KR100740891B1 - 금나노-펩타이드칩 및 이의 이차이온 질량분석법을 이용한효소 활성 및 효소 활성 저해효과 분석 방법 - Google Patents

금나노-펩타이드칩 및 이의 이차이온 질량분석법을 이용한효소 활성 및 효소 활성 저해효과 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다양한 지지체 상에 구성된 자기조립 단층막에 금나노입자의 단층막을 형성한 후 상기 금나노입자의 단층막에 펩타이드를 고정시킨 금나노-펩타이드칩에 관한 것이다.
상기 금나노-펩타이드칩에서 금나노입자는 펩타이드의 이차이온 질량 신호를 효과적으로 증폭시킬 수 있으므로, 펩타이드의 질량을 간단하고 정확하게 측정하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 금나노-펩타이드칩과 이차이온 질량분석을 이용하여 효소의 활성 및 효소활성에 대한 저해제의 저해도를 효과적으로 측정할 수 있다.
본 발명에 의하면, 세포 내 다양한 효소 활성을 빠르고 정확하게 분석할 수 있으므로 신호전달 및 상호작용 기전의 규명을 통하여 질병진단 및 신약개발에 중요한 방법을 제공할 수 있다.
금나노입자, 이차이온 질량분석, 신호증폭, 펩타이드칩, 효소 활성, 저해제 효과, 자기조립 단층막, 마이크로 패터닝, 이미징

Description

금나노-펩타이드칩 및 이의 이차이온 질량분석법을 이용한 효소 활성 및 효소 활성 저해효과 분석 방법{Novel construction of gold nanoparticle-based peptide chip, and assaying enzyme activity and inhibitor effect using secondary ion mass spectrometric analysis thereof}
도 1은 금 나노입자에 의해 증폭된 펩타이드의 이차이온 질량분석 스펙트럼.
도 2는 본 발명에 의한 금나노-펩타이드칩에서 키나아제 반응 전(A)과 후(B)의 이차이온 질량분석 스펙트럼.
도 3은 본 발명에 의한 금나노-펩타이드칩에서 PKA 키나아제 반응의 저해 효과에 대한 그래프.
도 4은 금 나노입자에 펩타이드 다중결합을 통한 키나아제 활성도의 동시분석을 나타낸 이차이온 질량분석 스펙트럼.
도 5는 마이크로 패턴 및 마이크로 어레이를 이용한 펩타이드의 이차이온 질량분석 이미징을 보여주는 개념도 및 사진.
본 발명은 금 나노입자를 이용한 펩타이드칩과 상기 금나노-펩타이드칩 상에서 금 나노입자에 의해 증폭된 펩타이드의 이차이온 질량신호를 이용한 효소활성의 탐색 및 측정에 관한 것이다. 또한 본 발명은 더 나아가 상기 금나노-펩타이드칩을 이용한 효소활성에 대한 저해제의 선별 및 저해도의 측정에 관한 것이다.
생체 내에서 중요한 역할을 담당하고 있는 다양한 효소들의 활성을 측정하는 일은 세포 내 신호전달, 분열 및 성장과정의 생체 메커니즘을 이해하는데 매우 중요하다. 예를 들어, 세포내에서 번역 후 과정에 관여하고 있는 키나아제(kinase)와 포스포타아제(phospotase)의 상호작용의 경우에는 세포내 다양한 질병관련 신호전달 과정과 밀접하게 연관되어 있다(Hunter, T. 2000, Cell, 100, 113-127). 일반적으로 효소의 활성을 측정하는 방법은 효소면역 진단방법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)과 같은 용액 내 항원-항체반응을 통하여 이루어지고 있으나 최근에 대량분석을 목적으로 단백질 칩 등을 이용하여 고체상(solid phase)에서 다양한 측정방법이 도입되어 왔다(MacBeath, G. and Schreiber, S. L. 2000, Science, 289, 1760-1763). 단백질 칩과 더불어 효소에 특이한 기질로서 작용하는 펩타이드를 적용한 펩타이드 칩 방법은 상대적으로 안정화된 기질표면을 제공하고 시스템과 손쉬운 합성 및 재현성 있는 결합방법 때문에 특이적인 효소의 활성도를 초고속으로 스크리닝 할 수 있는 방법으로서 크게 부각되고 있다 (Reimer, U., Reineke, U. and Schneider-Mergener, J. Cur. Opi. Biotech. 2002, 13, 315-320). 그러나 이러한 칩을 응용한 측정방법 역시 최종 분석단계에서는 주로 형광 또는 방사선 동위원소 등에 의존한 것으로서 기존 ELISA 측정법과 마찬가지로 표지방식으로 인하여 발생할 수 있는 실험적인 오차(표지로 인한 단백질 변형 및 표지자체의 비안정성으로 인한 오차 등)를 극복하지 못하고 있는 실정이다.
따라서 보다 안정성을 제공해 주는 펩타이드 칩에서 대표적인 비표지법으로 알려진 질량분석법이 적용될 경우, 직접적으로 펩타이드의 질량을 검출하는 방식으로 보다 정확하고 정밀한 방법을 제공해 줄 수가 있기 때문에 상당한 응용가치가 있다.
가장 널리 사용되고 있는 질량분석기는 전자스프레이 이온화 질량 분광법 (Electrospray ionization mass spectrometry)과 레이저 탈착/이온화 질량 분광법 (Matrix-assisted laser desorption/ inoization mass spectrometry, MALDI)이 있다. 질량분석기를 칩 표면에 응용한 기술로서는 MALDI를 응용한 SELDI (Surface-enhanced laser desorption/ ionization) 방법이 대표적이고, 기존 Mrksich 그룹에서는 MALDI를 사용하여 펩타이드 칩 위에서 효소의 활성도 측정 및 저해제 스크리닝을 위한 질량분석을 수행한 경우가 있다(Su, J. and Mrksich, M. Angew. Chem. 2002, 114, 4909-4912; D.-H., Tang, W-J. and Mrksich, M. 2004, Nanobiotech. 22, 717-723). 그러나, 최근에 이차이온질량분광법(Secondary ion mass spectrometry, SIMS)은 MALDI에 비해 매트릭스를 사용하지 않는 장점이 있기 때문에 낮은 질량범위에서 보다 재현성 있는 분석을 위해 적합한 것으로 알려져왔고, 수 나노미터의 표면분석에 아주 정확하고 민감한 것으로 보고되어 왔다(Belu, A. M., Graham, D. J. and Castner, D. G. 2003, Biomaterials, 24, 3635-3653). 또한, 빠른 스캐닝과 함께 질량분석 이미징에도 매우 효과적인 것으로 알려져 있어(Altelaar, A. F. M., van Minnen, J., Jimenez, C. R., Heeren, R. M. A. and Piersma, S. R. 2005, Anal. Chem. 77, 735-741), 이를 펩타이드 칩에 적용할 경우 그 응용력은 크게 배가될 것으로 기대한다.
