、ゥサギ網状赤血球ライセー ト、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなど力もなる無細胞蛋白質翻訳系を用い てインビトロ合成する方法が挙げられる。
上記方法において、目的の蛋白質をコードする DNAに、 SZT— X— VZLZIから なるコンセンサス配列をコードする DNAを連結した DNAを用いれば、 C末端に SZ T—X—VZLZlからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質を容易に得ることが できる。
[0029] 上記 (C)の工程において、（A)の工程で得られた PDZドメインを有する蛋白質を、 ァフィ-ティタグを指標にして精製する方法としては、例えば、ァフィ-ティタグに親和 性を有する物質が結合したビーズ又はカラムを用いて精製する方法が挙げられる。 尚、上記 (D)の工程において、 PDZドメインを有する蛋白質を基板に固定する方 法については、上記に詳述したとおりである。
また、上記 (E)の工程において、 PDZドメインを有する蛋白質と他の蛋白質を結合 させるためには、 PDZドメインが固定された基板に、 SZT— X— VZL/Iからなるコ ンセンサス配列を C末端に有する他の蛋白質を含む溶液を添加すればよぐ当該溶 液には他の蛋白質以外の不純物が混合していてもよい。このように、本発明の製造 方法においては、必ずしも他の蛋白質を精製する必要がないため、コスト低減にすぐ れ、また、他の蛋白質にはわず力 3アミノ酸配列を付加するのみでよいので、他の蛋 白質の機能を損なうことなぐ品質の高い蛋白質チップを提供することを可能とする。
[0030] 次に、オリゴヌクレオチドを介して PDZドメインが基板に連結した、本発明の蛋白質 チップの製造方法について説明する。当該製造方法は、以下の工程を含む。 (A)ァフィ-ティタグが連結された PDZドメインを有する蛋白質を、細胞内で発現さ せ又は酵素的に合成する工程；
(B) C末端に SZT— X— VZLZIからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質 を、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
(C)上記 (A)の工程で得られた PDZドメインを有する蛋白質を、ァフィ-ティタグを 指標にして精製する工程；
(D)基板にオリゴヌクレオチドを固定する工程；
(E)上記 (C)の工程で精製された PDZドメインを有する蛋白質に、当該 PDZドメイ ンを介して前記 (B)の工程で得られた他の蛋白質を結合させ、さらに、前記ァフィ二 ティタグを介して前記オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを 結合させて、蛋白オリゴヌクレオチド複合体を作製する工程；
(F)上記 (D)の工程により得られた基板に、上記 (E)の工程により得られた蛋白オリ ゴヌクレオチド複合体をカ卩えて、基板上のオリゴヌクレオチド及び複合体のヌクレオチ ドをハイブリダィズさせる工程。
[0031] 上記 (A)〜（C)の工程については、前述した方法により実施することができる。
また、上記 (D)の工程において、基板にオリゴヌクレオチドを固定する方法としては 、公知の DNAアレイの製造方法を使用することができる。公知の DNAアレイの製造 方法としては、 DNAをフォトリソグラフィー技術やインクジェット技術により基材上で一 塩基ずつ、プローブ DNAを合成させながら固定ィ匕する方法と、あらかじめ別途合成 させておいたプローブ DNAをメカ-カルマイクロスポッティング技術やインクジェット 技術で基材上に固定化する方法が挙げられる。
上記 (E)の工程において、 PDZドメインを有する蛋白質に、オリゴヌクレオチドを結 合させる方法としては、例えば、ァフィユティータグとしてアビジンを使用し、該ァビジ ンを介して、ピオチン標識したオリゴヌクレオチドを連結する方法が挙げられる。 オリゴヌクレオチドにピオチンを結合させる方法としては、酵素を使用する方法など 力 Sある (特許文献 12：国際公開第 95Z04069号パンフレット、特許文献 4：特開 200 3 - 153698号公報、特許文献 6：特開 2004 - 230545号公報)。
[0032] 本発明の一つの実施形態として、上記 (D)の工程において、互いに配列の異なる 複数のオリゴヌクレオチドを基板上に配列させ、上記 (E)の工程にぉ 、て複合体を作 製するにあたり、基板上の任意の場所のオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオ チドを使用することにより、任意の蛋白質を基板上の任意の場所に固定させることが 可能となる。
