CN114283889A

CN114283889A - 一种矫正同源重组修复缺陷评分的方法及装置

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Publication number: CN114283889A
Application number: CN202111616188.9A
Authority: CN
Inventors: 易鑫; 付骁睿; 程海楠; 李彩琴; 潘潇; 郝时光; 孟璐; 杜新华; 易玉婷
Original assignee: Shenzhen Guiinga Medical Laboratory
Current assignee: Shenzhen Guiinga Medical Laboratory
Priority date: 2021-12-27
Filing date: 2021-12-27
Publication date: 2022-04-05

Abstract

一种矫正同源重组修复缺陷评分的方法及装置，该方法包括：矫正步骤，包括按如下公式对同源重组修复缺陷评分进行矫正，获得矫正后的同源重组修复缺陷评分：HRD score_矫正＝LOH score+(1‑α*WGD)*LST score+(1‑β*WGD)*TAI score；HRD score_矫正是指矫正后的同源重组修复缺陷评分，LOH score是指杂合性缺失评分，LST score是指大片段迁移评分，TAI score是指端粒等位基因不平衡评分，WGD是指全基因组复制信息值，α和β是指矫正系数。通过对同源重组修复缺陷评分进行矫正，有效提高同源重组修复缺陷评估的准确性，为癌症患者用药提供指导。

Description

一种矫正同源重组修复缺陷评分的方法及装置

技术领域

本发明涉及生物信息学领域，具体涉及一种矫正同源重组修复缺陷评分的方法及装置。

背景技术

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，全世界每年有近25万女性被诊断为卵巢癌。通过手术和基于铂和紫杉烷的化疗，平均5年生存率约为30％^[1]。近年来多个PARP抑制剂陆续获批上市，有效延长了卵巢癌患者的无进展生存期(progression-free survival，PFS)。卵巢癌PARP抑制剂的生物标记物从BRCA基因拓展到同源重组修复缺陷(homologousrecom bination deficiency，HRD)状态，意味着卵巢癌获益人群将从20％左右扩展到50％以上，这对改善患者生存预后有极大帮助。

同源重组修复(homologous recombination repair，HRR)是DNA双链断裂(doublestrand break，DSB)的首选修复方式。HRD通常指细胞水平上的HRR功能障碍状态，当HRR出现功能障碍时，DSB会过度依赖非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)、微同源末端连接(microhomology mediated end joining，MMEJ)和单链退火途径(single-strand annealing，SSA)等低保真、高易错的替代性DNA损伤修复途径，从而极可能造成基因组不稳定，其中包含可被鉴别的基因突变、插入/缺失模式，以及染色体结构异常、基因拷贝数变异等，这也是当前构建HRD临床检测方法的理论基础。

HRD检测并无统一标准，HRD检测采用二代测序("Next-generation"sequencingtechnology，NGS)方法，通常包括两个部分，BRCA1/2突变状态及基因组不稳定性状态的评分(genomic instability score，GIS)，或称HRD评分(HRD score)。基因组不稳定性状态的评分，目前有两大类方法。一大类是基于单核苷酸多态性位点(single nucleotidepolymorphism，SNP)的“基因组瘢痕”分析。全球范围内仅2种HRD检测产品在大型Ⅲ期临床研究中得到验证，并已经得到FDA的批准，具体为：Myriad

CDx(Myriad GeneticLabor atories,Inc.)和FoundationFocus^TMCDx BRCA LOH(Foundation Medicine,Inc.)。在Myriad

CDx检测中，HRD阳性定义为肿瘤BRCA1/2突变和(或)GIS评分≥42分，GIS评分由杂合性丢失(loss of heterozygosity，LOH)、端粒等位基因失平衡(telomericallelic imbalance，TAI)和大片段迁移(large-scale state transitions，LST)三项综合计算得出，阈值的设定基于BRCA缺陷的卵巢癌和乳腺癌肿瘤样本第5分位的HRD分值，并最早在乳腺癌和卵巢癌对含铂类药物化疗敏感性的预测中被证实有效。但该检测产品在SNP位点的选择和阈值设置时均没有考虑东方人群特点。在FoundationFocus^TMCDx BRCA LOH检测中，HRD阳性定义为肿瘤BRCA1/2突变和(或)基因组LOH评分≥16％，阈值的设定最初基于其对卵巢癌患者接受含铂类药物化疗效果的有效区分，随后根据其对卵巢癌患者接受rucaparib治疗效果的区分进行了调整。有研究报道，该检测产品可识别的BRCA1/2基因突变样本的阳性率较Myriad

CDx低。另一大类是基于全外显子组(WES)或全基因组(WGS)数据获得的包括突变特征在内的单个或多个维度数据特征的检测方法。如，突变特征Signature 3的SigMA、HRDetect以及ShallowHRD。WGS检测需要更高测序数据量以及无法涵盖HRR信号通路的体细胞突变等缺点限制了其在临床上的应用。

