JPS61209600A - α−アミラ−ゼの分別定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、α−アミラーゼの定量方法に関し、更に詳し
くは、鉄イオンを用０てα−アミラーゼアイソザイムを
分別定量するα−アミラーゼの分別定量方法に関する。

〔従来の技術〕

生体液中に検出されるα−アミラーゼは、膵臓由来のＰ
型アミラーゼと唾液腺由来のＳ型アミラーゼの二種類の
アイソザイムに区別されることが知られでいる。これら
のα−アミラーゼアイソザイムは、膵臓疾患、耳下腺、
及び外科手術後の過アミラーゼ症において、その量や存
在比が著しく異なるため、これらの病気の早期発見など
にα−アミラーゼの分別定量が臨床的にも重要な役割を
果すことになり、簡便で迅速な定量方法の開発が望まれ
ている。

従来、この分別定量を目的とした各種の方法が提案され
ている。この例としては、荷電の差を利用した電気泳動
による分離方法、ゲル濾過方法、アフィニティ・クロマ
トグラフィによる方法、免疫学的方法、及びアミラーゼ
インヒビターによる方法等が知られでいる。

就中、電気泳動による方法とアミラーゼインヒビターに
よる方法は一般的に行なわれている。

電気泳動法［：Ｃ１ｉｎ、ｃｈｉｆｌｌ、Ａｃｔａ　、
５４　、１３７（１９７４）〕は、精度及び操作性等の
有利さを有しているが、Ｐ型とＳ型のα−アミラーゼの
ｐＩが近似し、そのうえ各々のα−アミラーゼの分子量
が同程度であることからアイソザイムの分離が容易でな
い。又、分離に長時間を必要とするため迅速に検体を処
理する方法としては問題が残る。一方、アミラーゼイン
ヒビター法は、オドンネル（０・Ｄｏｎｎｅｌｌ）氏ら
によって報告（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃ
ｔａ、４２２，１５９（１９７６）〕以来、小麦中に存
在するα−アミラーゼインヒビターを用いてＳ型、及び
Ｐ型のアイソザイムの分別定量を試みる報告は多い〔特
開昭５８−８５８９９、特開昭５８−１７４３３２、特
開昭５９−４２８９７等〕。この方法は、電気泳動によ
る方法と比べれば測定が簡単にできるが、現実的にはα
−アミラーゼインヒビター停秤量、溶解及び希釈等の煩
雑な操作を必要とする。更にα−アミラーゼインヒビタ
ーが天然物からの抽出であるため、ロフトがバラツキ易
く、それ故測定の精度及び正確性の管理が困難であるば
かりでなく、価格においても高価で実用的であるとはい
えない。

〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明は、上記の従来の欠点を解消すべく鋭意研究を重
ねた結果、α−アミラーゼに対し鉄イオンがインヒビタ
ー同様の特異的阻害を′示すことを見出し、この鉄イオ
ンを用いて簡便で正確に測定できるα−アミラーゼのア
イソザイム分別定量方法を提供することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、α−アミラーゼを含有する試料液に対し、イ
ンヒビターとして鉄イオンを作用させ、特定のα−アミ
ラーゼアイソザイム活性を阻害させた後、該試料液中の
α−アミラーゼ活性を測定することを特徴とするα−ア
ミラーゼの分別定量方法である。

鉄イオンによるα−アミラーゼを含有する試料液の阻害
は、鉄イオンの沈澱とｐＨの影響を考慮して、緩衝液中
でｐＨを中性付近に保持し、鉄イオンの沈澱は、鉄イオ
ン濃度を小さくして最小限にとどめて行なう。そして、
α−アミラーゼ活性測定は反応混合溶液をよく混和して
、均一な懸濁状態にして行なう。

本発明で用いる鉄イオンは特異性の高い塩化第二鉄、硫
酸第二鉄が好ましく、そして２価より３価の方が効果的
である。鉄イオンの阻害に対する濃度依存性は、α−ア
ミラーゼ濃度０．１り／コで３７℃、３０分間のインキ
ュベーションの場合、Ｓ型アミラーゼは塩化物イオンの
保護効果も多少あるが、約２ｍＭ程度使用することによ
って失活効果が達成される。

