JPH0198498A

JPH0198498A - アミラーゼアイソエンザイム活性分別定量方法

Info

Publication number: JPH0198498A
Application number: JP25669387A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Ito; 啓伊藤; Zensuke Ogawa; 小川　善資; Nobuhiro Oda; 信博織田; Shigeru Sato; 茂佐藤
Original assignee: Kurita Water Industries Ltd
Current assignee: Kurita Water Industries Ltd
Priority date: 1987-10-12
Filing date: 1987-10-12
Publication date: 1989-04-17

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はα−アミラーゼアイソエンザイム活性の新規な
分別定量方法に関するものである。

［従来の技術］人体中には主に膵臓由来のアミラーゼ（ｐ−アミラーゼ
）と唾液腺由来のアミラーゼ（Ｓ−アミラーゼ）の少く
とも２種のα−アミラーゼアイソエンザイムが存在する
。これらのアイソエンザイムは、例えばｆＪ７４Ｉａガ
ンのときにはｐ−アミラーゼが増加し、肺ガンの場合に
はＳ−アミラーゼが増加するというように病気に応じて
量が変動する。

従来、これらのα−アミラーゼアイソエンザイム活性を
分別定量する方法として電気泳動法、イオン交換クロマ
トグラフィーなどを利用した方法が知られている。また
、一方のα−アミラーゼのみと反応するモノクローナル
抗体を存在させて、α−アミラーゼ活性を測定する方法
も提案されている（特開昭６１−１６４１６１号）。

［発明が解決しようとする問題点］このうち、電気泳動法とイオン交換クロマトグラフィー
による方法は、いずれも分析に長時間を要し、操作が繁
雑なため、再現性が得られ難いという欠点がある。

一方、モノクローナル抗体を用いる方法も、現在のとこ
ろＳ−アミラーゼ又はｐ−アミラーゼのいずれかを特異
的にかつ完全に活性を阻害するものは見い出されていな
い上に、活性を十分阻害するまでに時間を要するため、
自動分析測定に適用させ難い。

本発明は、これら従来方法が持つ問題を克服すべく研究
を重ねた結果、完成された発明である。

［問題点を解決するための手段コ本発明は下記−数式（Ｉ）および−数式（ＩＩ）で表わ
される異なる二種類のマルトオリゴ糖を含む基質と試料
とをグルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼの共存
下で反応させ遊離するそれぞれのマルトオリゴ糖の還元
末端の配糖体を定量し、それらの値からアミラーゼアイ
ソエンザイム活性を分別定量下ることを特徴とするアミ
ラーゼアイソエンザイム活性分別定量方法である。

Ａ−ＧＩＩｌ−Ｂ、　　　　　　　・・・（Ｉ）Ｃ−Ｇ
　　ｎ　　−８２・・・　　＜　　ＩＩ　　）（式中Ａ
はＢ、　、　Ｂ２は又は単糖類もしくはその訪導体、ＣはＨ又はＨＧはグルコース、ｍ、ｎは３〜１５の整数をそれぞれ表
わす。（ＩＩＩ　）〜（Ｖｌ）式中、Ｒ１−Ｒ６は水素
原子、低級アルキル基、ベンジル基、Ｎ−置換アミノメ
チル基、（ＣＨ２）ｘＣＯＯＭ　（Ｘは０．１又は２、
Ｍは水素原子又はアルカリ金属を表わす。）、又は単糖
類、Ｘ１〜Ｘ６は酸素原子又はイオウ原子、Ｚｌ。

Ｚｌは水素原子、ハロゲン原子又はカルボキシル基を表
わす。）ところで、α−アミラーゼアイソエンザイムは基質であ
るマルトオリゴ糖の構造によってα−アミラーゼアイソ
エンザイムが反応障害を受けることがある。

例えば、後述の実験例１に記載したように、７種類の各
種オリゴ糖を基質として同一試料のα−アミラーゼ活性
を測定した結果を示した第１図、第２図及びこれらの結
果に基いて、各基質のミカエリス定数（Ｋ、値）及び最
大反応速度（Ｖ□８）を算出した結果をまとめた第３表
から、次のようなことが明らかである。