发明内容

根据第一方面，在一实施例中，提供一种矫正同源重组修复缺陷评分的方法，包括：

矫正步骤，包括按如下公式对同源重组修复缺陷评分进行矫正，获得矫正后的同源重组修复缺陷评分：

HRD score_矫正＝LOH score+(1-α*WGD)*LST score+(1-β*WGD)*TAI score；

HRD score_矫正是指矫正后的同源重组修复缺陷评分，LOH score是指杂合性缺失评分，LST score是指大片段迁移评分，TAI score是指端粒等位基因不平衡评分，WGD是指全基因组复制信息值(亦称WGD值)，α、β是指矫正系数。

根据第二方面，在一实施例中，提供一种评估同源重组修复缺陷的方法，包括：

预测步骤，包括根据第一方面所述方法获得的矫正后的同源重组修复缺陷评分，预测待测样本所属患者是否存在同源重组修复缺陷。

根据第三方面，在一实施例中，提供一种矫正同源重组修复缺陷评分的装置，包括：

矫正模块，用于按如下公式对同源重组修复缺陷评分进行矫正，获得矫正后的同源重组修复缺陷评分：

HRD score_矫正＝LOH score+(1-α*WGD)*LST score+(1-β*WGD)*TAI score；

根据第四方面，在一实施例中，提供一种评估同源重组修复缺陷的装置，包括：

预测模块，用于根据第一方面所述方法和/或第三方面所述装置获得的矫正后的同源重组修复缺陷评分，预测待测样本所属患者是否存在同源重组修复缺陷。

根据第五方面，在一实施例中，提供一种装置，包括：

存储器，用于存储程序；

处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现如第一方面和/或第二方面所述的方法。

根据第六方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第一方面和/或第二方面所述的方法。

依据上述实施例的一种矫正同源重组修复缺陷评分的方法及装置，通过对同源重组修复缺陷评分进行矫正，有效提高同源重组修复缺陷评估的准确性，为癌症患者用药提供指导。

附图说明

图1为实施例1中评估同源重组修复缺陷的流程图；

图2为实施例2中HRD与WGS一致性结果图；

图3为实施例2中HRD与标准品一致性结果图；

图4为实施例3中HRD与铂疗效的生存曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”，如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。

术语解释

TAI：Telomeric Allelic Imbalance，端粒等位基因不平衡。

LST：Large-scale state Transition，大片段迁移。

WGD：whole genome duplication，全基因组复制，亦称全基因组重复。

CNV：Copy number variations，基因拷贝数变异。

SNV：Single Nucleotide Variant，单核苷酸位点变异。

reads：读段，测序仪产生的核苷酸序列被称为“读段”。序列读段长度可以在几十到几千个核苷酸之间。

BAF：B allele frequency，次等位基因频率，是指在给定群体中，第二常见的基因型(次等位基因)出现的基因频率就称为次等位基因频率。

HRD：homologous recombination deficiency，同源重组修复缺陷，亦称同源重组缺陷、同源修复缺陷，癌症具有同源重组修复缺陷/同源修复缺陷(“HRD”)或其特征是同源重组修复(HRR)基因突变或缺失。

LOH：Loss of heterozygosity，杂合性缺失，是指位于一对同源染色体上的相同基因座位的两个等位基因中的一个(或其中部分核苷酸片段)发生缺失，与之配对的染色体上仍然存在。

TAI：Telomeric Allelic Imbalance，端粒等位基因不平衡。

LST：Large-scale state Transition，大片段迁移。

BRCA：breast cancer susceptibility gene，乳腺癌易感基因，是重要的抑癌基因，包括BRCA1和BRCA2。BRCA1/2基因是评估乳腺癌、卵巢癌和其他相关癌症发病风险的重要生物标志物，也是影响患者个体化治疗方案选择的生物标志物，所以BRCA检测具有重要的临床意义。

PARP抑制剂：亦称PARPi，是一种能够影响癌细胞的自我复制方式的医学用剂。

HRD score_矫正＝LOH score+(1-α*WGD)*LST score+(1-β*WGD)*TAI score；

HRD score_矫正是指矫正后的同源重组修复缺陷评分，LOH score是指杂合性缺失评分，LST score是指大片段迁移评分，TAI score是指端粒等位基因不平衡评分，WGD是指全基因组复制信息值(亦称WGD值)，α、β是指矫正系数。LOH score、LST score、TAI score、WGD均可以通过现有的软件计算得到。

在一实施例中，α可以为0.35，β可以为0.35。

在一实施例中，全基因组复制信息值为0、1或2。

在一实施例中，全基因组复制信息值为最优模型输出的全基因组复制信息值。最优模型的筛选方法为现有方法，具体可参照申请号为202010567812.X的中国专利《基于测序数据识别肿瘤纯度和绝对拷贝数的方法及装置》说明书第98～108段记载的方法进行。

在一实施例中，利用过滤后体系CNV、SNV突变位点集作为开源软件ABSOLUTE的输入，输出待测样本在多个模型下模拟的WGD值、纯度值(purity值)、倍性值(ploidy值)，参照申请号为202010567812.X的中国专利《基于测序数据识别肿瘤纯度和绝对拷贝数的方法及装置》说明书第98～108段记载的方法，对预测得到的模型进行筛选，确定最优模型，输出最优模型下的WGD值、纯度值、倍性值。

