JP3055931B2 - ガラクトシル―マルトオリゴ糖誘導体、その製造法及びそれを用いたヒト膵臓型及び唾液型α―アミラーゼの分別定量方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、特にヒト膵臓型及び／又は睡液型α−アミ
ラーゼ活性の分別定量を行なうための測定用基質として
適したガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体、その製造
法、及びそれを用いたヒト膵臓型及び睡液型α−アミラ
ーゼの分別定量方法に関する。

「従来の技術」 ヒトの体液、例えば睡液、膵液、血液、尿等に含まれ
るα−アミラーゼの活性を測定することは、臨床診断上
極めて重要である。ところで、ヒトが有するα−アミラ
ーゼには、膵臓型と睡液型の２種類があり、例えば膵
炎、膵臓癌の場合には、膵臓型α−アミラーゼ活性が上
昇し、耳下腺炎の際には、睡液型のα−アミラーゼ活性
が上昇することが知られている。したがって、臨床診断
においては、この２種類のα−アミラーゼ活性を、合計
値としてだけではなく、分別して定量する方法の開発が
望まれ、いくつかの方法が報告されている。

これらの報告には、例えば電気泳動法を用いる方法
（神津（1974）日消誌,71,1）、等電点分画法を用いる
方法（Takeuchi（1975）Clin.Chim.Acta,60,207）、モ
ノクローナル抗体を用いて免疫学的に両酵素を分離して
から酵素量を測定堤する方法（Ito（1985）J.Biochem.,
97,1357）、睡液型α−アミラーゼを優先的に阻害する
インヒビターを使用する方法（O'Donnell（1977）Clin.
Chem.,23,560）等がある。

しかしながら、電気泳動法、等電点分画法は、測定操
作が煩雑で、自動分析計への適合性が困難であり、モノ
クローナル抗体を用いる方法は、抗体の調製が必要であ
り、インヒビターを用いる方法では、膵臓型α−アミラ
ーゼも阻害される等の問題があった。

また、別の方法として、非還元末端のグルコースをア
ミノピリジル基で修飾したマルトオリゴ糖誘導体に対す
る両酵素の作用の相違を、高速液体クロマトグラフィー
等の自動分析計を利用して測定する方法（特開昭59−31
699号、同59−51800号及び同61−83195号）も報告され
ている。

しかし、上記方法では、測定用基質の調製に極めて複
雑な行程が必要とされる。例えば、アミロースを構成す
るグルコース残基を部分的にCHOに酸化した後、アミノ
ピリジル基に置換する。この部分修飾アミロースに、液
化型アミラーゼとグルコアミラーゼを作用させて、非還
元末端のグルコースが修飾されたマルトオリゴ糖の混合
物を得る。この混合物を水素化ホウ素ナトリウムで還元
した後、カラムクロマトグラフィーにより精製して、非
還元末端が修飾され、還元末端が糖アルコールになった
目的の重合度のマルトオリゴ糖誘導体を得るという方法
で調製される。

又は、前記部分修飾アミロースに、グルコアミラーゼ
を作用させ、次いで、水素化ホウ素ナトリウムを反応さ
せて得られる混合物に、ｐ−ニトロフェニルグルコシド
等を添加して、サイクロデキストリングルカノトランス
フェラーゼを作用させた後、カラムクロマトグラフィー
を用いて精製して、非還元末端が修飾され、還元末端に
発色団が結合した目的とする重合度のマルトオリゴ糖誘
導体を得るという方法で調製される。

このように、非還元末端が修飾されたマルトオリゴ糖
誘導体の調製方法は、極めて複雑な工程が必要であり、
収率も低い。そのため、このマルトオリゴ糖誘導体を基
質として用いてヒト膵臓型と睡液型のα−アミラーゼ活
性を分別定量する方法も、実用化することは容易ではな
かった。