即ち、化学修飾していないマルトペンタオース（Ｇ５）
や還元末端にフルクトースを修飾したマルトペンタオー
ス（ＧＳ−Ｆ）では、ｐ−アミラーゼとＳ−アミラーゼ
はほぼ均等に作用するのに対し、非還元末端をプロピリ
デン化し、かつ配糖体としてフルクトースを反応させた
マルトヘプタオースの基質、即ちプロピリデン−マルト
ペンタオース（Ｐ　ｒ　ｏ　−Ｇ　７−　Ｆ　）では、
Ｇｍに比べるとｐ−アミラーゼもＳ−アミラーゼも反応
阻害を受けるものの、ｐ−アミラーゼの方が約１゜５倍
の反応阻害を受ける。

この性質を十分に把握しておけば、２種類の異なるマル
トオリゴ糖を基質とすることによフて、従来より正確に
α−アミラーゼアイソエンザイム活性を分別定量するこ
とができるのである。

本発明はこのような構造の異なるマルトオリゴ糖果の基
質に対するα−アミラーゼアイソエンザイムの反応性の
違いに着目して完成されたものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

先ず、本発明で用いられる基質について説明する。

本発明で用いられる一般式（１）のα−アミラーゼ活性
測定用基質は、アミラーゼアイソエンザイムの一方を強
く反応阻害するものであり、非還元末端Ａのグルコース
の４位と６位が一緒になってアルキレン橋（プロピリデ
ンやエチリデン）を形成しているものに限られる（前記
−数式％式％））一般式（ＩＩＩ　）の具体例としては、Ｘｌ、Ｘ２．Ｒ
１゜Ｒ２が下記第１表に記載するようなものが例示され
る。

第　　１　　表他方、本発明で用いられるもう一方のマルトオリゴ環は
、トータルとしてのα−アミラーゼ活性を測定できるも
のが選ばれる。即ち、−数式（ＩＩ　）で表わされる基
質においては、非還元末端は未置換グルコースでも良い
し、その４位及び／又は６位が置換されたもの（例えば
ベンジル化）でも良い（−数式（■））。さらに前記−
数式（ＩＩＩ　）のようにグルコースの４位と６位が一
緒になってアルキレン橋（例えばベンジリデン）を形成
していても良い。

一般式（Ｖ）で表わされる非還元末端の具体例を第２表
に示す。

第２表前記−数式（１）、（ＩＩ）において、Ｂｌ及びＢ２は
同じでもよく異なっていても良い。

Ｂｌ及びＢ２の具体例としては４−ニトローフェニル、
２−クロロ−４−ニトロ−フェニル、２．６−ジクロロ
−４−ニトロフェニル、２．６−ジプロモー４−二トロ
フェニル、２−ブロモ−４−ニトロフェニル、２−ヨー
ド−４−ニトロフェニル、２−フルオロ−４−ニトロフ
ェニルなどが例示される。

また、Ｂｌ及びＢ２は広義の単糖類あるいはその誘導体
でも良く、具体的にはグルコース、フルクトース、マン
ノース、ガラクトース、ソルボース、タガロース、イノ
シトールなどが例示される。これらの誘導体としてはリ
ン酸基を導入したものが挙げられる。

還元末端Ｂ、、Ｂ、としては、測定精度や安定性及び他
の血清成分によるＭｉ街作用を受けることが少ないなど
の面からフルクトースやイノシトールが好ましい。

一般式（Ｉ）、（ＩＩ）においてＧｍ、Ｇｎは、具体的
にはマルトペンタオース（Ｇｓ）、マルトオクタツース
（Ｇ８）、マルトデカオース（ａｔ。）、マルトヘキサ
デカオース（Ｇ　ｌ１ｌ）などが挙げられる。

これらのうち、Ｇ　５　””’　Ｇ　ａは水溶性に優れ
ているため好ましい。

本発明で用いる一般式（Ｉ）で表わされるマルトオリゴ
環としては、ベンジリデン−０７−フルクトース（Ｂ　
ｚ　−０７−Ｆ　）　、プロピリデン−〇、−フルクト
ース（Ｐｒｏ−Ｇｔ−Ｆ）などが最も好ましい例として
挙げられる。

一方、−数式（ＩＩ）で表わされるマルトオリゴ環とし
ては、Ｇｍ−フルクトース（Ｇｓ−Ｆ）、Ｇ５−イノシ
トール（Ｇａ−Ｉｎｏ）、ベンモル化Ｇｍ−フルクトー
ス（Ｂｅ−Ｇｓ　　　Ｆ）％　プロピル化Ｇｍ−フルク
トース（Ｐ　ｕ　ｔ　−Ｇ　５−Ｆ）、Ｎ−メチルアミ
ノメチル化−Ｇｍ−フルクトース及びイソマルトヘキサ
オース−Ｆなどが最も好適な例として挙げられる。