在一实施例中，LOH score、LST score、TAI score是根据待测样本测序数据的单核苷酸位点变异集、基因拷贝数变异位点集计算得到。可以使用现有的软件进行计算，包括但不限于scarHRD软件。

在一实施例中，待测样本包括但不限于肿瘤组织样本。

在一实施例中，肿瘤包括实体瘤。

在一实施例中，肿瘤包括但不限于卵巢癌。

在一实施例中，待测样本测序数据的基因拷贝数变异位点集是根据待测样本测序数据以及对照样本测序数据分析得到。

在一实施例中，对照样本与待测样本来源于同一患者。

在一实施例中，对照样本包括但不限于血细胞、癌旁组织中的至少一种。对照样本为血细胞时，检测的有效组分是血细胞中的白细胞。

在一实施例中，生物体为人。

在一实施例中，待测样本、对照样本均包含DNA。

在一实施例中，测序数据为基于下一代测序(NGS)生成的测序数据。

在一实施例中，测序数据是比对到参考基因组序列的测序数据。

在一实施例中，参考基因组序列来源于参考群组。

在一实施例中，参考基因组序列包含来自参考群组的共有序列。

在一实施例中，参考基因组序列包含hs37d5基因组、GRCh37基因组、b37基因组、hg18基因组、hg17基因组、hg16基因组或hg38基因组的至少一部分。

在一实施例中，参考基因组序列为GRCh37(亦称hg19)。

在一实施例中，测序数据包括捕获测序数据。

在一实施例中，捕获测序数据包括全外显子组测序(WES)数据、区域捕获测序数据中的至少一种。

预测步骤，包括根据第一方面方法获得的矫正后的同源重组修复缺陷评分，预测待测样本所属患者是否存在同源重组修复缺陷。该方法所获得的结果仅仅为中间结果，而非最终的诊断结果，因此，不属于疾病的诊断治疗方法。

在一实施例中，根据患者是否存在同源重组修复缺陷，可以预测患者接受药物治疗的临床获益。

在一实施例中，药物包括但不限于PARP抑制剂。

在一实施例中，根据矫正后的同源重组修复缺陷评分与阈值的大小关系，预测待测样本所属患者是否存在同源重组修复缺陷。

在一实施例中，如果矫正后的同源重组修复缺陷评分≥阈值，则预测待测样本所属患者为同源重组修复缺陷阳性患者；如果矫正后的同源重组修复缺陷评分＜阈值，则预测待测样本所属患者为同源重组修复缺陷阴性患者。

在一实施例中，同源重组修复缺陷阳性患者包含乳腺癌易感基因功能缺失的患者。

在一实施例中，乳腺癌易感基因功能缺失的患者是指含有双等位基因突变的乳腺癌易感基因的患者，乳腺癌易感基因功能完整的患者是指含有单等位基因突变的乳腺癌易感基因或野生型乳腺癌易感基因的患者。

在一实施例中，阈值为39。

HRD score_矫正＝LOH score+(1-α*WGD)*LST score+(1-β*WGD)*TAI score；

预测模块，用于根据第一方面方法和/或第三方面装置获得的矫正后的同源重组修复缺陷评分，预测待测样本所属患者是否存在同源重组修复缺陷。

根据第五方面，在一实施例中，提供一种装置，包括：

存储器，用于存储程序；

处理器，用于通过执行存储器存储的程序以实现如第一方面和/或第二方面的方法。

根据第六方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，介质上存储有程序，程序能够被处理器执行以实现如第一方面和/或第二方面的方法。

《同源重组修复缺陷临床检测与应用专家共识(2021版)》^[2]提示，综合检测所需样本量、数据量、体细胞突变，可采用高深度WES加高密度SNPs方法，对肿瘤样本中HRR信号通路中的遗传性突变、体细胞突变及基因组不稳定性状态同时进行全面检测。在一实施例中，本发明采用高深度WES加高密度SNPs方法对HRD进行评估。

在一实施例中，本发明采用高深度WES加高密度SNPs方法，可对肿瘤样本中HRR信号通路中的遗传性突变、体细胞突变及基因组不稳定性状态同时进行全面检测，从而为卵巢癌患者提供更全面的用药指导。

实施例1

本实施例的评估方法主要包括以下几个步骤：

(1)对肿瘤样本及配对的血细胞样本，利用测序下机数据，经过比对、排序、过滤、标记重复等步骤后生成的测序数据文件(bam格式)；

(2)利用Mutect2软件对肿瘤待测样本进行SNV分析，获得体系SNV的突变集合，包含突变频率、突变位点深度等信息；

(3)对获得的体系SNV进行注释；

(4)利用cnvkit软件，将肿瘤待测样本及配对样本的bam作为输入，分析获得样本发生CNV突变的区段(segment)，并输出区段的大小、区段包含的探针数、区段的BAF值等信息；