「発明が解決しようとする課題」 このように、従来の方法では、膵臓型のα−アミラー
ゼと、睡液型のα−アミラーゼとを分別定量するのは容
易ではない。その理由は、両酵素のアミノ酸配列には、
94％のホモロジーがあり、活性部位を構成するアミノ酸
残基も互いによく似ており、基質に対する作用形式もあ
まり相違がないためと考えられる。

したがって、本発明の目的は、ヒト膵臓型及び／又は
睡液型α−アミラーゼの分別定量が可能で、かつ、製造
容易な測定用基質であるガラクトシル−マルトオリゴ糖
誘導体、その製造法、及びそれを用いたヒト膵臓型及び
睡液型α−アミラーゼの分別定量方法を提供することに
ある。

「課題を解決するための手段」 本発明者らは、αアミラーゼの活性測定の際に、共役
酵素の作用を受けない安定な基質を得る目的で、酵素の
転移反応を利用して、ｐ−ニトロフェニル−α−マルト
ペンタオキシドの非還元末端グルコース残基に、ガラク
トシル基を結合させた誘導体を製造し、既に特願平２−
64620号として提案している。この製造過程では、ガラ
クトシル基がβ−1,4結合した誘導体と、β−1,6結合し
た誘導体とが4:1で混合した混合物が得られる。

本発明者らは、この２種類の異性体について更に検討
したところ、上記のβ−1,6結合した誘導体は、膵臓型
α−アミラーゼを作用させた場合と、睡液型α−アミラ
ーゼに作用させた場合とでは、異なった分解生成物を生
成するが、β−1,4結合した誘導体にはその作用がない
ことがわかった。したがって、ガラクトシル基がβ−1,
6結合した誘導体をα−アミラーゼ活性測定基質として
用いることにより、ヒト膵臓型及び／又は睡液型α−ア
ミラーゼの分別定量が可能であることを見出し、本発明
を完成するに至った。

すなわち、本発明のガラクトシル−マルトオリゴ糖誘
導体は、下記一般式（Ｉ）で示される。

（式中、Ｒは置換あるいは無置換のフェニル基を示し、
ｎは２〜５の整数を示す。） また、本発明のガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体
の製造法は、ガラクトシル残基を有する糖と、下記一般
式（II）で示されるマルトオリゴ糖誘導体とに、β−ガ
ラクトシダーゼを作用させて、ガラクトシル基を、前記
マルトオリゴ糖誘導体の非還元末端のグルコース残基
に、β−1,6結合させることを特徴とする。

（式中、Ｒは置換あるいは無置換のフェニル基を示し、
ｎは２〜５の整数を示す。） 更に、本発明のヒト膵臓型及び睡液型α−アミラーゼ
の分別定量方法は、ヒト膵臓型及び／又は睡液型α−ア
ミラーゼを含有する検体と、前記一般式（Ｉ）で示され
るガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体とを反応させ
て、生成する数種のマルトオリゴ糖誘導体の生成比を測
定し、この測定値からヒト膵臓型及び／又は睡液型α−
アミラーゼ活性を分別定量することを特徴とする。

以下、本発明について更に詳細に説明する。

前記一般式（Ｉ）、（II）において、Ｒは置換あるい
は無置換のフェニル基を示し、例えば４−ニトロフェニ
ル基、２−クロロ−４−ニトロフェニル基、2,4−ジク
ロロフェニル基等が挙げられる。これらの配糖体のアグ
リコン部の結合様式はα体、β体のいずれでもよい。

また、ｎは２〜５の整数を示すが、基質として使用す
る際の水解作用を考慮すると、ｎは３〜５であることが
より好ましい。

本発明の一般式（Ｉ）で示されるガラクトシル−マル
トオリゴ糖誘導体は、ガラクトシル残基を有する糖をド
ナーとし、一般式（II）で示されるマルトオリゴ糖誘導
体をアクセプターとする糖転移反応を、β−ガラクトシ
ターゼを用いて行なうことにより得ることができる。