그러나 이차이온 질량분광법의 능력은 MALDI에 비해 지금까지 제한된 질량측정 범위(대개 200Da 이내) 때문에 칩 표면위에서 생체물질을 직접 분석하는데 어려움이 있었고, 이를 극복하기 위해 다양한 이차이온 증폭방법들이 제안되어 왔다(Wu, K. J.; Odom. R. W. 1996, Anal. Chem. 68, 873-882; McArthur, S. L.; Vendettuoli, M. C., Ratner, B. D. and Castner, D. G, 2004, Langmuir 20, 3704-3709). 예를 들어, 알칼리 이온에 의한 양이온화(cationization)나 금 박막의 도포를 통한 이차이온증가 방법이 소개되어 왔고 최근에는 다원자가 이온 건(polyatomic ion gun)을 사용하여 이차이온 효율을 향상시키려는 노력이 있었으나, 여전히 낮은 신호향상 능력 및 표면 재현성의 부족으로 펩타이드 칩에 직접적으로 적용하기에는 아직까지 많은 어려움이 따르고 있다. 따라서, 단백질 칩에 비해 상대적으로 낮은 질량범위를 가지고 있는 펩타이드 칩의 효용가치를 높이기 위해서는 보다 간편하고 재현성 있는 표면구성과 함께 이차이온 질량분석에서의 효과적인 신호증폭 방법이 요구된다.
최근에 금 나노입자는 다양한 생명공학 분야에 적용되어 왔고, 특히 질량분 광법의 영역에서 금 나노입자는, MALDI에서 효과적인 매트릭스로서도 최근 사용된 예가 있으나(McLean, J. A., Stumpo, K. A. and Russell, D. H. 2005, J. Am. Chem. Soc. 127, 5304-5305) 용액 내에 목표물질과 먼저 섞고 난 후 표면위에서 측정한 것으로, 칩 표면위에서 직접적으로 적용된 사례는 아니다. 상기 전술된 Mrksich 그룹에서의 경우에서는, MALDI 매트릭스를 사용하여 측정한 것으로서 나노입자를 적용한 사례는 또한 아니다. 칩 표면에 나노입자를 직접 적용한 예는 표면수식 기술과 표지물질로 활용한 예들로서, 금 나노입자를 활용하여 표면에서 SPR (surface plasmon resonance)과 유사한 LSPR(localized surface plasmon resonance)현상을 유도하거나(Nath, N. and Chilkoti, A. 2004. Anal. Chem. 76, 5370-5378), SERS(Surface-enhanced Raman scattering)와 같은 라만분광법에 증폭된 표지물질로서 사용된 경우가 있다(He, L., Natan, M. J. and Keating, C. D. 2000, Anal. Chem. 72, 5348-5355; Cao, Y. C., Jin, R. Nam, J.-M., Thaxton, C. S. and Mirkin, C. A. 2003, J. Am. Chem. Soc. 125, 14676-14677). 그러나 현재까지 금 나노입자를 이용한 펩타이드칩과, 상기 펩타이드칩과 질량분석을 이용하여 다양한 생체물질과의 상호작용을 연구한 예는 알려져 있지 않다.
본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 이차이온 질량분석기를 통하여 펩타이드의 질량신호를 효과적으로 증폭할 수 있는 금나노-펩타이드칩을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 금나노-펩타이드칩을 이용하여 펩타이드의 질량을 표지없이 정확하게 측정할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 금나노-펩타이드칩을 이용하여 효소의 활성을 직접적으로 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한 상기 금나노-펩타이드칩을 이용하여 효소에 대한 저해제를 신속하고, 정확하게 선별하고 저해제의 저해도를 정량화하여 상호 비교할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 상기의 금나노-펩타이드칩 및 이차이온 질량분석기 이용하여 금나노-펩타이드칩 표면 위에서 빠른 이미징 스캐닝을 통하여 다양한 효소들의 활성을 동시 분석할 수 있는 금나노-펩타이드칩을 제공하는 것을 목적으로 한다.
전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일양태는 (A) 유리, 실리콘, 금속, 반도체 및 플라스틱으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 지지체; (B) 상기 지지체의 표면에 구성된 자기조립 단층막; (C) 상기 자기조립 단층막의 말단기와 금나노입자의 표면 작용기의 결합에 의해 자기조립 단층막 위에 형성된 금나노입자의 단층막; 및 (D) 상기 금나노입자에 의해 고정된 펩타이드;로 이루어진 금나노-펩타이드칩에 관한 것이다.
상기 자기조립 단층막(Self-assembled monolayers, SAMs)은 지지체의 표면에 입혀진 규칙적으로 정렬된 유기 분자 박막으로서 지지체와 이온결합을 이루는 알칸산(alkanoic acid)이나, 상이온 복합체(charge-transfer complex)를 형성하는 유기황(organosulfur)화합물 또는 순수한 공유결합을 이루는 유기규소(organosilicon)화합물을 사용하여 제조할 수 있다. 자기조립 단층막을 형성하는 화합물의 구체적인 예로는 n-alkanoic acid(CnH2n+1COOH)와, alkyl silanes으로서 akylchlorosilanes, akylalkoxysilanes, alkylaminosilanes 등의 화합물, 유기황 화합물로서 akanthiolates, n-alkyl sulfide, di-n-alkyl disulfides, thiophenols, mercaptopyridines, mercaptoanilines, mercaptoimidazoles 등을 들 수 있으며, 이 때 각 화합물에서 탄수의 수는 3~25개인 것이 바람직하다.
통상적으로 자기조립 단층막을 이루는 화합물들은 기질과 결합하는 머리부분의 반응기와 규칙적인 분자 막 형성을 가능하게 하는 몸통부분의 긴 알칸 사슬, 분자막의 기능을 좌우하는 말단부분의 작용기로 구성되어 있다. 상기 말단부분의 작용기로서, 가장 간단한 작용기로는 알킬기를 예로 들 수 있으며, 아민, 티올, 카르복실기, 알데하이드, 에폭시, 말레이마이드 중 하나 혹은 두개 이상의 혼합형태로 사용하는 것이 바람직하다.
자기조립 단층막은 상기 화합물을 대개는 2mM~10mM 농도 범위에서 제조한 후 상기 지지체를 용액속에 담그는 방법으로 행하여 진다. 이 때, 지지체 표면의 산화층을 먼저 제거하는 것이 바람직하며, 자기조립 단층막을 형성과정에서도 공기 중 산소에 의한 산화반응을 차단시키기 위해 질소분위기 하에서 반응하는 것이 바 람직하다. 지지체 상의 산화층은 지지체를 황산/과산화수소의 피라나(Pirana)용액을 5~10분간 처리하는 것에 의해 제거될 수 있다. 상기 자기조립 단층막 구성을 위한 화합물의 반응과정은 상온에서 2~24시간 반응시키는 것이 바람직하나 반응시간이 24시간을 넘는다고 하여도 자기조립 단층막 형성에 문제가 발생하는 것은 아니다. 보다 빠른 반응을 유도하기 위해서는 30~40℃에서 2시간만 반응시켜도 무방하다.