(5)利用ABSOLUTE软件对肿瘤待测样本的纯度、倍性分析，获得肿瘤待测样本的纯度purity、倍性ploidy、以及全基因组复制WGD值；

(6)将获取到的肿瘤待测样本的CNV和SNV信息作为scarHRD软件的输入，计算待测样本的LOH score值、TAI score值、LST score值，同源重组修复缺陷评分HRD score值为LST score值、TAI score值和LOH score值的加和；

(7)利用肿瘤待测样本的WGD值矫正LST score、TAI score两个指标值，输出经矫正后的HRD score值。

图1所示为本实施例评估同源重组修复缺陷的流程图。评估方法具体分为以下步骤：

(1)体系SNV突变位点集获取步骤，包括肿瘤待测样本及其配对血细胞样本数据经过比对获得的bam，作为SNV突变分析软件Mutect2的输入，分析获取肿瘤待测样本的SNV突变位点及各SNV突变位点的突变频率、突变位点深度；利用注释软件对SNV突变位点进行基因层面的注释，获得发生SNV突变的基因位点。

(2)体系CNV突变位点集获取步骤，包括根据待测肿瘤样本的比对bam结果文件，利用cnvkit软件分析待测肿瘤样本发生CNV突变的segment区段，以及各segment区段的大小、各segment区段包含的探针数、各segment区段的BAF值，对CNV突变位点进行注释，获得体系CNV突变位点集；

(3)纯度、倍性值获取步骤：利用过滤后体系CNV、SNV突变位点集作为开源软件ABSOLUTE的输入，输出待测样本多个模型下模拟的WGD值、纯度值(purity值)、倍性值(ploidy值)，参照申请号为202010567812.X的中国专利《基于测序数据识别肿瘤纯度和绝对拷贝数的方法及装置》说明书第98～108段记载的方法，对预测得到的模型进行筛选确定最优模型，输出最优模型下的WGD值、纯度值、倍性值。

(4)同源重组修复缺陷评分步骤，包括利用获得的体系SNV突变位点集和体系CNV突变位点集，利用scarHRD软件，分析计算待测肿瘤样本的LOH score值、TAI score值、LSTscore值；同源重组修复缺陷评分HRD score值为LST score值、TAI score值和LOH score值的加和。

(5)利用WGD矫正同源重组修复缺陷评分(HRD score值)：采用穷举方法，确定了LST指标、TAI指标的矫正系数分别为0.35，且阈值为39时，BRCA阳性HRD阳性比例为90.8％(59/65)，大于90％；BRCA阴性HRD阳性为47％(40/85)，小于50％；HRD score值为矫正后LSTscore值、矫正后TAI score值、原始的LOH score值的加和，具体公式如下：

HRD score_矫正＝LOH score+(1-0.35*WGD)*LST score+(1-0.35*WGD)*TAI score；

其中，HRD score_矫正是指矫正后的同源重组修复缺陷评分，LOH score是指杂合性缺失评分，LST score是指大片段迁移评分，TAI score是指端粒等位基因不平衡评分，WGD是指全基因组复制信息值(亦称WGD值)，0.35为矫正系数。

矫正的原因主要包括：存在WGD样本的HRD得分显著比不存在WGD的样本高，如果不矫正将会存在较多的假阳性结果。

穷举方法具体如下：穷举α和β系数(0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.45)，穷举阈值(20～49之间的整数)，共3000种组合形式，从中筛选出BRCA阳性HRD阳性比例大于90％且BRCA阴性HRD阳性比例小于50％，并且可将存在WGD(基因组复制)的样本的HRD数值矫正回正常状态(与不存在WGD的样本无显著差异)。

HRD score阈值的确定方法如下：

1.全基因组DNA提取

石蜡包埋组织(FFPE)通过添加蛋白酶K、孵化缓冲液(incubation buffer)进行机外孵育后，使用Promega Maxwell 16仪进行磁珠法全基因组DNA提取，具体步骤如下：

(1)石蜡包埋组织刮取。顺序从上到下，从右到左。

(2)样本短暂离心，温度70℃，转速1220rpm孵育过夜。

(3)孵育完全的石蜡转入新的1.5mL EP管中，加入400微升裂解液。加好裂解液的样本混合液震荡离心。

(4)将FFPE自动化提取仪打开程序设置01，将试剂条装入托板，并将回溶管插入托板相应孔内，并在每个回溶管中加入75微升TE缓冲液。

(5)撕掉试剂条封膜，将样本混合液加入试剂条中样本孔内，吹打混匀。转移后在试剂条上插入LEV管套，取出回溶管，将回溶管瞬时离心。

(6)将离心好的回溶管内DNA与磁珠混合物转入新的1.5mL EP管中，并将管子放入磁力架上，待磁珠全部吸附在管壁上，将60μL DNA吸入贴好标签的1.5mL EP管子。

2.文库构建

使用AFA超声破碎仪进行全基因组DNA片段化，片段化DNA主峰大小为200～250bp，实验步骤包括：

(1)加样，启动打断程序。

(2)打断后取60ng进行电泳检测，判断打断结果，打断结果合格的样本进行建库。

完成片段化的样本经过磁珠纯化实现片段化DNA回收，并依次经过末端修复及加“A”、接头连接、接头连接后纯化、捕获前PCR(Non-C-PCR)、PCR后纯化，得到捕获前中间文库。具体操作如下：