また、本発明は、オリゴヌクレオチドが固定された基板、及び、当該オリゴヌクレオチ ドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した PDZドメインを有する蛋白 質を含むキットを提供する。このキットにより、特別な装置を備えていない研究室内に おいても、任意の蛋白質を任意の基板上の位置にアレイした蛋白質チップを作製す ることが可能となる。
[0033] 以上、本発明の蛋白質チップについて、具体的な実施の形態を示して説明したが 、本発明はこれらに限定されるものではない。当業者であれば、本発明の要旨を逸 脱しな 、範囲内にお 、て、上記した蛋白質チップの各実施形態に様々な変更 ·改良 をカロえることが可能である。
実施例 1
[0034] PDZドメイン蛋白質、及び PDZドメイン-ストレプトアビジン蛋白質融合体産生系の構 築
FAP-1 (非特許文献 2 : Sato, T" et al. Science 268, pp.411- 415, 1995)由来の cD NA、 HFAPD (FAP- 1の 3,898〜5,712 (開始コドンは +64位） ) (配列番号 2)を含む pGE Xプラスミドを铸型に、 PCRによって PDZドメインを含む DNA断片を調製した。ストレブ トァビジン領域（Stv)は、 Streptomyces avidiniiのゲノム DNA(ATCCF # 27149)を铸型 に PCRで調製した。 PDZ及び Stvはー且 pBluescript II SK (ストラタジーン社）にサブク ローン化後 pSK[KpnI/XhoI/HindIII]- Stv- PDZ、作製したプラスミドを铸型に pGEX- 6 P-l[BamHI/SmaI] (アマシャムバイオサイエンス社）への揷入用の PCR断片を調製し 繋ぎ変えた。以下に PCRに使用したプライマーを記す。
[0035] pSK[KpnI/XhoI/HindIII]- Stv- PDZ作製用
Stv— PDZの Stv部分（Forward)： 5，— GGGGTACCACCATGGGCATCACCGGCACC TGG -3' (配列番号 3)
Stv— PDZの Stv部分（Reverse)： 5，— CCGCTCGAGAGCACCTTGGTGAAGGTGTC -3 (配列番号 4)
Stv-PDZの PDZ部分（Forward)： 5 ' -CCGCTCGAGAAGATGAATTTTAAAACT -3 ' (配列番号 5)
Stv- PDZの PDZ部分（Reverse)： 5， - CCCAAGCTTATCATCACTGTGGGGTTACC
GGGAC -3' (配列番号 6)
pGEX- 6P- l[BamHI/SmaI]- Stv- PDZ
(Forward) : 5， - CGGGATCCGGCGAATTGGGTACCACCATG- 3，（配列番号 7) (Reverse :M13 reverse) : 5， - GGAAACAGCTATGACCATG- 3，（配列番号 8)
[0036] 得られたプラスミドで形質転換した大腸菌 BL21を培養し (37°C、 3.5時間， O.lmM IP TG添加後 25°Cで 4.5時間）、 PBSに懸濁後、リゾチーム処理 (終濃度 lmg/mL) ,超音 波破砕後、 Triton X-100 (終濃度 1%)を加え 4°Cにて 30分放置後、遠心分離し上清を 細胞溶解液として調製した。これにダルタチオンセファロース 4B (アマシャムバイオサ ィエンス社)を加え 4°Cにて 1晚混合後、遠心分離にてビーズを沈殿、 PBSにて洗浄し (5回）、 50mM HEPES pH7.4, 150mM NaCl, 5mM DTT, 10% Glycerolに懸濁し（50% slurry)、これを各 GST融合蛋白質が結合したダルタチオンビーズとした。一部をサン プルバッファーに懸濁 ·加熱後、 10% SDS- PAGEで分画し、 CBB染色（Quick- CBB, 和光純薬工業社）により融合蛋白質の産生を確認した。図 7に示すように、 GST-HFA PDは一部分解が認められた力 GST-Stv-PDZは比較的分子量が保たれて 、た。 実施例 2
[0037] · C末端に SLV配列を有するヒトリボゾーム蛋白質の産生系構築