なお、本発明は前述のとおり、二種のマルトオリゴ環に
対するα−アミラーゼアイソエンザイムの反応性の差を
巧みに利用するものであるため、使用するマルトオリゴ
環は必ず異種のものを使用する必要がある。

二種の組み合わせの好適例としては、プロピリデン−０
７−フルクトース（Ｐ　ｒ　ｏ　−Ｇ　ｙ　−Ｆ　）と
ａＳ−フルクトース（Ｇｓ−Ｆ）、ベンジリデン−Ｇツ
ーパラニトロフェノール（Ｂｚ−Ｇｍ−ｐＮＰ）とプロ
ピリデン−０７−フルクトース（Ｐｒｏ−Ｇｍ−Ｆ）な
どが挙げられる。

次に本発明で用いられる化合物の製造方法の一例を説明
する。

まず、サイクロデキストリン（α、β、γのいずれでも
良い。）と、グルコースを除く単糖類、例えばしよ糖（
Ｇ＋Ｆ）とをサイクロデキストリングルカノトランスフ
ェラーゼの共存下に反応させる。その結果、サイクロデ
キストリンが開環し、その還元末端にしよ糖が転移し、
新たに還元末端がフルクトースとなる。もっとも、この
際、デキストリンの分断も行なわれるので、得られるデ
キストリンは原料のサイクロデキストリンのグルコース
数のものに限られず、それ以下のグルコース数のものも
生成する。マルトオリゴ糖のグルコース数が、この操作
で所望のものよりも少なければ、マルトース以上のオリ
ゴ環と、得られた転位デキストリンとを再度サイクロデ
キストリングルカノトランスフェラーゼの共存下に反応
させれば良い。

なお、非還元末端のグルコースＣは、前述の通り、その
４位及び／又は６位を修飾されている方が、測定誤差が
少なくなるので好ましいものである。非還元末端の４位
及び／又は６位を修飾する場合には、上述の方法で得ら
れた単糖類転移マルトオリゴ糖を、酸触媒の存在下にジ
メトキシトルエンやジメトキシプロパンと反応させる。

その結果、−数式（ｎｔ）、（Ｖｌ）で示される非還元
末端が得られる。

一方、−数式（Ｖ）で示される非還元末端を導入する場
合には、上記−数式（ＩＨ）又は（Ｖｌ　）の化合物の
６位及び／又は４位を触媒存在下にＯＨ基とし、次いで
、ハロゲン化アルキルを反応させ、接触還元すればよい
。また、Ｘｌ−Ｘ６のいずれかをＳにしたい場合には、
（ＩＩＩ　）式、（Ｖ）式又は（Ｖｌ）式の化合物をス
ルホン酸エステル化し、メルカプタン類を反応させれば
良い。

なお、前述の例で、非還元末端にフルクトースを導入す
る場合の原料としてしょ糖を用いる例を示したが、マル
トシルシュクロースを原料としても良い。また、サイク
ロデキストリンのかわりに市販のマルトオリゴ糖を用い
ても良い。サイクロデキストリングルカノトランスフェ
ラーゼとしては、バチルス・マセランス、バチルス・メ
ガテリウム、バチルス・サーキュランス及びバチルス・
オーベンシス等を起源とするものを使用できる。

このようにして得られた反応生成液から、所望のマルト
オリゴ糖を分１！１精製する手段としては、ＧＰＣ，イ
オン交換クロマトグラフィー、合成吸着剤による方法等
が挙げられる。

次に本発明の定量方法を述べる。

先ず一般式（Ｉ）のマルトオリゴ糖の一定量と試料及び
共役酵素としてグルコシダーゼ及び／又はグルコアミラ
ーゼを加えると次式のように反応が進む（なお、一般式
（１）の例としてＰｒｏ−０７−Ｆを挙げる。）。

α−アミラーゼＰｒｏ−Ｇ７−Ｆ　　　　　　　　Ｐｒｏ−Ｇ４＋Ｇ３
−Ｆグルコアミラーゼここで遊離したフルクトースを例えばマンニトールデヒ
ドロゲナーゼ（ＭＤＨ）やソルビトールデヒドロゲナー
ゼ（ＳＤＨ）と、ＮＡＤＨ又はＮＡＤ共存下に反応させ
ることによりＮＡＤ又はＮＡＤＨを生成させ、その吸光
度の変化によりフルクトース量が測定できる。