상기 금나노입자의 단층막은 자기조립 단층막 구성 후 분산액으로 제조된 금 나노입자를 표면위에 단층막으로 결합시키는 것에 의해 형성된다. 금나노입자의 분산액은 금염과 리간드를 각각 적절한 용매에서 용해시킨 후 두 용액을 혼합하고 교반하여 리간드가 금속 코아를 둘러쌈으로써 금나노입자를 안정화시켜 제조할 수 있다(Handley, D. E. In Colloidal Gold-Principles, Method, and Applications; Hayat, M. A., Ed.; Academic Press: New York, 1989; Vol 1, Chapter 2, 13-32). 사용되는 금염으로는 HAuCl4, NaAuCl4와 같이 통상적으로 금나노입자의 분산액 제조에 사용되는 것을 사용할 수 있으며, 리간드로는 시트레이트(citrate), n-알켄티올(n-alkanethiol), PEG-thiol(polyethyleneglycol thiol), dendrimer, alkylphosphine, alkylphosphine oxide, sulfur-containing ligands(H2S, (trimethylsilyl)2S, xanthate, disulfide, dithiol, trithiol, resorcinarene tetrathiol), (trimethylsilyl)3P, aryl isocyanine, acetone, iodine, PEG, starch 의 군에서 선택된 하나 혹은 둘 이상 혼합물이 사용될 수 있다.
자기조립 단층막과 금나노입자의 결합은 자기조립 단층막의 말단기와 금 나노입자 표면작용기 간의 이온결합이나 티올흡착 혹은 공유결합에 의해 이루어진다. 본 실시예에서는 중성용액에서 음이온을 띠고 있는 금 나노입자와 양이온을 띠고 있는 아민말단 자기조립 단층막 사이의 이온결합 방법을 예시하였으나 이에 한정되는 것은 아니다. 금나노입자 단층막의 구성을 위하여 지지체에 자기조립 단층막을 형성한 후 금나노입자의 분산액을 단층막 표면위에 뿌리거나 혹은 단층막 표면을 금나노입자 분산액에 담그는 방법으로 이루어진다. 상온에서 30분간 반응시키거나 4℃에서 1-2시간반응 시킨 후 표면을 다시 증류수로 씻어낸다. 상온에서의 반응시간이 길어질 경우 금나노입자 분산액이 응집을 일으킬 수 있으므로 1시간 이상의 반응은 피하는 것이 좋다. 보다 재현성 있는 표면을 유지하기 위해서는 금나노입자의 분산액을 일정한 유속으로 단층막 표면위에 흘려주는 방법이 바람직하다.
상기 금 나노입자의 크기는 1~50nm인 것이 바람직하다. 나노입자의 크기가 커질 경우 금나노입자간의 반발력이 커지기 때문에 밀도(단위표면당 부착된 금나노입자의 개수)가 작아지게 되어 금나노입자에 의한 효과를 보기가 어렵게 된다. 실시예에서 제조한 분산액에서의 금 나노입자의 크기를 확인한 결과, 전자현미경의 금 나노입자의 크기는 약 3.2nm (SD±0.4, n=100)로서 4℃에서 수십일간 안정성을 유지하였다. 금 나노입자 분산액을 아민말단을 가진 자기조립 단층막 면위에 결합한 후 원자현미경(AFM) 사진으로 분석한 결과도 분산액으로 합성된 금 나노입자와 동일한 크기로 고르게 분포되어 있음을 확인할 수 있었다(결과 미도시).
상기 펩타이드의 길이, 서열, 질량 등의 특성은 금나노-펩타이드칩의 제작 목적에 따라 적절하게 선택할 수 있는 임의의 것으로 특정한 서열을 가진 펩타이드에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서는 표면에 음이온전하를 띠고 있는 금나노입자와 펩타이드의 아민기간의 이온결합 또는 펩타이드의 시스테인을 이용한 티올흡착에 의한 결합을 이용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니며 사용되는 펩타이드와 금나노입자의 양태에 따라 물리적 흡착, 티올흡착, 공유결합, 소수성 결합 등이 이용될 수 있다. 본 결합을 위한 반응 용매로는 순수한 증류수나 완충용액(PBS, HEPES, Tris buffer 등)의 친수성 용매와 DMSO, Ethanol등의 유기용매를 사용할 수 있으나 보다 바람직하기로는 10~100 mM PBS 혹은 HEPES용액과 함께 중성 pH (6~7)을 유지하는 것이 바람직하다. 이 중 아민기를 가지고 있는 Tris 용액은 음이온전하를 띠고 있는 금나노입자 표면과 작용하여 펩타이드의 흡착을 방해할 수 있다. 펩타이드의 물에 대한 용해도가 작아 DMSO를 이용할 경우 DMSO의 최종 농도가 5% (v/v)를 넘지 않도록 유의하여야 한다.
금나노입자와의 반응은 상기 금나노-자기조립막을 펩타이드 용액내에서 상온혹은 4℃에서 0.5~2시간 침적시키는 것에 의해 진행된다.
상기 금나노-펩타이드칩은 금나노입자에 의해 형성된 단층막에서 금나노입자간의 빈 공간이 있는 경우에는 추후 이차반응에서 자기조립 단층막과 효소사이의 비특이적 흡착을 야기할 수 있다. 가령, 자기조립 단층막의 말단 부분으로 구성되는 아민, 티올, 카르복실기, 알데하이드, 에폭시, 말레이마이드와 같은 작용기가 금나노입자와 결합하지 않은 채 노출되어 있는 경우 효소의 극성을 가진 부분과의 이온결합 반응이나 효소의 비극성부분과의 소수성 결합에 의한 흡착이 일어날 수 있으므로, 금나노입자간의 공간을 메워 비특이적 결합을 방지하는 것이 바람직하다. 상기 금나노입자 간의 빈 공간은 화학적 폴리머로서 에틸렌글리콜 아민, 에틸렌글리콜 티올, N-hydroxysuccinimide(NHS)-에틸렌글리콜, maleimide-에틸렌글리콜 등의 에틸렌글리콜 계열의 화합물과 폴리에틸렌글리콜 아민, 폴리에틸렌글리콜 티올, (NHS)-폴리에틸렌글리콜, maleimide-폴리에틸렌글리콜 등의 폴리에틸렌글리콜 계열의 화합물, 혹은 생물학적 화합물로서 카르보하이드레이트 단위체 결합에 기초한 폴리머, 단백질 disulfide isomerase, bovine serum albumin으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물로 충진되는 것이 바람직하다.
상기 금나노입자간의 빈 공간의 충진은 금나노입자의 단층막에 펩타이드를 결합시킨 후 이루어지는 것이 바람직하다. 충진과정이 펩타이드 결합 전에 수행될 경우 금나노입자 표면을 사전에 덮을 수 있으므로 펩타이드 리간드의 결합을 방해할 수 있다. 보다 상세하게는 금나노입자의 단층막을 구성한 후 상기 화합물의 용액을 뿌려주거나 침지하거나 흘려주는 것에 의해 반응한다. 상기 화합물의 반응성 및 용해도 따라 사용되는 용매, pH, 완충용액 등은 다르게 결정될 수 있으나 표면에 부착된 금나노입자와 펩타이드에 영향을 주지 않는 범위내에서 유기용매보다는 pH 5-9범위의 완충용액이 적절하며 화합물의 농도는 2mM-10mM의 조건을 유지하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 일 양태는 상기 본 발명에 의한 금나노-펩타이드칩을 사용하여 이차이온 질량분석에 의해 펩타이드의 질량을 측정하는 방법에 관한 것이다.