C末端に SLV配列を有する任意の蛋白質としてヒトリボゾーム蛋白質の培養細胞用 発現プラスミドを作製した。ヒトリボゾーム蛋白質- SLVは、 5'側に制限酵素認識部位 、 3'側に SLVのコドン、終始コドン及び制限酵素認識部位を含むプライマーセットを 用い、 Human Reference Total RNA (ストラタジーン社）から逆転写酵素により調製し た cDNAを铸型に PCR断片を調製し、発現ベクター pCMV- Tag- 2B (ストラタジーン社） の EcoRI〜XhoI若しくは BamHI〜XhoIに挿入した。以下に PCRに使用したプライマー を記す。
[0038] Sa Forward： 5， - GGGAATTCACCATGTCCGGAGCCCTTGATG- 3，（配列番号 9)
， (配列番号 10)
S4X
Forward： 5， -GGGAATTCACCATGGCTCGTGGTCCCAAG- 3， （配列番号 11)
CG-3' (配列番号 12)
S12
Forward： 5， -CGGGATCCACCATGGCCGAGGAAGGCATTG- 3， （配列番号 13)
T-3' (配列番号 14)
S14
Forward： 5， -GGGAATTCACCATGGCACCTCGAAAGGGG- 3， （配列番号 15)
AC-3' (配列番号 16)
S15
Forward： 5， -GGGAATTCACCATGGCAGAAGTAGAGCAG- 3， （配列番号 17)
GG-3' (配列番号 18)
し 5
Forward： 5 ' - GGGAATTCACCATGGGGTTGTTAAAGTTG- 3 ' (配列番号 19)
' (配列番号 20)
し 9
Forward： 5， - GGGAATTCACCATGAAGACTATTCTCAGC- 3， （配列番号 21)
Reverse： 5 ·
G-3' (配列番号 22)
L13a Forward： 5， - GGGAATTCACCATGGCGGAGGTGCAGGTCC- 3， （配列番号 23)
CT-3' (配列番号 24)
L17
Forward： 5 ' - GGGAATTCACCATGGTTCGCTATTCACTTG - 3 ' (配列番号 25)
T-3' (配列番号 26)
L18
Forward： 5， - GGGAATTCACCATGGGAGTGGACATCCGCC- 3， （配列番号 27)
G-3' (配列番号 28)
L28
Forward： 5， - GGGAATTCACCATGTCTGCGCATCTGCAATG- 3， （配列番号 29)
3' (配列番号 30)
L32
Forward： 5， - GGGAATTCACCATGGCCGCCCTCAGAC- 3， （配列番号 31) A-3' (配列番号 32)
[0039] 得られたヒトリボゾーム蛋白質- SLVの発現プラスミドは FuGENE HD (ロシュ社）を用 いてヒト腎臓由来 293T細胞にトランスフエクシヨンし、回収した細胞をプロテアーゼィ ンヒビターカクテル（ロシュ社）を含む 150m NaCl, 20mM Tris- HC1 pH7.4, ImM EDT A, 1% Triton X-100 に懸濁 '遠心分離により細胞溶解液を調製した。各ヒトリポゾ一 ム蛋白質- SLVは、 15%SDS-PAGEによる分画後、ウェスタンブロッテイングし、ベクタ 一由来の FLAGペプチドを認識する抗 FLAG抗体 (シグマ社， M2)、及び 2次抗体とし て抗マウス IgG-HRP (バイオ'ラッド社）に浸漬後、 ECLにて検出した。リボゾーム蛋白 質の種類によって発現の差があるものの発現が検出された。
[0040] (2) C末端に SLVを有する GFP蛋白質の産生系構築 GFP (Green Fluorescent Protein)の発現は、大腸菌にて発現するプラスミド pGLO ( バイオ'ラッド社)を铸型に以下のプライマーで増幅した GFPの C末端に SLVを付加し たアミノ酸配列をコードする PCR断片を Xhol, EcoRIで処理し、 pGLOの XhoI〜EcoRI 断片と入れ替えた。
[0041] Forward： 5 ' -ACAAACTCGAGTACAACTATA-3 ' (配列番号 33)
Reverse： 5 '— CGAATTCATTACACCAGAGATTTGTAGAGCTCATCCAT— 3 ' ( 配列番号 34)
[0042] GFP蛋白質は、 pGLO (野生型 GFPを発現)及び構築したプラスミド (GFP-SLV)を大 腸菌 BL21でァラビノース含有培地にて発現誘導させ、疎水クロマトグラフィー (バイオ 'ラッド社 Macro- Prep HIC担体）により簡易精製した。取得した粗蛋白質は GFP, GF P-SLV ヽずれも蛍光を発して!/、た。