鉄イオンを作用させて特定のα−アミラーゼアイソザイ
ム活性を阻害させた後の試料液中のα−アミラーゼ活性
の測定は、公知のα−アミラーゼ活性測定用試薬を用い
て行なう。例えば、デン粉にα−アミラーゼを作用させ
て、残存するデン粉量をヨードデン粉反応で測定するア
ミロクラスティク法、α−アミラーゼによって分解され
た還元糖量を測定するサッカロゼニック法、色素をデン
粉に結合させたものを基質とし、α−アミラーゼ作用に
よって遊離した寡糖結合の色素量を測定するクロモゼニ
ツク法、オリゴサツカライドやデン粉、或いはこれらの
誘導体を基質とし、α−アミラーゼと添加共役酵素の作
用によって生成するグルコースや色素等を測定する共役
酵素法等で使用されている公知゛の試薬を用いてα−ア
ミラーゼ活性を測定することができる。

〔作用〕

本発明によれば、α−アミラーゼアイソザイムのうちＳ
型はＰ型に比べ鉄イオンの阻害を受は易く、父、カウン
ターイオンがα−アミラーゼの安定化効果をもつ塩化物
イオンより硫酸イオンであるときの方が効果的である。

鉄イオンのα−アミラーゼアイソザイムに対する特異的
阻害の確認は、Ｓ型アミラーゼとＰ型アミラーゼを任意
の割合で混合し、これに鉄イオンを作用させたところ、
混合比と残存活性に直線関係が得られ、Ｓ型とＰ型のア
ミラーゼ間に保護効果等の相互作用は観察されず、鉄イ
オンがＳ型アミラーゼに対して特異的かつ定量的に阻害
していることかられかる。この結果、鉄イオンを用いて
、簡便で正確に測定できるα−７ミラーゼのアイソザイ
ム分別定量方法が可能になった。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、これら
の実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものではない
。

実施例１ ■、酵素溶液 （１）Ｓ型アミラーゼの精製 ヒトの唾液を遠心（１０“、ＯＯＯｒｐｍ、１ｈｒ）し
だ上清を５０ｍ１”ｖｌ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，
０）に対し透析（４℃、２４ｈｒ）した後、同緩衝液で
予め平衡化しであるセファデックスＧ−１００のカラム
（２，５Ｘ７５ｃｍ）を用い、溶出速度１０　、８ｍＡ
！／ｈ　ｒ　、分画量６、Ｏｄでゲル濾過を行なう。タ
ンパク質の溶出は２８０ａｓｃにおける吸光度により検
出し活性画分をアミコン膜（ａｍｉｃｏｎ　ｍｅｎｂｒ
ａｎｅＰＭ−１０）を用いた限外濾過により濃縮し、デ
ィスクゲル電気泳動により単一性を確認した後、精製酵
素標品とする。

（２）Ｐ型アミラーゼの精製 ヒトの膵液（凍結品）を解かし、０．１Ｍフッ化フェニ
ルメチルスルフォニル’Ｆ＝最終濃度３ｍＭになるよう
に加え、膵臓より主に分泌されるトリプシン、キモトリ
プシン等のセリン、プロテアーゼによる分解を防ぎ、不
要沈澱物を遠心（１４，５０Ｏｒｐｍ、３０ｍ１ｎ、）
除去した上清を限外濾過により濃縮する。５ｅｐｈａｄ
ｅｘＧ−１００を用いたゲル濾過により分離後、この活
性画分分集め、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，
５）に対し透析し、同緩衝液で平衡化しであるＤＥＡＥ
−セルロースのカラム（２ｘ２０ｃｍ）に吸着させる。

同緩衝液のｂｅｄ　ｖｏｌｕｍｅの容量にて洗浄後、０
〜０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む同緩衝液の直線濃度
勾配により、２７．０ｍ／／ｈｒの流速にて、’３ｎｌ
／フラクションの分画を集める。このときの活性分画を
収集・濃縮し、ディスクゲル電気泳動により単一性を確
認した後、精製酵素標品とする。

（３）酵素溶液の調製 精製したＳ型アミラーゼ及びＰ型アミラーゼを各々Ｏ：
１．１：３．１：１．３：１、に〇の割合で混合し、１
％ウシ血清アルブミンを含む生理食塩水に溶解する。

２試薬 （１）塩化第二鉄溶液 塩化第二鉄（６水塩）５４０■／ｌを含む０．２Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）に鉄イオンとして１ｍＭとなる
ように調製する。

（２）基質溶液 アミロース（ＭＷ！−ｉ２　、９００　）１７４■を適
当量の１Ｍ水酸化ナトリウムに溶解し、塩酸で中和して
、塩化ナトリウム及び塩化カルシウムを含む０．２Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７、０）で全量ｉｏｏｍ／に調製する
。