(21)末端修复及加“A”

按照表1配制末端修复及加“A”反应Premix(Mix 1)，振荡混匀并离心。Premix是指预混液。

表1EP Mix配制表

组分	单反应体积(μL)
		NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer	7
NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix	3
		总体积	10

Premix(Mix 1)分装，每个反应10μL，加入到打断纯化后的50μL DNA样本中，振荡混匀并离心。按照表2反应条件在恒温混匀仪或PCR仪上孵育。孵育完成后，短暂离心，将蒸发起的液滴收集入管内。

表2EP反应条件表

(22)接头连接

将溶解后的NEBNextΜltra II Ligation Master Mix、NEBNext LigationEnhancer及接头振荡混匀并离心。按照表3配制接头连接反应Premix(Mix 2)，充分振荡混匀并离心。

表3连接Mix配制表

组分	单反应体积(μL)
		NEBNext Ultra II Ligation Master Mix	30
NEBNext Ligation Enhancer	1
		总体积	31

接头(Adapter)加入量对应关系参照表4。

表4Adapter加入量对照表

建库起始量(ng)	15μM接头体积(μL)
		100～800	4
20～100	2

本实施例的接头加入量为4μL。

Premix(Mix 2)分装。按照每个反应用量，依次向反应管中加入Premix(Mix 2)及对应体积的接头，振荡混匀并离心。将反应管置于恒温混匀仪上孵育，20℃，15min。孵育时，按照任务单分装分子标签(亦称index，样本的分子标签，用于区分不同的样本)。孵育完成后，短暂离心，将管壁上的液体离心至管底。

(23)接头连接后纯化

向每个反应管中加入87μL Axygen磁珠，吹打或轻微振荡混匀后，室温下孵育10min，使磁珠与DNA片段充分结合，孵育期间配制80％乙醇。轻微离心后，将离心管置于磁力架上至澄清。弃上清，打开磁力架上全部离心管，依次加入500μL 80％乙醇。

(24)捕获前PCR(Non-C-PCR)

提前将Index及KAPA HiFi HotStart ReadyMix置于室温进行溶解，将溶解后试剂振荡混匀并离心。

对照任务单上检测样本量摆放PCR管，并在管上标记对应序号，将溶解后的index、样本按照任务单顺序进行排序，分别在PCR管中加入对应的反应组分，确保index、样本、PCR管与任务单一一对应，混匀并离心。如下，表5-1为单端引物的NC-PCR Mix配制表，表5-2为双端引物NC-PCR Mix配制表，根据任务单上的引物类型进行正确添加。

表5-1单端引物NC-PCR Mix配制表

表5-2双端引物NC-PCR Mix配制表

组分	单反应体积(μL)
		index-GF(10p)	2.5
index-GR(10p)	2.5
		KAPA HiFi HotStart ReadyMix	25
Adapter-Ligated library	20
		总体积	50

设置阴性参照和阳性参照：每次PCR反应均需要设置阳性、阴性参照，阴性参照孔用TE代替样本，阳性参照孔加入1μL阳性参考品并用TE补齐体积。阳性和阴性样本选用特定index进行PCR。将样本放置到PCR仪中，核对编号及PCR反应程序。PCR程序见表6，热盖温度105℃，50μL体系。

表6NC-PCR反应程序

(25)NC-PCR产物纯化

按照任务准备一套1.5mL EP管，并在管盖上标记序号，打印标签，贴在对应EP管上；使用45μL Axygen磁珠对PCR产物进行纯化，最终溶解在31μL TE(pH 8.0)缓冲液中。将纯化产物转移至准备的EP管中。

3.杂交捕获

浓度质控合格的中间文库依次经混合(pooling，是指将不同样本的文库混合在一起)、蒸干、探针杂交、洗脱、洗脱产物PCR、PCR后纯化得到杂交后普通文库。具体操作步骤如下：

(301)准备板装Block：根据杂交表中的杂交组数，向杂交板孔内添加5μL的cot1溶液，pooling自动化PCR板开始作业。

(302)将pooling好的杂交板放置在真空浓缩仪内，准备好配平板进行蒸干处理。将浓缩成干粉状的杂交板进行封膜保存待用。

(303)至少提前30min开启PCR仪杂交程序，热盖温度100℃，提前开启恒温混匀仪，设定温度为25℃，4min，2000rpm；

(304)杂交前变性，配制变性缓冲液，振荡混匀后分装至蒸干的杂交板中，将准备好的探针加入杂交板中，4μL/例；充分振荡混匀并离心，置于恒温混匀仪上常温5min，25℃4min，2000rpm；

(305)将杂交板置于PCR仪，程序如下表所示，开始杂交并记录杂交起始时间，杂交时间不小于4h。

表7

步骤	温度(℃)	时间
			1	95	30s
2	65	hold

(306)提前30min从4℃取出M-270磁珠，平衡至室温，磁珠使用量：20μL/例，将磁珠分到八连排中，并标好序号。

(307)调整排枪量程至200μL，将Bead Wash Buffer加入到M-270磁珠中，吹打混匀，放到磁力架上，静置至澄清，弃上清。重复一次。

(308)调整排枪量程至100μL，将Bead Wash Buffer加入到M-270磁珠中，吹打混匀，放到磁力架上，静置至澄清，弃上清，再用10μL排枪将残留液体吸净。