実施例 3
[0043] プルダウンアツセィによる PDZドメインの Fas分子の捕捉
C末端に SLVを有する Fas分子を発現する Jurkat細胞を細胞溶解バッファー（150m M NaCl, 20mM Tris— HCl pH8.0, ImM EDTA, 1% Triton X— 100, protease inhibitor c ocktail tablet [ロシュ社])で懸濁後、遠心分離により上清を調製し、この細胞溶解液 を入れたチューブに、実施例 1にて調製したダルタチオンビーズ懸濁物をカ卩え、チュ ーブを 4°Cにて 1晚回転混合した。遠心分離により回収したビーズを、細胞溶解バッ ファーにて懸濁後遠心分離することにより洗浄を繰返した後、残存したバッファーとビ ーズが入ったチューブを加熱し、溶液を 10% SDS-PAGEにて分画後、ニトロセルロー ス膜（Hybond C super,アマシャムバイオサイエンス社）に転写した。フィルターをブロ ッキング (5%スキムミルク，若しくは BSAに浸漬)後、 1次抗体 (抗 Fas抗体， sc-715,サ ンタクルズ社）に浸漬し、 HRP標識した 2次抗体 (抗ゥサギ IgG, BDファーミンジェン社 )に浸漬後、 ECLにて検出した。 GST- HFAPDと共に GST-Stv-PDZにおいても Fas分 子が確認され、 PDZドメインに Fas分子が捕捉されプルダウンされることが確認された 実施例 4
[0044] プルダウンアツセィによる PDZドメインのリボゾーム蛋白質- SLVの捕捉 任意の蛋白質に対し SLVを付加させ、蛋白質- SLVが PDZに捕捉されるかどうかを 確かめるため、リボゾーム蛋白質を例として、リボゾーム蛋白質の cDNAに PCRで C末 端部に SLVをコードする配列を有するプライマーで増幅させることにより SLVを付加し 、 PCR産物を発現ベクターに組込み、構築したプラスミドで培養細胞に形質転換にて 発現させ粗蛋白質として調製し、粗蛋白質中の各リボゾーム蛋白質- SLVが PDZによ る捕捉されるかを検討した。なお、 SLVが付加された各リボゾーム蛋白質の培養細胞 内での発現は、実施例 2 (1)に示したように、予めウェスタンブロッテイングにて確認し た。発現が確認された各細胞の溶解液に GST- Stv- PDZビーズ若しくは GST- PDZ (H FAPD)ビーズを添カ卩しプルダウンさせ、ウェスタンブロッテイングし、フィルター上のリ ボゾーム蛋白質- SLVを抗 FLAG抗体によって検出した。その結果、各種リボゾーム蛋 白質- SLVと PDZドメインとの結合が確認された。
実施例 5
[0045] マイクロプレート上に固定した PDZドメインによる各種蛋白質- SLVの捕捉能試験
実施例 1にて調製した GST融合蛋白質が結合したダルタチオンビーズに、 50mM Tr is-HCl pH8.0、 10m還元型ダルタチオンを力卩ぇ溶出 '回収した溶液を PBS-Tにて透 祈し、各 GST融合蛋白質を調製後、 96穴マイクロプレートに 1ゥエル当たり 1 ug/100u L添加し 4°C一晩インキュベートし、 GST融合蛋白質を固相化した。溶液を除去し、 PB S-Tで洗浄，ブロッキング後、 C末端に SLVを有する任意の蛋白質を添加し固定した（ 室温にて 2時間)。検出は捕捉した抗原を認識する 1次抗体を結合'洗浄後、 HRP標 識した 2次抗体を結合し洗浄後、 ABTS Peroxidase Substrate (KPL社）にて発色させ 、 0.1% SDSにて反応を停止後、プレートリーダー（infinite M200,テカン社）にて 405η mの吸収を測定した。なお、 GFPの検出には、抗 GFP抗体- HRP (Miltenyi Biotec社） を使用し、 2次抗体は使用しな力つた。
[0046] (1)プレートに固定した PDZドメインによる細胞溶解液中のリボゾーム蛋白質- SLVの 捕捉能
GST-Stv-PDZを発現させた大腸菌 BL21から調製した細胞溶解液をダルタチオンビ ーズに結合させ、溶出 '透析した GST-Stv-PDZを 96穴マイクロプレートに固定し、段 階希釈したリボゾーム蛋白質- SLVを発現する 293T溶解液を添加した。捕捉されたリ ボゾーム蛋白質を抗 FLAG抗体で検出した。図 8に示すように、発現量が高ぐプル ダウンされる量が多く認められるリボゾーム蛋白質 Sa-SLVにおいてプレートに捕捉さ れることを確認した。また、同様に調製した GST-HFAP Aを固相化したプレートでも S1 4, S15, L9-SLV力 PDZ固相化プレートに捕捉されることを確認した（図 9)。