사용될 수 있는 일차이온 소스로서는 As, Ga, Au, Bi, C60 등의 다양한 이온 소스 중 어느 하나를 사용할 수 있으며 사용된 일차이온 소스의 종류에 따라 신호증폭의 크기가 결정될 수 있다.
본 발명의 금나노-펩타이드칩은 이차이온 질량분석에서 펩타이드의 질량 신호를 효과적으로 증폭하기 때문에 펩타이드의 질량 측정에 효과적이다. 본 발명에 의한 금나노-펩타이드칩에서 금나노입자에 의한 펩타이드의 질량 신호 증폭효과를 확인하기 위하여 금나노입자가 없는 여러 가지 자기조립 단층막위에서의 펩타이드의 질량 신호와 금나노-펩타이드칩에서의 펩타이드의 질량신호를 비교하였다. 그 결과, 금나노입자가 없는 것보다 약 10배 정도의 신호증가 현상을 관찰할 수 있었으며, 이는 이차이온 질량신호 증폭에 보다 효과적인 것으로 보고된(Vendettuoli, M. C., Ratner, B. D. and Castner, D. G, 2004, Langmuir 20, 3704-3709) 방향족의 링구조를 가진 자기조립 단층막보다도 훨씬 효과적이었다. 더구나 상기의 신호 증폭 효과는 펩타이드의 집적도의 차이에 따른 농도효과가 아닌 것으로, 금 나노입자에 의존한 효과임을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 의한 금나노-펩타이드칩과 이차이온 질량분석을 사용하면 펩타이드의 질량을 보다 간편하고 정확하게 측정할 수 있다.
또한 본 실시예에서는 언급되지 않았으나 금 표면이 아닌 다른 지지체(실리콘과 유리기판)위에서 측정한 결과도 동일한 신호증폭 효과를 확인하였다. 펩타이드의 질량분석 신호의 크기는 기질표면의 구성에 있어서 지지체 및 형성된 자기조립 단층막의 차이에 따라 아민말단기의 집적도가 다를 수 있기 때문에 다르게 나타날 수 있으나, 다양한 지지체 위에서도 금 나노입자에 의한 질량 신호의 증폭 효과는 손쉽게 적용될 수 있다.
펩타이드의 질량 분석을 위해서는 상기 금나노-펩타이드칩에서 바람직하기로는 펩타이드의 질량이 1,500 Da을 넘지 않는 것이 좋으나 질량범위는 칩 표면위에 구성된 금 나노입자의 양에 비례하여 신호가 증가될 수 있으므로 구성되는 금 나노입자의 형태와 양에 따라 측정범위는 확장될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일양태는, (1) 이차이온 질량 분석에 의해 본 발명에 의한 금나노-펩타이드칩에서 펩타이드의 질량을 측정하는 단계; (2) 상기 금나노-펩타이드칩과 활성을 측정하고자하는 효소를 반응시키는 단계; (3) 상기 반응이 완료된 금나노-펩타이드 칩에서 펩타이드의 질량을 측정하는 단계; 및 (4) 상기 (1)단계에서 측정된 금나노-펩타이드의 질량과, 상기 (3)단계에서 측정된 펩타이드의 질량의 변화를 측정하여 효소의 활성을 확인하는 단계;로 이루어지는 효소 활성 검출 방법에 관한 것이다.
상기 효소는 키나아제, 포스파테아제, 프로티아제, 아세틸라아제, 메틸라아 제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 하나 이상의 효소일 수 있다.
상기 효소 활성 검출을 위한 금나노-펩타이드칩에서 펩타이드는 검출하고자 하는 효소의 종류에 따라 적절한 작용기를 가지도록 구성하는 것이 바람직하다. 상기 펩타이드의 예를 들면, 아민 혹은 카르복실기의 말단의 어느 한쪽에 시스테인이 부착된 형태, 라이신이나 아르기닌 등의 아민기가 부착된 형태, 위 형태를 제외한 펩타이드 자체의 아민 혹은 카르복시 말단만으로 구성된 형태 등으로서, 펩타이드의 길이(또는 질량)는 리간드의 종류에 따라 다양하게 적용할 수 있고 임의의 링커로서 길이를 조절할 수 있다. 보다 구체적으로 Abl 키나에제에 특이한 반응성을 갖는 펩타이드 리간드로서 IYAAPK의 경우, 상기예에서 언급하였듯이 IYAAPKC 혹은 CIYAAPK, IYAAPKK, IYAAPKR , IYAAPKGGGGC 등의 다양한 형태로서 수행될 수 있고 아민 말단쪽이 아세틸화되어 있거나 (Ac-IYAAPK) 카르복실기 말단쪽이 아민화되어 있거나(IYAAPK-NH 2 ) 혹은 두가지의 혼합형 (Ac-IYAAPK-NH 2 )이 가능하다. 각 종류의 펩타이드는 서로 다른 형태의 질량분석 패턴을 보여주기 때문에 실험목적에 적합하도록 사전에 펩타이드를 구성하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 일 양태로서, (1) 제 1 항에 의한 금나노-펩타이드칩과 효소의 혼합물로 이루어진 대조구과 금나노-펩타이드칩과 효소 및 시험물질의 혼합물로 이루어진 시험구를 각각 반응시키는 단계; (2) 상기 반응이 완료된 대조구와 시험구에의 금나노-펩타이드 칩에서 펩타이드의 질량을 각각 측정하는 단계; 및 (3) 상 기 (2)단계에서 각각 측정된 대조구와 반응구의 펩타이드의 질량을 비교하여 시험물질의 효소활성에 미치는 영향을 확인하는 단계;로 이루어지는 효소활성 저해제의 선별 방법에 관한 것이다.
상기 효소활성 저해제의 선별방법 및 하기 효소활성 저해도의 수치화 방법에 사용되는 효소나 펩타이드의 특성은 전술한 효소활성 검출방법에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명에 의한 효소활성 저해제의 선별방법은 좀 더 나아가 효소활성 저해도를 수치화시키는 데 응용될 수 있다. 즉, (1) 제 1 항에 의한 금나노-펩타이드칩과 효소 및 시험물질의 혼합물로 이루어진 시험구를 시험물질의 농도를 변화시켜 각각 반응시키는 단계; (2) 효소와 반응 전의 금나노-펩타이드칩과 상기 반응이 완료된 시험물질의 농도별 시험구의 금나노-펩타이드 칩에서 펩타이드의 질량을 각각 측정하는 단계; (3) 상기 (2)단계에서 각각 측정된 시험구에서 효소와 반응전의 펩타이드의 질량과 효소에 의해 변형된 펩타이드의 질량에 해당하는 피크의 비율로부터 계산된 저해도와 저해제의 농도간의 상관관계를 구하는 단계; 및 (4) 상기 (3) 단계에서 두 피크의 저해효과가 50%인 지점의 저해제의 농도를 구하는 단계;에 의해 상기 (4)단계에서 구해진 저해제의 농도로 효소활성 저해도를 수치화할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 구해진 저해도 수치를 시험물질간 상호 비교하는 것에 의해 효소활성 저해도를 상대 비교하는 것도 가능하다.