ここで、ドナーとして用いられるガラクトシル残基を
有する糖は、下記一般式（III）で示される。

（式中、X₁はグルコース残基、シュークロース残基又は
ガラクトースの重合体を示す。） 一般式（III）で示されるガラクトシル残基を有する
糖としては、例えばラクトース、メリビオース、ラフィ
ノース、スタキオース、ガラクタン等が挙げられる。本
発明においてはこれら糖のいずれを用いてもよいが、安
価で、入手しやすいことから、ラクトースを用いるのが
好ましい。

アクセプターとして用いられるマルトオリゴ糖誘導体
は、前記一般式（II）で示されるが、この具体例として
は、Ｒがフェニル基であるものとして、フェニル−α−
マルトシド、フェニル−α−マルトトリオシド、フェニ
ル−α−マルトテトラオシド、フェニル−α−マルトペ
ンタオシド、フェニル−α−マルトヘキサオシド、フェ
ニル−α−マルトヘプタオシド等が例示される。また、
Ｒが置換フェニル基であるものとしては、ｐ−ニトロフ
ェニル−α−マルトシド、ｐ−ニトロフェニル−α−マ
ルトトリオシド、ｐ−ニトロフェニル−α−マルトテト
ラオシド、ｐ−ニトロフェニル−α−マルトペンタオシ
ド、ｐ−ニトロフェニル−α−マルトヘキサオシド、ｐ
−ニトロフェニル−α−マルトヘプタオシド等が例示さ
れる。

本発明において用いられるβ−ガラストシダーゼは、
ガラクトシドを加水分解してガラクトースを遊離する酵
素として知られている。本発明では、いずれの起源のβ
−ガラクトシダーゼを用いてもよく、具体的には「Biol
acta」（商品名、大和化成（株）製）、「Lactose F
“アマノ”」（商品名、天野製薬（株）製）、「Lactos
e Y−AO」（商品名、（株）ヤクルト製）等が挙げられ
る。

本発明の糖転移反応は、好ましくは次のような方法に
よって行なうことができる。

まず、一般式（III）で示されるガラクトシル残基を
有する糖と、一般式（II）のマルトオリゴ糖誘導体と
を、pH6〜９程度に調整された緩衝液中に添加する。こ
の場合、ガラクトシル基を有する糖の基質濃度は10〜40
重量％が好ましく、マルトオリゴ糖誘導体の基質濃度は
10〜40重量％が好ましい。次に、上記緩衝液にβ−ガラ
クトシダーゼを添加し、20〜60℃の温度下に、50〜100
時間反応させて、一般式（II）のマルトオリゴ糖誘導体
非還元末端のグルコース残基に、ガラクトシル基がβ−
1,4結合した誘導体と、β−1,6結合した誘導体とが混合
して生成された反応液を得る。

次いで、この反応液に緩衝液を追加して基質濃度を1/
3〜1/2に低下させることにより、ガラクトシル基がβ−
1,4結合した誘導体を選択的に加水分解させ、ガラクト
シル基がβ−1,6結合したガラクトシル−マルトオリゴ
糖誘導体を優先的に合成させる。反応終了後、pH調整又
は加熱により酵素反応を停止し、例えばカラムクロマト
グラフィー等により分画して、前記一般式（Ｉ）で示さ
れる本発明のガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体を得
る。

カラムクロマトグラフィーによる分画は、例えば「ト
ヨパール（Toyopearl）HW−40Sゲル」（商品名、TOSOH
（株）製）を充填したカラムを用い、移動相として25％
メタノールを用いる方法、ODSカラムを用い、移動相に
は10％メタノールを用いる方法等により行なうのが好ま
しい。このカラムクロマトグラフィーによる分画の際
に、未反応のアクセプターである一般式（II）のマルト
オリゴ糖誘導体の分画を回収することができ、これを次
の反応に繰り返し再使用することにより収率を著しく高
めることができる。

このようにして得られた本発明のガラクトシル−マル
トオリゴ糖誘導体は、ヒト膵臓型及び／又は睡液型α−
アミラーゼの分別定量が可能な活性測定用基質として使
用することができる。