[0047] · プレートに固定した PDZドメインによる GFP-SLVの捕捉能の SLV特異性
GST-Stv-PDZを発現させた大腸菌 BL21から調製した細胞溶解液をダルタチオンビ ーズに結合させ、溶出した GST-Stv-PDZを 96穴マイクロプレートに固定し、精製した GFP及び GFP-SLVを段階希釈して加え、捕捉された GFPを抗 GFP抗体で検出した。 図 10に示すように、 GST固相化プレートにお 、て lOOugの蛋白量添加で若干非特異 的な結合が認められたものの、 GST-Stv-PDZプレートでは GFPは殆ど結合せず、 GF P-SLVにおいて特異的に結合することが確認された。
実施例 6
[0048] GST-Stv-PDZのピオチンオリゴヌクレオチドを介した固定
ポリスチレンマイクロプレートの各ゥエルに 2本鎖 DNA溶液（リボゾーム蛋白質 S8, S12, S30をコードする DNA各 50ngに ssDNAを 450ngを混合した溶液， 95°C5分加熱後急冷 ) 50uLと 50uLの固定化バッファー（1.5N NaCl, 0.3M Tris— HC1 pH7.5, 0.3M MgCl )
2 を加え、 37°Cにて 1晚インキュベートした。溶液を除去後、 37°Cにて 30分風乾し、 UV 固定（UV Stratalinker, Stratagene社）後、各ゥエルを 0.1M NaCl, 0.1M Tris- HC1 pH9 .3, 2mM MgCl , 0.1% Tween20にて 3回洗浄した。
2
各ゥエルにプレハイブリダィズ溶液（6x SSPE, 0.05% Tween, 20mM EDTA, 5x Denhal tz, lOOng /uL ssDNA, 0.05% SDS) lOOuLをカ卩え、 45°C30分保持後 5% BSAに室温に て 1時間浸漬した。 GST- Stv-PDZ 50ug(10nmole)に S12の配列を有する 5'末端にビ ォチンを標識したオリゴヌクレオチド： 号 35)
2 nmole dOO uM溶液を 20uL)を混合し室温にて 1時間放置後、続いて GFP-SLVを 50 ug添加し室温にて 1時間放置後、ハイブリダィズ溶液（6x SSC, 0.05% Tween, 20mM EDTA,脱イオン化フオルムアミド， 100ng/uL ssDNA, 0.05% SDS)に添カ卩し 300uLとし 、各ゥエルに lOOuLずつ分注した。 45°Cで 3時間インキュベーション後、同温の 6x SS PE, 0.05% Tweenにて洗浄後、 PBSTにて洗浄し、抗 GFP抗体- HRPを結合し呈色反 応の後検出した。図 11に示すように、 S12のゥエルで高い結合性を示すことから、 S12 の配列を有するピオチンィ匕オリゴを介した GFP-SLVの捕捉が示唆された。

Claims

請求の範囲
[1] 基板；
ァフィ二ティタグが連結された PDZドメインを有する蛋白質；及び、
c末端に SZT—X—VZLZIからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質； を含み、
当該コンセンサス配列を介して当該他の蛋白質が当該 PDZドメインに結合した蛋 白質チップ。
[2] 前記基板が、オリゴヌクレオチドが表面に固定化された基板であり、
前記ァフィ二ティタグに、当該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌク レオチドが結合しており、
当該オリゴヌクレオチド及びこれに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをノヽィ ブリダィズさせたものである、請求項 1に記載の蛋白質チップ。
[3] 前記ァフィ二ティタグが、 GSTとアビジンの融合蛋白質力もなるァフィ-ティタグであ る、請求項 1又は 2に記載の蛋白質チップ。
[4] 前記 PDZドメイン力 ヒトの FAP1蛋白質の PDZドメインである、請求項 1〜3のい ずれかに記載の蛋白質チップ。
[5] 前記コンセンサス配列力 SLVからなる配列である、請求項 1〜4のいずれかに記 載の蛋白質チップ。
[6] 蛋白質チップの製造方法であって、以下の工程を含む製造方法：
(A)ァフィ-ティタグが連結された PDZドメインを有する蛋白質を、細胞内で発現さ せ又は酵素的に合成する工程；
(B) C末端に SZT— X— VZLZIからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質を 、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