효소활성 저해제의 저해정도 측정 결과에 대한 정량분석의 표준화된 방법을 제시하기 위한 저해도 및 IC50값의 계산 방법은 실시예 4에 보다 상세하게 기술하였으므로 계산에 대한 구체적인 설명은 실시예에 있는 내용으로 갈음한다. 실시예에서는 키나아제에 대한 저해효과만을 예로 들었으나 이에 한정되는 것은 아니며, 다양한 효소반응에 대한 저해제의 효과를 탐지할 수 있고 보다 구체적인 정량반응 과정을 통해 IC50값을 정확하게 결정할 수 있다.
본 발명에 의한 금나노-펩타이드칩에는 금나노입자에 다수종의 펩타이드를 동시에 결합시키는 것에 의해 효소의 여러 가지 활성을 동시에 측정하는 것이 가능하다.
보다 상세하게는, 금 나노입자위에 2개 이상의 펩타이드가 결합되어 있는 칩을 이용하게 되면 여러 가지 효소를 서로 다른 위치에서 동시에 반응시켜 분석하는 동시 복합분석이 가능하다. 한가지 효소가 동시에 여러 가지 활성을 가질 경우, 여러 활성의 동시 분석이 가능한 것은 물론 당연하다. 상기의 방법에 의하면 많은 펩타이드를 집적화시킴으로써 다양한 효소 활성의 스크리닝을 보다 빠르게 측정할 수가 있다. 단, 펩타이드를 금 나노입자위에 여러개 결합시키기 위해서는 펩타이드 종류에 따라 결합되는 정도가 구조로 인한 접근능력에서 차이가 있을 수 있으므로 반응용액에서의 각 펩타이드의 농도를 조절하여 펩타이드 질량피크에서 동일한 크기를 얻을 수 있는 범위를 선택하는 것이 바람직하다.
상기 금나노입자에 다수종의 펩타이드를 동시에 결합시킬 경우, 상기 펩타이 드의 고정은 마이크로 어레이 또는 미세유로 패터닝에 의해 어레이될 수 있다. 다수종의 펩타이드가 자기조립 단층막 위에 어레이되어 있는 경우에는 질량분석 이미징을 이용하여 효소반응 전후의 이미지를 비교하는 것에 의해 효소활성을 고속으로 탐색할 수 있다. 질량분석 스펙트럼과는 달리, 질량분석 이미징 기법은 특정 면적 내에서 일정시간동안 발생된 이차이온을 획득한 후 정보를 저장하게 되면 이후 원하는 질량범위를 빠르게 탐색하여 측정면적 내에서의 해당 질량을 갖는 물질의 분포를 정확하게 예측할 수 있는 장점이 있다.
이하, 실시 예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 : 금나노-펩타이드칩의 제조
1) 금나노-(Ac-PRNYVTP-NH2)칩의 제조
실리콘 위에 티타늄(Ti 20Å)과 금(Au, 400Å)을 순서대로 도금한 기판을 황산/과산화수소의 피라나 (Pirana) 용액에 5분간 담근 후 꺼내어 증류수로 세척하였다.
상기 기판에 자기조립 단층막을 구성하기 위하여 기판을 질소분위기 하에서 2mM의 농도의 11-mercaptoundecylamine(MUAM), Dojindo) 에탄올 용액에 2시간 동안 침적하였다가 꺼내어 에탄올로 세척하였다.
순수한 증류수 97.3mL에 300 mM HAuCl4ㆍ3H2O(Aldrich) 수용액 85 μL를 첨가하여 1분간 교반한 후 1 % C6H5Na3O7ㆍ2H2O 수용액(trisodium salt, Sigma) 1 mL를 첨가한 후 추가로 2분간 교반을 지속하였다. 교반이 완료되면 상기 용액에 300 mM NaBH4(Sodium borohydride, Sigma) 수용액 85 μL을 첨가한 후 상온에서 추가로 10분간 교반하여 금나노입자 분산액을 제조한 후 4 ℃에 보관하여 사용하였다. 자기조립 단층막을 구성한 기판을 상기의 방법에 따라 제조한 금나노입자 분산액에 30분동안 담근 후 증류수로 세척하여 금나노-자기조립 단층막을 구성하였다.
펩타이드 Ac-PRNYVTP-NH2(Peptron Co. Ltd.)를 10mM 인산완충 용액 (phosphate buffer saline, pH 7.4)에 녹여 펩타이드의 최종농도가 50 mM가 되도록 제조하여 결합에 사용하였다. 금나노-자기조립막을 상온에서 펩타이드 용액 내에서 1시간 동안 침적시킨 후 꺼내어 증류수로 세척하고 질소가스를 사용하여 건조하여 금나노-(Ac-PRNYVTP-NH2)칩을 제조하였다.
2) 금나노-(Ac-PRNYpVTP-NH2)칩의 제조
펩타이드로 Ac-PRNYVTP-NH2 대신 Ac-PRNYpVTP-NH2를 사용한 것을 제외하고는 1)과 동일한 방법에 의해 금나노-(Ac-PRNYpVTP-NH2)칩을 제조하였다.
3) 금나노-(Ac-IYAAPKKGGGGC)칩의 제조
실리콘 기판을 황산/과산화수소의 피라나 (Pirana) 용액에 5분간 담근 후 꺼내어 증류수로 세척하였다.
상기 기판에 자기조립 단층막을 구성하기 위하여 기판을 질소분위기 하에서 10% 3-(Aminopropyl)triethosysilane(3-APTES, Aldrich) 메탄올 용액에 2시간 동안 침적하였다가 꺼내어 메탄올로 세척하였다. 1)과 동일한 방법에 의해 금나노-자기조립단층막을 구성한 후 펩타이드 Ac-IYAAPKKGGGGC(Peptron Co. Ltd.)를 10mM 인산완충 용액 (phosphate buffer saline, pH 7.4)에 녹여 펩타이드의 최종농도가 50 mM가 되도록 제조하여 결합에 사용하였다. 금나노-자기조립막을 상온에서 펩타이드 용액 내에서 1시간 동안 침적시킨 후 꺼내어 증류수로 세척하고 질소가스를 사용하여 건조하였다.
폴리에틸렌글리콜(mPEG-SMB-2000, Nektar)을 50mM sodium bicabonate buffer(pH 8.5)에 최종농도 5mM로 녹인 후 상기 펩타이드가 결합된 칩을 담궈서 상온에서 30분간 반응한 후 증류수로 세척하여 금나노-(Ac-IYAAPKKGGGGC)칩을 제조하였다.
4) 금나노-(Ac-IYAAPKKGGGGC +Ac-LRRASLGGGGC)칩의 제조
펩타이드로 Ac-IYAAPKKGGGGC 대신 Ac-IYAAPKKGGGGC와 Ac-LRRASLGGGGC를 혼합 하여 사용한 것을 제외하고는 3)과 동일한 방법에 의해 금나노-(Ac-PRNYpVTP-NH2)칩을 제조하였다.
5) 마이크로 패터닝에 의한 금나노-펩타이드칩의 제조
상기 1)의 공정에 따라 자기조립 단층막을 구성하고, 금 나노입자의 분산액을 제조한 후 제조된 250 μM 금 나노입자 분산액를 SPR 장비(BIAcore-X, Sweden)에 장착된 미세유로 채널을 통해 3 ㎕/min 속도로 30분간 표면에 흡착시킨 후 증류수를 흘려주어 표면을 세척하였다.