次に、本発明のガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体
を測定用基質として用いるα−アミラーゼの活性測定方
法について説明すると、測定検体としては、ヒト膵臓型
及び睡液型α−アミラーゼの混合物あるいはそれぞれを
単独に含有するものでもよく、例えばヒトの血液、血
清、尿、睡液等が挙げられる。そして、上記ガラクトシ
ル−マルトオリゴ糖誘導体を含有する基質溶液に、上記
のような検体を添加し、所定時間反応させる。

反応条件としては、従来から行なわれているマルトオ
リゴ糖を測定用基質として用いる方法に採用されている
条件をそのまま採用することができる。すなわち、測定
用基質の濃度は0.1〜10mMの範囲とすることが好まし
く、反応温度は25〜40℃とすることが好ましい。また、
反応時間は測定の目的により自由に選択できるが、通常
３〜30分間程度が好ましく、pHは約６〜８が好ましく、
各緩衝液を使用して至適pHを維持することが好ましい。

こうして反応させると、各種のマルトオリゴ糖誘導体
が加水分解により生成する。この加水分解により生成し
たマルトオリゴ糖誘導体を高速液体クロマトグラフィー
により測定する。この測定値から、次のような方法によ
って、ヒト膵臓型α−アミラーゼと、睡液型α−アミラ
ーゼとの活性を分別定量することができる。

すなわち、測定用基質であるガラクトシル−マルトオ
リゴ糖誘導体として、ｐ−ニトロフェニル−α−マルト
ペンタオシド（pNP−α−G₅）の非還元末端グルコース
残基に、ガラクトシル基がβ−1,6結合した誘導体（Gal
−β−1,6−pNP−α−G₅）を用いた場合、ヒト膵臓型α
−アミラーゼ（HPA）及び／又は睡液型α−アミラーゼ
（HSA）と反応させると、加水分解物として、ｐ−ニト
ロフェニル−α−グルコシド（pNP−α−G₁）、ｐ−ニ
トロフェニル−α−マルトシド（pNP−α−G₂）、ｐ−
ニトロフェニル−α−マルトトリオシド（pNP−α−
G₃）とが生成される。

これらの加水分解物を総生成量から、α−アミラーゼ
活性の総量を求めることができる。また、ヒト膵臓型α
−アミラーゼ（HPA）と、睡液型α−アミラーゼ（HSA）
とでは、pNP−α−G₁とpNP−α−G₂の生成比にかなりの
相違がある。すなわち、加水分解物におけるpNP−α−G
₁/pNP−α−G₂のモル比と、HPAとHSAの存在比とは、直
線関係を示す。したがって、pNP−α−G₁/pNP−α−G₂
のモル比から、HPAとHSAの存在比を求めることができ
る。そこで、加水分解物の総生成量から求めたα−アミ
ラーゼ活性を、上記で求めたHPAとHSAの存在比で割り振
ることにより、HPAの活性とHSAの活性の分別定量を行う
ことができる。

「作用及び効果」 上記のように、本発明の前記一般式（Ｉ）で示される
ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体は、α−アミラー
ゼ活性の測定用基質として用いた場合、ヒト膵臓型α−
アミラーゼと、睡液型α−アミラーゼとで、加水分解物
の生成比にかなりの相違がある。したがって、加水分解
物の総量によってα−アミラーゼ活性の総量を求めると
ともに、それぞれの加水分解物の生成比によって、ヒト
膵臓型α−アミラーゼと睡液型α−アミラーゼの活性を
分別定量することができる。また、この測定は、高速液
体クロマトグラフィーを用いて行なうことができるの
で、操作が比較的簡便であり、また、自動化も可能であ
る。

更に、本発明のガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体
は、安価で入手しやすいラクトースを原料とすることが
でき、比較的温和な反応条件の酵素合成法で製造するこ
とができるので、工業的な製造においても有利である。

「実施例」 実施例１（ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製
造） ラクトース1884.8mgと、ｐ−ニトロフェニル−α−マ
ルトペンタオシド（pNP−α−G₅）1704mgを、50mMリン
酸緩衝液（pH7.0）6mlに分散させた後、β−ガラクトシ
ダーゼとして「Biolacta」（商品名、大和化成（株）
製）を3mg添加し、40℃で、86時間静置して反応させ
た。