ＮＡＤ　　　　ＮＡＤＨなお、配糖体が一般式（ＩＶ　）の場合には遊離してく
るニトロフェノール系化合物を常法により定量すれば良
い。

次に、一般式（ＩＩ　）のマルトオリゴ環（例えばＧｍ
−Ｆ）を含む基質を同量、前記と同様に試料と反応させ
、遊離してくる配糖体の量を定量する。

こうして二種のマルトオリゴ環から成る基質それぞれに
ついてα−アミラーゼ活性が測定されれば、次に示すよ
うに連立方程式をたててα−アミラーゼアイソエンザイ
ム活性を算定する。

ＡＧＳ　−Ｆ＝αｐ＋β５ＡＰｒｏ−Ｇｍ−Ｆ＝ｙｐ＋ΔＳ（ここで、ＡＧＳ−Ｆはａｓ　Ｆを基質としたときのα
−アミラーゼ活性測定値、ＡＰｒｏ−〇７−ＦはＰｒｏ
−Ｇｍ−Ｆを基質としたときのα−アミラーゼ活性測定
値、ｐ、Ｓはα−アミラーゼアイソエンザイム活性、α
、γはＧｍを基質とした場合のｐ−アミラーゼの反応速
度に対するそれぞれの反応速度の比、β、ΔはＧＳを基
質とした場合のＳ−アミラーゼの反応速度に対するそれ
ぞれの反応速度の比を表わす。）なお、Ｇｍを基質としたときの反応速度を基準にするの
は第３表からもわかるように、Ｓ−アミラーゼとｐ−ア
ミラーゼがほぼ同じ反応速度を示すからである。このＧ
５による基準値は一度測定しておくと、同じ濃度の基質
を用いる限り、いつでも採用することができる。

また、ここでは各基質の最大反応速度を基準にしてα−
アミラーゼアイソエンザイム活性を算出する方法につき
述べたが、ある一定濃度の基質を用いた場合に得られる
酵素反応速度を基準としても同様の計算によりアイソエ
ンザイム活性は求められる。

［作　用］構造の異なる２種類のマルトオリゴ糖を含む基質を試料
と接触させることにより、α−アミラーゼアイソエンザ
イムは構造の違いに基いて固有の反応障害を受け、酵素
反応速度が異なってくる。

本発明においては、このような作用の差に基いて、それ
ぞれのアイソエンザイム活性を分別定量するものである
。

［実施例］以下、実験例及び実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明する。

実験例！Ｇｓ　　（マルトペンタオース）、クロロニトロフェニ
ルマルトペンタオシド（ａｓ−ＧＮＰ）、フラクトマル
トペンタオシドＣａ１ｌ−Ｆ）、４．６−ベンジリデン
−フルクトマルトペンタオシド（Ｂ　ｚ　−Ｇ　ｓ　−
Ｆ　）　、６−ベンジル化フルクトマルトペンタオシド
（Ｂｅ−Ｇｍ−Ｆ）、４．６−ベンジリデン−バラニト
ロフェニルマルトへブタオシド（Ｂ　ｚ　−Ｇ　ｙ　−
ｐ　Ｎ　Ｐ　）及び４．６−プロピリデン−フルクトマ
ルトへブタオシド（Ｐｒｏ−Ｇｍ−Ｆ）を一定量づつ試
験管にとり、それぞれにｐ−アミラーゼ５００ｍＵ／ｍ
１とα−グルコシダーゼＩＯＵ／ｍＩｌを加え、３７℃
で１０分間反応させた。次に遊離するフルクトース又は
ニトロフェノール系化合物を前述した方法で測定した。

結果を第１図に示す。

また、上記においてｐ−アミラーゼにかえてＳ−アミラ
ーゼを用いた他は全く同じ操作を行なった。結果を第２
図に示す。

第１図及び第２図から、各々のミバエリス定数、最大反
応速度を算出した結果を第３表に示す。第３表よりＧｍ
についてはアイソエンザイム活性はほぼ同じであるが、
非還元末端を化学修蝕することにより反応障害が生じる
ことがわかる。