이후, 50 mM 농도의 펩타이드 P1(Ac-PRNYVTP-NH2)을 먼저 채널 1에 약 3 ㎕/min의 속도로 30분간 흘려준 후, 50mM 농도의 펩타이드 P2(Ac-PRNYpVTP-NH2)를 채널 2에 같은 방법으로 흘려주고 증류수로 세척하고 질소가스를 사용하여 건조하였다.
이때, 미세유로 채널 하나의 폭은 약 500 ㎛이고 채널사이의 간격은 100 ㎛이었다.
실시예 2 : 금나노-펩타이드칩을 이용한 펩타이드의 이차이온 질량 분석
상기 금나노-펩타이드칩에서 펩타이드의 이차이온 질량 분석을 수행하여 금나노입자에 의해 펩타이드의 이차이온 질량신호가 증폭되는 것을 확인하였다. 이 차이온 질량분석은 TOF-SIMS V(ION-TOF GmbH)를 사용하여 Au1 + 혹은 Bi1 + 일차 이온으로(25 KeV) 표면의 static 조건(< 1013 ion/cm2)에서 수행하였다. 측정 표면적은 500×500μm2였으며, 측정결과 CH3 + , C2H3 + , Au1 + 에 대한 피크의 해상도는 모두 5,000이상을 유지하였다.
금나노입자에 의한 펩타이드의 질량신호 증폭효과를 비교하기 위하여 상기 실시예 1의 1) 및 2)에서 제조한 금나노-(Ac-PRNYVTP-NH2)칩 및 금나노-(Ac-PRNYpVTP-NH2)칩과 함께 금나노입자가 없는 상기 서열의 펩타이드칩을 제조하여 함께 펩타이드의 이차이온 질량분석을 실시하여 그 결과를 도 1에 도시하였다. 보다 구체적으로 자기조립 단층막의 구성을 위하여 11-mecaptoundecanoic acid(MUA)(도 1의 A1, A2), 6-mercaptonicotinic acid(MNA)(도 1의 B1, B2) 또는 MUAM(도 1의 C1, C2)을 각각 사용하여 자기조립 단층막을 구성하고, 금나노입자의 단층막 형성을 위한 금나노입자 분산액의 처리공정을 생략한 것을 제외하고는 실시예 1의 1) 및 2)의 공정과 동일한 공정으로 카르복실기 말단이 아민으로 치환된 Ac-PRNYVTP-NH2(P1) 및 인산기가 붙은 형태의 Ac-PRNYpVTP-NH2(P2)칩을 각각 제조하여 MUAM위에 금 나노입자와 함께 펩타이드를 흡착한 금나노-펩타이드칩(도 1의 D1, D2)과 함께 이차이온 질량분석 결과를 비교하였다.
도 1의 이차이온 질량분석의 양이온 스펙트럼에서 P1과 P2펩타이드의 주된 신호는 수소이온이 결합된 형태의 [M+H]+로 검출되었는데 P1과 P2모두 금 나노입자가 없는 것보다는 약 10배정도의 신호증가 현상을 관찰할 수 있었다. 특히, 방향족의 링구조를 가진 자기조립 단층막인 MNA는 이차이온의 신호증폭에 보다 효과적인 것으로 보고된 바 있으나, 본 발명에 의한 금나노-펩타이드칩에서는 이보다 높은 신호증폭이 관찰되었다.
금 나노입자위에 결합된 펩타이드의 양을 SPR(BIAcore-X, Sweden)을 사용하여 측정해본 결과, A1, C1 및 D1의 칩에 각각 15ng/cm2, 37ng/cm2, 52ng/cm 2 이 결합되어 있어, D1의 경우 C1보다 약 1.4배 정도 많은 양의 펩타이드가 결합되어 있었다(결과 미도시). 그러나 MUA(A1)에서 보다는 MUAM(C1)의 자기조립 단층막에 많은 펩타이드의 양이 결합되어 있음에도 불구하고 실제 신호는 MUA에서 다소 높게 측정된 것으로부터, 펩타이드의 질량신호의 크기는 펩타이드의 양에 비례하는 것은 아님을 알 수 있다. 따라서 약 10배가량의 신호증폭 효과는 펩타이드의 농도효과가 아닌, 금 나노입자에 의한 증폭 효과로 해석할 수 있다.
실시예 3 : 키나아제 반응에 대한 이차이온 질량분석 측정 결과
Abl 키나아제(Calbiochem), ATP 및 MgCl2의 최종 농도가 각각 2U, 150 μM, 30 mM가 되도록 50mM Tris 용액(pH 7.5, 0.05 mM EDTA, 1mM DTT, 0.015 % Tween-20, 0.1 mg/mL BSA 포함)에 첨가하여 반응액을 제조한 후, 실시예 1의 3)에서 제조한 금 나노입자가 결합된 펩타이드 칩 위에서 30℃에서 2시간동안 반응하였다. 키나아제의 반응 후에 실시예 2와 동일한 방법에 의해 이차이온 질량 분석을 실시하고 그 결과를 도 2에 도시하였다. 이차이온 질량분석은 실시예 2와 동일하게 TOF-SIMS V를 사용하여 25 KeV의 에너지로 표면의 static 조건(< 1013 ion/cm2)에서 수행하였고 Au1 + 혹은 Bi1 + 일차 이온이외에 Au1 - 혹은 Bi1 - 음이온 모드에서도 수행하였다. 측정 표면적은 동일하게 500×500 μm2였으며, 측정결과 CH3 + , C2H3 + , Au1 + 의 양이온과 C - , CH-, C2 -, C2H-의 음이온 피크의 해상도는 모두 5,000이상을 유지하였다.
도 2의 양이온 스펙트럼에서는 아민말단에 시스테인이 부착된 펩타이드 분자량 수준에서 관찰되는 질량변화와([M-SH-COO]+→[M-SH-COO+HPO 3 ]+), 티로신(tyrosine) 부근의 질량변화 ([Tyr-COOH]+→[Tyr-COOH+HPO 3 ]+)가 관찰되었고, 음이온 스펙트럼에서는 인산이온(PO 2 - , PO 3 - , H 2 PO 4 - )이 검출되었다. 따라서 금나노-펩타이드칩 위에서 펩타이드와 키나아제의 반응에 의해 펩타이드에 인산화가 일어난 것을 확인할 수 있었다.
본 실시예를 통하여, 금나노-펩타이드칩의 효소 반응에 의한 펩타이드의 질량변화를 측정하여 효소의 활성도를 손쉽게 검출할 수 있음을 증명하였다.
실시예 4: 키나아제에 대한 저해반응의 정량분석
키나아제의 활성도에 대한 저해반응을 확인하기 위한 하나의 실시예로서 PKA 키나아제에 대한 저해제인 4-cyano-3-methylisoquinoline (CMIQ, Sigma)에 대한 효과를 예시하였다.