その後、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）を等量添加し、4
0℃で、30時間反応させることにより、ガラクトシル基
がpNP−α−G₅にβ−1,4結合した誘導体を選択的に加水
分解させた。

反応終了後、トヨパール（Toyopearl）HW−40Sゲルを
充填したカラム（φ2.2×95cm）を用いて分画を行なっ
た。分画は、移動相として25％メタノールを用い、流速
0.8ml/minで、室温下に行なった。目的とする区分を分
取し、凍結乾燥して粉末150mgを得た。

この粉末を高速液体クロマトグラフィーで分析したと
ころ、ｐ−ニトロフェニル−α−マルトペンタオシドの
非還元末端グルコース残基に、ガラクトシル残基がβ−
1,4結合した誘導体と、β−1,6結合した誘導体とが、組
成比1:9で含まれる混合物であった。

更に、この粉末を、ODSカラム（充填剤：「YMC−pack
AQ−323」（商品名、（株）エイエムシィ製））を用
いて分画した。分画は、移動相として10％メタノールを
用い、流速3.8ml/minで、室温下にて行ない、目的とす
る区分を分取し、凍結乾燥して粉末95mgを得た。この粉
末について、¹³C核磁気共鳴スペクトル（NMR）により、
構造確認を行なったところ、ｐ−ニトロフェニル−α−
マルトペンタオシドの非還元末端グルコース残基に、ガ
ラクトシル基がβ−1,6結合した誘導体（Gal−β−1,6
−pNP−α−G₅）であることを確認した。上記の¹³C核磁
気共鳴スペクトルを第１図に示す。なお、NMRの測定
は、内部標準物質としてトリメチルシリルプロパンスル
フォネートを用いて行ない、化学シフトは内部標準から
低磁場側にppm単位で示した。

実施例２（α−アミラーゼ活性の測定） 上記のGal−β−1,6−pNP−α−G₅を0.1mMとなるよう
に、0.04MのCaCl₂を含有する0.1M 3,3−ジメチルグルタ
リックアシッド−5M NaOH緩衝液（pH6.8）に溶解し、基
質溶液とした。この基質溶液を２組用意し、一方の組に
はヒト膵臓型α−アミラーゼ（HPA）を、他方の組には
睡液型α−アミラーゼ（HSA）をそれぞれ2.6U/ml添加
し、37℃で、12分間反応させた。

上記反応中、３分毎に反応液を採取し、その加水分解
生成物の組成を、ODSカラム（充填剤:YMC−pack AQ−3
12）を用い、移動相:10％メタノール、流速1.0ml/min、
室温の条件下に、高速液体クロマトグラフィーで追跡し
た。なお、加水分解物の検出は、UV検出基（300nm）で
行なった。

この結果、加水分解として、ｐ−ニトロフェニル−α
−グルコシド（pNP−α−G₁）、ｐ−ニトロフェニル−
α−マルトシド（pNP−α−G₂）、ｐ−ニトロフェニル
−α−マルトトリオシド（pNP−α−G₃）が検出され
た。

こうして測定した加水分解物の組成と、反応時間との
関係を第２図に示す。第２図において、左欄「Ａ）HS
A」は、睡液型α−アミラーゼ（HSA）の反応結果を示
し、右欄「Ａ）HPA」は、ヒト膵臓型α−アミラーゼ（H
PA）の反応結果を示す。また、−●−はpNP−α−G₁、
−▲−はpNP−α−G₂、−■−はpNP−α−G₃の生成量を
表わしている。

第２図の結果から、HPA及び、HSAの加水分解物の生成
比にはかなり相違があることがわかる。つまり、ｐ−ニ
トロフェニル−α−グルコシド（pNP−α−G₁）とｐ−
ニトロフェニル−α−マルトシド（pNP−α−G₂）との
モル比が、HPAでは約3.2であるのに対して、HSAでは1.1
である。