(309)将杂交PCR板放至65℃恒温混匀仪，转移杂交产物至磁珠，振荡混匀。

(310)将八连排放入65℃PCR仪中，孵育45min，其中每15min取出振荡一次。

(311)将65℃孵育试剂转移至65℃恒温混匀仪，从PCR仪中取出样本，加入100μL 65℃的Wash Buffer I，吹打混匀，放到磁力架上，静置至澄清，弃上清，从磁力架取下。

(312)加入170μL从磁力架取℃的Stringent Wash Buffer，吹打混匀，放入65℃PCR仪孵育5min。该操作共进行2次。

(313)将样本放到磁力架上，静置至澄清，弃上清，从磁力架上取下，依次加入170μL Wash Buffer I、Wash Buffer II、Wash Buffer III，吹打混匀。Wash Buffer I、WashBuffer II、Wash Buffer III为96rxn xGEN-lockdown-reagents试剂盒(购自IDT公司)中的试剂。

(314)将样本放到磁力架上，静置至澄清，弃上清，从磁力架上取下，加入20μL NF-H₂O回溶，振荡混匀。

(315)设置阴性参照和阳性参照：阴性参照孔用NF-H₂O代替样本，阳性参照孔加入1μL阳性参考品+19μL NF-H₂O。

(316)取20μL阳参样本加至放有Mix的八连排中。设置下表所示的PCR程序。

表8

(317)程序运行结束后取样本离心，放到磁力架上。取浅孔板，将样本按顺序转移至板中，每个孔位中加入60μL Axygen磁珠，吹打混匀30次，室温孵育10min后将浅孔板放到磁力架上，静置至澄清，弃上清。

(318)向每个孔位中加入170μL 80％乙醇，轻微吹打后静置片刻，弃上清。重复一次。

(319)用10μL排枪将残留液体吸干净，将浅孔板放到38℃干热器上加热烘干，至磁珠表面出现裂痕后，从干热器上取下浅孔板。

(320)向浅孔板中加入31μL TE(pH8.0)缓冲液，吹打混匀，室温下孵育5min，使DNA片段充分溶解入TE缓冲液中。

(321)将浅孔板置于磁力架上至完全澄清，上清纯化产物转移到1.5mL EP管中。

(322)纯化产物用酶标仪进行定量，将洗脱文库送至质控上机组进行Labchip质控。

4.测序和信息分析

通过Gene+Seq2000测序仪进行双端(PE100)测序，测序过程经过多重质控检查。

4.1数据管理系统

吉因加的数据管理系统对样本类型、采样部位、样本编号、文库号、index号以及上机信息等进行一一对应，并将这些信息绑定于数据分析的各个环节，并在数据分析结束以后，记录本次数据分析所使用的流程名称及其版本信息，数据库名称及其版本信息，并保存该样本对应的fastq、BAM和VCF文件的关键的文件信息。

4.2FASTQ数据产出

通过软件splitBarcode(版本：0.1.3)软件，结合样本对应的index序列信息，将每个样本对应的全长reads信息从下机文件中提取，并分别以固定的命名格式将双端测序的reads分别存储为两个fastq文件中。肿瘤样本的测序数据量为60G，有效深度为500×；对照样本的测序数据量为18G，有效深度为200×。

4.3Index匹配异常检查

在突变检测阶段，通过识别肿瘤样本和对照样本中纯合位点的异常和匹配情况，对index匹配异常或者样本间交叉污染的情况进行检测。

4.4数据比对和bam文件生成

在数据比对之前，首先通过fastp(版本：0.20.0)软件对于输入fastq文件中的低质量reads进行过滤。过滤之后的高质量reads通过BWA(版本：0.7.15-r1140)软件将其比对到人类基因组中(版本：hs37d5)，生成初始比对结果的bam文件，随后通过sentieon软件(版本：201808)依次对初始比对结果文件中的PCR重复的reads进行标记，结合千人数据库和dbSNP(版本：138)数据库中的常见indel突变对检测检测芯片两端延伸50bp范围内的indel区域进行重新比对，结合千人数据库、dbSNP(版本：138)数据库和COSMIC数据库中的信息，对检测芯片两端延伸50bp范围内的碱基质量值进行重新矫正。

4.5样本质控QC

(1)样本配对错误

生物信息流程如下：通过计算对照样本中对芯片区间两端延伸50bp的范围内的纯合位点与肿瘤样本的一致性进行样本配对是否异常的判断依据，若一致性低于90％则认为所检测的对照和肿瘤样本存在配对错误的风险。

(2)样本污染

通过GATK(版本：4.1.4)软件中的Calculate Contamination模块结合对照样本和肿瘤样本的bam文件信息，通过对检测样本中纯合位点中支持参考碱基的reads信息进行读取和统计，从而对样本的交叉污染情况进行评估，若污染率高于3％则认为样本间存在交叉污染的风险，舍弃该样本，不进行后续步骤。