금나노-펩타이드 칩은 유리기질로 구성된 슬라이드 글래스(75×25 mm) 표면위에 원형모양의 홀(hole, 지름 3mm, 높이 1mm)로 구성된 실리콘 rubber를 부착시킨 후 실시예 1의 3)의 방법에 따라 각 홀내에서 구성하였다.
CMIQ는 최소량의 DMSO에 녹여 증류수로 희석하는 방식으로 0.1nM, 0.5nM, 1nM, 5nM, 10nM, 50nM, 100nM, 500nM, 1μM, 5μM 용액을 농도별로 준비한 후 PKA 키나아제와 함께 섞어서 상기 홀 내에 구성된 금나노-펩타이드칩에 각각 도입하여 30℃에서 2시간동안 반응하였다. 이 반응에서 ATP농도는 100 μM이고 사용된 키나아제의 농도는 1U로서, 표면에 부착된 펩타이드 기질의 양은 대개 일정하므로 ATP와 키나아제 농도는 최대의 효소반응이 도달되는 지점의 농도로서 결정되었다.
측정결과에 대한 정량분석의 표준화된 방법을 제시하기 위해, 이차이온 분석 스펙트럼으로 부터 사용된 펩타이드의 인산화되기 전의 피크 면적(이하 AP1)과 인산화된 후 변화한 피크 면적(이하 AP2)에 대한 비율 즉, [M-SH-COO]+와 [M-SH-COO+HPO 3 ]+의 피크면적의 비율로부터 인산화효율을 구하였다. 인산화 전/인산화 후 피크의 선택은 이에 한정되는 것은 아니며 도 2에서 제시한 것과 같이 인산화반응에 의해 변화된 피크에 대해서 모두 적용할 수 있다. 피크의 면적은 정확하게 최대신호를 갖는 피크높이의 1/2이 되는 지점과 피크의 질량구간이 만나는 면적을 의미한다.
보다 상세하게는, 두 개의 기준시료인 키나아제 처리 전의 금나노-펩타이드칩과 인산화된 금나노-펩타이드칩에서 AP1과 AP2의 값이 이온세기에 따라 상이할 수 있으므로 이를 보정하기 위하여 아래의 수학식 1을 사용하여 인산화효율을 계산하였다.
Figure 112006013978154-pat00001
상기 수학식 1에 사용된 기호는 각 금나노-펩타이드칩의 이차이온 질량분석 스펙트럼에서의 피크의 면적을 의미하며 표 1에 각각의 상세한 의미를 기재하였다.
Figure 112006013978154-pat00002
표 2는 인산화효율을 계산한 구체적인 예를 나타낸다.
Figure 112006013978154-pat00003
저해도를 계산하기 위해서는 상기 수학식에서 계산된 % phosphorylation값으로 부터 치환한다. 실제로, 키나아제의 효율은 100%가 되지 않기 때문에 키나아제 반응에서 위 수학식 1을 도입하여 최대 인산화 효율이 60%가 나왔다면 이 지점으로부터 저해제를 농도별로 처리함에 따라 효율이 감소할 것이므로 최초 인산화효율이 60%인 지점의 저해효과를 0% 보고 저해제에 의해 인산화효율이 최대로 감소하여 0%가 되는 지점을 100%로 하여 계산할 수 있다. 보다 구체적으로 저해제의 농도별로 인산화효율을 계산한 후 아래의 수학식 2에 의해 저해도를 계산할 수 있다.
Figure 112006013978154-pat00004
상기 식에서 Pmax는 최대 인산화효율 즉, 저해제가 없는 시료에서의 인산화 효율을 나타내며 P는 시험시료에서의 인산화 효율을 나타낸다.
도 3은 PKA 키나아제에 대한 저해제(CMIQ)를 농도별로 처리하였을 때의 각 저해도를 수학식 2에 의해 계산한 후 %저해도(% inhibition)를 Y축의 변수로 저해제의 농도를 X축의 변수로 나타내어 도시한 결과이다. %저해도와 저해제 농도의 상관관계는 실험 데이타로부터 Sigmaplot 9.0(Systat Software Inc.)에 의해 하기 수학식 3을 이용한 비선형 회귀분석(non-linear regression)을 통해 수식화할 수 있으며, 이로부터 IC50(최대저해도의 50%되는 지점의 저해농도)값과 Imax(저해제에 의해 최대 저해효과가 일어나는 지점의 % inhibition) 값을 구할 수 있다(Nucleic acid 2004, 32. (2), 422-431).
Figure 112006013978154-pat00005
본 실시예의 CMIQ의 PKA 키나아제에 대한 저해효과의 경우, Imax는 100%, n=0.9996, IC50은 약 87nM이었다.
이러한 방법을 이용하면 키나아제 뿐만 아니라 다양한 효소반응에 대한 저해제의 효과를 탐지할 수 있고 보다 구체적인 정량반응 과정을 통해 IC50값을 정확하게 결정할 수 있다.
실시예 5: 키나아제의 동시분석
금 나노입자위에 2개 이상의 펩타이드가 결합되어 있는 칩을 이용하여 특정 키나아제를 서로 다른 위치에서 동시에 반응시켜 분석하는 동시 복합분석을 시도하였다.
실시예 1의 4)의 방법에 따라 PKA와 Abl 키나아제에 특이한 펩타이드인 Ac-LRRASLGGGGC 및 Ac-IYAAPKKGGGGC를 동시에 섞어서 금나노-펩타이드칩을 제조하였다. Abl 키나아제와 PKA 키나아제를 실시예 2와 3에 기재된 조건하에서 각각 상기 금나노-펩타이드칩 표면 위에서 반응시킨 후 이차이온 질량분석을 수행하여 그 결과의 스펙트럼을 도 4에 나타내었다. 도 4에 따르면 Abl 키나아제와 PKA 키나아제는 서로 다른 펩타이드의 질량 피크에는 영향을 주지 않아, 키나아제에 특이한 펩타이드의 질량신호 만이 변화함을 확인할 수가 있었다.
따라서, 이 방법을 사용하게 되면 많은 펩타이드를 집적화시킴으로써 다양한 효소 활성의 스크리닝을 보다 빠르게 측정할 수가 있다.
실시예 6: 펩타이드의 이차이온 질량분석 이미징
실시예 1의 5)에서 제조한 금나노-펩타이드칩에서 미세유로 채널 하나의 폭은 약 500 ㎛이고 채널사이의 간격은 100 ㎛로 구성되어 있으므로 300×300 ㎛2 크기로 이차이온 질량분석을 하여 그 이미지를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 확인할 수 있듯이, 양쪽 끝부분이 각 채널로 패턴된 것과 동일한 이미지를 얻을 수 있었다 (흰색 막대는 100 ㎛의 크기임). 즉, [P1+H]+지역에서는 왼쪽 라인부분에서 강한 이미지가 생성되고 반대로 [P2+H]+에서는 오른쪽 라인부분에서 강한 이미지가 생성되므로 질량분석 이미지를 통하여 표면위에 구성된 패턴을 직접적으로 확인할 수가 있다. 금이온 신호인 [Au3]+의 이미지 또한 금 나노입자가 있는 양쪽 라인에서 강하게 나타나고 있음을 보아 실시군에서 금 나노입자가 각 채널에 정확하게 흡착되었음을 나타내주고 있다.