実施例！Ｇｍ−Ｆ　　２ｍｍｏＩＬ／λ、α−グルコシダーゼＩ
ＯＵ／ｍＩｌ、マンニトール脱水素酵素１゜Ｕ　／　ｍ
　Ｘ、ＮＡＤＨ０，１６ｍｍｏＡ／ｕを加え、反応速度
を測定し、これを試薬盲検とする。

これに試料を加え、反応速度を測定し、盲検値を差し引
き、ＧＳ−Ｆの活性を求めた。

次に、Ｐｒｏ−Ｇｍ−Ｆ　　２ｍｍｏｆｌ／Ｊ１１グル
コアミラーゼ２５　Ｕ　／　ｍ　Ｉｔ　、α−グルコシ
ダーゼＩＯＵ／ｍｊｌ、マンニトール脱水素酵素１０Ｕ
／ｍｆｌ、ＮＡＤＨ０，１６ｍｍｏｕ／ｆを加え、試薬
盲検を測定し、その後同様にして、Ｐｒｏ−Ｇ７−Ｆ活
性を測定する。この両者の活性を次式に代入し、ｐ−ア
ミラーゼ活性、Ｓ−アミラーゼ活性をそれぞれ求めた。

Ａ　Ｇ　ｓ　−Ｆ　＝　０　、６５　Ｐ　＋　０　、　
７４５ＡＰｒｏ−Ｇｍ−Ｆｗｏ、２９ｐ＋０．６６ｓそ
こで、精製されたｐ−アミラーゼ２００ｍＵ／　ｍ　ｆ
ＬとＳ−アミラーゼ２００ｍＵ／ｍＩＬを等量混合し、
Ｇ　ｓ　−Ｆを基質として測定したところ１３９ｍＵ／
ｍｕ、Ｐｒｏ−０７−Ｆを基質として測定したところ９
５　ｍ　Ｕ　／　ｍ　ＩＬと測定された。

これを上記連立方程式にて解くとｐ−アミラーゼのパー
センテージは５０％となった。

更に患者検体を用いて、末法と従来法である電気泳動法
にて相関を取ると、第３図に示す通り、高い相関性のあ
ることが判明した。

［発明の効果コ以上詳述した通り、本発明は構造の異なる２種類のマル
トオリゴ糖を基質としてα−アミラーゼ活性を測定する
ものであって、本発明の方法によれば、簡単に、しかも
正確に、α−アミラーゼアイソエンザイム活性を分別定
量することができる。また、アイソエンザイムに特有の
阻害剤や抗体を、本発明の方法にあわせて使用すること
により、更に、アイソエンザイム活性分別定量を正確か
つ簡易にすることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は実験例１の結果を示すグラフである
。第３図は実施例１の結果を示すグラフである。代理人　　弁理士　　瓜　野　　剛第１図基質濃度（ｍＭ）第２図基質濃度（ｍＭ　）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記一般式（ I ）及び一般式（II）で表わされ
る異なる二種類のマルトオリゴ糖を含む基質と試料とを
グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼの共存下で
反応させ、遊離するそれぞれのマルトオリゴ糖の還元末
端の配糖体を定量し、それらの値からアミラーゼアイソ
エンザイム活性を分別定量することを特徴とするアミラ
ーゼアイソエンザイム活性分別定量方法。Ａ−Ｇ＿ｍ−Ｂ＿１・・・（ I ）Ｃ−Ｇ＿ｎ−Ｂ＿２・・・（II）（式中Ａは ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（III）Ｂ＿１、Ｂ＿２は ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（IV）又は単糖類もしくはその誘導体、Ｃは ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（Ｖ）又は ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（VI）Ｇはグルコース、ｍ、ｎは３〜１５の整数をそれぞれ表
わす。（III）〜（VI）式中、Ｒ＿１〜Ｒ＿６は水素原
子、低級アルキル基、ベンジル基、Ｎ−置換アミノメチ
ル基、（ＣＨ＿２）＿ｘＣＯＯＭ（ｘは０、１又は２、
Ｍは水素原子又はアルカリ金属を表わす。）、又は単糖
類、Ｘ＿１〜Ｘ＿６は酸素原子又はイオウ原子、Ｚ＿１
、Ｚ＿２は水素原子、ハロゲン原子又はカルボキシル基
を表わす。）
（２）Ｂ＿１又はＢ＿２がフルクトース、イノシトール
及びそれらの誘導体から成る群より選ばれるものである
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の定量方
法。