実施例３ Gal−β−1,6−pNP−α−G₅を実施例２と同様にして
緩衝液中に溶解し、基質溶液を作成した。この基質溶液
に、HPAとHSAの混合比を変えた各種の混合物（HPAの含
有量がそれぞれ80％、60％、50％、40％、20％となり、
かつ、合計のα−アミラーゼ活性が2.6U/mlとなるよう
にしたもの）をそれぞれ添加し、37℃で９分間反応させ
た。この反応中、３分毎に反応液を採取し、その加水分
解生成物の組成を、実施例２と同様な高速液体クロマト
グラフィーで測定した。

こうして測定した加水分解の組成と、反応時間との関
係を第３図に示す。第３図において、「Ａ）20％HPA」
はHPA 20％とHSA 80％の混合物、「Ｂ）40％HPA」はHPA
40％とHSA 60％の混合物、「Ｃ）50％HPA」はHPA 50％
とHSA 50％の混合物、「Ｄ）60％HPA」はHPA 60％とHSA
40％の混合物、「Ｅ）80％HPA」はHPA 80％とHSA 20％
の混合物の反応結果をそれぞれ示している。また、−●
−はpNP−α−G₁、−▲−はpNP−α−G₂、−■−はpNP
−α−G₃の生成量を表わしている。

また、pNP−α−G₁/pNP−α−G₂のモル比と、HPAとHS
Aの存在比との相関関係を求めた結果を第４図に示す。

第４図の結果から、pNP−α−G₁/pNP−α−G₂のモル
比と、HPAとHSAの存在比とは直線関係を示すことがわか
る。したがって、pNP−α−G₁/pNP−α−G₂のモル比か
ら、HPAとHSAの存在比を求めることができる。また、加
水分解物の総生成量も同時に求めることができ、それに
よって求められた合計の活性を測定できるので、この合
計の活性をヒト膵臓型及び睡液型α−アミラーゼの存在
比で割り振ることにより、それぞれの酵素活性が算出で
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例で得られたGal−β−1,6−pNP
−α−G₅の¹³Cの核磁気共鳴スペクトルを示す図、第２
図はGal−β−1,6−pNP−α−G₅に対するヒト膵臓型及
び睡液型α−アミラーゼの加水分解作用を示す図、第３
図は種々の混合比のヒト膵臓型及び睡液型α−アミラー
ゼの、Gal−β−1,6−pNP−α−G₅に対する加水分解作
用を示す図、第４図はpNP−α−G₁−α−G₁/pNP−α−G
₂のモル比と、HPAとHSAの存在比との相関関係を示す図
である。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07H 1/00 - 23/00 C08B 37/00 C12P 19/00 - 19/64 C12Q 1/00 - 1/70 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記一般式（Ｉ）で示されるガラクトシル
   −マルトオリゴ糖誘導体。 （式中、Ｒは置換あるいは無置換のフェニル基を示し、
   ｎは２〜５の整数を示す。）
2. 【請求項２】ガラクトシル残基を有する糖と、下記一般
   式（II）で示されるマルトオリゴ糖誘導体とに、β−ガ
   ラクトシダーゼを作用させて、ガラクトシル基を、前記
   マルトオリゴ糖誘導体の非還元末端のグルコース残基
   に、β−1,6結合させることを特徴とする請求項１記載
   のガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造法。 （式中、Ｒは置換あるいは無置換のフェニル基を示し、
   ｎは２〜５の整数を示す。）
3. 【請求項３】ヒト膵臓型及び／又は睡液型α−アミラー
   ゼを含有する検体と、請求項１記載のガラクシル−マル
   トオリゴ糖誘導体とを反応させて、生成する数種のマル
   トオリゴ糖誘導体の生成比を測定し、この測定値からヒ
   ト膵臓型及び／又は睡液型α−アミラーゼ活性を分別定
   量することを特徴とするヒト膵臓型及び睡液型α−アミ
   ラーゼの分別定量方法。