이상과 같이 본 발명의 금나노-펩타이드칩에 의하면 금나노입자에 의해 펩타이드의 이차이온 질량 신호가 증폭되므로 금나노-펩타이드칩 상에서 펩타이드의 질량을 검출하는 것이 용이하게 된다.
이를 응용하면, 효소의 활성에 의해서 발생되는 펩타이드의 질량변화를 용이하게 검출할 수 있기 때문에 효소반응 대해서 어떠한 표지물질 없이 정확한 정량분석, 정성분석이 가능하다.
또한, 특정 효소에 대한 다양한 저해제의 스크리닝 및 약품 개발에 유용하게 응용될 수 있을 뿐만 아니라 다양한 펩타이드 어레이와 이차이온 질량분석 이미징 기법을 사용하면 세포내 효소들의 초고속 스크리닝을 통하여 생체분자들의 상호작용 규명, 세포 내 신호전달 기전 이해, 질병 진단 및 치료제 개발 등에 광범위하게 사용될 수 있을 것으로 기대한다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (17)

  1. (A) 유리, 실리콘, 금속, 반도체 및 플라스틱으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 지지체;
    (B) 상기 지지체의 표면에 구성된 자기조립 단층막;
    (C) 상기 자기조립 단층막의 말단기와 금나노입자의 표면 작용기의 결합에 의해 자기조립 단층막 위에 형성된 금나노입자의 단층막; 및
    (D) 상기 금나노입자에 의해 고정된 펩타이드;
    로 이루어진 것을 특징으로 하는 금나노-펩타이드칩.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 자기조립 단층막의 말단기는 아민, 티올, 카르복실기, 알데하이드, 에폭시, 말레이마이드로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 하나 이상의 작용기인 것을 특징으로 하는 금나노-펩타이드칩.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 금 나노입자는 시트레이트(citrate)로 표면을 수식화한 것을 특징으로 하는 금나노-펩타이드 칩.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 금나노입자의 단층막에서 금나노입자간의 빈 공간은 에틸렌글리콜 아민, 에틸렌글리콜 티올, N-hydroxysuccinimide(NHS)-(폴리)에틸렌글리콜, maleimide-에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 아민, 폴리에틸렌글리콜 티올, NHS-폴리에틸렌글리콜 및 maleimide-폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 하나 이상의 화합물에 의해 충진된 것을 특징으로 하는 금나노-펩타이드칩.
  5. 제 1 항에 의한 금나노-펩타이드칩을 사용하여 이차이온 질량분석에 의해 펩타이드의 질량을 측정하는 것을 특징으로 하는 펩타이드의 질량 측정 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    이차이온 발생을 위해 사용되는 일차이온 소스로서 As, Ga, Au, Bi, C60 이온 소스군에서 선택된 하나의 이온 소스를 사용하는 것을 특징으로 하는 펩타이드의 질량측정 방법.
  7. (1) 이차이온 질량 분석에 의해 제 1 항에 의한 금나노-펩타이드칩에서 펩타이드의 질량을 측정하는 단계;
    (2) 상기 금나노-펩타이드칩과 활성을 측정하고자하는 효소를 반응시키는 단계;
    (3) 상기 반응이 완료된 금나노-펩타이드 칩에서 펩타이드의 질량을 측정하는 단계; 및
    (4) 상기 (1)단계에서 측정된 금나노-펩타이드의 질량과, 상기 (3)단계에서 측정된 펩타이드의 질량의 변화를 측정하여 효소의 활성을 확인하는 단계;
    로 이루어지는 것을 특징으로 하는 효소 활성 검출 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 효소는 키나아제, 포스파테아제, 프로티아제, 아세틸라아제, 메틸라아제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 하나 이상의 효소인 것을 특징으로 하는 효소활성 검출 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 금나노-펩타이드칩의 펩타이드는 아민말단 또는 카르복실기 말단부분의 아미노산이 시스테인, 글라이신, 라이신, 알라닌, 세린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산인 것을 특징으로 하는 효소활성 검출 방법.
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 금나노-펩타이드칩의 펩타이드는 글라이신 링커를 통해 길이를 확장한 것을 특징으로 하는 효소활성 검출 방법.
  11. (1) 제 1 항에 의한 금나노-펩타이드칩과 효소의 혼합물로 이루어진 대조구와 금나노-펩타이드칩과 효소 및 시험물질의 혼합물로 이루어진 시험구를 각각 반응시키는 단계;
    (2) 상기 반응이 완료된 대조구와 시험구에의 금나노-펩타이드 칩에서 펩타 이드의 질량을 각각 측정하는 단계; 및
    (3) 상기 (2)단계에서 각각 측정된 대조구와 반응구의 펩타이드의 질량을 비교하여 시험물질의 효소활성에 미치는 영향을 확인하는 단계;
    로 이루어지는 것을 특징으로 하는 효소활성 저해제의 선별 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 효소는 키나아제, 포스파테아제, 프로티아제, 아세틸라아제, 메틸라아제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 하나 이상의 효소인 것을 특징으로 하는 효소활성 검출 방법.
  13. (1) 제 1 항에 의한 금나노-펩타이드칩과 효소 및 시험물질의 혼합물로 이루어진 시험구를 시험물질의 농도를 변화시켜 각각 반응시키는 단계;
    (2) 효소와 반응 전의 금나노-펩타이드칩과 상기 반응이 완료된 시험물질의 농도별 시험구의 금나노-펩타이드 칩에서 펩타이드의 질량을 각각 측정하는 단계;
    (3) 상기 (2)단계에서 각각 측정된 시험구에서 효소와 반응전의 펩타이드의 질량과 효소에 의해 변형된 펩타이드의 질량에 해당하는 피크의 비율로부터 계산된 저해도와 저해제의 농도간의 상관관계를 구하는 단계; 및
    (4) 상기 (3) 단계에서 두 피크의 저해효과가 50%인 지점의 저해제의 농도를 구하는 단계;
    로 이루어지는 것을 특징으로 하는 상기 (4)단계에서 구해진 저해제의 농도로 효소활성 저해도를 수치화하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 효소는 키나아제, 포스파테아제, 프로티아제, 아세틸라아제, 메틸라아제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 하나 이상의 효소인 것을 특징으로 하는 효소활성 저해도를 수치화하는 방법.
  15. (A) 유리, 실리콘, 금속, 반도체 및 플라스틱으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 지지체;
    (B) 상기 지지체의 표면에 구성된 자기조립 단층막;
    (C) 상기 자기조립 단층막의 말단기와 금나노입자의 표면 작용기의 결합에 의해 자기조립 단층막 위에 형성된 금나노입자의 단층막; 및
    (D) 상기 금나노입자에 의해 고정된 펩타이드 기질;
    로 이루어진 것을 특징으로 하는 효소활성의 고속 탐색용 금나노-펩타이드칩.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 고정된 펩타이드 기질은 마이크로어레이 또는 미세유로 패터닝에 의하여 어레인 된 것임을 특징으로하는 금나노-펩타이드칩.
  17. 제 16 항에 의한 금나노-펩타이드칩을 사용하여 이차이온 질량분석 이미징을 통해 펩타이드의 질량을 측정하는 것을 특징으로 하는 펩타이드의 질량 측정 방법.
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