（３）　　ヨウ化カリウム溶液 ヨウ化カリウム３３　ｇ／ｌの水溶液にヨウ素３　、３
　ｇ／ｌとなるように調製する。

３、実験方法と効果 （１）調製した酵素溶液の各々２０１１１３に０．２Ｍ
リン酸緩衝液ＩＨ７，０）２０μノを加え、３７℃で１
５分間インキュベージ３ン後、基質溶液０　、３ｍ／を
追加し、更に３７℃で１０分間インキエベーションする
。次いでヨウ化カリウム溶液１ｄを加えて反応を止めて
、純水８ｍｌを加えて６６０？ａ”の吸光度（ＡＯ）を
測定する。別の試験管に０．２Ｍ！Ｊン酸緩衝波緩衝液
Ｈ７，０）４０１ｉＪをとり、基質溶液α３ゴを加え、
次いでヨウ化カリウム溶液１ｄを加えた後、純水８ｍｌ
を追加して６６０１１Ｅの吸光度（Ａｂ　）を測定する
。これらの吸光度から下記の式によりΔＡＯの値を求め
る。７ＡＯはα−アミラーゼ活性に比例した値となる。

く記）ｊＡｏ＝Ａｂ−Ａ。

（２）調製した酵素溶液の各々２０μｌに塩化第二鉄溶
液２０μノを加え、３７℃で１５分間インキュベージ式
ン後、基質溶液９．３ｍｌを追加し、更に３７℃で１０
分間インキエベーションする。次いでヨウ化カリウム溶
液１ｍ７！を加えて反応を止めで、純水８ｍｌを加えで
６６０５ｍの吸光度（Ａｉ　）を測定する。この吸光度
を下記の式によりΔＡｉの値を求める。

く記〉ΔＡ　ｉ　＝Ａ　ｂ　−Ａ　１ （３）以上の実験によりＳ型アミラーゼとＰ型アミラー
ゼの混合比の残存活性率を下記の。

式により求める。

この結果をプロットしたものを°第１図に示す。

実施例２ １、酵素溶液 実施例１で精製したＳ型及びＰ型アミラーゼを１％ウシ
血清アルブミンを含む生理食塩水に溶解する。

２、試薬 実施例１の試薬に同じ。

３、測定方法と効果 （１）　　酵素溶液２０μｌを用いて実施例１の３−（
１）と同様の方法で吸光度（Ａｏ　）及びブランクの吸
光度（Ａｂ）を測定する。

（２）酵素溶液２０μｌを用いて実施例丁の３−（２）
と同様の方法で吸光度（Ａｉ）を測定する。

（３）残存活性率を実施例１の３−（３）の式より求め
、この結果をプロットしたものを第２図に示す。

実施例３ 実施例２における試薬の塩化第二鉄溶液を硫酸第二鉄に
変えて、以下、実施例２と同様に実験する。この結果を
プロットしたものを第３図に示す。

【図面の簡単な説明】 第１図は、実施例１に於けるＳ型及びＰ型アミラーゼの
混合比とその残存活性率との関係を示した図であり、第
２図及び第３図は、実施例２及び実施例３における各々
の鉄イオン添加時のα−アミラーゼ活性の経時変化を示
した。ものである。 第　１　　図 ＯＱ２５　　Ｑ５０　　Ｑ７５　１　（ＰＩ／５−ＰＩ
）１　　０．７５　０．５０　０．２５　０　（Ｓ／Ｓ
、Ｐｌ）Ｍｉｘｅｄ　　Ｒａｔｉ。 第　　Ｚ　　図 ｔで Ｉｎｃｕｏａｔｉｏｎ　　Ｔｉｍｅ　　（ｍｉｎ）ｔＨ
５Ａ−＋−ＨＰＡ（１）−Ｏ−ＨＰＡ（２）第　３　図 つ δＮ Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　　Ｔｉｍｅ　（ｍｉｎ）÷Ｈ５
Ａ　　　＋ＨＰＡ（１）　　＋）−ｆＰＡ（２□）手続
補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和６０年特許Ｍ第０４７５８１号 ２．５＆明の名啄 α−アミテーゼの分別定量方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住　　所　　　　　神奈川県相横原市大野台２−２９−
１４５、補正の対象 「願書」及び［明［１ ６、補正の内容

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 α−アミラーゼを含有する試料液に対し、 インヒビターとして鉄イオンを作用させ、特定のα−ア
   ミラーゼアイソザイム活性を阻害させた後、該試料液中
   のα−アミラーゼ活性を測定することを特徴とするα−
   アミラーゼの分別定量方法。