4.6SNV和CNV calling

肿瘤待测样本及其配对血细胞样本数据经过比对获得的bam，作为SNV突变分析软件Mutect2的输入，利用Mutect2软件对肿瘤待测样本进行SNV分析，获得体系SNV的突变集合，包含突变频率、突变位点深度等信息，并对获得的体系SNV进行注释，将该步骤得到的突变进行过滤，保留满足如下条件的突变：(1)位于热点集的突变且支持突变的reads数(AD)≥4且突变频率(AF)≥0.01；(2)突变位于热点区域且突变类型不为snv且AD≥4且A≥0.01；(3)突变不位于热点区域和热点集且AF≥0.012且AD≥8且突变标签为PASS。满足前述三种条件中的任意一种的突变均被保留。

利用cnvkit软件，将肿瘤待测样本及配对样本的bam文件作为输入，分析获得样本发生CNV突变的segment区段，并输出区段的大小、区段包含的探针数、区段的BAF值等信息。

5.HRD score阈值的确定

利用过滤后体系CNV、SNV突变位点集作为开源软件ABSOLUTE的输入，输出待测样本在多个模型下模拟的WGD值、purity值、ploidy值，参照申请号为202010567812.X的中国专利《基于测序数据识别肿瘤纯度和绝对拷贝数的方法及装置》说明书第98～108段记载的方法，对预测得到的模型进行筛选确定最优模型(每例样本的最优模型不同)，输出最优模型下的WGD值、纯度值、倍性值。利用scarHRD软件，分析计算待测肿瘤样本的LOH score值、TAI score值、LST score值；同源重组修复缺陷评分HRD score值为LST score值、TAIscore值和LOH score值的加和，最后利用WGD矫正同源重组修复缺陷评分(HRD score值)。

矫正的原因如下：存在WGD样本的HRD得分显著比不存在WGD的样本高，如果不矫正将会存在较多的假阳性结果。BRCA阴性样本未矫正时，存在WGD样本集和不存在WGD样本集的HRD score p值为0.0023，有显著差异，矫正后p值为0.82，无显著差异。不存在WGD样本集合的HRD阳性比例为49.3％(33/67)；存在WGD(未矫正)样本集合的HRD阳性比例为74.3％(29/39)，偏高；存在WGD(矫正)样本集合的HRD阳性比例为43.6％(17/39)。

不存在WGD时，WGD＝0；存在WGD时，WGD＝1或2。

为了确定HRD score的阈值，本实施例选用了151例高级别浆液性卵巢癌患者样本，分为BRCA缺陷(65例)和BRCA功能完整(86例)两组样本，具体而言，选择为BRCA缺陷的肿瘤具有(a)BRCA1或BRCA2中的一个有害突变，野生型拷贝中的LOH；或(b)同一基因中的两个有害突变，选择为BRCA功能完整的肿瘤(a)具有BRCA1或BRCA2单等位基因突变；或(b)不存在BRCA1或BRCA2突变。美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)已批准可用于伴随诊断的My Choice CDx产品将HRD阳性定义为能筛选出95％的BRCA功能缺失的患者，满足条件的cutoff值定为42^[3]。本实施例通过对HRD评分进行矫正，并将阈值设定为39，可保证90.8％(59/65)BRCA功能缺失的患者被筛选出来，虽然准确筛出的患者占比降低，但是这部分患者理论上为基因组更加不稳定者，预期可达到更好的药物治疗效果。HRD数值越高，基因组越不稳定，推测使用PARP抑制剂(PARPi)疗效更好。

本实施例可检测出90％以上的BRCA1/2突变样本为HRD阳性样本，50％左右的BRCA1/2阴性样本为HRD阳性样本。

151例样本的检测结果如下表所示。

表9

该队列用于定义旨在反映HR缺陷状态与HR非缺陷状态的HRD评分阈值。

满足以下两个条件之一则可定义为BRCA缺陷：(1)BRCA1/2双等位基因突变；(2)BRCA1/2突变样本的BRCA1/2野生型拷贝存在LOH。上述提到的突变信息可通过本发明检测方法获得。

BRCA是一种与遗传型乳腺癌相关的基因，野生型是指没有突变的基因型。

实施例2HRD准确性评估

本实施例采用实施例1的方法(简称WES检测法)进行评估。

(1)与WGS检测的一致性比较

本实施例采用50例卵巢癌FFPE样本(福尔马林固定石蜡包埋处理的样本，Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，简称FFPE样本)，将基于实施例1的WES检测法检出的结果与通过WGS检测得到的HRD数值进行比较，结果如图2所示，Spearmanρ＝0.88，表现出了较好的一致性。

(2)与标准品的一致性比较

本实施例检测了12对HRD标准品，通过与参考数值比较，考察该检测方法的准确性，结果如图3显示，本实施例的检测方法的HRD检测结果与标准品具有较高的一致性，Spearmanρ＝0.87。