(C)上記 (A)の工程で得られた PDZドメインを有する蛋白質を、ァフィ-ティタグを指 標にして精製する工程；
(D)上記 (C)の工程で精製された PDZドメインを有する蛋白質を、基板に固定する 工程；
(E)上記 (D)の工程で PDZドメインを有する蛋白質が固定された基板に、上記 (B) の工程で得られた他の蛋白質を加えて、前記 PDZドメインを有する蛋白質と前記他 の蛋白質を結合させる工程。
[7] 蛋白質チップの製造方法であって、以下の工程を含む製造方法。
(A)ァフィ-ティタグが連結された PDZドメインを有する蛋白質を、細胞内で発現さ せ又は酵素的に合成する工程；
(B) C末端に SZT— X— VZLZIからなるコンセンサス配列を有する他の蛋白質を 、細胞内で発現させ又は酵素的に合成する工程；
(C)上記 (A)の工程で得られた PDZドメインを有する蛋白質を、ァフィ-ティタグを指 標にして精製する工程；
(D)基板にオリゴヌクレオチドを固定する工程；
(E)上記 (C)の工程で精製された PDZドメインを有する蛋白質に、当該 PDZドメイン を介して前記 (B)の工程で得られた他の蛋白質を結合させ、さらに、前記ァフィ-テ イタグを介して前記オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを 結合させて、蛋白オリゴヌクレオチド複合体を作製する工程；
(F)上記 (D)の工程により得られた基板に、上記 (E)の工程により得られた蛋白オリ ゴヌクレオチド複合体をカ卩えて、基板上のオリゴヌクレオチド及び複合体のヌクレオチ ドをハイブリダィズさせる工程；
[8] 請求項 7に記載の蛋白質チップの製造方法であって、
前記 (B)の工程において、前記他の蛋白質が、複数種の他の蛋白質であり、 前記 (D)の工程において、前記オリゴヌクレオチド力 配列の異なる複数種のオリゴ ヌクレオチドであり、
前記 (E)の工程において、前記 PDZドメインに結合させる他の蛋白質の種類に応 じて、前記ァフィ二ティタグを介して結合させるヌクレオチドの種類を異ならせることを 特徴とする、蛋白質チップの製造方法。
[9] オリゴヌクレオチドが固定された基板、及び、当該オリゴヌクレオチドに相補的な配 列を有するオリゴヌクレオチドが結合した PDZドメインを有する蛋白質を含むキット。
[10] PDZドメイン蛋白質を基板上に結合させ、当該蛋白質に結合する蛋白質の C末端 に SZT—X—VZLZIからなるコンセンサス配列を有する任意の蛋白質を結合可 能とし、当該任意の蛋白質が基板上に配置することによる当該蛋白質の立体構造の 変化を抑制すること、又は当該蛋白質の配向を揃えることを特徴とする、基板上に P DZドメイン蛋白質を結合させた蛋白質チップ。
[11] PDZドメイン蛋白質を基板上に結合させ、重鎖不変領域 C末端に SZT— X— VZ LZIからなるコンセンサス配列が付加された任意の抗体を、当該 PDZドメイン蛋白質 に結合させ、当該抗体に任意の蛋白質を結合可能とし、当該抗体の蛋白質結合部 位が当該基板に接触することを抑制することにより、当該抗体と任意の蛋白質との結 合能力を向上させたことを特徴とする、重鎖不変領域 c末端に SZT— X— VZLZI 力もなるコンセンサス配列が付加された任意の抗体力 PDZドメイン蛋白質に結合さ せ、当該複合体を基板上に結合させた蛋白質チップ。
[12] 蛋白質の c末端に SZT—X—VZLZIからなるコンセンサス配列を有する任意の 蛋白質に対して、任意のオリゴヌクレオチドを連結した PDZドメイン蛋白質を結合さ せ、当該オリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを配置させたマイクロアレイであつ て、任意の蛋白質 PDZドメイン蛋白質 オリゴヌクレオチドを配置させる蛋白質チ ップ。
[13] PDZドメイン蛋白質にアビジン標識若しくはピオチン標識をし、オリゴヌクレオチドに ピオチン標識若しくはアビジン標識を結合させることにより、アビジン標識及びビォチ ン標識が結合することを利用した前記 PDZドメイン蛋白質と前記オリゴヌクレオチドと を結合させることを特徴とする請求項 12に記載の蛋白質チップ。
[14] 前記 SZT— X— VZLZIからなるコンセンサス配列力 SLVからなる配列であるこ とを特徴とする、請求項 10乃至 13のいずれかに記載の蛋白質チップ。
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