实施例3HRD score与临床疗效

本实施例采用实施例1的方法，对59例首次铂类化疗药物治疗的高级别浆液性卵巢癌患者样本进行了检测，并统计了首次铂疗效数据与HRD的关系，其中包含45例铂敏感数据和14例铂耐药数据。统计结果见图4。从图4可见，HRD阳性样本相比于HRD阴性样本具有更高的PFS(Log rank p＝0.04，HR＝0.55)，PFS是指无进展生存期(progression-freesurvival)，具体是指由随机至第一次发生疾病进展或任何原因死亡的时间。

本领域技术人员可以理解，上述实施方式中各种方法的全部或部分功能可以通过硬件的方式实现，也可以通过计算机程序的方式实现。当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序可以存储于一计算机可读存储介质中，存储介质可以包括：只读存储器、随机存储器、磁盘、光盘、硬盘等，通过计算机执行该程序以实现上述功能。例如，将程序存储在设备的存储器中，当通过处理器执行存储器中程序，即可实现上述全部或部分功能。另外，当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序也可以存储在服务器、另一计算机、磁盘、光盘、闪存盘或移动硬盘等存储介质中，通过下载或复制保存到本地设备的存储器中，或对本地设备的系统进行版本更新，当通过处理器执行存储器中的程序时，即可实现上述实施方式中全部或部分功能。

参考文献：

[1]Reid BM,Permuth JB,Sellers TA.Epidemiology of ovarian cancer:areview.Cancer Biol Med.2017；14:9-32.

[2]陈锐,纪元,申鹏,于津浦,张海伟,赵伟鹏.同源重组修复缺陷临床检测与应用专家共识(2021版)[J].中国癌症防治杂志,2021,13(04):329-338.

[3]Telli M L,Timms K M,Reid J,et al.Homologous recombinationdeficiency(HRD)score predicts response to platinum-containing neoadjuvantchemotherapy in patients with triple-negative breast cancer[J].Clinicalcancer research,2016,22(15):3764-3773.

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims

1.一种矫正同源重组修复缺陷评分的方法，其特征在于，包括：

HRD score_矫正＝LOH score+(1-α*WGD)*LST score+(1-β*WGD)*TAI score；

HRD score_矫正是指矫正后的同源重组修复缺陷评分，LOH score是指杂合性缺失评分，LST score是指大片段迁移评分，TAI score是指端粒等位基因不平衡评分，WGD是指全基因组复制信息值，α、β是指矫正系数。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，α为0.35，β为0.35。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述全基因组复制信息值为最优模型输出的全基因组复制信息值；

全基因组复制信息值为0、1或2。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LOH score、LST score、TAI score是根据待测样本测序数据的单核苷酸位点变异集、基因拷贝数变异位点集计算得到。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括人肿瘤组织样本；

所述肿瘤包括实体瘤；

所述肿瘤包括卵巢癌；

所述待测样本测序数据的基因拷贝数变异位点集是根据待测样本测序数据以及对照样本测序数据分析得到；

所述对照样本与所述待测样本来源于同一患者；

所述对照样本包括血细胞、癌旁组织中的至少一种；

所述待测样本、对照样本均包含DNA；

所述测序数据为基于下一代测序生成的测序数据；

所述测序数据是比对到人参考基因组序列的测序数据；

所述参考基因组序列来源于参考群组；

所述参考基因组序列包含来自参考群组的共有序列；

所述参考基因组序列包括hg19人基因组；

所述测序数据包括捕获测序数据；

所述捕获测序数据包括全外显子组测序数据、区域捕获测序数据中的至少一种。

6.一种评估同源重组修复缺陷的方法，包括：

预测步骤，包括根据权利要求1～5任意一项所述方法获得的矫正后的同源重组修复缺陷评分，预测待测样本所属患者是否存在同源重组修复缺陷。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，根据所述矫正后的同源重组修复缺陷评分与阈值的大小关系，预测待测样本所属患者是否存在同源重组修复缺陷；

如果所述矫正后的同源重组修复缺陷评分≥阈值，则预测待测样本所属患者为同源重组修复缺陷阳性患者；如果所述矫正后的同源重组修复缺陷评分＜阈值，则预测待测样本所属患者为同源重组修复缺陷阴性患者；

所述同源重组修复缺陷阳性患者包含乳腺癌易感基因功能缺失的患者；

所述乳腺癌易感基因功能缺失的患者是指含有双等位基因突变的乳腺癌易感基因的患者；

所述阈值为39；

预测步骤中，根据患者是否存在同源重组修复缺陷，预测患者接受药物治疗的临床获益；

所述药物包括PARP抑制剂。

8.一种矫正同源重组修复缺陷评分的装置，包括：

HRD score_矫正＝LOH score+(1-α*WGD)*LST score+(1-β*WGD)*TAI score；

9.一种评估同源重组修复缺陷的装置，包括：

预测模块，用于根据权利要求1～5任意一项所述方法和/或权利要求8所述装置获得的矫正后的同源重组修复缺陷评分，预测待测样本所属患者是否存在同源重组修复缺陷。

10.一种装置，包括：

存储器，用于存储程序；

处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现如权利要求1～7任意一项所述的方法。

11.一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如权利要求1～7任意一项所述的方法。